Nicht-invasive Diagnostik von Chromosomenanomalien aus dem mütterlichen Blut

Transkript

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2 Nicht-invasive Diagnostik von Chromosomenanomalien aus dem mütterlichen Blut Zürich, 28. Februar 2013 PD Dr. med. Olav Lapaire Geburtshilfliche Klinik, Universitätsspital Basel

3 Meilensteine der NIPT Forschung Fortschritte der Techniken Patentrechtliche Aspekte Ethische Probleme Offene Punkte Journal of Prenatal Diagnosis 3

4 Meilensteine in der Geburtshilfe 70er Jahre: Visualisierung der intrauterinen Entwicklung 80er Jahre: Erhöhte Anzahl von detektierbaren Pathologien 90er Jahre: Spezifizierung von abnormen Befunden Ende der 90er Jahre: Individuelle Risikoermittlung 4

5 Implementierung der invasiven / nicht-invasiven pränatalen Diagnostik in Europa Mersy E et al., Hum Reprod Update Feb 8 5

6 6 NT-Messung SSW

7 7

8 8

9 Meilensteine in der Geburtshilfe 21. Jahrhundert: Implementierung der nichtinvasiven pränatale Diagnostik im klinischen Alltag Prenatal Diagnosis. July 2010, Volume 30, Number 7 9

10 10 NZZ 2012

11 11 Basler Appell gegen Gentechnologie

12 12 H. Wittmeier 2009

13 13 NZZ online

14 14 Lapaire O et al. Placenta. 2007

15 15

16 fetale Zellen / ml maternales Blut im 2. Trimenon

17 17 Bianchi DW et al. Human Reprod Update 2004 Nov-Dec;10(6):

18 NICHD NIFTY Study NIFTY - National Institute for Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study 18

19 NICHD NIFTY Study NIFTY - National Institute for Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. Multizenter Studie (n= 3000 Fälle) Studienziel: Fetale Zellen für nicht-invasive pränatele Diagnosik fetaler Aneuploidien Vergleich FACS and MACS Vergleich der Resultate mit inv. Diagnostik (AC / CVS) 19

20 NICHD NIFTY Study Sensititvität 74% [95% CI: 61-87%] bezüglich Detektion fetaler Aneuploidien comparable to single marker prenatal serum screening Technological advances are needed before fetal cell analysis has clinical application as part of a multiple marker method for non-invasive prenatal screening. 20

21 21

22 1997 Oxford: Nachweis fetaler DNA in der maternalen Zirkulation. -Marker für schwangerschaftsassoziierte Erkrankungen -Material für nicht-invasive pränatale Diagnostik Weiterführende Arbeiten beschäftigten sich u.a. mit paternal vererbten Allelen (Bsp. fetale Rhesus D Status) 22

23 Vorteile der cffdna versus fetalen Zellen Viel höhere Konzentrationen im maternalen Blut Einfache Extraktion Hohe Stabilität Bis 10% der totalen cfdna Fraktion Detektion schon im 1. Trimester möglich Zuverlässige Resultate ab (8) SSW 23

24 24

25 Baby Gender Mentor = at home DNA test at 5 weeks Promise of 99.9 % accurate test result Bianchi DW. Obstet Gynecol. 2006;107:216-8 Science 2005; 309:

26 Entwicklung der nicht-invasive pränatale Diagnostik fetaler Aneuploidien, 2 verschiedene Techniken: 26

27 Digitale PCR Next Generation Sequencing 27

28 Digital PCR Hahn S, Lapaire O et al

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30 Titrierung von Trisomie 21 DNA in euploider DNA Aneuploides Material konnte bis auf eine Verdünnung auf 10% detektiert werden, wenn 4000 individuelle PCR-Reaktionen monitorisiert werden. Nachteil: Limitierte Anzahl der Loci Fan HC, Quake SR. Detection of aneuploidy with digital polymerase chain reaction. Anal Chem. 2007; 79(19): Lo YM, Lun FM, Chan KC, Tsui NB, Chong KC, Lau TK, et al. Digital PCR for the molecular detection of fetal chromosomal aneuploidy. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007; 104(32):

31 Next Generation Sequencing (NGS) Deep Sequencing Massive Parallel Sequencing (MPS) lily / fotolia.com Voelkerding KV, Dames SA, Durtschi JD. Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics. Clinical chemistry. 2009; 55(4):

32 32 Hahn S, Lapaire O et al. 2011

33 Next Generation Sequencing (NGS) Deep Sequencing Massive Parallel Sequencing (MPS) Vorteil: grosse Anzahl nummerischer Informationen für jedes Chromosom/Locus sequence reads können für Chrosomom 21 akkumuliert werden. Vergleich mit mehreren Millionen reads des gesamten Genoms. Voelkerding KV, Lyon E. Digital fetal aneuploidy diagnosis by next-generation sequencing. Clinical chemistry. 2010; 56(3):

34 Stanford: Die ersten retrospektiven Studien: Hong Kong: 9 Fälle mit Trisomie 21, 2 Fälle mit Trisomie 18, 1 Fall mit Trisomie 13: korrekte Identifikation 14 Fälle mit Trisomie 21 vs. Kontrollgruppe: korrekte Identifikation Fan HC, Blumenfeld YJ, Chitkara U, Hudgins L, Quake SR. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun sequencing DNA from maternal blood. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(42): Chiu RW, Chan KC, Gao Y, Lau VY, Zheng W, Leung TY, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(51):

35 Die ersten prospektiven Studien: 753 Patientinnen mit erhöhtem Risiko für Trisomie 21: 8-plex Analysis (simultane Analyse von 8 Proben): Sensititvität: 79.1%, Spezifität: 98.9%. Dupplex-Assay: Sensitivität: 100%, Spezifität: 97.9% Chiu RW, Akolekar R, Zheng YW, Leung TY, Sun H, Chan KC, et al. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplexed maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study. BMJ. 2011; 342: c

36 Die ersten prospektiven Studien: 449 Proben von Hochrisiko-Patientinnen: alle 39 Fälle mit Trisomie 21 korrekt diagnostiziert 1 normale Probe als falsch positiv beurteilt. Spezifität: 99.7%. Hauptunterschied der beiden Studien: Tiefe der NGS: 5 million sequence reads vs reads in der 8-plex Studie Ehrich M, Deciu C, Zwiefelhofer T, Tynan JA, Cagasan L, Tim R, et al. Noninvasive detection of fetal trisomy 21 by sequencing of DNA in maternal blood: a study in a clinical setting. American journal of Obstetrics and Gynecology. 2011; 204(3): 205 e

37 37 Genet Med 2011; 13(11):

38 Validierungs-Studie von Sequenom 4664 Proben von Hochrisiko-Patientinnen: 212 Proben mit Trisomie 21, 1471 euploide Proben Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE, Neveux LM, Ehrich M, et al. DNA sequencing of maternal plasma to detect Down syndrome: an international clinical validation study. Genet Med 2011; 13(11):

39 209 / 212 Fälle korrekt identifiziert (Sensitivität: 98.6%), 3 / 1471 euploiden Proben falsch positiv (falsch positiv Rate = 0.2%). Nicht-konklusives Resultat in 13 Fällen. Genet Med 2011; 13(11):

40 Analyse der Datenmenge 1.25% der cfdna von Chromosom 21 Bei Trisomie 21: ca. 1.32%. Differenz wird als z-score bezeichnet. Cut-off bei score von 3 (3x SD eines euploiden Feten) 40

41 Diskussion: Post-hoc Adjustierung für GC Nucleotide verbessert die Resultate Raum für technische /bioinformatische Verbesserungen GC: Guanin-Cytosin Paare: Wichtig für Stabilität Genet Med 2011; 13(11):

42 Verbesserung des Algorithmus Konventioneller Algorithmus: 10/13 Fälle mit Trisomie 21 korrekt identifiziert; 5/8 Fälle mit Trisomie 18 korrekt identifiziert. Optimierung des Bio-Informatik-Algorithmus Benutzung von normalized chromosome values (NCVs): alle Fälle von Trisomie 21/18 korrekt identifiziert Wichtigkeit der post NGS analytischen Schritte Sehnert AJ, Rhees B, Comstock D, de Feo E, Heilek G, Burke J, et al. Optimal detection of fetal chromosomal abnormalities by massively parallel DNA sequencing of cell-free fetal DNA from maternal blood. Clinical chemistry. 2011; 57(7):

43 Digital Analysis of Selected Regions (DANSR) Fokusierung auf die Detektion von Trisomie 21/18 durch selective massive parallel sequencing Ca. 5% der sequence reads mittels konventioneller NGS Methode 298 maternale Blutproben mit 39 Fälle mit Trisomie 21, 8 mit Trisomie 18. Alle Fälle korrekt diagnostiziert. Sparks AB et al. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenatal Diagnosis. 2012; 32(1): 3-9 Ashoor G et al. Chromosome-selective sequencing of maternal plasma cell-free DNA for first-trimester detection of trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012; 206:322 43

44 single molecule sequencing (SMS) Helicos Vorteil: keine PCR vor Sequenzierung notwendig. Nachteil: langsamer, weniger Samples /Zeiteinheit im Vergleich zu massive parallel sequencing system Thompson JF, Milos PM. The properties and applications of single-molecule DNA sequencing. Genome Biol. 2011; 12(2): 217 van den Oever JM, Balkassmi S, Verweij EJ, van Iterson M, van Scheltema PN, Oepkes D, et al. Single molecule sequencing of free DNA from maternal plasma for noninvasive trisomy 21 detection. Clinical Chemistry. 2012; 58(4):

45 Melissa study (MatErnal Blood IS Source to Accurately diagnose fetal aneuploidy) Einsatz der normalized chromosome values (NCVs) und MPS (massive parallel sequencing) Prospektive Studie 60 Zentren 2882 high-risk Schwangere mit invasiver Diagnostik Alle Fälle mit Trisomie 21 (n=89) korrekt identifiziert. Dazu: 35/36 Fällen mit Trisomie 18, 11/14 Fällen mit Trisomie, 15/16 Fällen mit Monosomie X. Keine euploiden Proben falsch beurteilt. Bianchi DW, Platt LD, Goldberg JD, Abuhamad AZ, Sehnert AJ, Rava RP. Genome-Wide Fetal Aneuploidy Detection by Maternal Plasma DNA Sequencing. Obstetrics and Gynecology. May

46 Non-invasive prenatal testing (NIPT) Sensitivität und Spezifität in der Detektion von Aneuploidien Devers PL et al. J Genet Couns 2013 Jan 22 46

47 Screening oder diagnostischer Test? Diagnostischer Test: 100% Sensitivität / 100 % Spezifität Oder: Test erlaubt definitive Diagnose Benn P et al. Ultrasound Obstet Gynecol 2012; 39:

48 48 Prenat Diagn 2012 Jan;32(1):1-2. doi: /pd.2919

49 49 Prenat Diagn 2012 Jan;32(1):1-2. doi: /pd.2919

50 Mögliches 2-Stufen Screeningverfahren Kagan KO et al. Geburtsh Frauenheilk 2012; 72:

51 51 MANAGED CARE / APRIL 2012

52 52 Uniklinik Freiburg

53 53 Patentrechtliche Aspekte

54 Patentrechtliche Aspekte US Patent No. 6,258,540 und European Patent EP B1: Non-Invasive Prenatal Diagnosis von Dennis Lo Paternal vererbte Sequenzen (Y-spezifisch, Rhesus-Ag) Ca. 95% der fetalen Aneuploidien aufgrund maternaler nondisjunction Kein Hinweis auf technische Innovationen 54

55 Genauigkeit/Qualität Kosten Geschwindigkeit der Implementierung Sicherheit Klinische Nutzen Patientinnen-Bedürfnisse 55

56 Vernachlässigung von vererbbaren Erkrankungen? Hämoglobinopathien, Enzymdefekte etc. 56

57 Ethische Aspekte Maternale Daten der Sequenzierung (Bsp. BRCA1/2) Offene Frage: Speicherung der Daten / Zugang zu den Daten Verwendung der Daten für Selektion Lantos JD, Artman M, Kingsmore SF. Ethical considerations associated with clinical use of next-generation sequencing in children. The Journal of pediatrics. 2011; 159(6): e1 57

58 58

59 59 Expert Rev Mol Med May 4;13:e16

60 Basel Danke für die Aufmerksamkeit! Olav Lapaire 60