Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zu AmtR, dem Stickstoffregulator in Corynebacterium glutamicum Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Kristin Hasselt aus Altdöbern TIB/UB Hannover 131 509 969
Inhalt 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung 3 2.1 Corynebakterien 3 2.2 Stickstoffaufnahme und -assimilation in C. glutamicum 5 2.3 Stickstoffabhängige Regulation in C glutamicum 6 2.4 DieTetR-Familie 11 2.4.1 TetR 12 2.4.2 QacR 13 2.4.3 EthR 14 2.4.4 AmtR 14 2.5 Zielsetzung der Arbeit 15 3 Material und Methoden 17 3.1 Bakterienstämme und Plasmide 17 3.2 Nährmedien und Kultivierungsbedingungen 20 3.2.1 Nährmedien für E. coli 20 3.2.2 Nährmedien für C. glutamicum 20 3.2.3 Antibiotika 21 3.2.4 Kultivierungsbedingungen 22 3.3 Biochemische Techniken 23 3.3.1 Herstellung von Zellextrakten aus E. coli und C glutamicum 23 3.3.2 Proteinreinigung 24 3.3.2.1 Reinigung von AmtR 24 3.3.2.1.1 Gewinnung des Fusionsproteins MBP-AmtR 24 3.3.2.1.2 Gewinnung von reinem AmtR-Protein 25 3.3.2.1.3 Herstellung von Selenomethionin-markiertem AmtR-Protein 25 3.3.2.2 Reinigung von GlnK-AMP 26 3.3.2.2.1 Dynabeads Protein G 26
3.3.2.2.2 Strepll-7og 27 3.3.3 Bestimmung der Proteinkonzentration mittels NanoDrop 1000 Spectrometer 27 3.3.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 28 3.3.5 Färbung mit Coomassie Brilliant Blue 29 3.3.6 Western blot 29 3.3.7 Kristallisation 31 3.3.7.1 Kristallisation von nativem und Selenomethionin-markiertem AmtR-Protein 31 3.3.7.2 Co-Kristallisation von AmtR-Protein mit DNA 31 3.3.7.3 Co-Kristallisation von AmtR-Protein mit GlnK-Peptid 32 3.3.7.4 Co-Kristallisation von AmtR-Protein mit AMP 33 3.3.7.5 Datensammlung und Strukturlösung 33 3.3.8 Oberflächenplasmonresonanzmessungen 33 3.4 Molekularbiologische Techniken 35 3.4.1 DNA-Techniken 35 3.4.1.1 Plasmid-Präparationen aus E. coli 35 3.4.1.2 Präparation chromosomaler DNA aus C. glutamicum 35 3.4.1.3 Reinigung und Konzentrierung von DNA 36 3.4.1.4 Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA 36 3.4.1.5 Modifizierung von Nukleinsäuren 37 3.4.1.6 Ligation von DNA 38 3.4.1.7 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 38 3.4.1.8 Ortsgerichtete Mutagenese 40 3.4.1.9 Sequenzierung von DNA 41 3.4.1.10Southern blot 42 3.4.1.11Gelretardationstests 44 3.4.2 RNA-Techniken 47 3.4.2.1 Präparation von Gesamt-RNA und RNA-Gelelektrophorese 47 3.4.2.2 RNA-Hybridisierung (Dot blot) 48
3.5 Techniken zur Manipulation von Zellen 51 3.5.1 Herstellung und Transformation chemisch kompetenter E. co//-zellen 51 3.5.2 Präparation und Elektroporation elektrokompetenter C. glutamicum-iewen 52 3.5.3 Herstellung von Deletionsmutanten in C. glutamicum 53 3.6 Arbeiten mit C. glutamicum-zewen in Kultur 54 3.6.1 Fluoreszenzspektrometrie 54 4 Ergebnisse 55 4.1 Analyse von AmtR-Varianten 55 4.1.1 AmtR-Varianten in der DNA- und der GlnK-Bindestelle 55 4.1.2 Herstellung einer omtr-deletionsmutante 57 4.1.3 Gelretardationsexperimente 59 4.1.4 Oberflächenplasmonresonanzexperimente (SPR-Experimente) 61 4.1.5 Abschätzung der Bindekonstanten der AmtR- und AmtR-Varianten-Interaktion mit DNA anhand von Gelretardationsexperimenten 63 4.2 AmtR-DNA-Bindung 64 4.2.1 Variation der AmtR-Bindesequenz stromaufwärts des amtfl-gens 64 4.2.1.1 Gelretardationsexperimente 65 4.2.1.2 Fluoreszenzmessungen 66 4.2.1.3 Chromosomale Integration des variierten amtfl-promotors 68 4.2.1.3.1 RNA-Hybridisierungsexperimente zur Untersuchung von KH2 68 4.2.1.3.2 Vergleich der Promotorstärke von gltb in den Stämmen C. glutamicum Wildtyp und KH2 70 4.2.1.3.3 Wuchsverhalten der C. glutamicum-stämme Wildtyp, KH1 und KH2 71 4.2.1.4 Oberflächenplasmonresonanzexperimente mit amtb- und g/n/l-promotorregionen 73 4.3 Reinigung und Strukturaufklärung von AmtR 76 4.3.1 AmtR-Reinigung 76 4.3.2 Kristallisation und Strukturaufklärung von AmtR 78 4.4 Reinigung von GlnK-AMP 85 4.4.1 Intein-Tog 85
4.4.2 Strepll-Tog 87 4.4.3 Magnetic beads 88 5 Diskussion 89 5.1 Das regulatorische Netzwerk in C. glutamicum 89 5.2 AmtR-DNA-Interaktion 91 5.2.1 Variation von AmtR 91 5.2.2 Variation der DNA 94 5.2.3 AmtR-Autoregulation 96 5.3 AmtR-GlnK-Interaktion 98 5.4 AmtR-Struktur 99 6 Anhang 103 6.1 Konstruktion von Plasmiden 103 6.2 Herstellung von Sonden und DNA-Fragmenten 106 6.2.1 RNA-Sonden 106 6.2.2 Southern blotsonde zum Nachweis der Deletion von amtr 106 6.2.3 DNA-Fragmente für Gelretardationsexperimente (EMSAs) 106 6.2.4 DNA-Fragmente für Oberflächenplasmonresonanzexperimente (SPR) 106 3 Konstruktion von Stämmen 110 Literaturverzeichnis 112 Publikationen 125 Abkürzungsverzeichnis 126