RNA/Protein & Protein/Protein-Interaktionen innerhalb des U11/U12 di-snrnp Partikels des U12-abhängigen Spleißosoms aus HeLa-Zellen

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1 RNA/Protein & Protein/Protein-Interaktionen innerhalb des U11/U12 di-snrnp Partikels des U12-abhängigen Spleißosoms aus HeLa-Zellen Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie Abteilung Zelluläre Biochemie Göttingen vorgelegt von Heike Benecke aus Marburg/Lahn Bochum 2004

2 Meiner Familie

3 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1. Zusammenfassung 1 2. Einleitung Das prä-mrna Spleißen Die Konsensussequenzen zweier Klassen von prä-mrna Introns Die katalytischen Transesterifizierungsreaktionen Das U2-abhängige oder majore Spleißosom Die majoren U snrnps Die majoren U snrnas Die snrnp-proteine des U2-abhängigen Spleißosoms Gemeinsame Proteine der snrnps Die U snrnp-spezifischen Proteine Nicht-snRNP Proteine Die Assemblierung des U2-abhängigen Spleißosoms Das U12-abhängige oder minore Spleißosom Die minoren U snrnas Proteinzusammensetzung der snrnps Gemeinsame Proteine der snrnps Die U snrnp-spezifischen Proteine Nicht-snRNP Proteine Struktur der U11/U12-spezifischen Proteine Strukturelle Homologien zwischen U11/U12- und U1- oder 21 U2-spezifischen Proteinen Die Assemblierung des U12-abhängigen Spleißosoms Zielsetzungen dieser Arbeit Material & Methoden Material Chemikalien und Feinchemikalien Nukleotide, Radionukleotide und Aminosäuren 28

4 Inhaltsverzeichnis II Antikörper und Seren Enzyme und Inhibitoren Zellinien Bakterienstämme Hefestämme Vektoren und Plasmide DNA-Oligonukleotide RNA-Oligonukleotide Häufig verwendete Puffer Reaktionssets (Kits) Geräte Sonstige Arbeitsmaterialien Methoden Allgemeine Methoden Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Extraktion und Fällung von Nukleinsäuren und Proteinen Elektrophorese Agarosegelelektrophorese von DNA und deren Isolierung Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 37 (SDS-PAGE) Native Gelelektrophorese Molekularbiologische Standardmethoden Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und Sequenzierung Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA bzw. PCR-Produkten 39 und Ligation Transformation von Plasmiden in E. coli und deren Präparation Northern Blot Verfahren und Herstellung radioaktiver Sonden In vitro Transkription von m 7 G-gekappter bzw. radioaktiv 41 markierter RNA oder prä-mrna Gekoppelte in vitro Transkription und Translation Radioaktive 5 -Endmarkierung von RNA-Oligonukleotiden Klonierungen 42

5 Inhaltsverzeichnis III Zellbiologische Methoden Kultivierung von HeLa-Zellen und Herstellung von 43 spleißaktivem Zellkernextrakt Isolierung von SR-Proteinen aus HeLa-Zellkernextrakt Kultivierung von Bakterienzellen Expression und Aufreinigung rekombinanter Proteine aus E. coli Immunbiochemische Methoden Isolierung von spleißosomalen snrnps aus HeLa-Zellkernextrakt Affinitätsreinigung des α-35k Antikörpers Immundepletion von Proteinen aus Zellkernextrakt Immunpräzipitationen (IPs) Ko-Immunpräzipitation mit dem H20-Antikörper (anti-cap) Western Blot und Immunostaining durch ECl Spezielle Methoden In vitro Phosphorylierungsstudien GST-Präzipitationen (GST-pulldown) In vitro prä-mrna Spleißen in HeLa-Zellkernextrakt Blei(II)-induzierte Spaltung und Primer Extensions-Analyse Gelretardationsstudien (EMSA) und Kompetitionsexperimente MBS-induzierte Quervernetzung von Proteinen Lineare Glyzeringradientenzentrifugation Oligonukleotid-vermittelte Selektion von U11/U12 di-snrnps Far Western Analyse Yeast Two Hybrid Analysen Kristallographische Standardmethoden Bioinformatische Methoden BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Phylogenetische Sequenzvergleiche Strukturvorhersagen Ergebnisse Untersuchung des U11/U12-20K Proteins Identifizierung putativer Orthologe des 20K Proteins Das 20K Protein ist nicht mit dem U11-Monopartikel assoziiert 64

6 Inhaltsverzeichnis IV Analyse des RNA-Bindungsverhaltens des 20K Proteins Die Charakterisierung des U11-35K Proteins Sequenzvergleich putativer Orthologe des 35K Proteins Molekulare Charakterisierung des 35K Proteins Das 35K Protein bindet nicht an U11 oder U12 in Ko-IP Studien Das U11-35K Protein wird nicht durch SRPK1 phosphoryliert ASF/SF2 wird nach Zugabe zu 18S U11/U12 Gradientfraktionen 75 phosphoryliert Identifizierung einer potentiellen U11/U12-assoziierten Kinase Studien zur möglichen Funktion des 35K Proteins Affinitätsreinigung des α-35k Antikörpers und Immundepletion 80 des 35K Proteins aus Zellkernextrakt Die in vitro Spleißreaktion der P120 prä-mrna wird nicht durch 82 Zugabe des α-35k Antikörpers inhibiert 4.3 Das U11/U12-65K Protein Das U11/U12-65K Protein ist phylogenetisch hoch konserviert Molekulare Charakterisierung des 65K Proteins Das 65K Protein interagiert direkt mit der U12 snrna Die 65K/U12-Interaktion wird über das C-terminale RRM 87 des Proteins vermittelt Die Bindung des 65K Proteins an die U12 snrna zeigt keine 89 Auswirkung auf die Affinität für die U11 snrna Das 65K Protein interagiert mit der 3 -Hälfte der U12 snrna Eine alternative Struktur für die 3 -Hälfte der U12 snrna Blei(II)-induzierte Spaltung unterstützt die alternative 3 -Hälfte 93 der U12 snrna Der verlängerte 3 -Stem-Loop ist ein evolutionär hoch 95 konserviertes Merkmal der U12 snrna Das 65K Protein bindet an einen 7-Nukleotid-Loop in der 3 -Hälfte 97 der U12 snrna Das 65K Protein bindet in sequenzspezifischer Weise 100 an die Loop-Struktur der alternativen 3 -Hälfte der U12 snrna Das Fragment 65K-C-half bindet auch an die U6atac snrna Studien zur Funktionalität des 65K Proteins U12wt inhibiert auch das U2-abhängige Spleißen in vitro 103

7 Inhaltsverzeichnis V Versuche zur Kokristallisation des 65K-C-RRM/U12wt-Komplexes Expression und Aufreinigung von 65K-C-RRM aus Rosetta Zellen Kokristallisationsversuch des 65K-C-RRM/U12wt-Komplexes mit 107 Standard-Screens 4.4 Protein/Protein Interaktionen im U11/U12 di-partikel Chemische Quervernetzung von U11/U12-spezifischen Proteinen Analyse stabiler Proteinkomplexe durch Hochsalzexperimente Analyse von Protein/Protein-Interaktionen durch das 119 Yeast Two Hybrid System Überprüfung der Protein/Protein-Interaktionen durch Far Western 121 Analysen und GST-Präzipitationen Das 65K Protein interagiert über die N-terminale Hälfte mit dem 124 C-Terminus des U11-assoziierten 59K Proteins 5. Diskussion Überlegungen zur Funktion des U11/U12-20K Proteins Strukturelle Ähnlichkeiten und funktionelle Unterschiede 129 zwischen dem U11-35K und dem U1-70K Protein Homologien zwischen dem U11-35K und dem U1-70K Protein U11-35K - ein SR-ähnliches Protein? Die 65K/U12-Interaktion und eine alternative 3 -Hälfte für 134 die U12 snrna Das 65K Protein interagiert direkt mit der humanen U12 snrna 134 über das C-terminale RRM Die Determinanten der Bindungsspezifität sind stromaufwärts 136 des C-terminalen RRMs des 65K Proteins lokalisiert Das Fragment 65K-C-RRM bindet auch an die U1 und die U2 snrna U11/U12-65K und die Proteine U1-A und U2B scheinen 138 verwandt zu sein Einblicke in die evolutionäre Beziehung zwischen U2- und 140 U12-abhängigem Spleißosom Eine alternative Struktur für die 3 -Hälfte der U12 snrna Das 65K Protein bindet an den terminalen Loop des alternativen Stem-Loops der U12 snrna Das Fragment 65K-C-half bindet auch an die U6atac snrna 144

8 Inhaltsverzeichnis VI 5.4 Einblicke in die Protein/Protein-Interaktionen innerhalb 145 des U11/U12 di-snrnps 5.5 Überlegungen zur Bedeutung der 65K/59K-Interaktion für die 146 Bildung des U11/U12 di-snrnps und das Intron Bridging 5.6 Ausblick Literaturverzeichnis Anhang 162

9 1. Zusammenfassung 1 1. Zusammenfassung In den frühen Stadien des prä-mrna Spleißens ist die präzise Erkennung und die Paarung der Spleißstellen von zentraler Bedeutung. In höheren Eukaryonten wurde vor einiger Zeit das weniger abundante U12-abhängige Spleißosom identifiziert, welches die Entfernung einer seltenen Klasse von prä-mrna Introns katalysiert. Obgleich die Spleißkatalyse ähnlich der des U2-abhängigen Spleißosoms verläuft, deuten generelle Unterschiede in den frühen Schritten der Spleißosomenbildung, sowie in der Proteinzusammensetzung der beteiligten Komponenten auf unterschiedliche Mechanismen für die Erkennung und die Paarung der Spleißstellen hin. Im U2-abhängigen Spleißosom assoziieren das U1 und das U2 snrnp schrittweise mit der prämrna. Die Erkennung und Bindung der 5 -Spleißstelle durch das U1 snrnp wird dabei essentiell durch die spezifischen Proteine U1-70K und U1-C unterstützt. Zusammen mit nicht-snrnp Proteinen wird über dem Intron eine molekulare Brücke gebildet, die die Paarung der Spleißstellen einleitet und die nach der Assoziation des U2 snrnps vollendet wird. Im Gegensatz dazu binden U11 und U12 im U12-abhängigen Spleißosom in Form eines stabilen di-snrnps an die prä-mrna, wodurch die Erkennung der Spleißstellen simultan erfolgt. Die molekulare Brücke ist somit bereits vorformiert und wird sehr wahrscheinlich durch U11/U12-spezifische Proteine vermittelt. Um unser Verständnis von den generellen Mechanismen dieser Prozesse im U12-abhängigen Spleißosom zu erweitern, wurde im Rahmen dieser Arbeit die molekulare und funktionelle Charakterisierung der Proteine 20K, 35K und 65K vorgenommen. Diese U11/U12-spezifischen Proteine teilen signifikante Homologien mit den Proteinen U1-C, U1-A und U1-70K. Daher war es von besonderem Interesse zu sehen, ob sie analoge Funktionen übernehmen. Obgleich die strukturellen Ähnlichkeiten zwischen dem 35K Protein und U1-70K eine enge Verwandtschaft der beiden Faktoren implizieren, deckten RNA-Bindungsstudien keine Interaktion des 35K Proteins mit der U11 oder U12 snrna auf. Anders als bei U1-70K scheint die Aktivität des Proteins nicht über posttranslationale Phosphorylierung reguliert zu werden. Ebenso wenig konnte eine Interaktion zwischen dem 20K Protein und der prä-mrna

10 1. Zusammenfassung 2 detektiert werden, die eine analoge Funktionsweise zu U1-C bedeuten würde. Obgleich die funktionelle Bedeutung beider Proteine für das U12-abhängige Spleißen ungeklärt blieb, unterstützen diese Resultate die Vermutung, dass der Erkennung der Spleißstellen im U2- und U12-abhängigen Spleißosom generell verschiedene Mechanismen zugrunde liegen. Im Gegensatz dazu zeigten GST- und Ko-Immunpräzipitationsstudien, dass das 65K Protein direkt an die U12 snrna bindet, wobei das C-terminale RRM notwendig und ausreichend für diese Interaktion ist. Interessanterweise interagiert das C-terminale RRM allein auch mit der U1 und der U2 snrna. Zusammen mit der hohen Sequenzhomologie dieser Domäne zu den N-terminalen RRMs von U1-A und U2-B weisen diese Resultate auf eine evolutionäre Verwandtschaft zwischen 65K, U1-A und U2-B hin und darauf, dass einige Proteine des U12-abhängigen Spleißosoms direkt aus denen des U2-abhängigen Spleißosoms (oder umgekehrt) entstanden sein könnten. Studien mit verkürzten Transkripten der U12 snrna zeigten darüber hinaus, dass die Bindestelle des 65K Proteins in der 3 -Hälfte von U12 lokalisiert sein muss. Entgegen der gegenwärtigen Vorstellung zur Sekundärstruktur der U12 snrna zeigten computergestützte Analysen, dass diese Region alternativ zu einer langen Stammstruktur mit einer hoch konservierten, terminalen Haarnadelschleife, bestehend aus sieben Nukleotiden, gefaltet werden kann. Chemische RNA-Strukturanalysen durch Blei-induzierte Spaltung unterstützen dieses alternative Modell, welches phylogenetisch hoch konserviert ist. Zusätzlich demonstrierten Bindungsstudien mit synthetischen RNA-Oligonukleotiden, dass das 65K Protein in sequenzspezifischer Weise an diese Loop-Struktur bindet. Interessanterweise interagiert die N-terminale Hälfte von 65K zusätzlich mit dem U11-assoziierten 59K Protein, wie in vitro und in vivo Bindungsanalysen ergaben. Diese Resultate lassen darauf schließen, dass beide Proteine wichtige Funktionen für die Bildung und die Stabilität des U11/U12 di-snrnps, sowie eine wichtige Rolle für die Bildung der molekularen Brücke und so für die Paarung der Spleißstellen einnehmen. Die vorliegende Arbeit liefert erste Einblicke in die strukturelle Organisation des U11/U12 di-snrnp Partikels und vermittelt eine Vorstellung von dem komplexen Netzwerk an Protein/Protein- und Protein/RNA-Interaktionen, die zur Bildung des di-snrnps und der Paarung der Spleißstellen beitragen.

11 2. Einleitung 3 2. Einleitung In eukaryontischen Zellen beginnt die Genexpression im Zellkern mit der Transkription der genetischen Informationen von der DNA zur prä-mrna (prä-messenger RNA). Diese prä-mrna besteht zum größten Teil aus nichtkodierenden Sequenzen, den Introns, die den kodierenden Exons zwischengeschaltet sind. Zur Erhaltung des natürlichen Leserahmens und der Bildung reifer, funktioneller mrna ist die präzise Entfernung der Introns und die Ligation der flankierenden Exons essentiell. Diese Prozessierung des Primärtranskripts bezeichnet man als prä-mrna Spleißen (engl.: splicing) das von einem dynamischen Multienzym-Komplex, dem Spleißosom katalysiert wird. Das Spleißosom setzt sich aus mehreren Ribonukleoproteinpartikeln, den U snrnps (engl.: uridine-rich small nuclear ribonucleoprotein particles) zusammen. Gemeinsam mit nicht-partikel-spezifischen Faktoren lagern sich die U snrnps in einer definierten Reihenfolge auf dem prä-mrna Substrat zusammen und bilden schließlich das katalytisch aktive Spleißosom. 2.1 Das prä-mrna Spleißen Die Konsensussequenzen zweier Klassen von prä-mrna Introns Die Entfernung von Introns aus einem mrna Vorläufer erfordert äußerste Präzision, wobei die genaue Erkennung der Intron/Exon-Grenzen durch die spleißosomalen Komponenten einen kritischen Schritt darstellt. Nur geringfügige Fehler können die Bildung nicht-funktioneller mrnas zur Folge haben. Introns enthalten hoch konservierte Rahmensequenzen an der 5 - und 3 -Spleißstelle, sowie dem Verzweigungspunkt, die für die Erkennung und die Assemblierung des Spleißosoms essentiell sind (Abb. 2.1). Die meisten prämrna-introns folgen der sogenannten GT-AG-Regel, welche sich auf die beiden ersten und letzten Nukleotide der Sequenz bezieht. Die 5 -Spleißstelle (5 -ss) umfasst acht konservierte Nukleotide mit der Konsensussequenz AG/GURAGU (Abb, 2.1, oberes Schema). Im Gegensatz zu Hefen (S. cerevisiae), in denen nahezu die gesamte 5 -Spleißstelle invariant ist, ist diese in höheren Eukaryonten weniger konserviert. Die 3 -Spleißstelle (3 -ss) setzt sich aus drei Komponenten zusammen: dem Verzweigungspunkt, dem

12 2. Einleitung 4 Polypyrimidintrakt und der eigentlichen 3 -ss (YAG/G) (Reed, 1989). Der Verzweigungspunkt mit der Konsensussequenz YNYURAC liegt Nukleotide vor dieser, wobei der wichtigste Bestandteil ein hoch konserviertes Adenosin ist. Während der Rest der Sequenz in höheren Eukaryonten nur geringer Konservierung unterliegt, ist diese Region in Hefen mit der Konsensussequenz UACUAAC nahezu invariabel (Lin et al., 1985). Die geringere Konservierung der 5 -Spleißstelle in höheren Eukaryonten wird durch ein zusätzliches Element, dem zwischen 3 -ss und Verzweigungspunkt gelegenen Polypyrimidintrakt teilweise kompensiert. Die hier beschriebenen Introns werden vom majoren Spleißosom erkannt und nach der U2 snrna, die als eine der ersten Komponenten mit der prä-mrna interagiert als U2-abhängige Introns bezeichnet. Abbildung 2.1 Die Konsensussequenzen der Introns. Der obere Abschnitt zeigt die Konsensussequenzen der U2-abhängigen Introns von Metazoen und Hefen, der untere ein Intron vom U12-Typ. Die Position der 5 - und 3 -Spleißstelle, des Verzweigungspunkts und des Polypyrimidintrakts (Yn) sind angegeben. Hoch konservierte Nukleotide, wie das Adenosin des Verzweigungspunkts wurden hervorgehoben. Y oder R kennzeichnen Pyrimidine oder Purine, N steht für ein beliebiges Nukleotid. Exons: Boxen; Introns: Linien. Die Zahlenwerte über den Introns informieren über die durchschnittliche Länge in Nukleotiden (Nt). Vor etwa 15 Jahren, nach der Sequenzierung der ersten Introns, wurde eine neue Gruppe in eukaryontischen Kernen entdeckt, die der GU-AG-Regel nicht folgen (Abb. 2.1, unteres Schema)(zusammengefasst in Tarn & Steitz, 1997; Wu & Krainer, 1999). Diese werden von den terminalen Dinukleotiden AT-AC

13 2. Einleitung 5 flankiert (Hall & Padgett, 1994) und somit auch als ATAC -Introns bezeichnet. Solche Introns können in vielen Genen verschiedener Vertebratenklassen, wie Fische, Amphibien, Vögel und Säuger und auch in Pflanzen identifiziert werden, fehlen aber z. B. in Hefen und Nematoden (Burge et al., 1998). Später wurde bekannt, dass einige AT-AC -Introns auch GT-AG-Enden besitzen (Dietrich et al., 1997). Innerhalb der intronischen Sequenz sind konservierte Abschnitte zu finden, die nicht den U2-abhängigen Introns entsprechen. So unterliegen die Konsensussequenzen an der 5 -Spleißstelle (AUAUCCUUU) und dem Verzweigungspunkt (UCCUUAAC) wesentlich höherer Konservierung als die der U2-abhängigen Introns. Außerdem fehlt ihnen, der charakteristische Polypyrimidintrakt (Burge et al., 1998). Die Konsensussequenz des Verzweigungspunkts wird von der U12 snrna erkannt, was zur Bezeichnung dieser Introns als U12-abhängige Introns führte (Dietrich et al., 1997). Nur 0.4% aller humanen Introns sind vom U12-Typ (Burge et al., 1998; Levine & Durbin, 2001) und werden vom U12-abhängigen oder minoren Spleißosom entfernt. Die Spleißreaktion der seltenen U12-abhängigen Introns, welche im selben Gen mit den U2-abhängigen Introns ko-existieren können, verläuft wesentlich langsamer und stellt somit einen geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Genexpression dar (Patel et al., 2002) Die katalytischen Transesterifizierungsreaktionen Chemisch gesehen stellt der Spleißprozess zwei aufeinanderfolgende Transesterifizierungsreaktionen dar (Guthrie & Patterson, 1988; Moore et al., 1993). Der Mechanismus der Spleißreaktion ist in Abbildung 2.2 zusammengefasst. Der erste katalytische Schritt beinhaltet die Spaltung der prä-mrna an der 5 -Intron/Exon-Grenze. Diese resultiert aus dem nukleophilen Angriff auf die Phosphodiesterbindung der 5 -Spleißstelle durch die 2 -Hydroxylgruppe des hoch konservierten Verzweigungspunkt-Adenosins. Dadurch wird das 5 -Ende des Introns an den Verzweigungspunkt (engl.: branch point) geknüpft. Die dabei entstehende intronische Lassostruktur (engl.: intron lariat) ist zu diesem Zeitpunkt noch mit dem Exon 2 verbunden. Im zweiten Schritt erfolgt die Spaltung der 3 -Intron/Exon-Grenze durch den nukleophilen Angriff des freien

14 2. Einleitung 6 3 -Hydroxyls von Exon 1, woraus die Ligation der Exons zur fertig prozessierten mrna resultiert. Das Intronlariat wird freigesetzt und abgebaut, während die reife mrna aus dem Kern exportiert und der Proteinbiosynthese zugeführt wird. Abbildung 2.2 Die katalytischen Schritte der Spleißreaktion. Im ersten Schritt der Spleißreaktion erfolgt der nukleophile Angriff der 2 -OH-Gruppe des Verzweigungspunkt- Adenosins an die Phosphodiesterbindung der 5 -Spleißstelle. Dabei entstehen als Spleißintermediate das freie Exon 1 und die Intronlariat/Exon 2 Struktur. Im zweiten Schritt erfolgt der nukleophile Angiff durch die 3 -OH-Gruppe des Exon 1 auf die Phosphodiesterbindung der 3 -Spleißstelle. Die Exons werden miteinander ligiert und das Intronlariat wird freigesetzt. 2.2 Das U2-abhängige oder majore Spleißosom Die majoren U snrnps Die U snrnps übernehmen die Erkennung der Spleißstellen und tragen zu der für die Katalyse essentiellen Faltung des prä-mrna Substrats bei. Es handelt sich dabei um kleine Protein/RNA-Komplexe, die bisher in allen

15 2. Einleitung 7 eukaryontischen Zellen gefunden wurden. Man unterscheidet vier U snrnps, U1, U2, U4/U6 und U5, die die Bausteine des sogenannten U2-abhängigen oder majoren Spleißosoms darstellen. Die U snrnps enthalten ein (U1, U2 und U5) oder zwei (U4/U6) snrna-moleküle und sowohl gemeinsame, als auch partikel-spezifische Proteine Die majoren U snrnas Die spleißosomalen Uridin-reichen, kleinen nukleären RNAs (engl.: uridinerich small nuclear ribonucleic acids, U snrnas) sind im Kern lokalisiert und umfassen im humanen System eine Länge von 106 bis maximal 187 Nukleotiden. Mit 1x 10 6 Kopien pro Zelle sind die humanen U1, U2, U4, U5 und U6 snrnas sehr abundant. Mit Ausnahme von U6 sind alle Produkte der RNA-Polymerase II und zeichnen sich durch eine 2,2,7-Trimethylguanosin-Kappenstruktur (engl.: m 3 G-cap) am 5 -Ende aus. Charakteristische Merkmale sind neben einem hohen Uracilgehalt die konservierten Sm-Bindestellen (Konsensus: PuAU 4-6 GPu), an der die gemeinsamen Sm-Proteine binden (Branlant et al., 1982). Die U6 snrna stellt als Produkt der RNA- Polymerase III mit einer einfachen γ-methylkappenstruktur eine Ausnahme dar (Singh & Reddy, 1989), der darüber hinaus die Sm-Bindestelle fehlt. Die Primärsequenzen der jeweiligen U snrnas variieren zwischen verschiedenen Organismen, wohingegen die Sekundärstrukturen phylogenetisch hoch konserviert sind. Abbildung 2.3 zeigt die postulierten Sekundärstrukturen der majoren humanen U snrnas, wobei es sich um dynamische Strukturen handelt, die sich in machen Fällen während der Zusammenlagerung des Spleißosoms und der Katalyse verändern. Charakteristisch für alle snrnas ist die Ausbildung mehrerer Haarnadelschleifen, die durch einzelsträngige Bereiche miteinander verbunden sind und potentielle Bindestellen für spezifische Proteine darstellen. U4 und U6 interagieren durch Basenpaarung unter Ausbildung des U4/U6-Duplex (Brow & Guthrie, 1988; Hashimoto & Steitz, 1984). Die Katalyseschritte der Spleißreaktion werden wahrscheinlich durch die snrnas gesteuert (Yean et al., 2000), welche an definierte Sequenzen der prä-mrna binden, untereinander Basenpaarungen eingehen können und somit das katalytische Zentrum des Spleißosoms bilden.

16 2. Einleitung 8 Abbildung 2.3 Die U snrnas des U2-abhängigen Spleißosoms. Dargestellt sind die Primärsequenzen und Sekundärstrukturen der humanen U snrnas des U2-abhängigen Spleißosoms (nach Guthrie & Patterson, 1988). Die konservierte Sm-Proteinbindestelle ist markiert.

17 2. Einleitung Die snrnp-proteine des U2-abhängigen Spleißosoms Zusätzlich zu den RNA-Komponenten übernehmen Proteine essentielle Aufgaben im Spleißprozess (Krämer, 1996). Neuere massenspektrometrische Studien haben ergeben, dass das majore Spleißosom über etwa 150 Proteine verfügt (zusammengefasst in Jurica et al., 2002). Zusammen mit einer U snrna ist eine Vielzahl von Proteinen an der Bildung eines jeweiligen U snrnps beteiligt. Dabei unterscheidet man gemeinsame Proteine, die in allen snrnps vorkommen von snrnp-spezifischen Faktoren, die nur mit bestimmten snrnps assoziiert vorliegen. Neben den spezifischen Faktoren werden mehrere nicht-snrnp Proteine für die Spleißreaktion benötigt (zusammengefasst in Burge et al., 1999; Will & Lührmann, 2001). In Tabelle 2.1 ist die Proteinzusammensetzung der humanen snrnps des U2-abhängigen Spleißosoms aufgeführt Gemeinsame Proteine der snrnps Alle majoren U snrnps mit Ausnahme von U6 besitzen den gleichen Satz an sieben Sm-Proteinen B/B, D1, D2, D3, E, F und G mit Molekulargewichten von 9 bis 29 kd (Lehmeier et al., 1990). Diese nehmen eine wesentliche Rolle bei der snrnp-biogenese ein und vermitteln den Import der Partikel in den Zellkern (Fischer & Lührmann, 1990). Die Sm-Proteine lagern sich zu einer heptameren Ringstruktur zusammen, die an der Sm-Bindestelle (engl.; Smsite) der U snrnas anlagert und so die Sm-Core Domäne bildet (Hermann et al., 1995; Kambach et al., 1999; Raker et al., 1999, 1996). Hierauf folgt die Hypermethylierung der Kappenstruktur (Mattaj, 1986) und der Import der Sm- Core Domäne in den Zellkern, wo sich die snrnp-spezifischen Proteine anlagern. Die Sm-Proteine werden für die Assoziation einiger spezifischer Proteine benötigt (Nelissen et al., 1994). Das U6 snrnp verfügt über einen Satz von sieben Sm-ähnlichen, den sogenannten LSm-Proteinen 2-8 (LSm: engl.: like Sm; (Achsel et al., 1999; Salgado-Garrido et al., 1999; Vidal et al., 1999), die ebenfalls eine heptamere Ringstruktur bilden, welche am 3 -Ende der U6 snrna anlagert. Interessanterweise stellen die Sm-Proteine Epitope für einen Antiköper dar, der bei der Autoimmunkrankheit Systemischer Lupus Erythematodes identifiziert wurde (Lerner & Steitz, 1979). Die Bezeichnung

18 2. Einleitung 10 Sm leitet sich dabei von dem Namen derjenigen Patientin (Smith) ab, bei der der Antikörper zuerst beschrieben wurde Die U snrnp-spezifischen Proteine Die U snrnps des U2-abhängigen Spleißosoms besitzen eine individuelle Anzahl an spezifischen Proteinen, die essentiell zur Assemblierung des Spleißosoms auf der prä-mrna und zur Katalyse der Spleißreaktion beitragen. Im Folgenden werden die Proteine der einzelnen humanen U snrnps beschrieben. Das U1 snrnp sedimentiert mit einem Koeffizienten von 12S im Glyzeringradienten. Mit nur drei spezifischen Proteinen (U1-C, U1-A, U1-70K) stellt es das kleinste spleißosomale snrnp dar. U1-70K und U1-A binden direkt an die Stem-Loops I und II der U1 snrna (Scherly et al., 1989; Surowy et al., 1989). Das U1-A Protein ist eine der am besten charakterisierten spleißosomalen Komponenten. Verschiedene biochemische und kristallographische Studien beschreiben detailliert die Interaktion dieses Faktors, der über das N-terminale RNA-Erkennungsmotiv (RRM) in sequenzspezifischer Weise den Stem-Loop II der U1 snrna erkennt und bindet. U1-C hingegen steht nicht in direktem Kontakt mit der U1 snrna, sondern assoziiert stabil über Interaktionen mit U1-70K und den Sm-Proteinen mit dem Partikel (Nelissen et al., 1994). U1-70K und U1-C spielen wichtige funktionelle Rollen bei der Erkennung der 5 -Spleißstelle und erleichtern die Interaktion des U1 snrnps mit dieser. U1-70K unterstützt die Assoziation von U1 durch Interaktionen mit SR-Proteinen, die direkt an die prä-mrna binden (Kohtz et al., 1994). U1-C bindet direkt an die 5 -Spleißstelle der prä-mrna (Du & Rosbash, 2002). Das 17S U2 Partikel verfügt über 19 spezifische Proteine und stellt die funktionell aktive Form des U2 snrnps dar (Behrens et al., 1993). Neben den Sm-Proteinen und den U2-spezifischen Proteinen U2-A und U2-B ist dieses Partikel durch die beiden heteromeren Spleißfaktoren SF3a und SF3b, sowie sieben substöchiometrisch vorliegende Proteine (SPF30, SPF31, SPF45, hprp5, hprp43, CHERP und SR140; nicht gezeigt) charakterisiert (Behrens et al., 1993; Brosi et al., 1993a, b; Das et al., 1999; Will et al., 2002).

19 2. Einleitung 11 Tabelle 2.1 Die Proteinkomposition der majoren U snrnps. Dargestellt sind die gemeinsamen und spezifischen Proteine der majoren snrnps (nach Kastner & Lührmann, 1999). Die gemeinsamen Sm-Core-Proteine sind gelb gekennzeichnet, die LSm- Proteine orange. Die Proteine U2-A und U2-B bilden in vivo ein Dimer, welches an die Loop-Struktur IV der U2 snrna bindet und zusammen mit den Sm-Proteinen die stabile 12S Grundform des U2 snrnps darstellt. Die Zusammenlagerung des funktionellen Partikels erfolgt in zwei Schritten, wobei zunächst SF3b an den 12S U2 snrnp bindet. Die folgende Anlagerung von SF3a überführt dieses Intermediat in den 17S U2 snrnp. Der SF3a Komplex setzt sich aus drei Proteinen mit Molekulargewichten von 120, 66 und 60 kda zusammen. Gemeinsam mit den sieben Proteinen des SF3b Komplexes (SF3b155, SF3b145, SF3b130, SF3b49, p14, SF3b14b und SF3b10) unterstützen diese Faktoren die Bindung des U2 snrnps an den Verzweigungspunkt (Brosi et al., 1993a, b; Gozani et al., 1996). Das 25S U4/U6.U5 tri-snrnp setzt sich in Energie-unabhängiger Weise aus dem 13S U4/U6 di-partikel und dem 20S U5 snrnp zusammen (Black & Pinto, 1989). In aufgereinigtem tri-snrnp wurden etwa 30 verschiedene Proteine identifiziert (zusammengefasst in Will & Lührmann, 1997). Zusätzlich zu zwei Sätzen von Sm-Proteinen, die mit U4 und U5 assoziiert sind enthält das tri-snrnp die sieben LSm-Proteine des U6 snrnps (Achsel et al., 1999; Salgado-Garrido et al., 1999). Fünf weitere Proteine mit Molekulargewichten von 90, 61, 60, 20 und 15.5 kda sind U4/U6 assoziiert (Lauber et al., 1997;

20 2. Einleitung 12 Makarova et al., 2002; Nottrott et al., 1999; Teigelkamp et al., 1998). Mit Ausnahme des 52K Proteins sind zudem sämtliche U5-spezifischen Proteine mit den jeweiligen Molekulargewichten von 15, 40, 100, 102, 110, 116, 200 und 220 kda (Bach et al., 1989) mit dem tri-snrnp assoziiert. Desweiteren wurden drei tri-snrnp-spezifische Faktoren 27, 65 und 110 kda identifiziert, die mit der Familie der SR-Proteine verwand sind (Fetzer et al., 1997; Makarova et al., 2001) Nicht-snRNP Proteine Nicht-U snrnp Faktoren nehmen wichtige Funktionen bei der Assemblierung des Spleißosoms sowie der Katalyse ein. Eine wichtige Gruppe von nichtsnrnp Faktoren, sind die Proteine der SR-Familie (zusammengefasst in Fu, 1993), die die Rekrutierung der einzelnen snrnps in den frühen Assemblierungsstadien unterstützen. Die klassischen SR-Proteine sind durch den Besitz einer oder mehrerer RRMs am N-Terminus, sowie durch Sequenzabschnitte mit einem hohen Gehalt an repetitiven Serin-Arginin Dipeptiden (SR-Motiv) im C-terminalen Bereich charakterisiert (Birney et al., 1993; Graveley, 2000). SR-Domänen sind hoch phosphoryliert (Roth et al., 1990; Screaton et al., 1995; Zahler et al., 1993), wobei der Phosphorylierungsstatus entscheidend für die Proteinaktivität in vivo ist. Aufgrund ihrer modularen Struktur können diese Faktoren über das RRM an die prä-mrna binden und simultan über das SR-Motiv mit anderen Proteinen interagieren. Serin/Argininreiche Regionen sind auch in nicht SR-Faktoren zu finden, wie zum Beispiel U1-70K (Mancebo et al., 1990; Theissen et al., 1986) und in beiden Untereinheiten von U2AF (Zamore et al., 1992; Zhang et al., 1992). Diese nicht-snrnp Faktoren, die ebenfalls essentiell für das Spleißen sind, werden daher auch als SR-verwandte Proteine bezeichnet Die Assemblierung des U2-abhängigen Spleißosoms Bei jedem Spleißvorgang wird das Spleißosom de novo auf dem entsprechenden Intron schrittweise gebildet (Reed & Palandjian, 1997). Durch multiple Interaktionen zwischen den spleißosomalen Proteinen und der prämrna, sowie den snrnas und der prä-mrna erfolgt die spezifische Erkennung der intronischen Rahmensequenzen.

21 2. Einleitung 13 Abbildung 2.4 Die Assemblierung des U2-abhängigen Spleißosoms. (zur Verfügung gestellt von Dr. B. Kastner, AG Lührmann). Die Spleißreaktion wird durch die Interaktion des U1 snrnps an die 5 -Spleißstelle durch Basenpaarung initiiert (E-Komplex). Währenddessen ist das U2 snrnp locker mit der prä-mrna assoziiert. Der A-Komplex wird durch die stabile Bindung des U2 snrnps an den Verzweigungspunkt gebildet. Durch den Eintritt des tri-snrnps (B-Komplex) erfolgt eine Reihe struktureller Umwandlungen, die die Dissoziation von U1 und U4 zur Folge haben und das Prä-Spleißosom in eine katalytisch aktive Form überführen. Im C-Komplex ist der erste Katalyseschritt bereits erfolgt. Nach dem zweiten Schritt werden das Intronlariat und die reife mrna freigesetzt. Die spleißosomalen Komponenten dissoziieren und werden für einen neuen Spleißzyklus regeneriert. Der erste Schritt in der Zusammenlagerung des Spleißosoms ist die Energieunabhängige Bildung des E-Komplexes (engl.; early complex; Abb. 2.4). Diese wird durch die Basenpaarung des 5 -Endes der U1 snrna mit der 5 -Spleißstelle (5 -ss) initiiert (Zhuang & Weiner, 1986). Die Assoziation von U1 wird durch die U1-spezifischen Proteine 70K und C, sowie durch Proteine der SR-Familie stabilisiert (Du & Rosbash, 2002; Heinrichs et al., 1990; Kohtz et al., 1994; siehe auch ). Die nachfolgende Bindung des U2 snrnps an den Verzweigungspunkt erfolgt in ATP-abhängiger Weise und führt zur Bildung des Prä-Spleißosoms (A-Komplex) (zusammengefasst in Reed & Palandjian, 1997). Die Assoziation des U2 snrnps durch Basenpaarung des 5 -Endes der U2 snrna mit dem Verzweigungspunkt wird durch U2AF

22 2. Einleitung 14 vermittelt (Ruskin et al., 1988; Valcarcel et al., 1996). Zusätzlich wird die Anlagerung des U2 snrnps durch die Interaktion des SF3a und SF3b Komplexes mit der prä-mrna in der Nähe des Verzweigungspunkts verstärkt (Gozani et al., 1996). Während der frühen Assemblierungsschritte wird zwischen dem U1 snrnp, sowie dem Spleißfaktor SF1/mBBP und der großen Untereinheit von U2AF (U2AF65), welche kooperativ an Verzweigungspunkt und Polypyrimidintrakt binden eine molekulare Brücke gebildet, die die Interaktion des U1 snrnps an die 5 -Spleißstelle stabilisiert (Kohtz et al., 1994; Reed, 1996; Wu & Maniatis, 1993). Proteine der SR-Familie spielen bei diesem als Intron- Bridging bezeichneten Prozess eine entscheidende Rolle (Abb. 2.5). Über die SR-Domäne interagiert das SR-Protein ASF/SF2 simultan mit snrnp- Komponenten, wie U1-70K und U2AF35, welches über U2AF65 an den Verzweigungspunkt gebunden ist (zusammengefasst in Krämer, 1996). Durch diese multiplen Interaktionen werden die 5 - und 3 -Spleißstelle in räumliche Nähe gebracht. Nach der stabilen Integration des U2 snrnps im A-Komplex, wird SF1/mBBP deplaziert und weicht einer Reihe neuer Interaktionen. Neuste Studien haben gezeigt, dass das U2-assoziierte DEAD-box Protein Prp5 in diesem Stadium eine wichtige Rolle bei der Verknüpfung des U1 und U2 snrnps einnimmt (Xu et al., 2004). Die genauen Prozesse, die zur Paarung der Spleißstellen beitragen sind jedoch nicht bekannt. Abbildung 2.5 Das Intron Bridging. SR-Protein-Netzwerk während der frühen Zusammenlagerung des Spleißosoms (nach Will & Lührmann, 1997). Die Interaktion des U1 snrnps mit der 5 -Spleißstelle wird durch externe Faktoren, wie Proteine der SR-Familie stabilisiert. Nicht-snRNP Proteine sind an der Ausbildung einer molekularen Brücke beteiligt, die die Intronenden in räumliche Nähe bringen.

23 2. Einleitung 15 Die anschließende Anlagerung der U4/U6 und U5 snrnps - in Form des U4/U6.U5 tri-snrnps - führt zur Bildung des reifen Spleißosoms (B-Komplex). Vor der eigentlichen Spleißreaktion veranlasst ein ausgedehntes Netzwerk an snrna-snrna und snrna-prä-mrna-interaktionen dynamische Wechsel, die die Auflösung der Basenpaarung zwischen U1 und der 5 -Spleißstelle (5 -ss), sowie U4 und U6 bewirken und die Destabilisierung des U1 und U4 snrnps zur Folge haben (zusammengefasst in Nilsen, 1998; Staley & Guthrie, 1998). Nach der Dissoziation des U4 snrnps nimmt die U6 snrna eine neue Konformation an, welche eine Basenpaarung mit der U2 snrna und der 5 -ss ermöglicht. Das katalytisch aktive Spleißosom (B*-Komplex) entsteht schließlich durch die Bildung der U6/U2-Helix und der U6/5 -ss Interaktion, welche die 5 -ss und den Verzweigungspunkt in räumliche Nähe bringen (Abb. 2.6) (Madhani & Guthrie, 1994; Yean et al., 2000). Der C-Komplex, in dem der erste Katalyseschritt bereits abgeschlossen ist, besteht aus den U2, U5 und U6 snrnps (zusammengefasst in Reed & Palandjian, 1997). Nach Vollendung des zweiten Schritts, dissoziieren die spleißosomalen Komponenten und werden für einen neuen Spleißzyklus regeneriert. Das Intronlariat wird vollständig abgebaut (Ruskin & Green, 1985), während die reife mrna ins Cytoplasma transportiert und der Proteinbiosynthese zugeführt wird. Abbildung 2.6 Das RNA-Netzwerk des majoren und minoren Spleißosoms. (nach Will et al., 1995) Dargestellt sind die RNA/RNA- Interaktionen im katalytischen Zentrum nach der ersten Transesterifizierungsreaktion. Oben: U2-abhängiges Spleißosom; unten: U12-abhängiges Spleißosom. Boxen repräsentieren Exons, das Intron (ausgenommen der konservierten Sequenzen an 5 - und 3 -Spleißstelle, sowie Verzweigungspunkt) ist als breite Linie gekennzeichnet.

24 2. Einleitung Das U12-abhängige oder minore Spleißosom Mit der Existenz der U12-abhängigen Introns wurde ein neues, ebenso selten vorkommendes Spleißosom, das minore oder U12-abhängige Spleißosom klassifiziert (Hall & Padgett, 1996; Tarn & Steitz, 1996a, b). Erste Analysen deckten bezüglich Komposition und Assemblierung Parallelen zum majoren Spleißosom auf. Auch hier bilden fünf snrnps den aktiven Komplex. Die snrnps U11 und U12 sind funktionell analog zu den U1 und U2 snrnps des majoren Spleißosoms, während U4atac/U6atac analog zum U4/U6 snrnp ist (Hall & Padgett, 1996; Kolossova & Padgett, 1997; Tarn & Steitz, 1996a, b; Yu & Steitz, 1997). Der U5 snrnp hingegen ist beiden Spleißosomen gemeinsam. Die bisherigen biochemischen Untersuchungen belegen, dass die Chemie der Spleißreaktion ähnlich zum U2-abhängigen System über den bereits beschriebenen 2-Schritt-Mechanismus verläuft (zusammengefasst in Patel & Steitz, 2003). Außerdem existieren Hinweise darauf, dass beide Spleißosomen, abgesehen von geringen Ausnahmen, in vergleichbarer Weise auf der prä-mrna assemblieren. U11 ist für die Erkennung der 5 -Spleißstelle verantwortlich, während U12 an den Verzweigungspunkt bindet. Die folgende Anlagerung des tri-snrnps (U4atac/U6atac.U5) führt auch hier zur Bildung des funktionell aktiven Apparats Die minoren U snrnas Die U snrnas des U12-abhängigen Spleißosoms sind strukturell und funktionell analog zu denen des majoren Apparats (Hall & Padgett, 1996; Incorvaia & Padgett, 1998; Kolossova & Padgett, 1997; Tarn & Steitz, 1996a, b; Yu & Steitz, 1997), aber sehr viel weniger abundant (1x x 10 3 Kopien/Zelle). Mit Ausnahme von U6atac besitzen auch sie eine Sm- Bindestelle, sowie eine Trimethylguanosinkappe und sind Transkripte der RNA-Polymerase II. U6atac ist ein Produkt der RNA-Polymerase III und besitzt eine einfache γ-monomethylkappe und keine Sm-Bindestelle (Tarn & Steitz, 1996a, b). Anders als die majoren U snrnas werden die des U12-abhängigen Spleißosoms aber nur geringfügig posttranskriptionell modifiziert (Pseudouridinylierung und 2 -O-Methylierung)(Massenet & Branlant, 1999). Während sich die Primärsequenzen der minoren U snrnas deutlich von denen der

25 2. Einleitung 17 majoren snrnas unterscheiden, werden die Sekundärstrukturen weitgehend nachgeahmt (vergl. Abb. 2.3 mit 2.7). So spiegelt beispielsweise U11 die für die U1 snrna typische Kleeblattstruktur wider und unterscheidet sich nur in Länge und Primärsequenz von dieser. U4atac/U6atac prägen in gleicher Weise, wie U4/U6 durch Basenpaarung eine Y-Struktur aus und gehören einem di-partikel an. Die Sekundärstrukturen scheinen generell hoch konserviert zu sein, wobei die erst kürzlich identifizierte U11 snrna von Drosophila mit einer außergewöhnlichen Länge eine interessante Ausnahme bildet (Schneider et al., 2004). Abbildung 2.7 Die U snrnas des U12-abhängigen Spleißosoms. Dargestellt sind die Primärsequenzen und Sekundärstrukturen der humanen U snrnas des U12-abhängigen Spleißosoms. Während die Sekundärstrukturen die Faltung der U snrnas des U2-abhängigen Spleißosoms nachahmen, unterscheiden sich die Primärsequenzen grundlegend. Die Sm-Bindestelle ist markiert. (U11, U12: nach Wassarman & Steitz, 1992; U4atac/U6atac: nach Shukla et al., 2002.

26 2. Einleitung Proteinzusammensetzung der snrnps Im Gegensatz zum U2-abhängigen Spleißosom ist die Proteinkomposition des minoren Apparats weniger gut charakterisiert. Informationen hierzu wurden erst durch die Untersuchung einzelner Untereinheiten, wie dem 18S U11/U12-Komplex und dem minoren tri-snrnp-komplex erlangt (siehe Tabelle 2.2) Gemeinsame Proteine der snrnps Wie im U2-abhängigen Spleißosom sind in jedem snrnp mit Ausnahme von U6atac die sieben gemeinsamen Sm-Proteine zu finden (Montzka & Steitz, 1988; Tarn & Steitz, 1996b). Die U6atac snrna besitzt wie U6 eine Oligo(U)- Sequenz am 3 -Ende und wird von den sieben LSm-Proteinen 2-8 gebunden (Schneider et al., 2002) Die U snrnp-spezifischen Proteine Der Hauptbestandteil an U11 und U12 snrnps in Zellkernextrakt liegt vornehmlich komplexiert vor und sedimentiert als U11/U12 di-snrnp Partikel im 18S Bereich eines Glyzeringradienten (Montzka & Steitz, 1988). U11 existiert daneben als Monopartikel im 12S Bereich, während das 15S U12-Monopartikel nur in Spuren zu finden ist. Durch Affinitätschromatographie mit einem biotinylierten Oligonukleotid, komplementär zu den 5 -Enden der U11 oder U12 snrna (Will et al., 1999), konnten die wenig abundanten U11-Monopartikel oder U11/U12 di-snrnps spezifisch isoliert und angereichert werden. Bei der Untersuchung der Proteinkomposition durch Massenspektrometrie (MALDI; Matrix-assisted Laser Desorption/Ionisation), wurden etwa 20 verschiedene Proteine identifiziert, von denen viele vom U2-abhängigen Apparat bekannt sind und folglich von beiden Spleißosomen geteilt werden. So wurden zusätzlich zu den acht Sm-Proteinen alle Untereinheiten des SF3b Komplexes identifiziert (Will et al., 1999), was darauf hindeutet, dass einige Interaktionen, die zur Erkennung des Verzweigungspunkts beitragen, konserviert sind. Zusätzlich wurden substöchiometrische Mengen der U2-assoziierten Proteine hprp43, Urp und Y-box 1 detektiert (nicht gezeigt; Will et al., 2004). Der SF3a Komplex hingegen ist nicht mit dem U11/U12-snRNP assoziiert. Sieben neue Proteine, 65K, 59K, 48K, 35K, 31K,

27 2. Einleitung 19 25K und 20K, wurden für den di-snrnp identifiziert. Diese sind nicht im U2-abhängigen Spleißosom zu finden und gelten somit als U11/U12- spezifisch (Will et al., 2004). Erste Studien haben gezeigt, dass das 59K, 48K, 35K, und 25K Protein U11-assoziiert sind (Will et al., 2004). Die meisten dieser Proteine sind zwischen Vertebraten, Insekten und Pflanzen hoch konserviert, welches ein Indiz für ihre Bedeutung für den Prozess des U12-abhängigen Spleißens ist. Die Identifizierung U11/U12-spezifischer Proteine, sowie das Fehlen U1-spezifischer Proteine, die essentiell zur Stabilisierung der U1 snrnp/5 -ss-interaktion beitragen, impliziert dass viele derjenigen Protein/Protein und Protein/RNA-Wechselwirkungen, die die Erkennung der Spleißstellen und die Formierung des Prä-Spleißosoms vermitteln, nicht zwischen den beiden Spleißosomen konserviert sind. Tabelle 2.2 Die Proteinkomposition des 12S U11-Monopartikels und des 18S U11/U12 di-snrnps im Vergleich zu 12S U1 und 17S U2. Analog zum tri-snrnp des majoren Spleißosoms setzt sich das 25S U4atac/U6atac.U5 tri-snrnp aus dem 13S U4atac/U6atac di-partikel und dem U5 snrnp zusammen. Wie Immunpräzipitationen und in vitro Bindungsstudien gezeigt haben, ähneln sich die Proteinkompositionen beider tri-snrnp Komplexe ebenfalls weitgehend (Luo et al., 1999; Nottrott et al., 2002; Schneider et al., 2002). So interagiert beispielsweise das 15.5K Protein, welches an den 5 -Stem-Loop der U4 snrna bindet in vitro auch mit der entsprechenden Region der U4atac snrna. Die Existenz einer Vielzahl gemeinsamer snrnp- Proteine lässt auf eine evolutionäre Beziehung zu einem gemeinsamen Vorfahren schließen (Schneider et al., 2002).

28 2. Einleitung Nicht-snRNP Proteine Die Proteine der SR-Familie werden sowohl für das Spleißen von U2-, als auch von U12-abhängigen Introns benötigt, indem sie die Aktivitäten beider Apparate in ähnlicher Weise koordinieren (Hastings & Krainer, 2001). Diese Ähnlichkeiten deuten darauf hin, dass zumindest einige derjenigen SR- Proteine, die in diese Prozesse involviert sind von beiden Spleißosomen geteilt werden. Das Fehlen des Polypyrimidintrakts in U12-abhängigen Introns deutet darauf hin, dass U2AF höchst wahrscheinlich keine Rolle für das U12-abhängige Spleißen spielt. Ob andere nicht-snrnp-proteine im minoren Spleißosom zu finden sind, ist zur Zeit noch unklar Struktur der U11/U12-spezifischen Proteine Die meisten U11/U12-spezifischen Proteine enthalten Sequenzmotive, wie z.b. RNA-Erkennungsmotive, Arginin/Serin- oder Prolin-reiche Domänen sowie Zink-Finger-Motive (Abb. 2.8), die Rückschlüsse auf die potentiellen funktionellen Eigenschaften dieser Proteine erlauben. Kandidaten für direkte Interaktionen mit der U11 oder U12 snrna sind das 65K, 35K und 31K Protein, welche eine oder mehrere RNA-Bindungsdomänen aufweisen. Das RNA-Erkennungsmotiv (RRM; engl.: RNA recognition motif oder RNP-80 Motiv) ist ein gut studiertes Strukturmotiv, dass charakteristisch für die meisten RNA-bindenden Proteine ist (Burd & Dreyfuss, 1994; zusammengefasst in Varani & Nagai, 1998). RRMs umfassen 70 bis 100 Aminosäuren und sind meist in den terminalen Abschnitten einer Proteinsequenz lokalisiert. Diese Domänen sind durch zwei hoch konservierte Submotive, das RNP-1 Oktamer und das RNP-2 Hexamer charakterisiert, welche aus aromatischen Aminosäuren bestehen, die von hoch konservierten, meist hydrophoben Resten unterbrochen werden. Das Submotiv RNP-1 befindet sich etwa 30 Aminosäuren stromab (3 ) von RNP-2. Die Kristallstrukturen verschiedener Faktoren, wie U1-A und U2-B zeigen, dass das RRM ein typisches βαββαβ- Motiv aufweist, das zu einer viersträngigen antiparallelen β-faltblattstruktur gefaltet wird (zusammengefasst in Varani & Nagai, 1998). Dabei werden die beiden Submotive, welche für die RNA-Bindung essentiell sind, auf den

29 2. Einleitung 21 zentral gelegenen antiparallelen β-faltblättern einander gegenüber gestellt und bilden so die für die RNA zugängliche Oberfläche des Motivs. Abbildung 2.8 Die U11/U12-spezifischen Proteine tragen eine Vielzahl von Sequenzmotiven. (RRM: RNA-Erkennungsmotiv (RNA recognition motif); Pro: Prolin-reiche Region; Arg: Arginin-reiche Region; Gly: Glycin-reiche Region; ER/DR/SR-rich: Region reich an Glutamat-Arginin/Aspartat-Arginin/Serin-Arginin; C2H2: C2H2-Zink-Finger-Motiv; CCCH: CCCH-Zink-Finger-Motiv) Strukturelle Homologien zwischen U11/U12- und U1- oder U2- spezifischen Proteinen Interessanterweise spiegeln einige Proteine die generelle Domänenstruktur von U1 und U2 snrnp-assoziierten Faktoren wider (Abb. 2.9), was ein Indiz für eine funktionelle Analogie ist. So findet sich beispielsweise die generelle Domänenstruktur des 20K Proteins in der des U1-assoziierten C Proteins wieder. Zusätzlich zu einer Prolin-reichen Region am N-Terminus, sowie einer C-terminalen C2H2-Zink-Finger-Domäne verfügt der minore Faktor über ein weiteres CCCH-Zink-Finger-Motiv. Wie oben erwähnt, bindet U1-C nicht direkt an die U1 snrna, unterstützt aber die Basenpaarung der U1 snrna mit dem prä-mrna Substrat (siehe ). Das U11/U12-spezifische 35K Protein ist wesentlich kürzer, strukturell aber ähnlich aufgebaut, wie U1-70K des U2-abhängigen Spleißosoms. Das N-terminal lokalisierte RNA-Bindungsmotiv weist signifikante Homologien zur entsprechenden Domäne von U1-70K auf, während diese in der Argininreichen Domäne wesentlich schlechter ausgeprägt sind. U1-70K interagiert mit der Stem-Loop-Struktur I der U1 snrna und stabilisiert durch weitere Interaktionen mit SR-Proteinen die Wechselwirkung des U1 snrnps mit der

30 2. Einleitung Spleißstelle (vergl ). Die strukturellen Ähnlichkeiten mit dem U1-70K Protein deuten darauf hin, dass das 35K Protein RNA-bindende Aktivität besitzt und möglicherweise in entsprechende Interaktionen mit Faktoren der SR-Familie involviert sein könnte. Das 65K Protein verfügt über zwei terminal gelegene RNA-Bindungsdomänen, sowie eine zentral lokalisierte Prolin-reiche Region. Diese modulare Struktur teilt es mit dem U1-assoziierten A und dem U2-assoziierten B Protein (Sillekens et al., 1987). Letztere interagieren über das N-terminale RRM mit der U1 respektive U2 snrna, wobei U1-A an die Stem-Loop- Region II der U1 snrna bindet und U2-B in Form eines Dimers mit U2-A mit der Stem-Loop-Region IV der U2 snrna interagiert (Price et al., 1998; Scherly et al., 1990a, b). Zahlreiche biochemische und kristallographische Studien beschreiben detailliert die Interaktionen beider Faktoren mit der jeweiligen RNA (zusammengefasst in Varani & Nagai, 1998). Die hohe Homologie zwischen dem 65K Protein und U1-A und U2-B deuten auf eine vergleichbare Funktion des U11/U12-spezifischen Proteins hin. Abbildung 2.9 Ähnlichkeiten in der Domänenstruktur zwischen Proteinen des U2 und U12-abhängigen Spleißosoms deuten auf analoge Funktionsweisen hin. Das U11/U12-65K weist durch die Anwesenheit zweier N- und C-terminal lokalisierter RRMs eine ähnliche modulare Struktur wie U1-A und U2-B auf. U11/U12-35K besitzt ein RRM am N-Terminus, sowie eine C-terminale ER/DR/SR-reiche Domäne, die es mit U1-70K teilt. U11/U12-20K ist ein Zink-Finger-Protein, das im Gegensatz zu U1-C mit einer zweiten Zink-Finger-Domäne ausgestattet ist Die Assemblierung des U12-abhängigen Spleißosoms In den letzten Jahren konnten erste Erkenntnisse bezüglich der Ausbildung des U12-abhängigen Spleißosoms gewonnen werden. Tatsächlich ähnelt die

31 2. Einleitung 23 Assemblierungskaskade des minoren Spleißosoms grundsätzlich der des U2-abhängigen Komplexes und ahmt sie weitläufig nach. Auffallende Unterschiede spiegeln sich in den frühen Stadien der Spleißosomenassemblierung wider (Abb. 2.10). Die Zusammenlagerung des U2-abhängigen Spleißosoms wird durch die Basenpaarung der U1 snrna mit der 5 -Spleißstelle initiiert, gefolgt von der stabilen Interaktion des U2 snrnps mit dem Verzweigungspunkt, welche über den E-Komplex zur Bildung des Prä- Spleißosoms (A-Komplex) führt. Abbildung 2.10 Vergleich der Assemblierungskaskaden des U2- und U12-abhängigen Spleißosoms. Unterschiede sind hauptsächlich in den frühen Stadien zu erkennen.