Aus dem Institut für Humangenetik der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Genexpressionsanalyse von DNA-Reparaturgenen in primären Fibroblasten von Tumorpatienten mittels Real Time-PCR Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz vorgelegt von Holger Schön aus Ludwigshafen Mainz, 2014 http://d-nb.info/1069208655
1. Einleitung 1 1.1 Zusammenfassung 1 2. Literaturdiskussion 2 2.1 Warum DNA-Reparatur? 2 2.2 Signalwege 4 2.3 Tumorentstehung und erbliche Varianten 7 2.3.1 Tumorentstehung 7 2.3.2 Erbliche Tumoren 10 2.4 Genexpression und Tumor 11 2.4.1 Epigenetische Regulation der Genexpression 13 2.4.2 Kotranskriptionelle und posttranskriptionelle Modifikationen der mrna 14 3. Material und Methoden 18 3.1. Material 18 3.1.1 Zellmaterial für die Genexpressionsanalyse mittels Real-Time PCR 18 3.1.2 Verwendete Primer 21 3.1.2.1 ATM (Ataxia telangiectasia mutated) 21 3.1.2.2 CDKN1A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1)) 22 3.1.2.3 DNMT3A (DNA (cytosine-5-)-methy!transferase 3 alpha) 22 3.1.2.4 EEF1G (Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma) 23 3.1.2.5 ERCC2 (Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 2) 23 3.1.2.6 FTH1 (Ferritin, heavy Polypeptide 1) 24 3.1.2.7 KRT17 (Keratin 17) 24 3.1.2.8 LIG4 (Ligase IV, DNA, ATP-dependent) 25 3.1.2.9 OSGEP (O-sialoglycoprotein endopeptidase) 25 3.1.2.10 PAK2 (p21 protein (Cdc42/Rac)-activated kinase 2) 26 3.1.2.11 POLK (Polymerase (DNA directed) kappa) 26 3.1.2.12 RAD9A (DNA repair exonuclease rad9 homolog A) 26 3.1.2.13 RAD9B (DNA repair exonuclease rad9 homolog B) 27 3.1.2.14 RFC2 (Replication factor C (Activator 1) 2) 27
. 3.1.2.15 RFC5 (Replication factorc (activator 1)5) 28 3.1.2.16 RRN18S (18S ribosomal RNA) 28 3.1.2.17 SH3KBP1 (SH3-domain kinase binding protein 1) 29 3.1.2.18 SP011 (Meiotic protein covalently bound to DSB homolog (S. cerevisiae)) 29 3.1.2.19 TBP (TATA box binding protein) 29 3.1.2.20 TIE1 (Tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1) 30 3.1.2.21 TNKS2 (Tankyrase, TRF1-interacting ankyrin-related ADP-ribose Polymerase 2) 31 3.1.2.22 UBE2V1 (Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1) 31 3.1.2.23 VIM (Vimentin) 31 3.1.3 Verwendete Chemikalien 32 3.1.4 Verwendete Geräte 33 3.1.5 Verwendete Software 33 3.2 Methoden 34 3.2.1 Molekularbiologische Methoden 34 3.2.1.1 RNA-Extraktion 34 3.2.1.2 Qualitätsbestimmung mittels Gelelektrophorese 34 3.2.1.3 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren mittels Nanodrop 35 3.2.1.4 cdna-synthese / Reverse Transkription 37 3.2.1.5 PCR-Techniken 38 3.2.1.5.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) allgemein 38 3.2.1.5.2 Quantitative Real-Time PCR (RT-qPCR) 40 3.2.1.6 Festlegung der geeigneten endogenen Kontrollgene für die Real-Time PCR 43 3.2.1.7 DNA Reparatur nach induzierter Bestrahlung 44 4. Ergebnisse 45 4.1 Auswahl der Gene für die Expressionsanalyse mittels Real-Time PCR 45 4.2 Messung der Expression der Gene ATM, CDKN1A, LIG4, PAK2, TIE, UBE2V1 und TBP in den Fibroblastenzellen der Kontrollindividuen 46 4.3 Messung der Expression der Gene ATM, CDKN1A, LIG4, PAK2, und UBE2V1 in den Fibroblastenzellen der Krebspatienten (1N- und 2N-Kollektiv) 49 4.4 Messung der Expression von elf weiteren Genen in den Fibroblastenzellen der Kontrollindividuen 53 4.5 Messung der Expression von elf weiteren Genen in den Fibroblasten der Krebspatienten (1N- und 2N-Kollektiv) 56
4.6 Vergleich des Expressionsniveaus der 17 Gene zwischen dem 1N- und 2N- Koilektiv 61 4.7 Expressionsanalyse nach Induktion der Zelllinien des des 1N- und 2N- Kollektivs mittels 1 Gy starker ionisierneder Strahlung 65 4.7.1 Expressionsvergleich des Gens RAD9A zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs 66 4.7.2 Expressionsvergleich des Gens CDKN1A zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs 67 4.7.3 Expressionsvergleich des Gens VIM zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs 69 4.7.4 Expressionsvergleich des Gens RFC2 zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs 71 4.7.5 Expressionsvergleich des Gens KRT17 zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs 72 4.8 mrna-expression von zehn Kandidatengenen in den uninduzierten Fibroblasten des 2N-Probanden KKR A24 im Vergleich zu seinem monozygoten gesunden Zwilling KKR D24 74 5. Diskussion 75 5.1 Rekrutierung der Patientenkollektive 75 5.2 Bewertung der verwendeten Chemikalien 78 5.3 Bewertung des Zellmaterials 79 5.4 Identifizierung geeigneter Gene für die Real Time-RT-PCR Analyse mittels Microarray-Untersuchung 80 5.5 Festlegung der endogenen Kontfollgene 81 5.6 Die Rolle der differenziell exprimierten Gene CDKN1A, FTH1 und RAD9A bei der Zellzyklusregulation und DNA-Reparatur 81 5.6.1 CDKN1A 82 5.6.2 FTH1 83 5.6.3 RAD9A 84 5.7 Die Expression von RAD9A, CDKN1A, VIM, RFC2 und KRT17 nach Induktion mit ionisierender Strahlung 87 5.8 RAD9A als aktueller Forschungsgegenstand 89
6. Quellenverzeichnis 90 7. Abbildungsverzeichnis 100 8. Tabellenverzeichnis 102 9. Anhang 104 9.1 Abkürzungsverzeichnis 104 9.2 Koautorenschaft 107 9.3 Veröffentlichungen 107 9.4 Lebenslauf 108