Lebensmittelanalytik

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1 Innovative molekularbiologische Methoden für die Lebensmittelanalytik DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades des Fachbereichs Chemie der Universität Hamburg aus dem Institut für Lebensmittelchemie der Universität Hamburg HAMBURG SCHOOL OF FOOD SCIENCE vorgelegt von Anna Franziska Vaagt (aus San Jose / Costa Rica) Hamburg 2014

2 I Abkürzungsverzeichnis V 1. ZusammenfassungAbstract Abstract 3 2. Einleitung und Grundlagen Moderne molekularbiologische Methoden in der Lebensmittelanalytik Pilze und verwendete Methoden zur Differenzierung Verwendete ZielSequenzen der DNA Ribosomale DNA (rdna) 2.4 DNAIsolierungsmethoden Charakterisierung der DNAIsolate DNA Amplifikationsmethoden PolymeraseKettenreaktion (PCR) Reaktionskomponenten für die Amplifikation Isothermale Amplifikation Innovative Detektionsmethoden Denaturierende Highperformance liquid chromatography (DHPLC) 2.8 Zielsetzung Material und Methoden 3.1 Untersuchungsmaterial DNAIsolierung Charakterisierung der DNAIsolate EndpunktsPCR und realtime PCR LAMP, realtimelamp, LoopLAMP 49 Universität Hamburg I

3 Detektion der Amplifikationsprodukte DHPLC Sequenzierungen 4.1 Entwicklung einer DNAIsolierungsmethode Aufarbeitung: Magnetische Partikel Aufarbeitung: SäulenMethode DNAIsolierung aus prozessierten PilzMatrices und anderen Lebensmitteln 4. Ergebnisse und Diskussion PolymerasenKettenReaktion; Universelle PCR PrimerKonstruktion Optimierung der PCRBedingungen 4.3 DHPLCAnalysen Entwicklung einer SizingMethode, nichtdenaturierender Modus Anwendung der nichtdenaturierenden Methode Differenzierung des Gallenröhrlings vom echten Steinpilz Differenzierung des Gifthäublings vom Stockschwämmchen Überprüfung der Methode mit Handelsproben und Herkunftsbestimmung des Steinpilzes Sizing als MultiplexMethode Heteroduplextrennung, partielldenaturierender Modus Differenzierung des Austernseitlings vom Kräuterseitling Differenzierung : Coffea arabica von Coffea canephora Spezifische PCR und realtime PCR PrimerKonstruktion Spezifität und Sensitivität 100 Universität Hamburg II

4 4.5 Isothermale Amplifikation: LAMP PrimerKonstruktion Entwicklung der LAMPMethoden Entwicklung von visuellen Detektionsmethoden Anwendung der LAMPMethoden auf konkrete Fragestellungen proofofprinciple" Detektion des Gifthäublings [Galerina marginata) Detektion des Grünen Knollenblätterpilzes (Amanita phalloides) Detektion des Gallenröhrlings [Tylopilus felleus) und der Steinpilze Analytik von Fischen : Alternative isothermale Amplifikationen Untersuchte Proben aus dem Handel Durchführungen Extraktionspuffer für die DNAIsolation (Methodenentwicklung) Verarbeitungsschritte der Pilze DNAExtraktionsmethoden Modifizierte CTABMethode zum Vergleich der Extraktionspuffer Adsorption an einer Silicamembran (modifizierte Säulenmethode) Adsorption an magnetischen Partikeln (MagneticBeadsMethode modifiziert) 5. Anhang Herstellung der magnetischen Partikel Agarosegelelektrophorese DHPLC DHPLCMethoden: SizingProgramm DHPLCMethoden: optimiertes Programm 140 Universität Hamburg III

5 DHPLCMethoden: PartiellDenaturierend Primer Sequenzen Unspezifische PCRPrimer: UniversalPrimer Spezifische PCRPrimer LAMPPrimer Abbildungen und Tabellen zu den dargestellten Ergebnissen Extraktionspuffer Weitere Ergebnisse der DHPLCAnalysen und EndpunktsPCR Ergebnisse Weitere Ergebnisse zur PCR weitere Ergebnisse der LAMPReaktionen Chemikalien und Materialverzeichnis Chemikalien, Verbrauchsmaterial und verwendete Software Geräteparameter Literatur Persönliche Daten Publikationen und Vorträge Lebenslauf 176 Universität Hamburg IV