Moderne Komplementanalytik Methoden und Indikationen Michael Kirschfink, Institut für Immunologie, Universität Heidelberg Einführung Physiologie, Pathophysiologie and klinische Relevanz Analytik des Komplementsystems
Das Immunsystem spezifisch/angeboren unspezifisch/erworben zellulär T-Lymphozyten B-Lymphozyten Makrophagen NK-Zellen humoral Antikörper Komplement
C3b
Komplementreaktion Klassischer Weg Immunkomplex C1 Y Y Lektin- Weg MBL MASP I MASP II C4, C2 Alternativweg Fremdoberfläche C3b C3 C3a C5 C6, C7 C8, C9n C5b-9 C5a
DC Aktivierung und Rekrutierung von Entzündungszellen Lyse Regulation der spez. Immunantwort Opsonisierung IC RES Phagocytose
Komplement als Mediatorsystem der Entzündungsreaktion
Plasma MCP/CD46 DAF/CD55 CR1/CD35 CD59 C1-Inhibitor C4 bp ------- Faktor H Faktor I ------- Clusterin S-Protein ------- Carboxypeptidase N
Pathophysiologische Bedeutung des Komplementsystems Indikationen für Komplementanalytik
Primäre Immundefekte 7,4% 6,1% 2,5% 23,8% 31,9% 7,4% 5% 3,2% 17,6% 66,3% 2% 13,6% 70,8% EUROPE N = 9612 19,8% JAPAN N = 678 23,8% AUSTRALIA N = 500 2% 9% 26% 5% LATIN AMERICA N = 1428 58% 4,9% 7,4% 4,9% Humoral 28,7% SOUTH AFRICA N = 122 54,1% Cellular / Combined Phagocytic Complement Other
I) Defekte des Komplementsystems C1-C8, B, P, MBL rezidivierende bakterielle Infekte C1, C2, C4 systemischer Lupus erythematodes C5-C8, P, MBL Neisserieninfekte C1 Inhibitor hereditäres Angioödem Faktor H -- hämolytisch-urämisches Syndrom, (FI, MCP, C3) MPGN CD55, CD59 paroxysmale nächtl. Hämoglobulinurie
C1 Inhibitor-Defekt Hereditäres Angioödem = Quinke Ödem Ursache? Analytik: CH50, C4, C1q, C1Inh (F+P) (anti-c1inh)
Komplement als Mediatorsystem der Entzündungsreaktion
II) Erkrankungen mit gesicherter Komplementbeteiligung Infektionserkrankungen--Sepsis ARDS/MOF/SIRS Vaskulitiden Nephritiden Ischämie/Reperfusionsschaden Angioödem, Capillary Leak Syndrome Autoimmunerkrankungen (v.a. SLE, RA) Transplantatabstoßung Transfusionsreaktionen Erkrankungen des ZNS (MS, GBS)
Komplement- Diagnostik sens. SchafsE C1-Inhibitor Prot/Fkt!! Y Y C1 klassischer Weg Mannan MBL,,MASPs Kaninchen/ Hühner E Alternativweg C3nef keine Lyse CH50 Einzelkomponenten C3 C5 C5b-9 AH50 C6, C7 C8, C9n C3a, C3d keine Lyse Einzelkomponenten SC5b-9
Algorhythmus der Komplementdiagnostik Primärer Defekt? Einzelfaktorenanalyse (Serum) Komponenten / Regulatoren: C1-C9, B, D, P, MBL C1-INH, fh, fi, SCPN - Protein - Funktion Gesamtfunktion Klassischer Weg Alternativer Weg Lektin Weg Auto-Antikörpernachweis Aktivierung? Komplementaktivierungsanalyse (EDTA-Plasma) Spaltprodukte: C3a, C3d, C4d, Ba, Bb Proteinkomplexe: C1r,s:C1-INH (klassischer Weg) C3b(Bb)P (alternativer Weg) sc5b-9 (terminale Sequenz) Familienanalyse C3-Nephritisfaktor (Serum) Auto-anti-C1q Auto-anti-C1-INH Auto-anti-Faktor H
K50% Funktionsanalyse im hämolytischen Test
ELISA für Komplementdefekte Klassischer wweg Lectinweg Alternativweg C4 C2 C3 C4 C2 C3 C1qrs C5 C6 C7 C8 C9 MBL/MASPs C5 C6 C7 C8 C9 P D C3 B C5 C6 C7 C8 C9 IgM Mannan LPS
Komplement- Parameter der Entzündungsdiagnostik im Gewebe/auf Zellen klassischer Weg C1q C4d Y Y C1 Alternativweg P C3 C3b, C3d Methoden: - Immunhistochemie - Cytofluorometrie C5 C6, C7 C8, C9n C5b-9 C5b-9 PNH: CD55 CD59
Fall: SLE und C1q Defekt Kirschfink et al, 1993, Petry, Kirschfink et al, 1995
Fall: SLE und C1q Defekt
Factor H binding to tissue
Haemolytisch-Uraemisches Syndrom (HUS) D+ Typische Form Shiga-Toxin E. coli O157:H7 Kinder, Diarrhö assoziiert D- Atypische Form Genetisch; sporadisch and familiär Erwachsene, Nicht Diarrhoe-ass. Mikroangiopathie Thrombocytopenie Akutes Nierenversagen Analytik: CH50, APH50, C3, C3d FH, FI, MCP
Multiple Genetische Defekte bei ahus Faktor H (~20 %) Warwicker et al. 1999, Neumann/Zipfel 2003, Noris et al. 2003) MCP Mutationen Richards et al. 2003, Noris et al. 2003 Faktor I Mutationen Dragon Durey et al. 2005 Faktor B Mutationen C3 Mutationen Rodriguez de Cordoba et al. 2006 Dragon Durey et al. 2008 CFHR1/CFHR3 Defekte Zipfel et al. 2007 Autoantikörper gegen Faktor H Dragon Durey et al. 2005, Jósi et al. 2007, Jószi et al. 2008 Mutationen bei ~ 60 % der ahus Patienten
ahus Effekt von Dialysis und anti-c5 Antikörper (Eculizumab) Therapie 8000 Dialysis Eculizumab 140 7000 120 SC5b-9 (ng/ml) 6000 5000 4000 3000 2000 1000 100 80 60 40 20 CH50 (%) 0 0 SC5b-9 (ng/ml) CH50 (%)
MPGN und Komplementdysregulation C3 Nephritisfaktor FaKtor H-Defekt (Maus, Schwein, Hund, Mensch) Autoantikörper gegen Faktor H C3 Mutation (fh Bindungsstelle) C3b Analytik: CH50, APH50, C3, C3d, C3NEF, FH
Electron microscopic immunogold localization of Factor H along the glomerular basement membrane (GBM) of a normal human kidney specimen revealing a transmembrane gradient of Factor H across the GBM with maximum Factor H concentration on the blood side and minimum Factor H concentration on the urine side of the GBM.
C4Nef C3Nef
C3 Nef in MPGN Patienten Schwertz et al, 2001
Komplementprofil in MPGN Patientsen Schwertz et al, 2001
MPGN mit Faktor H Defekt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 I C518R C941Y II R127L III C431S IV C673S V K224 Pigs L493V I1166R Factor H Plasma Mutation Domain Comment Reference I II III IV V pigs MPGN II Absent C518R C941Y CCP 9 CCP 16 FHL-1 present Ault et al, 1997 MPGN II absent R127L CCP 2 Dragon Durey et al. 2004 MPGN I absent C431S CCP 4 Dragon Durey et al. 2004 MPGN I absent C7673S CCP 11 Dragon Durey et al. 2004 MPGN II present DK224 CCP 4 Licht et al. 2004 MPGN II absent L493V I1166R CCP 9 CCP 20 Hegasy et al. 2002 <<
A B Patient A Father Patient B Mother 222 S Q K I I S Q K I I allele I: 737 tct cag --- att att tct cag aag att att allele II: tct cag --- att att tct cag --- att att Deletion of Lysin224 im Faktor H E I S I S Q I I P Y S K G E N N I E V R D WFR P P Q S E SG L Y P K T K S V N A M D G G Y R E E S Y E C D?K224 Y H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11112 12 13 14 15 16 17 18 19 20
MPGN: Deletion des Lys224 -- Komplementprofile
C3 Glomerulopathien Figure 3 Schematic representation of the expanding spectrum of renal diseases associated with an abnormal control of the
MPGN und AMD Faktor H-SCR7: Tyr402His = Riskofaktor für AMD
Gerinnungs-/. Kininsystem. klassischer Weg Inhibition Y Y C1 C1-Inhibitor anti-c5 srcr1 C3 C5 C5b-9 C5a anti-c5a Alternativweg C3b Serinproteinase- Inhibitoren ientzündung
http://www.klinikum.uni-heidelberg.de/immunchemie.3097.0.html