1. Einleitung...14 1.1 Der Knochen und seine Funktionen im Körper: Ein Überblick...14 1.2 Zelluläre und molekulare Aspekte des Knochenstoffwechsels...15 1.2.1 Biochemische Bestandteile des Knochens...15 1.2.2 Der Knochenumbau...15 1.2.3 Physiologische Einflüsse auf den Knochenstoffwechsel...16 1.2.3.1 Hormonelle Steuerung des Knochenstoffwechsels...16 1.2.3.2 Differenzierung der Knochenzellen...17 1.2.3.3 Einfluß der Geschlechtshormone auf den Knochenstoffwechsel...18 1.2.3.4 Auswirkung von Bewegung auf den Knochenstoffwechsel...18 1.2.3.5 Wirkung von Leptin im Knochenstoffwechsel...19 1.2.3.6 Weitere Faktoren mit Einfluß auf den Knochen...19 1.2.4 Veränderungen und Störungen des Knochenstoffwechsels...20 1.2.4.1 Altersbedingte Knochenveränderungen...20 1.2.4.2 Steroidinduzierte Knochenveränderungen...20 1.2.4.3 Weitere Einflußfaktoren und Erkrankungen...21 1.3 Transforming Growth Factor beta (TGF-ß)...23 1.3.1 Die TGF-ß-Superfamilie...23 1.3.2 Aufbau, Struktur und Regulation von TGF-ß...23 1.3.3 Physiologische Wirkung von TGF-ß...24 1.3.4 Wirkung von TGF-ß am Knochen...25 1.3.5 Funktion der Bone Morphogenic Proteins...26 1.3.6 Krankheiten, die mit TGF-ß assoziiert sind...26 Seite 5
1.4 Die Transforming Growth Factor-ß-Rezeptoren...28 1.4.1 Die TGF-ß-Rezeptoren beim Menschen...28 1.4.2 Transforming Growth Factor ß Receptor Typ I...28 1.4.3 Transforming Growth Factor ß Receptor Typ II...29 1.4.4 Transforming Growth Factor ß Receptor Typ III...30 1.4.5 Bindungsverhalten der TßR...31 1.4.6 Einfluß der TßR auf die Differenzierung...32 1.4.7 Krankheiten, die mit Veränderungen der TßR assoziiert sind...34 1.4.7.1 Osteoarthrose...34 1.4.7.2 Weitere Erkrankungen...34 1.5 Signalübertragung durch die TGF-ß-Rezeptoren...35 1.6 Die Smads...38 1.6.1 Einteilung, Aufbau und Funktion...38 1.6.2 Signalübertragung durch die Smads...39 2. Fragestellung...41 3. Methoden und Material...43 3.1 Herstellung der Proben...43 3.1.1 Probengewinnung...43 3.1.2 Probenaufbereitung...43 3.2 Zellkultur...44 3.3 RNA-Extraktion...45 3.3.1 RNA-Extraktion mit TRIzol...45 3.3.2 RNA-Extraktion nach Chomczynski und Sacchi...46 3.3.3 RNA-Messung im Photometer...47 3.4 Reverse Transkription...47 Seite 6
3.5 RNA-Gelelektrophorese...48 3.6 Die Polymerase-Kettenreaktion...49 3.6.1 Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion...49 3.6.2 Primerdesign...51 3.7 Quantitative PCR...52 3.7.1 Grundlagen...52 3.7.2 Quantifizierungsstrategien...52 3.7.3 Fluoreszenzfarbstoff SYBR Green I...55 3.7.4 Schmelzkurvenanalyse...55 3.8 Grundlagen und Anwendung des Light-Cycler...57 3.9 Grundlagen und Anwendung des TaqMan...60 3.10 Verwendung der Uracil-DNA-Glycosylase...62 3.11 Agarose-Gelelektrophorese...63 3.12 Gel-Elution...63 3.13 Standardreihenherstellung...64 3.14 Statistik...64 3.15 Primer und Produkte...66 3.15.1 PDH...66 3.15.2 TßR-I...66 3.15.3 TßR-II...66 3.15.4 Betaglykan...66 3.15.5 Weitere Primer...66 3.16 Geräte...67 3.16.1 PCR-Geräte...67 3.16.2 Gelelektrophorese...67 Seite 7
3.16.3 Zentrifugen...67 3.16.4 Computer und Software...67 3.16.5 Sonstige Geräte...68 3.17 Verwendete Chemikalien und Artikel...68 3.17.1 Einzelchemikalien...68 3.17.2 Verwendete Reagenziensätze...69 3.17.3 Enzyme...69 3.17.4 DNA-Größenstandards für Agarose-Gelelektrophorese...69 3.18 Puffer und Lösungen...70 4. Ergebnisse...73 4.1 Charakterisierung des Knochenkollektivs...73 4.2 PCR-Etablierung...77 4.2.1 Statistischer Vergleich der real-time -PCR-Geräte...77 4.2.1.1 Interassayvarianz...77 4.2.1.2 Intraassayvarianz...78 4.2.1.3 Sensitivität und Spezifität...78 4.2.1.4 Amplifikationseffektivität...81 4.2.1.5 Zuverlässigkeit der Standardreihen...82 4.3 Datenanalyse der Knochenstudie...84 4.3.1 Allgemeines Verteilungsmuster...84 4.3.2 Geschlechtsspezifische Verteilungsmuster...85 4.3.3 Verteilungsmuster bezüglich Hormonstatus...85 4.3.4 Altersabhängigkeit der TßR-Expression...86 4.3.5 Diagnosespezifische Unterschiede der TßR-Expression...87 4.3.6 Entnahmeortspezifische Expression der TßR-Expression...88 Seite 8
4.3.7 Mobilisationsspezifische Expression der TßR...89 4.3.8 Einfluß der Steroidmedikation auf die TßR-Expression...90 4.3.9 Expression der TßR in Abhängigkeit vom Body Mass Index...91 4.3.10 Korrelationen zwischen TGF-ß-Isoformen und TGF-ß-Rezeptoren...92 4.3.11 Korrelation zwischen den einzelnen TßR-Isoformen...93 4.3.12 Weitere Ergebnisse der Knochenstudie...96 4.4 Analyse der TßR in humanen, primären Knochenzellkulturen...98 4.4.1 Einfluß der TßR auf die Differenzierung...98 4.4.2 Einfluß der Steroide auf primäre Knochenzellkulturen...99 5. Diskussion...102 5.1 Wertigkeit der angewandten Methoden...102 5.2 Einflüsse auf die PDH-Expression bei relativer Quantifizierung...106 5.3 Diskussion der Ergebnisse der Knochenstudie...107 5.3.1 Generelle Aspekte...107 5.3.2 Einfluß des Geschlechts auf die TßR-Expression...108 5.3.3 Einfluß des Alters auf die TßR-Expression...110 5.3.4 TßR-Expression bei pathologischen Veränderungen des Knochens...112 5.3.5 Einfluß des Entnahmeortes auf die TßR-Expression...114 5.3.6 Einfluß der Mobilisation auf die TßR-Expression...116 5.3.7 TßR-Expression unter längerfristiger Glukokortikoidbehandlung...118 5.3.8 Einfluß des BMI auf die TßR-Expression...119 5.3.9 Korrelation zwischen den TßR-Isoformen...121 5.3.10 Weitere Ergebnisse der Knochenstudie...122 5.4 Diskussion der Ergebnisse der humanen, primären Knochenzellkulturen...123 5.4.1 Einfluß der TßR auf die Differenzierung...123 Seite 9
5.4.2 Einfluß von Glukokortikoiden auf primäre Knochenzellkulturen...124 6. Zusammenfassung...128 7. Literatur...130 8. Danksagung...157 9. Lebenslauf...158 Seite 10