PROBENVORBEREITUNG UND UMGANG MIT BIOLOGISCHEN MATERIALIEN
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- Elizabeth Kurzmann
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1 PROBENVORBEREITUNG UND UMGANG MIT BIOLOGISCHEN MATERIALIEN Gewebehomogenisierung Blender Potter Elvehjem Homogen isator Ultraschallhomogenisator Hochleistungshomogenisator 1
2 Blutabnahme und aufarbeitung Für größere Mengen an Blut: Venipunktion Blutabnahme und aufarbeitung Für größere Mengen an Blut: Venipunktion (einmalig) oder Katheder (venflow) 2
3 Blutabnahme und aufarbeitung Für größere Mengen an Blut: Venipunktion (einmalig) oder Katheder (venflow) Für kleinere Mengen: Kapillarblut (aus der Fingerspitze) Probennahme: Blut Gerinnungshemmung Heparinplasma (Li Heparin) EDTA Plasma (K2EDTA) Zitrat Plasma (3.8% Zitronensäure) Serum mit/ohne Trenngel 3
4 Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten Zentrifugation (bei relativ niedriger g Zahl) Eventuell Waschen Weitere Auftrennung (Differential(ultra)zentrifugation) Probennahme: Separation von Plasma und Erythrozyten 4
5 Probennahme: Auftrennung der Lipoproteine Differential(ultra)zentrifugation (Ch) Plasma VLDL NaBr- Lösung LDL HDL Probennahme: Auftrennung der Lipoproteine Differential(ultra)zentrifugation Trennung aufgrund der Dichte (Chylomikronen, VLDL, LDL, HDL) 5
6 Probenvorbereitung 1. Fettextraktion 2. Spurenelementanalytik 3. Festphasenextraktion (solid phase extraction, SPE) in Hinblick auf LC/MS Analysen 1. Fettextraktion Soxhlet Fettextraktion 6
7 1. Fettextraktion Automatische Extraktionsgeräte: Einzelne Schritte (Extraktion, Spülen und Trocknen) lassen sich programmieren Vorteil: die tatsächliche Anzahl an erforderlichen Extraktionszyklen wird auf jeder Position durchlaufen > reproduzierbare Extraktionsbedingungen 1. Fettextraktion Probenvorbereitung für die Analyse von Fettsäuren Fettextraktion eventuell HPTLC der Membranphospholipide Verseifung der Triglyceridester Reveresterung der freien Fettsäuren zu Methylfettsäureestern GC Analyse der Methylfettsäureester 7
8 1. Fettextraktion Rotationsverdampfer 1. Fettextraktion Accelerated Solvent Extraction (ASE) 8
9 1. Fettextraktion Accelerated Solvent Extraction (ASE) 2. Spurenelementanalytik Trockene Veraschung: Proben werden in geeigneten Gefäßen (Porzellan, Platin) unter Hitzezufuhr ( C) verascht Zur Bestimmung des Aschegehalts (Differenzwägung) Zur Bestimmung von Mengenelementen (Na, K, Ca, Mg) Ungeeignet für die Analyse von flüchtigen Spurenelementen (J, Se) 9
10 2. Spurenelementanalytik Trockene Veraschung: Muffelofen 2. Spurenelementanalytik Nasse Veraschung: Proben werden unter Zugabe eines Oxidationsmittels verascht (in der Regel eine Mischung aus H 2 O 2 und HNO 3 ) Aufschluss erfolgt durch Erhitzung in der Mikrowelle oder unter Hochdruck 10
11 2. Spurenelementanalytik Nasse Veraschung: Mikrowellenaufschlussgerät 2. Spurenelementanalytik Nasse Veraschung: Rotoren und Reaktionsgefäße für Mikrowellenaufschluß 11
12 2. Spurenelementanalytik Nasse Veraschung: Hochdruckaufschlussgerät 2. Spurenelementanalytik Probennahme ca. 5 g Lungengewebe von jedem Lungenlappen (Alveolare Region) L2 5 g Gewebe von Leber und Niere -> tiefgekühlt: -30 C -> gefriergetrocknet -> Mikrowellenaufschluss L3 L1 L4 L5 Probennahme 12
13 Probenvorbereitung menschliche Gewebe 0.5 g gefriergetrocknetes Gewebe gespiked mit 196 Pt, 108 Pd + 4 ml HNO ml H 2 O 2 Mikrowellenaufschluss 1 min/250w; 1min/0W; je 5 min 250W/400W/600W; 220 C Abrauchverfahren (offen) Einengen auf 500 µl µl HF + 2 ml HCl (37%) Isotopenverdünnungsanalyse ( 194 Pt/ 196 Pt; 195 Pt/ 196 Pt; 105 Pd/ 108 Pd; 106 Pd/ 108 Pd) Mikrowellenaufschluss 1h, 400W, 220 C Abrauchverfahren (offen) einengen auf 200 µl; + 2 ml aqua regia einengen auf 200 µl; + 1 ml HCl (37%) einengen auf 200 µl; + H 2 O subb; 5 ml Endvolumen Verdünnung vor dem Messen 1:4; ID ICP MS Analytisches set up Analytisches set up: USN 6000AT+ Element 1 Quantifizierung: IDMS ( 194 Pt/ 196 Pt, 195 Pt/ 196 Pt) spray chamber extraction lens plasma torch detector (SEM) electrostatic analyser magnetic sector field ICP SFMS skimmer cone sampler cone ion optics nebulizer 13
14 Probenvorbereitung Probenvorbereitung für spezielle chemische Anforderungen: PFA (Perfluoralkoxy; trade name: Teflon) Hochreines Polymer (Herstellung erfolgt unter Ausschluss von Weichmachern und Füllstoffen) sehr gute chemische Beständigkeit gegen fast alle Chemikalien hohe thermische Stabilität von 270 C bis +250 C extrem glatte Oberflächen herstellbar > leicht zu reinigen > keine memory Effekte autoklavierbar und sterilisierbar Probenvorbereitung Säure Ausdämpf Apparatur: zur Reinigung und Vorbereitung von Probengefäßen in der Ultra Spurenanalytik Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen) Säurereinigung 14
15 Probenvorbereitung Vessel Cleaner (Reinigung von Mikrowellengefäßen) How does it work? Vapor rises from the bath and condenses on the vessels; droplets carrying impurities and return to the acid bath. Probenvorbereitung Säurereinigung: subboiling Reinigung für Säuren (HNO3, HCl) oder H2O 15
16 Probenvorbereitung Urin 2 g Urin Gespiked mit 108 Pd + Standardaddition +250µL HNO 3, 1000µL H 2 O 2, 500µL HCl, 1240 µl H 2 O Isotopenverdünnungsanalyse ( 105 Pd/ 108 Pd; 106 Pd/ 108 Pd) UV-Aufschluss Abrauchverfahren (offen) einengen auf 200µL + 1 ml HCl (37%) einengen auf 200 µl 2 g Probenvolumen Probenvorbereitung bei der LC/MS Kopplung Welche Probenvorbereitung ist die richtige? Manuell oder automatisch? On line oder off line? Verdünnen oder Aufkonzentrieren? 16
17 Probenvorbereitung bei der LC/MS Kopplung Warum Probenvorbereitung? Minimierung der Matrixeffekte Eliminierung von Störsubstanzen Aufkonzentrieren des Analyten Verdünnen des Analyten Belastung des LC/MS Systems wird verringert (geringere Kosten in der Erhaltung) Genauere Ergebnisse Manuelle oder automatisierte Probenvorbereitung? 17
18 Automatisierung Probenvorbereitung: off line SPE, LLE Manuell oder automatisiert Probenvorbereitung: on line SPE, mehrdimensionale SPE, Säulenschaltung 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Principles of SPE SPE is an extraction process whereby an aqueous sample is filtered through a thin bed of sorbent particles, the analytes of interest are removed from the liquid matrix, and concentrated onto the sorbent. Once concentrated, the analytes are removed by an eluting solvent. 18
19 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) SPE Column 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Comparison of LLE vs SPE Disk LLE Uses ml solvent Shaking / continuous process Forms emulsions Little selectivity Takes 1 2 hours / sample SPE disk Uses 2 20 ml solvent Filtration process No emulsions formed Wide selectivity (adsorbent) Takes min. / sample 19
20 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) What are the Benefits of SPE? SPE uses less solvent than LLE SPE is faster (at least 5 times) High capacity Total SPE costs are considerably less than LLE High selectivity: broad choice of bonded phases and solvents Automation much easier 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) SPE Column accessories 40 20
21 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Silicagel Phases Reversed Phase C 18 Adsorption Si OH Normal Phase NH 2 CN C OH(OH) 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Phases Anion Exchange N + NH 2 Cation Exchange C 6 H 5 SO 3 H COOH SO 3 H Biochromatography WP PEI (NH 2 ) WP Butyl (C 4 ) WP CBX (COO) Sephadex G 25 21
22 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Interactions Non polar: van der Waals ~20 KJ/mole Polar: Dipole / Dipole ~ 40 KJ/mole Hydrogen bond ~40 KJ/mole Electrostatic: Ionic ~600 KJ/mole! 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) 4 Steps in SPE 22
23 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: sample load 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: washing step 23
24 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Experiment 1: Rapid Extraction of natural dyes in beverages: elution step 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Online SPE LC 24
25 3. Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction SPE) Online SPE LC 3. Festphasenextraktion (SPE) 25
26 Proteinfällung Vorteile: hohe Wiederfindungsrate bei geeignetem Fällungsreagenz universell einsetzbar schnell durchführbar geringe Fehlerquellen, da keine komplizierten Bauteile oder Schaltungen verwendet werden Nachteile: schwer automatisierbar Ionische Matrix bleibt erhalten > Belastung des LC/MS Systems Verdünnen (Dilute and Shoot) Vorteile: Alle Komponenten bleiben für die Messung erhalten (Analyt und Matrix!) geringer Aufwand für die Probenvorbereitung leicht automatisierbar kostengünstig Nachteile: Die Matrix muss chromatographisch abgetrennt werden Belastung der analytischen Säule und des MS mit der Matrix hohe Empfindlichkeit des MS erforderlich 26
27 Festphasenextraktion Vorteile: leicht automatisierbar direktes Einsetzen der Probe beim on line Betrieb Abtrennung der Matrix Nachteile: schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten hoher Zeitaufwand beim Einengen des Eluates Kosten für die Kartuschen (Einmalkartuschen) höherer Zeitaufwand für die Methodenentwicklung als bei der Proteinfällung nicht universell einsetzbar Flüssig Flüssig Extraktion (LLE) Vorteile: kostengünstiger als SPE schnelleres Einengen des Eluates als bei der SPE Matrix wird abgetrennt Nachteile: schlechter automatisierbar als SPE schlechte Wiederfindungsrate bei polaren Analyten nicht universell einsetzbar 27
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