EGF-R-Familie als Target für zytotoxische T-Lymphozyten. Helga Bernhard
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- Dennis Franz Gerstle
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1 EGF-R-Familie als Target für zytotoxische T-Lymphozyten Helga Bernhard
2 Adoptiver Transfer von HER2-spezifischen T-Zellen zur Therapie des HER2-positiven Mammakarzinoms Patientin mit HER2 + Mammakarzinom HER2-spezifischen T-Zellen: Isolierung, Aktivierung, Expansion adoptiver T-Zelltransfer Cancer Immunol Immunother 08
3 Generierung von HER2-reaktiven zytotoxischen T-Zellklonen von einer Patientin mit HER2+++ Mammakarzinom PBMC stimulation sorting cloning screening A2/HER2 < 0.01% A2/HER2 0.04% T2 + HER CTL 45 specificity avidity tumor recognition IC A2/HER2 % specific lysis % specific lysis CD8 CD8 T2 + HIV CD8 peptide (log M) T2 + HER T2 + HIV E : T ratio A2 + HER2 + tumor A2 + HER2 - tumor
4 Adoptiver Transfer von autologen HER2-spezifischen T-Zellklonen bei einer Patientin mit Mammakarzinom Patienten-Charakteristika Progression nach Chemotherapie und Herceptin HER2-positive Lebermetastasen disseminierte HER2-positive Tumorzellen im Knochenmark T-Zelltransfer 5 x Infusion der HER2-spezifischen T-Zellklone 1-9 x 10 8 T-Zellen pro Transfer Interleukin-2: U/m 2 s.c. / Tag Monitoring Frequenzanalyse der T-Zellen im Blut und Knochenmark Migrationsverhalten: 111 Indium-markierte T-Zellen
5 Frequenz-Analyse der HER2-spezifischen T-Zellen im peripheren Blut nach dem adoptiven T-Zelltransfer Transfer von 1.2 x 10 8 HER2-spezifischen T-Zellen (CTL 3) 0 h 1 h 4 h 24 h 48 h < < 0.01 < 0.01 A2/HER2 CD8
6 Wanderverhalten der autologen, HER2-spezifischen, CD8 + T-Zellen nach dem Transfer 24 h 72 h 4 h 24 h 48 h 111 Indium-markierter CTL Klon #45; Transfer von 7.1 x 10 8 T-Zellen i.v.
7 Barriere der soliden Metastasen gegenüber den transferierten HER2-spezifischen T-Zellen MRT FDG-PET 111 In Lymphozyten
8 Monitoring von T-Zellen und Tumorzellen im Knochenmark HER2-spezifische T-Zellen vor T-Zelltransfer < 0.01% HER2-positive Tumorzellen vor T-Zelltransfer A2/HER2 86 CD8 nach T-Zelltransfer 0.1% 256 Tumorzellen / 10 6 MNC nach T-Zelltransfer A2/HER2 91 CD8 0 Tumorzellen / 10 6 MNC
9 Zwischenbilanz - adoptiver T-Zelltransfer Proof of Principle Generierung von tumorreaktiven T-Zellen Selektion, Klonierung und Expansion Spezifität gegen das Tumor-assoziiertes Antigen HER2 Limitationen hoher Arbeitsaufwand eingeschränkte Wiederholbarkeit niedrige Avidität der T-Zellen schlechte Tumorerkennung kurzes Überleben der T-Zellen unüberwindbare Tumorbarriere in vitro in vivo
10 T-Zellrezeptor Gentransfer HER2-reactive CTL clone KU1 MPSV-LTR PR E HER2-TCRalpha MPSV- LTR MPSV-LTR PR E HER2-TCRbeta MPSV- LTR primary T cells TCR-transgenic T cells Kooperation mit Wolfgang Uckert, MDC, Berlin
11 Expression des HER2-reaktiven TCRs nach Gentransfer T-Zellklon KU1 HER2-TCR wt HER2-TCR opt A2/HER % 2 % 25 % CD8
12 HER2-spezifische Lyse durch primäre T-Zellen nach TCR-Transfer T-Zellklon KU1 HER2-TCR wt HER2-TCR opt % spezifische Lyse , Effektor : Target Ratio 0, , K562tA2tMigR1tHER2 K562tA2tMigR1 HLA-A2 + HER2 + MCF7
13 Erkennung von HER2+ Tumorzellen durch TCR-transgene -Zellen T-Zellklon KU1 HER2-TCR wt HER2-TCR opt IFNγ-Sekretion (pg/ml) MCF7 SK-MEL-29 SK-MEL-37 K562tA2 K562tA2tHER2 MCF7 SK-MEL-29 SK-MEL-37 K562tA2 K562tA2tHER2 MCF7 SK-MEL-29 SK-MEL-37 K562tA2 K562tA2tHER2
14 Kreuz-Spezifität von HER2-reaktiven T-Zellen mit HER3 und HER4 CTL clone KU1 A2/HER A2/HER A2/HER A2/HER % 88 % 74 % CD8 IFNγ-secretion (pg/ml) HER2 HER3 HER peptide concentration (10 x ) A2/HER HER2-TCR opt A2/HER A2/HER A2/HER % 39 % 26 % CD8 IFNγ-secretion (pg/ml) HER2 HER3 HER peptide concentration (10 x )
15 Sequenzhomologie des dominanten HLA-A2/HER2-Peptidepitops p HER1 p SISGDLHIL HER2 p KIFGSLAFL HER3 p KILGNLDFL HER4 p KINGNLIFL
16 Potentielle T-Zellrezeptoren zur klinischen Prüfung Potentielle HER T-Zellrezeptoren Clone Priming Model Restriction Antigen Specificity Function TCR cloning Function Optimizing Function KU1 allo/her CD8/A2 HER3>HER2,HER KU40 allo/her CD8/A2 HER2 ++ in progress KW63 auto/her2-mrna CD8/A2 HER2>>HER in progress OG2 auto/her CD4/DR4 HER2 + OG5 auto/her CD4/DR4 HER2 ++ in progress CM5 allo/her CD8/A2 HER3>>>HER2 ++ CM30 allo/her CD8/A2 HER3>>>HER2 ++ CM37 allo/her CD8/A2 HER3>>>HER2 ++ CM42 allo/her CD8/A2 HER3>>>HER2 ++ in progress CM56 allo/her CD8/A2 HER3>>>HER2 ++
17 Konstruktion von Antigen-spezifischen T-Zellen für den Transfer primäre T-Zellen Transfer des T-Zellrezeptors Antigen-spezifische T-Zellklone adoptiver Transfer Konstruktion von Antigen-spezifischen T-Zellen
18 DANKSAGUNG Labor Bernhard Heinke Conrad Bettina Brackertz Barbara Kast Kerstin Gebhard Julien Daniel Kathrin Julia Falchner Kathrin Hofer Melanie Kimm Holger Krönig Stephanie Mayer Julia Müller Maria Rosa Salvador Kooperationen Technische Universität München Helmholtz-Allianz München Charité + MDC Berlin Ludwig Institute for Cancer Research Deutsches Krebsforschungszentrum Förderung Deutsche Forschungsgemeinschaft Helmholtz Allianz José Carreras-Stiftung Wilhelm Sander-Stiftung Merck KGaA Darmstadt
19
20 Transfer von Antigen-spezifischen T-Zellrezeptoren LTR TCRα/β LTR Antigen-spezifische T-Zellen Molekulare Klonierung der TCR cdna TCR-Retrovirus funktionelle Charakterisierung Austausch der Antigenspezifität T-Zellen des Patienten adoptiver Transfer
21 Ziel: Breite Applikation von tumor-reaktiven T-Zellen durch TCR-Gentransfer Set von antigen-spezifischen T-Zellklonen hohe T-Zellrezeptor-Avidität gute Tumorerkennung Analyse der Kreuzreaktionen Klonierung der TCRs in retrovirale Vektoren TCR Gentransfer in primäre T-Lymphozyten Selektion von dominant exprimierten TCRs Optimierung der TCR-Expression Spezifität und Funktion der TCR transgenen T-Zellen
22 Generierung von HER2-spezifischen CTL-Klonen aus HLA-A2 - CD8 + T- Zellen nach Stimulation mit allogenen HLA-A2 + DC peptide HER A2-negative T-cell 3 rd stimulation lysis assay A2-positive allogeneic DC A2/HER CD8 sorting + cloning T2 + HER T2+ HIVpol CTL clone KU #1 TCR tumor recognition 100 cross-reactivity A2/HER CD8 T2 + HIVpol T2 + HER K562-A2 K562-A2 + IFNγ K562-A2-HER2 K562-A2-HER2 + IFNγ % specific lysis % specific lysis peptide (log 10 M) T2 + HER T2 + HER T2 + HER T2 + HER Conrad et al., Journal of Immunology 2008
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