Klinische Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie/Onkologie (E160)

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1 Klinische Kooperationseinheit (E160) Leiter: Dr. med. M. Görner (kommissarisch 3/02-8/03) Dr. med. Th. Luft, PhD (8/03 -) 354 Wissenschaftler Dr. med. Thomas Luft, PhD PD Dr. Johannes Schenkel Dr. med. Markus Munder PostDoc Dr. Svetlana Karakhanova, PhD Doktoranden Elena Rodionova (PhD-Studentin) Markus Schneider (MD Student) Gwendolyn Doschko (MD-Studentin) Technische Assistenten Michael Kirsch Michael Hess Claudia Luckner Katja Knebel (-8/03) Der Fokus der klinischen Kooperationseinheit Molekulare Hämatologie und Onkologie lag in den letzten beiden Jahren auf der Untersuchung und Manipulation immunologischer Antworten nach Blutstammzell-Transplantationen (SZT). Dafür besteht zwischen unserer Arbeitsgruppe und der Abteilung Hämatologie, Onkologie und Rheumatologie (Prof. Dr. A.D. Ho) der Universität Heidelberg eine enge klinische und wissenschaftliche Verbindung. Autologe und allogene SZT sind seit Jahren in die Struktur der Abteilung Hämatologie, Onkologie und Rheumatologie der Universität Heidelberg integriert. Beide Therapieansätze stellen für einige hämatologische Erkrankungen eine Möglichkeit der Heilung bzw. der Lebensverlängerung dar. Unsere Kenntnis der kurativen Mechanismen dieser aufwendigen Therapieformen sind jedoch lückenhaft, so dass Steuerung und Optimierung des eigentlichen Heileffektes derzeit noch nicht möglich sind. Deshalb entwickelte unsere Kooperationseinheit drei Arbeitsrichtungen, welche neue therapeutische und diagnostische Ansätze für hämatologische Patienten zum Ziel haben: 1. Vakzineentwicklung 2. Monitoring immunologischer Antworten nach SZT und 3. Untersuchung von Regulationsprinzipien immunologi scher Antworten. Im Rahmen der Entwicklung neuer Vakzineprotokolle wurde in Zusammenarbeit mit Prof. Dr. H. Goldschmidt (Abteilung Hämatologie, Onkologie und Rheumatologie der Universität Heidelberg) eine Vakzinestudie für Patienten mit Multiplem Myelom nach Hochdosis-Chemotherapie und autologer SZT begonnen. Diese soll randomisiert die Immunogenität Peptid-beladener Dendritischer Zellen in der Frühphase (4 Wochen nach SZT) und in der Spätphase (6 Monate nach SZT) nach autologer SZT vergleichen. Die Herstellung der Dendritischen Zellen erfolgt in Zusammenarbeit mit der Klinischen Kooperationseinheit Hautkrebs (D070, Leiter: Prof. D. Schadendorf). Erste Probeläufe mit Patienten-Leukapherisaten waren bereits im GMP-Labor der Gruppe D070 erfolgreich, die Studie soll im Jahre Patienten rekrutieren. Diese erste klinische Studie ist die logistische Voraussetzung a) für Vakzinestudien mit neuen Peptid-Antigenen und b) für Vakzinestudien nach allogener SZT. Zunächst werden Peptid-Antigene eingesetzt, welche bereits vielfach untersucht und sicher nicht toxisch sind. Wir arbeiten intensiv an der Entwicklung neuer Peptid-Antigene, die für spätere Generationen klinischer Studien zur Anwendung kommen sollen. Eine zweite Arbeitsrichtung zielt auf die Analyse immunologischer Veränderungen nach allogener SZT. Dazu sammelt unserer Arbeitsgruppe seit 2 Jahren Serum, Zellen, Proteinlysate und DNA/RNA allogen transplantierter Patienten. Bislang sind 90 Patienten in diese Studie rekrutiert, 14-tägig werden Blutproben entnommen und in verschiedenen Aufbereitungen eingefroren. 56 Patienten konnten bereits longitudinal bis über den Tag 100 nach SZT beobachtet werden. Dabei werden die klinischen Beobachtungen an diesen Patienten (Remissionen, Komplikationen) von immunologischen Untersuchungen begleitet. Ziel ist die Entwicklung neuer diagnostische Ansätze zur Vorhersage schwerer Komplikationen (z.b. einer Graft-versus-Host Disease, GvHD). Teile dieser Materialbank sind im letzten Jahr für die immunzytometrische Analyse von T-Zellpopulationen sowie für Untersuchungen der Regulation der Arginase im Verlauf nach SZT eingesetzt worden. Weitere Projekte (Quantifizierung der Aktivierung der MAPK p38 und ERK1/2) werden zur Zeit erarbeitet. Zum Dritten richtet sich unser Interesse auf basale Regulationsprinzipien immunologischer Antworten. Wir beobachteten fundamentale Unterschiede in der Regulation des Arginin-Metabolismus zwischen Maus und Mensch. Dies unterstreicht erneut die Signifikanz der Untersuchung spezifisch humaner Zellsysteme. Wir arbeiten mit einem Modell der Differenzierung humaner dendritischer Zellen und konnten beschreiben, dass diese in Abhängigkeit von Stärke und Persistenz äusserer Aktivierungsreize entweder zu migratorischen oder zu pro-inflammatorischen Zellen reifen. Die Stärke und Persistenz äusserer Reize wird transformiert in intrazelluläre Signale, deren Stärke nach 24 Stunden (Stärke der Persistenz) mit dem funktionellen Phänotyp der Zellen korreliert. Diese Arbeiten eröffnen neue Wege für die Analyse der Regulation immunologischer Reaktionen durch extra- und intrazelluläre Modulation von Stärke und Persistenz der Signale. Unsere Ergebnisse sind angesichts einer neuen Generation von Medikamenten, die auf die Hemmung spezifischer Signaltransduktionswege zielen, von klinischer Relevanz.

2 Immunogenität einer Vakzine mit Peptid-beladenen dendritischen Zellen in der Früh- und Spätphase nach autologer Stammzell-TPL T. Luft, O. Christensen*, H. Goldschmidt*, D. Schadendorf #, A.D. Ho* * Medizinische Klinik und Poliklinik V; # D070, DKFZ Klinische Phase I-II Vakzinestudien mit Peptid-beladenen dendritischen Zellen (DC) zeigten, dass 10-30% aller Patienten potente Immunreaktionen bis hin zu (vereinzelten) kompletten Remissionen ihrer malignen Erkrankung entwickeln können. Trotzdem profitiert die Mehrzahl der Patienten nicht von dieser aufwendigen Therpie. Diese geringe Wirksamkeit steht im Widerspruch zu zahlreichen in vitro und murinen in vivo Studien, in welchen sich DC als die potentesten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) zur Induktion einer T-Zell-vermittelten Immunantwort erwiesen. Wir vermuten, dass die Diskrepanz zwischen experimenteller und klinischer Wirksamkeit verursacht wird a) durch Verwendung migratorischer DC, die nicht zur Sekretion von IL-12p70 befähigt sind, und b) durch das Fehlen eines systemischen, pro-inflammatorischen Milieus, welches normalerweise bei viralen und bakteriellen Infektionen beobachtet wird. Da Tumoren ihr Mikromilieu selbst immunsuppressiv konditionieren, ist die Umgebung des Tumors sicher nicht in der Lage, die durch eine Vakzine expandierten T-Zellen zur Reifung zu bringen. Hinweise für eine inkomplette Reifung Peptid-spezifischer CTL wurden bereits bei HIV-Patienten gefunden. Die Perforinexpression von CTL, die durch eine DC-Vakzine expandiert wurden, ist bisher nicht untersucht. Jedoch benötigen CTL für ihre terminale Reifung IL-10 oder IL- 12p70, zwei Zytokine, die von den in bisherigen Vakzinestudien verwendeten DC nicht sezerniert werden. Die Studie des vorliegenden Antrags verwendet DC, die für 6h mit CD40Ligand und IFN-γ aktiviert wurden und nach T- Zell-Kontakt zur Sekretion dieser Zytokine in der Lage sind. Andererseits verlangt eine massive Expansion Peptid-spezifischer CTL ein systemisches, pro-inflammatorisches Milieu, wofür v.a. präklinische Studien mit adoptivem Transfer von CTL Hinweise erbrachten. Die frühe Phase der lymphozytären Rekonstitution (nach autologer oder allogener) SZT scheint die Expansion zytotoxischer T-Zellen besonders zu begünstigen. Diese Expansion ist initial oligoklonal, was auf eine Antigen-spezifische Expansion der CTL hinweist. Die hier vorgelegte Studie soll die Frage beantworten, ob sich die Immunogenität einer DC-Vakzine in der Frühphase nach autologer SZT von einer Vakzine in der Spätphase unterscheidet. Studiendesign - 30 Patienten mit Multiplem Myelom (MM) im Stadium III werden mit autologen DC vakziniert. Randomisation: a) 4 Wochen oder b) 6 Monate nach Hochdosis-Chemotherapie und nachfolgender autologer SZT. - Herstellung der DC-Vakzine aus autologen Monozyten im GMP-Labor des DKFZ-Partners. - Aktivierung der DC nach unserem eigenen Protokoll: 6 h CD40L-Monomere und IFN-γ. - DC werden mit tumorassoziierten Peptiden beladen: MAGE-A2 (KVAELVHFL, ; FLWGPRALV, ), LAGE-1 (SLLMWITQV, ), Influenza- Kontrollpeptid (GILGFVFTL, 58-66). - Studienendpunkte: Toxizität der Vakzine und Zahl und Funktion Peptid-spezifischer CTL im peripheren Blut. - Immunologische Evaluation nach 3 Vakzinierungszyklen (3 wöchige Zyklen) aus einem Leukapherisat: FACS-Analyse mit Tetrameren, intrazelluläre Expression von Perforin und Granzym B, Oberflächenmarker, ELISpot und ELISA. Bisher sind in zwei Probeläufen Leukapherisate von Patienten mit MM erfolgreich im GMP-Labor der Arbeitsgruppe D070 (Prof. D. Schadendorf) aufbereitet worden, die Studie soll im Jahr Patienten rekrutieren. Diese Studie ist ein erster Schritt hin zu nachfolgenden Studien mit neuen Peptidantigenen. Polymorphe HLA-DP-abgeleitete Peptide - neue Vakzineantigene für Fremdspender-Blutstammzelltransplantationen? E. Rodionova, M. Zöller #, A.D. Ho*, T. Luft * Medizinische Klinik und Poliklinik V; # D060, DKFZ Parallel zur Entwicklung klinischer Vakzinestudien nach SZT sucht unserer Gruppe nach neuen Tumor-assoziierten Antigenen. Dabei sind die HLA-DP-Allele vielversprechende Zielstrukturen, die sich bei den meisten allogenen Fremdspender-SZT zwischen Spender und Empfänger unterscheiden. Wir untersuchen die Bedeutung von HLA-A2-bindenden Peptiden der polymorphen Regionen dieser Allele als potentielle Antigene für CTL-Antworten bei Graft-versus- Leukämie (GvL) und Graft-versus-Host-Disease (GvHD) Reaktionen sowie als Antigene für zukünftige Vakzinestudien. Ähnlich den Minor Histokompatibilitätsantigenen HA-1 und HA-2 ist auch die Expression der HLA-Klasse II Moleküle im Wesentlichen auf hämatopoetische Zellen und ihre Abkömmlinge begrenzt. Auch Leukämie- und Lymphomzellen exprimieren diese Moleküle. Eine CTL-vermittelte Immunreaktion gegen Empfängerallele sollte daher nach allogener SZT eine GvL unterstützen und nur geringe Nebenwirkungen haben. Wir haben die HLA-A2-bindenden Peptide der polymorphen Regionen aller HLA-DP-Allele identifiziert und für einige dieser Peptide Bindungsfähigkeit und Immunogenität in vivo nachgewiesen. Zur Zeit arbeiten wir an der Klonierung Peptid-spezifischer CTL, um die Expression dieser Peptide an der Oberfläche von B-Lymphozyten zu untersuchen. Da die analogen Peptide der verschiedenen HLA-DP-Allele ein weites Spektrum von HLA-A2-Bindungsaffinitäten zeigen, hoffen wir, immunogene Peptide zu identifizieren, die spezifisch auf hämatopoetischen und malignen Zellen des Empfängers exprimiert werden. Diese Peptide könnten mögliche Antigene für zukünftige Vakzinestudien darstellen. Die Relevanz dieser Peptide im Kontext einer GvL bzw. GvHD-Reaktion wird anhand der Patientenproben unserer Materialbank untersucht. 355

3 356 Forschungsschwerpunkt E Stärke und Persistenz aktivierender Reize bestimmen Migration und Zytokinsekretion humaner dendritischer Zellen T. Luft* #, E. Maraskovsky, M. Schnurr, K. Knebel*, M. Kirsch*, M. Görner* #, R. Skoda*, A.D. Ho #, P. Nawroth und A. Bierhaus * E160, DKFZ; Medizinische Klinik I, Universität Heidelberg; # Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg the Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Australien Die Migration dendritischer Zellen (DC) in die Lymphknoten sowie die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine wie IL- 6 und IL-12p70 sind kritische Funktionen reifer DC. Allerdings ist die Ausprägung dieser Funktionen nicht notwendig aneinander gekoppelt. Wir konnten zeigen, dass quantitative Unterschiede in identischen Signaltransduktionswegen die Differenzierung der Zellen zu migratorischen oder Zytokin-sezernierenden Zellen beeinflussen. Die Ausprägung der Fähigkeit zur Migration verlangte nur schwache und transiente CD40-Signale, hingegen hemmten starke und persistente CD40 Signale die Migration und steigerten die Sekretion von Zytokinen. Dieses Modell traf gleichermassen für die DC-Aktivierung durch intakte Pathogene (lebende E. coli) zu. Weiterhin unterschied sich die Persistenz der Signaltransduktion in CD1c + DC des peripheren Blutes (PBDC) von der unreifer monozytärer DC, was eine mögliche Erklärung für das migratorische funktionelle Profil der PBDC erlaubt. ERK1/2 und p38k mediierten synergistisch die Sekretion von Zytokinen, jedoch wurde die Ausprägung migratorischer Fähigkeiten von p38k verstärkt und von ERK1/2 gehemmt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Richtung einer DC-vermittelten Immunantwort durch die Stärke und die Persistenz aktivierender Reize reguliert wird. (Manuskript eingereicht) Die Stärke der Persistenz intrazellulärer Signale bestimmt die Differenzierung dendritischer Zellen (DC) zu migratorischen oder zytokinsezernierenden Zellen - ein Regulationsmotif zellulärer Adaptivität T. Luft* #, E. Rodionova, E. Maraskovsky, M. Kirsch*, M. Hess, M. Görner, U. Klingmüller**, R. Skoda* und A.D. Ho # *DKFZ E160, ** DKFZ A150, # Medizinische Klinik und Poliklinik V, Universität Heidelberg, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Australien. Die Sekretion von Zytokinen und die Migration in periphere Lymphknoten sind zwei spezifische Charakteristika monozytärer dendritischer Zellen (MoDC), welche durch Stärke und Persistenz des Einwirkens extrazellulärer aktivierender Reize reguliert werden. MAPKinasen sind wesentliche Komponenten des intrazellulären Signaltransduktions- Netzwerkes und vermitteln Migration (p38k) und Zytokinsekretion (p38k und ERK1/2) von MoDC. Auch die Aktivität der Phosphatidylcholin-spezifischen Phospholipasen PC- PLC und PLD korrelieren mit einem migratorischen Phänotyp, jedoch in nicht-migratorischen Zellen ist ihre Aktivität vermindert. Wir beobachteten, dass die Persistenz dieser drei Signalwege von unterschiedlichen funktionellen Modulatoren dendritischer Zellen beeinflusst wird: Wortmannin verstärkte die Phosphorylierung von p38k und ERK1/2 nach 24 Stunden, was mit erhöhter Sekretion von IL-6 und IL-12p70 korrelierte. Dagegen hemmte D609 alle MAPK und Phospholipasen mit dem Resultat einer vollständigen Reifungshemmung der MoDC. Zyklisches AMP (camp) hatte interessante modulatorische Effekte: Hemmung der MAPK p38k und ERK1/2 sowie Verstärkung der Aktivität der PC-PLC. Entsprechend sezernierten MoDC, die in Anwesenheit von camp aktiviert wurden, geringere Mengen von Zytokinen und zeigten verstärkte migratorische Aktivität. Unsere Ergebnisse stützen die Hypothese, dass die Modulation der Stärke der Persistenz intrazellulärer Signale ein wesentliches regulatorisches Motif zellulärer Differenzierung ist. Dieses erlaubt adaptives Verhalten dendritischer Zellen angesichts einer grossen Bandbreite verschiedenster Typen und Stärken extrazellulärer Reize bei gleichzeitiger Integration eines komplexen Netzwerkes aktivierender und hemmender Module in der Zelle selbst. (Manuskript in Vorbereitung). Arbeitsgruppe Immunregulation Wir beschäftigen uns mit immunregulatorischen Regelkreisen innerhalb des myeloischen und lymphatischen Teils des Immunsystems. Ausgehend von eigenen Untersuchungen zur Regulation des Arginin-Metabolismus myeloischer Zellen (Munder et al. 1998, J. Exp. Med. 187:2103, Munder et al., J.Immunol. 1998, 160:5347; Munder et al. 1999, J.Immunol. 163:3771) sowie zur Anergisierung von T-Zellen (Munder et al 2002, J. Exp. Med. 196:1151) haben wir im letzten Jahr v.a. die entsprechenden Mechanismen im humanen Immunsystem studiert. 1. Arginin-Metabolismus in Zellen des menschlichen Immunsystems M. Munder, G. Doschko, M. Görner, C. Luckner Kooperationspartner: M. Modolell (Max-Planck-Institut für Immunbiologie, Freiburg); F. Mollinedo (Universität Salamanca, Spanien); J. Calafat (Krebsforschungszentrum der Niederlande, Amsterdam); C. Gil-Lamaignere und F.-M. Müller (Kinderklinik der Universität Heidelberg); A. D. Ho (Medizinische Klinik V, Heidelberg) Die Regulation des Arginin-Metabolismus myeloischer Zellen spielt eine zentrale Rolle in zahlreichen murinen Modellen für Inflammation, Autoimmunität und Tumorkontrolle. L-Arginin kann zum einen durch das induzierbare Enzym Stickstoffmonoxid-Synthase (inos) zum zytotoxischen Effektormolekül NO umgesetzt werden. In einem alternativen Stoffwechselweg wird L-Arginin durch das Enzym Arginase zu Ornithin und Harnstoff hydrolysiert. Durch Kompetition um das gemeinsame Substrat limitiert die Arginase somit die Synthese des v.a. proinflammatorisch wirkenden NO und stellt somit einen möglichen antiinflammatorischen Stoffwechselweg dar. Vom Ornithin ausgehend werden Polyamine und Prolin synthetisiert, welche essentiell für Zellproliferation bzw. Kollagensynthese sind. Die Arginase steht somit vermutlich im Zentrum von Prozessen der Geweberegeneration, Synthese von Extrazellularmatrix und Steuerung von Entzündung. In früheren Arbeiten hatten wir demonstriert, daß die Enzyme inos und Arginase in murinen Makrophagen und dendritischen Zellen durch TH1 Zytokine (inos) bzw. TH2 Zytokine (Arginase) streng dichotom induziert werden (Munder et al., J.Immunol. 1998, 160:5347). Ferner konnten wir zeigen, daß selektiv das hepatische Isoenzym der Arginase (Arginase I) in den erwähnten myeloischen Zellen reguliert wird (Munder et al.,

4 J.Immunol. 1999, 163:3771). Im letzten Jahr nun dehnten wir unsere Untersuchungen auch auf murine Granulozyten aus und zeigten erstmals, daß auch in dieser quantitativ bedeutsamsten Leukozytenfraktion die zytosolische Arginase I durch TH2 Zytokine induziert wird (M. Munder et al., Manuskript in Vorbereitung). Die Regulation der Arginase im humanen Immunsystem unterscheidet sich fundamental vom murinen System. Durch Auftrennung humaner Leukozyten in die einzelnen zellulären Linien wurde klar, dass das Enzym selektiv in Granulozyten (PMN) exprimiert wird (M. Munder, Manuskript in Vorbereitung). ImGegensatz zum murinen System ist es in den PMN bereits konstitutiv mit hoher Enzymaktivität vorhanden. Wir konnten ferner die subzelluläre Lokalisation aufklären und zeigen, dass die humane Granulozyten-Arginase in den azurophilen Granula exprimiert ist. Eine mögliche Funktion im Rahmen der Phagozytose und Zytotoxizität humaner Granulozyten wurde ebenfalls aufgeklärt (M. Munder, Manuskript in Vorbereitung). Neben diesen zellbiologischen Untersuchungen studierten wir an einer Kohorte von 50 Patienten nach allogener Stammzelltransplantation die Regulation der humanen PMN Arginase im Rahmen verschiedener inflammatorischer Zustände (G. Doschko, Manuskript in Vorbereitung). Augenblicklich interessieren wir uns für weitere mögliche Funktionen der humanen PMN Arginase sowie physiologische Induktoren und Suppressoren des Enzyms sowie die assoziierten intrazellulären Signaltransduktionswege. 2. Regulatorische humane CD4+CD25+ T-Zellen im Rahmen der allogenen Stammzelltransplantation und Graft-versus-Host Erkrankung M. Munder, S. Karakhanova, T. Luft, M. Görner, M. Schneider Kooperationspartner: L. Nicholson (Universität Bristol, England, UK); A. D. Ho (Medizinische Klinik V, Heidelberg) Zusatzfinanzierung: Amgen Die allogene Stammzelltransplantation ist für verschiedene hämatologische oder genetische Erkrankungen eine wichtige und oftmals die einzige kurative Therapieoption. Eine der wesentlichen Komplikationen der Methode besteht in der Abstoßungsreaktion der transplantierten Zellen gegenüber dem Empfänger (Graft-versus-Host Erkrankung, GvHD). Je nach Konditionierung und HLA-Kompatibilität zwischen Spender und Empfänger entwickeln 25-75% der transplantierten Patienten eine GvHD, welche nicht nur zu einer wesentlichen Einschränkung an Lebensqualität führt, sondern auch mit beträchtlicher Mortalität verbunden ist. Man geht davon aus, daß die GvHD durch eine Aktivierung alloreaktiver T-Lymphozyten des Spenders ausgelöst wird, wobei die genauen Pathomechanismen nach wie vor unklar sind. In den letzten Jahr wurde im murinen und humanen Immunsystem eine suppressorische CD4+ T-Zellpopulation charakterisiert, welche sich durch konstitutive Expression von CD25 auszeichnet. In verschiedenen murinen Krankheitsmodellen wurde gezeigt, dass ein Verlust der CD4+CD25+ T-Zellen zu Auto- oder Alloimmunität führt. Wir analysierten daher an einer Kohorte von 30 Patienten im ersten Jahr nach allogener Stammzelltransplantation engmaschig (alle 14 Tage) mittels Durchflusszytometrie das T-Zell-Kompartiment im peripheren Blut. Es zeigte sich, daß das Auftreten von GvHD mit einer Reduktion der CD4+CD25+ Suppressorzellen assoziiert ist (M. Schneider, Manuskript in Vorbereitung). In einem weiteren Pilotprojekt wurde klar, dass möglicherweise auch eine Störung der Funktionalität der CD4+CD25+ Zellen mit GvHD vergesellschaftet ist (S. Karakhanova, Manuskript in Bearbeitung). Die CD4+CD25+ Zellen stellen daher möglicherweise ein potentes zelluläres Therapeutikum zur gezielten Immunsuppression bei Auto- und Alloimmunität dar. Wir begannen mit der Etablierung eines Protokolls zur optimalen ex vivo Expansion dieser physiologisch anergen T-Zellpopulation. Im Rahmen der oben skizzierten Analyse der allogen transplantierten Patienten wurde ferner eine umfangreiche Materialdatenbank aufgebaut, welche als Grundlage zukünftiger Untersuchungen zur Immunrekonstitution nach Stammzelltransplantation dienen wird. Transgene Tiermodelle J. Schenkel Zusammenarbeit mit: Prof. Dr. Angel Alonso DKFZ, Dr. Jörn Coers Univ. Basel, Schweiz, Dr. Richard Jäger Univ. Bonn, Dr. Kirsten Kabsch DKFZ, Dr. Svetlana Karakhanova DKFZ, Michaela Hipp DKFZ, Dr. Andrea Mohr Univ. Ulm, Prof. Dr. Radek Skoda Univ. Basel, Schweiz, PD Dr. Johannes Vogel Univ. Zürich, Schweiz, PD Dr. Markus A. Weigand Univ. Heidelberg, Dr. Ralf Zwacka Univ. Ulm Transgene Tiermodelle zur Hämatopoese In Kooperation mit J. Coers, S. Karakhanova und R. Skoda Zum besseren Verständnis der Rolle des hämatopoetischen Potentials von Stammzellen haben wir eine Vielzahl von transgenen Tieren entwickelt, um die während der Differenzierung aktivierten Vorgänge zu verstehen. Derzeit sind wir in Heidelberg dabei, die für diese Modelle erforderlichen Mehrfachmutanten zu etablieren. Um die Rolle des Thrombopoetinrezeptors in Mausmodellen zur essentiellen Thrombozytose zu studieren, haben wir verschiedene punktmutierte Rezeptorgene in entsprechende Mausmutanten eingefügt, die Analyse dieser Tiere ist derzeit in Arbeit. Ein anderer Ansatz versucht Veränderungen im Splicing des Rezeptorgens mit Krankheiten zu assoziieren, hierzu haben wir auch Mausmodelle etabliert, die derzeit getestet werden. Die Rolle des E2 Proteins bei der Regulation der Aktivität des humanen Papilloma Virus Typ 11 (HPV-11) In Koperation mit A. Alonso, K. Kabsch und M. Hipp Ziel dieses Vorhabens ist, den Einfluss des E2 Proteins des HPV-11 auf die Genexpression der Wirtszelle zu verstehen. Mit Hilfe eines Reportergenkonstrukts wurde bereits die Aktivität des HPV-11 untersucht (Schenkel et al., 1999; Protopapa et al., 1999). Dabei erhielten wir eine spezifische Expression sowie eine Aktivierung nach verschiedenen Stimuli, nur die Reportergenaktivität war nicht in allen zu erwartenden Zielgeweben zu finden. Das dürfte u.u. daran liegen, daß in diesem Modell weder natürliches Wirtsnoch Virusprotein vorhanden sind. Um die Rolle von HPV-11 E2 in vivo untersuchen zu können, wurde das entsprechende Gen unter Kontrolle des humanen Ubiquitin C Promotors zur Generierung transgener Tiere verwendet. Wir erhielten mehrere Foundertiere, erwartungsgemäß wurden in einer Vielzahl von Geweben in der RT-PCR ein Signal gefunden, nicht das Transgen exprimierende Gewebe wurden nicht nachgewiesen, eine Quantifizierung des Genprodukts steht noch aus. Zum immunochemischen Nachweis des Transgens HPV-11 E2 haben wir in Kaninchen Antiseren generiert, die gegen 357

5 358 Forschungsschwerpunkt E das native bzw. das denaturierte Protein gerichtet sind. Mit diesen Antikörpern werden derzeit die Expressionsmuster des Transgenprodukts getestet. Da E2 für die Virusaktivierung essentiell ist, wollen wir in doppelt transgenen Mäusen dieses Phänomen weiter untersuchen, hierzu müssen doppelttransgene Tiere gezüchtet werden, die HPV-11 E2 und das o.g. Reportergen tragen. Studien zur Neurodegenration In Kooperation mit J. Vogel und M. Weigand Mehrere Vorhaben beschäftigen sich mit den (molekularen) Folgen verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen, die im Tiermodell simuliert werden. Zentrale Rolle spielt dabei die Aktivierung des c-jun Transkriptionsfaktors, den wir mit verschiedenen transgenen Mausmodellen untersuchen. Da eine Inaktivierung von c-jun zur Letalität führt, nutzen wir konditionale Modelle sowie Tiere, deren Transgen c-jun indirekt beeinflußt. Vermutlich gibt es ein Gleichgewicht zwischen c-jun und den Proteinen, die dessen Expression und Aktivierung beeinflussen können. Kommt es hier zu Verschiebungen, so verändert sich das Ausmaß des neurodegenrativen Ereignisses [22]. Neue transgene Tiermodelle in Kooperation mit R. Jäger, A. Mohr und R. Zwacka Um den experimentellen Nachweis der Beteiligung von Caspasen an der Apoptose im Brustepithel während der verschiedenen Phasen der Brustdrüsenentwicklung, insbesondere der postlaktationalen Involution zu erbringen wurden transgene Tiere generiert, die den Breitband-Caspasen- Inhibitor p35 aus Baculovirus unter der Kontrolle des Brustdrüsenspezifischen WAP-Promoters exprimieren. Aus fünf transgenen Founderlinien zeigt eine stärkere Transgenexpression, sie dient den genannten Experimenten. Da nicht alle Apoptosetypen durch Bcl-2 unterdrückt werden können, sollen die Tiere auch mit den bereits publizierten WAPbcl-2-Transgenen verglichen werden (Jäger et al., 1997 Oncogene 15: ). Caspase-8L ist eine anti-apoptotisch wirkende Splicevariante der Caspase-8. Sie ist vor allem in haematopoetischen Stammzellen exprimiert und wirkt dort als Schutzmechanismus, der diese Zellen vor dem Zelltod bewahrt. Während der Differenzierung in der Haemtopoese schalten die Zellen auf Caspase-8 um und können so wieder über Apoptose reguliert werden. Zur Überprüfung, ob eine fehlerhafte, andauernde Expression von Caspase-8L an der Pathogenese von lymphoproliferativen Krankheiten beteiligt ist, haben wir eine transgene Maus generiert die Caspase-8L in T-Zellen überexprimiert. Um ein Tiermodell für das anaplastische Lymphom zu schaffen, wurden transgene Mäuse generiert, die das beteiligte Onkogen p80 (ein aus einer Chromosomentranslokation resultierendes Fusionsprotein aus Nucleophosmin und der ALK-Kinase) unter der Kontrolle des thymocyten-spezifischen lck-promoters tragen. Von sechs Foundertiere fielen drei durch ungewöhnliches Größenwachstum auf. Eines verstarb an multiplen Lymphomen, die beiden übrigen Tiere aus nicht geklärter Ursache (keine Tumoren). Es gelang nicht, aus den Foundertieren transgene Linien zu etablieren. Der Transkriptionfaktor TCF/LEF ist hyperaktiv in vielen Kolorektalkarzionomen. Dies liegt an häufig auftretenden Mutationen im APC - (adenomatous polyposis coli) Gen, welches normalerweise β-catenin negativ reguliert. Mutiertes APC ist dazu nicht mehr in der Lage und es kommt zur Akkumulation von β-catenin, das wiederum an TCF/LEF bindet und dadurch seine Aktivität als Transkriptionsfakor erhöht. Dieser Prozess ist an der Krebsentstehung beteiligt. Um die Prozesse und mögliche Interventionsmöglichkeiten im Tiermodel untersuchen zu können haben wir eine TCF/ Lef-1 Reportermaus generiert. Publikationen (* = externer Koautor) [1] T. Luft, M. Moos, H. Goldschmidt, A.D. Ho* and M. Görner. Dissociation of putative graft-versus-hematopoiesis and graftversus-myeloma effects in patients with rapidly progressive multiple myeloma. Br J Haematol Nov;123(4): [2] Luft, T., Jefford, M., Luetjens, P., Toy, T., Hochrein, H., Masterman, KA., Maliszewski, C., Shortman, K., Cebon, J., and Maraskovsky, E. Functionally distinct DC populations induced by physiologic stimuli: Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) regulates the migratory capacity of specific DC subsets. Blood 2002, 100(4): , BMN evaluation: e** [3] Luft, T., P. Luetjens, H. Hochrein, K. Shortman, F. Masterman, M. Rizkalla, C. Maliszewski, J. Cebon, and E. Maraskovsky. Interferon-alpha (IFN-a) enhances CD40L-mediated activation of immature McDC. Int Immunol Apr 14(4): [4] Luft, T., M. Jefford, P. Luetjens, H. Hochrein, K. Masterman, C. Maliszewski, J. Cebon, and E. Maraskovsky. IL-1b enhances CD40L-mediated cytokine secretion by human Dendritic Cells (DC) - a mechanism for T cell independent DC activation. J Immunol Jan15; 168(2): [5] Luft T, Mark Rizkalla, Tsin Yee Tai, Qiyuan Chen, Roderick I. McFarlan*, Ian D. Davis, Eugene Maraskovsky and Jonathan Cebon. Exogenous peptides presented by TAP-deficient and TAP-competent cells: Intracellular loading and kinetics of presentation. J Immunol Sep 1;167(5): [8] *M. Jefford, *M. Schnurr, *T. Toy, *K.A. Masterman, *A. Shin, *T. Beecroft, *T. Yee Tai, *K. Shortman, *M. Shackleton,*I. D. Davis, *P. Parente, T. Luft, *W. Chen, *J. Cebon and *E. Maraskovsky: Functional comparison of DC generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: Differential regulation by specific classes of physiologic stimuli. Blood Sep 1;102(5): [9] M. Görner, R. Weber-Nordt, S. Höpfner, A. Benner, T. Luft, *A.D. Ho: Addition of a low fixed number of CD3+ cells to CD34- enriched allografts: Effects on engraftment, GvHD and survival after related and unrelated peripheral stem cell transplantation. 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