T-Zell-vermittelte Aktivierung Natürlicher Killerzellen

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1 Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene des Universitätsklinikums in Ulm Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Steffen Stenger T-Zell-vermittelte Aktivierung Natürlicher Killerzellen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Valeska Knoll aus Göttingen 2010

2 Meinen Eltern

3 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Steffen Stenger 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Thomas Barth Tag der mündlichen Prüfung:

4 I Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Natürliche Killerzellen Rolle bei der Immunabwehr Effektormechanismen und Subpopulationen Aktivierung Induktion einer adaptiven Immunantwort Fragestellung der Arbeit 7 2. Material und Methoden 2.1. Material Arbeitsgeräte Arbeitsmaterial Chemikalien Medien und Puffer Zytokine und Antikörper Antigene Methoden 3. Ergebnisse Isolierung peripherer mononukleärer Zellen Isolierung Natürlicher Killerzellen Generierung unreifer dendritischer Zellen Durchflusszytometrie Proliferationsmessung Kultur in Transwell-Platten Statistische Auswertung Identifikation proliferierender Natürlicher Killerzellen Optimierung der Proliferationsmessung für primäre humane Blutzellen Konzentration des Fluorochroms Konzentration der Lymphozyten 21 III

5 II Auswahl des Stimulus zur Induktion der Lymphozytenproliferation Bedeutung dendritischer Zellen für die Lymphozytenproliferation Phänotypische Charakterisierung proliferierender Zellen Nachweis der Proliferation aufgereinigter Natürlicher Killerzellen Anreicherung Natürlicher Killerzellen Einfluss von PPD auf die Proliferation Natürlicher Killerzellen Mechanismus der Aktivierung Natürlicher Killerzellen Rolle löslicher Faktoren für die Proliferation Natürlicher Killerzellen Identifikation aktivierender Zytokine Einfluss von Zytokinen dendritischer Zellen Einfluss von T-Zell-Zytokinen Rolle von Interleukin-2 auf die Proliferation Natürlicher Killerzellen Diskussion 4.1. Bedeutung der Proliferation Natürlicher Killerzellen bei der Immunantwort Bedeutung von Interleukin-2 bei der Immunantwort und in der Krebstherapie Interaktion von T-Zellen und Natürlichen Killerzellen Natürliche Killerzellen als Teil des adaptiven Immunsystems Zusammenfassung Literaturverzeichnis 57 Anhang 68

6 III Abkürzungsverzeichnis APZ CD CFSE DZ EDTA FITC GM-CSF IFN-γ IL MACS MCMV MHC MTB-Extrakt M.tb NK-Zellen NKT PBMZ PE PerCP PPD TH1-Zelle TH2-Zelle TLR TNF-α TT TZR Antigenpräsentierende Zellen Cluster of differentiation Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester Dendritische Zellen Ethylendiamin-Tetraacetat Fluorescein-Isothiocyanat Granulocyte macrophyge colonystimulating factor Interferon-γ Interleukin Magnetic Activated Cell Sorting Murine Cytomegalie Virus Haupthistokompatibilitätskomplex Extrakt von Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis Natürliche Killerzellen Natürliche Killer T-Zellen mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut Phycoerythrin Peridinin Chlorophyll Protein Purified Proteine Derivative T-Helfer-1-Zelle T-Helfer-2-Zelle Toll-like-Rezeptor Tumornekrosefaktor-α Tetanus-Toxoid T-Zell-Rezeptor

7 1 Einleitung 1. Einleitung 1.1 Natürliche Killerzellen Rolle bei der Immunabwehr 1975 wurden erstmalig Lymphozyten beschrieben, die Tumorzellen lysieren konnten, jedoch keine T-Lymphozyten waren. Das Besondere an diesen Lymphozyten war ihre unmittelbare Aktivierung ohne vorherige Differenzierung in Effektorzellen, wie es vom adaptiven Immunsystem bekannt ist. Aufgrund dieser Eigenschaft wurden sie von Eva Klein Natürliche Killer genannt (Kiessling et al. 1975). Nach der klassischen Einteilung zählen Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) zum angeborenen Immunsystem und grenzen sich von den zum adaptiven Immunsystem gehörenden B- und T-Lymphozyten ab (Janeway et al. 2002). Sie schützen den Körper bereits in der Anfangsphase der Immunantwort gegen eindringende Pathogene, während das adaptive Immunsystem erst aktiviert werden muss. NK-Zellen erkennen infizierte, transformierte oder Antikörper-markierte Zellen Rezeptor-vermittelt. Sie induzieren den apoptotischen Tod der Zielzelle durch Freisetzung lytischer Effektormoleküle sowie Apoptose-induzierenden Liganden wie Fas-Ligand und TRAIL (Smyth et al. 2001). Eine wichtige immunregulatorische Aufgabe ist die Sekretion der Zytokine Interferon-γ (IFN-γ), Tumor Nekrose Faktor-α (TNF-α) und Granulocyte macrophage stimulatory factor (GM-CSF). Zytotoxizität und Zytokinsekretion stehen sofort nach Aktivierung bereit, da sowohl zytotoxische Granula präformiert in Vesikeln vorliegen als auch IFN-γ-Transkripte in NK-Zellen gespeichert sind. Dieser ready to go -Mechanismus (Lanier 2005) prädispositioniert NK-Zellen für die Abwehr von Organpathogenen in der frühen Phase der Immunantwort. Zellen des angeborenen Immunsystems besitzen invariante, keimbahnkodierte Rezeptoren, mit denen nur eine limitierte Anzahl konservierter

8 2 Einleitung Oberflächenstrukturen auf Krankheitserregern erkannt wird (Janeway et al. 2002). Die unveränderlichen Rezeptoren und das begrenzte Rezeptorrepertoire ermöglichen den NK-Zellen nur eine unspezifische Bekämpfung eingedrungener Erreger. Deshalb werden sie als Teil des angeborenen Immunsystems betrachtet. Trotz der eingeschränkten Variabilität verhindert das angeborene Immunsystem im Regelfall eine Infektion (Strowig et al. 2008). Reichen die angeborenen Schutzmechanismen nicht aus, wird das adaptive Immunsystem unterstützend aktiv. Dies erfordert ca. eine Woche nach erstmaligem Antigenkontakt, da es durch dendritische Zellen (DZ) im Lymphknoten aktiviert wird (Janeway 1989b, Mempel et al. 2004) und die Ausdifferenzierung von antigenspezifischen Lymphozyten zu Effektorzellen erfolgen muss. Bis dahin limitiert das angeborene Immunsystem die Infektion. Als Folge der adaptiven Immunantwort nimmt die Frequenz der NK-Zellen am Ort der Infektion unter dem Einfluss antiproliferativer Zytokine ab (Zhao et al. 2009). Im Gegensatz zum angeborenen Immunsystem entwickelt das adaptive Immunsystem ein immunologisches Gedächtnis. Gedächtniszellen werden noch nach Monaten und Jahren durch eine Infektion mit demselben Pathogen aktiviert und wehren dieses sofort und spezifisch ab. Dagegen bekämpfen NK-Zellen als Teil des angeborenen Immunsystems auch wiederkehrende Infektionen mit den ihnen eigenen Mechanismen (O'Leary et al. 2006) Effektorfunktionen und Subpopulationen NK-Zellen entwickeln sich zusammen mit anderen Lymphozyten aus der gemeinsamen CD34+ hämatopoetischen Vorläuferzelle im Knochenmark (Freud et al. 2006a). Nachdem sie das Knochenmark verlassen haben, sind sie in Blut, Milz, Leber, Uterus und in geringer Anzahl im sekundären Lymphgewebe nachweisbar (Yokoyama et al. 2004). Sie definieren sich durch ihren Oberflächenrezeptor Cluster of differentiation (CD) 56 bei gleichzeitigem Fehlen des T-Zell-spezifischen CD3-Rezeptors. Ihre Frequenz im peripheren Blut beträgt ca. 10% (Fehniger et al.

9 3 Einleitung 2003). Es werden zwei NK-Zell-Subpopulationen entsprechend ihrer CD56- Rezeptordichte und Funktion unterschieden. Die niedrig CD56-exprimierenden CD56 dim NK-Zellen bilden einen Anteil von 90% der NK-Zellen im peripheren Blut. Sie tragen den für die Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität benötigten CD16-Rezeptor. Sie sind zytotoxisch, produzieren aber deutlich weniger Zytokine als die CD56 bright NK- Zell-Subpopulation. Die Frequenz der CD56 bright NK-Zellen beträgt 10% der gesamten peripheren NK-Zell-Population (Strowig et al. 2008). CD56 bright NK- Zellen zeichnen sich durch eine hohe CD56-Rezeptordichte aus und bilden die Mehrheit der NK-Zellen in den Lymphknoten. Diese erreichen sie mit Hilfe ihrer Rezeptoren L-Selektin und CCR7 (Campbell et al. 2001, Frey et al. 1998). Sie exprimieren wenige zytotoxische Rezeptoren und tragen kaum CD16 auf ihrer Oberfläche. Ihre Hauptaufgabe besteht in der Synthese von IFN-γ und TNF-α, wodurch sie das Immunsystem modulieren. Im Lymphknoten können sie auf diese Weise mit DZ und T-Zellen interagieren und die adaptive Immunantwort formen (Fehniger et al. 2003). CD56 bright NK-Zellen werden erst unter Interleukin (IL)-2-Einfluss zytotoxisch. Phänotypisch entsprechen sie dann den CD dim NK-Zellen, weshalb man annimmt, dass es sich bei den CD dim NK-Zellen um eine Differenzierungsstufe der CD bright NK-Zellen handelt (Freud et al. 2006b) Aktivierung Die natürliche Zytotoxizität der NK-Zellen wird durch das komplexe Zusammenspiel von inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren vermittelt. Liganden für inhibitorische Rezeptoren sind Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Klasse-I-Moleküle. Diese werden von gesunden Zellen ubiquitär exprimiert und schützen vor der NK-Zell-vermittelten Lyse. Liganden für aktivierende Rezeptoren werden in Pathogen-infizierten oder maligne transformierten Zellen exprimiert (Lanier 2005).

10 4 Einleitung NK-Zellen erkennen Veränderungen in Oberflächenmolekülstrukturen durch Ausbildung immunologischer Synapsen mit Zellen in ihrer Umgebung (Orange 2008). In der Regel überwiegen die inhibitorischen Signale, die über MHC-Klasse- I-Moleküle in die NK-Zelle geleitet werden. Dadurch löst sich die gebundene Zelle aus dem Verband und wird nicht zerstört. Die natürliche Zytotoxizität der NK- Zellen wird ausgelöst wenn, 1. die MHC-I-Expression auf der Zelloberfläche infolge einer Virusinfektion oder Transformation verändert ist. Folglich werden nicht genügend hemmende Signale in die Zelle geleitet und die Ausschüttung zytotoxischer Granula induziert. Dieses Phänomen wurde bereits 1985 von Klas Kärre mit der Missing-self -Hypothese erklärt, welche besagt, dass Zellen ohne körpereigene Erkennungsmerkmale (MHC-I-Moleküle) eliminiert werden (Ljunggren et al. 1985). 2. eine Zelle zwar eine regelrechte MHC-I-Molekül-Expression aufweist, die Signale, die über aktivierende Rezeptoren in die NK-Zelle geleitet werden aber dominieren. Dies geschieht, wenn Zellen infolge von Transformation oder Infektion überwiegend aktivierende Liganden auf ihrer Oberfläche tragen. Zur Induktion der natürlichen Zytotoxizität muss eine Reihe synergistisch wirkender Rezeptoren gebunden werden. Im Gegensatz dazu reicht die selektive Bindung des CD16-Rezeptors von der Antikörper-markierten Zelle aus, um die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität auszulösen (Bryceson et al. 2006b). Die NK-Zell-Aktivität wird nicht nur über aktivierende und inhibierende Rezeptoren auf Körperzellen reguliert. Auch Immunzellen steuern über lösliche Faktoren und Zell-Zell-Kontakt die NK-Zell-Aktivität. Von aktivierten T-Zellen freigesetztes IL 2 induziert die Proliferation und erhöht die Zytotoxizität in CD bright NK-Zellen über deren hoch affinen IL-2 Rezeptor (Carson et al. 1997).

11 5 Einleitung Eine NK-Zell-Aktivierung kann ebenfalls durch die Monokine IL-12 und IL-15 erfolgen. Diese werden sowohl von Monozyten (Yu et al. 2006) als auch von DZ sezerniert, wenn Toll-like Rezeptoren (TLR) auf ihrer Oberfläche gebunden werden. TLR erkennen konservierte molekulare Strukturen, die auf diversen pathogenen Mikroorganismen zu finden sind und tragen entscheidend zur Aktivierung des angeborenen Immunsystems bei (Luster 2002). IL-12 induziert die IFN-γ-Sekretion in NK-Zellen, fördert deren Zytotoxizität und wirkt proliferativ (Strowig et al. 2008, Ferlazzo et al. 2003). IL-15 spielt eine wichtige Rolle bei der NK-Zell-Reifung, der Induktion der IFN-γ-Freisetzung sowie der Proliferation von NK-Zellen (Ferlazzo et al. 2004b). Die Proliferation der NK-Zellen wird auch unabhängig von Zytokinen durch Zell- Zell-Kontakt mit DZ ausgelöst (Amakata et al. 2001). NK-Zellen besitzen eine Vielzahl an TLR auf ihrer Oberfläche. Deshalb wird diskutiert, ob eine direkte Aktivierung auch über TLR möglich ist. So wurde z.b. eine NK-Zell-Aktivierung (IFN-γ und TNF-α-Produktion) über TLR-2 durch das Lipophosphoglykan von Leishmanien beschrieben (Becker et al. 2003). Noch ist allerdings offen, ob die Aktivierung direkt über TLR oder indirekt durch Zytokine TLR-aktivierter Antigenpräsentierender Zellen (APZ) induziert wurde (O'Connor et al. 2006). Auch TNF-α aktiviert NK-Zellen und trägt zur NK-Zell-Reifung bei. Zusammen mit IL-15 induziert TNF-α die IFN-γ-Produktion (Lee et al. 2009). Die Neutralisation von TNF-α führt zu einer signifikanten Abnahme der IL-2 vermittelten Proliferation (Innins et al. 1992), was eine proliferative Wirkung von TNF-α zeigt. IFN-γ führt indirekt zu einer NK-Zell-Aktivierung, da es die IL-12- Ausschüttung in DZ induziert (Schroder et al. 2004) Induktion einer adaptiven Immunantwort Im Gegensatz zu NK-Zellen gehören T-Zellen zum adaptiven Immunsystem und erkennen aufgrund ihrer großen Rezeptorvielfalt viele unterschiedliche Antigene.

12 6 Einleitung Diese Variationsbreite entsteht durch Genumlagerungen während der Entwicklung und hat die Expression je eines individuellen Rezeptors in jedem T- Lymphozyten zur Folge (Chaplin 2010). Dadurch eliminiert das adaptive Immunsystem Pathogene mit höherer Spezifität und Effektivität als das angeborene Immunsystem (Janeway et al. 2002). Unabdingbare Voraussetzung für die Entwicklung der T-Zell-Effektorfunktionen ist die Aktivierung durch DZ im Lymphknoten. Unreife DZ befinden sich ubiquitär im peripheren Gewebe und phagozytieren Pathogene und infizierte Zellen. Nach Aktivierung durch Antigen-Kontakt, wandern DZ in das sekundäre Lymphgewebe und differenzieren sich zu APZ (Guermonprez et al. 2002). Reife DZ präsentieren die aufgenommenen Peptidantigene an naive T-Zellen. Erkennt eine T-Zelle das Antigen mit ihrem T-Zell-Rezeptor (TZR), wird sie aktiviert und setzt IL-2 frei. Dies führt zur klonalen Expansion, so dass nach 4-5 Tagen große Mengen an T-Zellen mit identischem TZR im Lymphknoten akkumulieren. Anschließend differenzieren sie zu Effektorzellen (Janeway 1989b). Je nach Zytokinmilieu im Lymphknoten entwickeln sich CD4-positive T-Helfer (TH)- Zellen oder CD8-positive zytotoxische T-Zellen. In Anwesenheit der Zytokine IFN-γ und IL-12, die nach Invasion intrazellulärer Bakterien freigesetzt werden, differenzieren sich TH-Zellen weiter zu TH1-Zellen. Zu den Aufgaben der TH1- Zellen gehört die Aktivierung von Makrophagen durch IFN-γ. Dies stimuliert die Effektivität der Makrophagen gegen intrazelluläre Bakterien (Abbas et al. 1996). Weiterhin leiten TH1-Zellen an B-Zellen kostimulatorische Signale, die daraufhin Antikörper vom Immunglobulin (Ig) G-Typ produzieren und extrazelluläre Bakterien opsonisieren. Dominiert das Zytokin IL-4 im Lymphknoten, wie es z.b. bei Wurminfektionen oder auch als Reaktion auf Allergene aus der Umwelt der Fall ist, differenzieren sich T-Zellen zu TH2-Zellen. Diese induzieren in B-Zellen den Wechsel zur Klasse der IgE-Antikörper. IgE bietet zum einen Schutz gegen parasitäre Wurminfektionen, ist aber auch für die Ausbildung allergischer Reaktionen verantwortlich. Welcher Subtyp an T-Helferzellen sich entwickelt, ist für den

13 7 Einleitung Erfolg einer Immunantwort von entscheidender Bedeutung. Bei einer Infektion mit intrazellulären Bakterien begünstigt die selektive Bildung von TH2-Zellen einen schweren Krankheitsverlauf. Da das Wirkspektrum von Antikörpern auf den extrazellulären Raum begrenzt ist, hat die Antikörperproduktion keinen Nutzen bei der Eliminierung intrazellulärer Erreger (Mosmann et al. 1989). Differenzierte Effektorzellen erreichen lympho- oder hämatogen den Ort der Infektion, wo sie eine effiziente Infektabwehr gewährleisten. 4. Fragestellung dieser Arbeit Bisher wurden angeborene und erworbene Immunität überwiegend als hintereinander geschaltete Abwehrmechanismen interpretiert. In der frühen Phase der Immunantwort dominieren NK-Zellen des angeborenen Immunsystems. In der Folge übernehmen T-Zellen des adaptiven Immunsystems die Kontrolle der Krankheitserreger. Die Parallelschaltung beider Systeme z.b. durch ein Zusammenspiel von NK-Zellen und T-Zellen wurde nur unzureichend berücksichtigt. Unsere Beobachtung, dass T-Zellen und NK-Zellen gleichzeitig von bakteriellen Antigenen aktiviert werden, gab die Initialzündung für diese Arbeit. In Experimenten zur T-Zell-Aktivierung durch Antigene von Mycobacterium tuberculosis (M. tb) wurde gezeigt, dass neben T-Zellen auch NK-Zellen antigenspezifisch proliferieren (Abb. 1) (Bastian et al. 2008). Da NK-Zellen keine antigenspezifischen Rezeptoren besitzen, ist der Mechanismus der Proliferation ungeklärt. Wir entwickelten die Hypothese, dass NK-Zellen indirekt durch T- Zellen aktiviert werden. Ziel dieser Arbeit war daher zu untersuchen, durch welche Mechanismen mikrobielle Antigene die Aktivierung von NK-Zellen induzieren.

14 8 Einleitung A unstimuliert B Totallipid Proliferierte, CD3- negative Lymphozyten Abbildung 1: Mykobakterielle Antigene aktivieren T-Zellen und NK-Zellen. CFSEgefärbte PB MZ wurden mit autologen DZ und Totallipid stimuliert und die Proliferation an Tag 6 mit dem Durchflusszytometer bestimmt. (A) Die Abbildung zeigt unstimulierte PBMZ, deren Hauptanteil von C D3-positiven (CFSE high ) T-Zellen gebildet wird. Sie proliferieren nicht, was durch ihren hohen CFSE-Farbstoffgehalt deutlich wird. (B) Die Abbildung zeigt die Proliferation stimulierter PBMZ, was durch die CFSE- Farbstoffabnahme (CFSE low ) ersichtlich ist. Neben CD3-positiven T-Zellen proliferieren auch CD3-negative Lymphozyten. CD: Cluster of differentiation; CFSE: Carboxyfluoreszein Succinim idyl Ester; DZ: Dendritische Zellen; NK-Zellen: Natürliche Killerzellen; PB MZ: mononukleare Zellen aus dem peripheren Blut.

15 9 Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1 Material Arbeitsgeräte Cäsium-137 Strahlenquelle FACScalibur Durchflusszytometer Laminair-Werkbank Lichtmikroskop Neubauerzählkammer Pipetus akku Ultraschallbad T310-H VarioMACS Seperator Vortexer Wasserbad Zellkulturinkubator Zentrifuge 5810R Molsgaard Medical Becton Dickinson Heraeus Olympus Schubert & Weiss Hirschmann Roth, Karlsruhe Miltenyi Biotec Heidolph Köttermann Heraeus Eppendorf Arbeitsmaterial Gewebekulturplatten, 24-Well Röhrchen für die Durchflusszytometrie Gewebekulturplatten, 96-Well Rundboden Kunststoffpipetten (5ml, 10ml und 25ml) Kulturflaschen, 15 ml MACS Sepreation Columns Pasteurpipetten Becton Dickenson Becton Dickenson Nunc Costar Becton Dickenson Miltenyi Biotec Brand

16 10 Material und Methoden Pipettenspitzen 0,5-10µl Pipettenspitzen 2-200µl Pipettenspitzen µl Schraubröhrchen, 15 ml Schraubröhrchen, 50 ml Transwelleinsätze für 24-Well Platte, 0,4µm Brand Roth Sarstedt, Nümbrecht Becton Dickenson Becton Dickenson Costar Chemikalien Buffy-Coat-Präparationen DRK Blutspendedienst Badenwürttemberg-Hessen, Ulm Bovines Serumalbumin CFSE EDTA Ficoll-Paque Plus Fötales Kälberserum Hepes Humanserum AB L-Glutamin Natriumazid PBS Penicillin/Streptomycin PPD (Tuberkulin GT) RPMI 1640 Sigma Alexis Sigma GE Healthcare Bio Sciences Sigma-Aldrich Biochrom AG Bio Whittaker PAA Roth PAA Biochrom AG Chiron Behring Gibco

17 11 Material und Methoden Trypanblau Biochrom AG Medien und Puffer Komplettes Medium: RPMI 1640, 10 mm Hepes, 2 mm L-Glutamin, 60 µg/ml Penicillin, 100µg/ml Streptomycin Zellkulturmedium: Komplettes Medium + 5% hitzeinaktiviertes Humanserum (HS) Puffer für die Durchflusszytometrie: PBS, 2% FCS, 0,1% Natriumazid Waschserum: PBS (400ml) + komplettes Medium (100ml) + 2% FCS CFSE-Waschpuffer: PBS + 2%FCS MACS-Puffer: PBS, 0,5% BSA, 2mM EDTA Zytokine und Antikörper anti-hu-cd3-percp (Maus IgG1) Maus-anti-IgG1 PerCP anti-hu-cd56-pe (Maus IgG1) Maus-anti-IgG1 PE anti-hu-mhc-ii-fitc (Maus IgG2b) Maus-anti IgG2b FITC anti-hu-ifn-γ (Maus-IgG2b) Becton Dickinson Becton Dickinson Becton Dickinson Becton Dickinson Invitrogen Becton Dickinson R&D Systems

18 12 Material und Methoden anti-hu-il-2 (Maus IgG1) anti-hu-tnfα (Maus IgG1) anti-hu-il-12 (Maus IgG1) anti-hu-il-15 (Maus IgG1) rhu IFN-γ GM-CSF rhu TNF-α rhu IL-12 rhu IL-15 rhu IL-2 rhu IL-4 NK Cell Biotin Antibody Cocktail human NK Cell MicroBead Cocktail human Maus-anti IgG1 R&D Systems Pierce Endogen R&D Systems R&D Systems R&D Systems Berlex Strathmann R&D Systems R&D Systems Chiron Strathmann Miltenyi Biotec Miltenyi Biotec R&D Systems Antigene MTB-Extrakt: Virulente Mycobakterien (H37Rv) wurden durch Bestrahlung (25kGy) inaktiviert und anschließend in PBS resuspendiert. Es folgte die 3-malige Behandlung im Ultraschallbad mit anschließender Zentrifugation für 1 Stunde bei xg, um die Bakterien in ihre Bestandteile zu zerlegen. Der Überstand wurde abgenommen und die Proteinkonzentration durch den Bicinchoninic (BCA) Protein Assay (Pierce) ermittelt. Totallipid: Lipidantigene eines virulenten Mykobakterien-Stamms (H37Rv) wurden mithilfe einer Chloroform-Methanol-Mischung (2:1) extrahiert und bei -

19 13 Material und Methoden 70 C gelagert. Um Totallipid in Experimenten zu verwenden, wurde die gewünschte Menge im Vakuum getrocknet und durch Ultraschall im warmen Wasserbad in Zellkulturmedium gelöst. PPD (Tuberculin GT) Staphylokokken Enterotoxin B Tetanus-Toxoid Chiron Behring Sigma-Aldrich Chiron Behring 2.2 Methoden Isolierung peripherer mononukleärer Zellen mithilfe eines Ficoll-Hypaque- Dichte-Gradienten Buffy-Coat-Präparationen (Antikoagulanz: Natriumcitrat) wurden zu einem Endvolumen von 100 ml mit PBS verdünnt und jeweils 25 ml dieser Zellsuspension vorsichtig auf 15 ml Ficoll-Paque-Plus (1,077 g/ml) in 50 ml Schraubröhrchen geschichtet. Die 4 Röhrchen wurden für 30 Minuten (min) bei 1600 U/min ohne Bremse zentrifugiert. Dabei sammelten sich aggregierte Erythrozyten und Granulozyten in einem Pellet an, Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten bildeten eine Interphase zwischen Ficoll und Serum. Die Interphase wurde zusammen mit dem Serum abgenommen und auf zwei 50 ml Schraubröhrchen verteilt. Diese wurden für 10 min bei 1800 U/min zentrifugiert, um die Zellen vom restlichen Ficoll-Paque-Plus zu befreien. Zur Entfernung der Thrombozyten folgten 10-minütige Waschschritte mit jeweils 20 ml Waschpuffer bei 1300 U/min, bei 1000 U/min und dreimal bei 800 U/min. Vor dem letzten Waschschritt wurden die Zellen aus beiden Röhrchen gepoolt und gezählt. Die auf diese Weise gewonnenen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMZ) wurden auf eine Konzentration von pro ml in Zellkulturmedium eingestellt. Die Zellzahl nach PBMZ-Isolierung wurde in der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Gleichzeitig konnten durch das Verdünnen der Zellsuspension mit Trypanblau tote Zellen identifiziert werden. Da der Farbstoff die Zellmembran

20 14 Material und Methoden geschädigter Zellen penetriert, färbten sie sich blau an und wurden von der Zählung ausgeschlossen. 10 µl der Zellsuspension wurden mit 100 µl Trypanblau verdünnt und 10 µl der Mischung zwischen Kammer und Deckglas pipettiert. Unter dem Mikroskop wurden 4 große Felder ausgezählt und der Mittelwert bestimmt. Ein großes Feld enthält ein Volumen von 0,1 µl, so dass sich die Zellzahl pro ml Flüssigkeit durch die Multiplikation mit errechnet Isolierung von NK-Zellen Die NK-Zell-Isolierung erfolgte aus frisch isolierten PBMZ mithilfe des Miltenyi NK Cell Isolation Kit II entsprechend den Angaben des Herstellers: PBMZ wurden in 100 µl MACS (Magnetic Activated Cell Sorting)-Puffer aufgenommen und mit 50 µl der biotinylierten Antikörper-Mischung gegen CD 3, CD 4, CD 14, CD 15, CD 19, CD 36, CD 123 und Glycophorin A im Dunkeln auf Eis inkubiert. Nach 30 min wurden die PBMZ mit 150 µl MACS-Puffer resuspendiert und der Zweitantikörper, 100 µl Fe 2+ -haltige anti Biotin-Mikrobeads, dazu gegeben. Weitere 30 min später wurden die nicht gebundenen Antikörper und Mikrobeads durch einen 10-minütigen Waschschritt bei 1300 U/min entfernt und die Zellsuspension in 500 µl MACS-Puffer aufgenommen. Die Antikörper-markierten PBMZ wurden durch eine Säule in einem magnetischen Feld geschickt und 2 mit jeweils 500 µl MACS-Puffer gespült. Antikörper-markierte Zellen blieben in der Säule hängen während NK-Zellen die Säule passierten, da sie keine der oben genannten Rezeptoren auf ihrer Oberfläche tragen (Abb. 2). Die NK-Zellen wurden gezählt, in Zellkulturmedium aufgenommen und im Durchfluss- Zytometer auf ihre Reinheit kontrolliert.

21 15 Material und Methoden PBMZ D E< d D E< d Markierung mit biotinylierten Antikörpern und Fe2+-haltigen anti Biotin-Mikrobeads E<d E<d d E< D Fe+-markierte Zellen bleiben in der Magnetsäule hängen Magnet d E<d E< E< E< Abbildung 2: Aufreinigung von NK- Zellen aus PBMZ. Mit Ausnahme der NK-Zellen werden PBMZ mit Fe+-Kügelchen konjugiert. Die markierten Zellen bleiben aufgrund des Magnetfeldes in der Säule hängen. N K-Zellen passieren die Säule und werden in einem Röhrchen aufgefangen. B: B-Zelle; M: Monozyt; NK: Natürliche Killer-Zelle; NKT: Natürl iche Killer-T-Zelle; PBMZ: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut; T: T-Zelle Generierung dendritischer Zellen Unmittelbar nach der PBMZ-Isolierung wurden PBMZ in kleinen Kulturflasche in Zellkulturmedium inkubiert. Dies führt zu einer selektiven Adhärenz von Monozyten, während Lymphozyten in Suspension bleiben. Nach 1 h wurden die PBMZ abgenommen und bis zur Verwendung am nächsten Tag in kleinen Kulturflaschen im Brutschrank inkubiert. Durch dreimaliges Waschen mit PBS wurden die restlichen nicht adhärenten PBMZ entfernt. Die verbliebenen Monozyten wurden für 24 Stunden in Zellkulturmedium mit GM-CSF (100 ng/ml) und IL-4 (2,5 ng/ml) kultiviert. Dadurch entwickeln sich unreife dendritische Zellen, die mithilfe von Ethylendiamin-Tetraacetat (EDTA) (1 mm)

22 16 Material und Methoden abgelöst werden. Vor der Verwendung in Experimenten wurden die DZ mit 30 Gy bestrahlt Durchflusszytometrie Zur Detektion von Oberflächenantigenen wurden ca Zellen in 200 µl Puffer für die Durchflusszytometrie aufgenommen und mit Fluorochromgekoppelten Antikörpern für 30 min im Kühlschrank inkubiert. Mithilfe einer Titration wurde für jeden Antikörper die zu verwendende Menge ermittelt, die für ein optimales Fluoreszenzsignal erforderlich ist (Tabelle 1). Ungebundene Antikörper wurden durch Waschen mit 2 ml Puffer für die Durchflusszytometrie bei 1300 U/min entfernt. Die gefärbten Zellen wurden in 200 µl Puffer aufgenommen und Zellen am Durchlusszytometer analysiert. Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm WinMDI 2.8 (Joe Trotter). Tabelle 1: Mengen verwendeter Antikörper CD: Cluster of Differentiation; FITC: Fluorescein-Isothiocyanat; MHC-II: Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse-II-Molekül; PE: Phycoerythrin; PerCP: Peridinin Chlorophyll Protein. Antikörper CD3 CD56 MHC-II Fluorochrom PerCP PE FITC M enge 3µl 5µl 1µl Proliferationsmessung Zum Nachweis der Zellproliferation wurde eine CFSE (Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester)-Verdünnungstest durchgeführt. CFSE ist ein fluoreszierender Farbstoff, welcher passiv die Zellmembran permeiert und intrazellulär stabil an Proteine bindet. Bei jeder Zellteilung wird der Farbstoff gleichmäßig auf beide Tochterzellen verteilt, so dass die Farbstoffmenge pro Zelle bei fortwährenden Zellteilungen immer geringer wird. Die Verdünnung von CFSE und die damit

23 17 Material und Methoden verbundene Abnahme der Fluoreszensintensität kann als Indikator von Zellteilungen mit dem Durchflusszytometer detektiert werden (Lyons et al. 1994) Für die CFSE-Färbung wurden Zellen in 500 µl CFSE-Waschpuffer aufgenommen und für 10 min im 37 C warmen Wasserbad mit dem Farbstoff inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit CFSE-Waschpuffer bei 1300 U/min wurden die Zellen in Zellkulturmedium aufgenommen und stimuliert. Nach 6- tägiger Inkubation im Brutschrank bei 37 C und 5% CO2 wurde die Intensität der CFSE-Färbung als Maß für die Proliferation der Zellen mit dem Durchflusszytometer analysiert. Zellen, die sich nicht geteilt hatten, besaßen noch die ursprüngliche Farbstoffmenge und waren CFSE-positiv. In proliferierten Zellen hatte sich der Farbstoff verdünnt, weshalb sie als CFSE-negativ bezeichnet wurden. Zur Charakterisierung der proliferierten Zellen wurden die Oberflächenantigene der PBMZ im Anschluss an die 6-tägige Stimulation gefärbt. Die bereits CFSEmarkierten Zellen wurden in Röhrchen für die Durchflusszytometrie überführt und nach einem Waschschritt mit anti-cd3- und anti-cd56-antikörpern im Kühlschrank inkubiert. Anschließend wurden die Zellen noch einmal bei 1300 U/min für 10 min gewaschen und am Durchflusszytometer analysiert. Durch dieses Vorgehen konnte die Expression von CD3, CD56 und die CFSE-Intensität gleichzeitig auf Einzelzellebene überprüft werden.

24 18 Material und Methoden PBMZ E< D d Zellanalyse mit dem Durchflusszytometer E<d nur Zellen aus R1 + CFSE SSC FSC unstimuliert E<d D d E< Zd D E<d de Inkubation für 6 Tage im Brutschrank SSC FSC FSC CFSE E< d 10 min Wasserbad + Antigen PPD E<d D d E< FSC Streulicht- Dotplot R1 proliferierte Zellen CFSE Fluoreszens- Dotplot Abbildung 3: Prinzip des CFS E-Verdünnungstests. PBMZ werden mit dem Farbstoff CFSE gefärbt und anschließend unstimuliert oder mit dem Antigen PPD im Brutschrank inkubiert. Nach 6 Tagen erfolgt die Proliferationsmessung mit dem Durchflusszytometer. (A) In dieser Abbildung sind die Dotplots unstimulierter Lymphozyten dargestellt. Die Lymphozyten haben sich nicht geteilt, was durch die homogenen CFSE-positiven Zellpopulationen, sowohl im Streulicht- Dotplot als auch im Fluoreszenz-Dotplot erkenntlich wird. (B) In dieser Abbildung ist die Proliferation der PBMZ infolge von PPD-Stimulation dargestellt. Sowohl im Streulicht-Dotplot als auch im Fluoreszenz-Dotplot erkennt man ruhende, CFSE-positive und proliferierte CFSEnegative Lymphozyten. B: B-Zelle; CFSE: Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester; FSC: Forward Scatter; M: Monozyt; NK: Natürliche Killer-Zelle; NKT: Natürliche Killer-T-Zelle; PBMZ: mononukläre Zellen aus dem peripheren Blut; PPD: Purified Proteine Derivative; R1: Region 1; SSC: Sideward Scatter; T: T-Zelle Kultur in Transwellplatten Zur Untersuchung, ob die Aktivierung von Zellen über lösliche Faktoren oder Zell-Zell-Kontakt vermittelt wird, wurden Transwell-Systeme etabliert. Wir verwendeten ein Transwell-System aus einer 24-Well-Platte, in welche kleine Einsätze (Transwells) mit semipermeablen Böden eingehängt wurden (Abb. 4). Die Zellen im unteren Well und Transwell kommunizieren nur über lösliche Faktoren, da Zell-Zell-Kontakt durch die Membran der Porengröße von 0,4 µm verhindert wird. Es wurden PBMZ und DZ pro Well in 400 µl Zellkulturmedium kultiviert. Je nach Versuchsansatz erfolgte die Stimulation mit Purified Proteine Derivative (PPD) (10 µg/ml) oder neutralisierende Antikörper gegen Zytokine. In

25 19 Material und Methoden die Transwelleinsätze wurden NK-Zellen in 200 µl Zellkulturmedium pipettiert. Nach 6 Tagen wurden sowohl die PBMZ des unteren Kompartiments als auch die NK-Zellen des oberen Kompartiments am Durchflusszytometer analysiert. NK-Zellen lösliche Moleküle? d E< d E< E< E< E< WW d E< d semipermeable Membran PBMZ + unreife DZ + PPD Abbildung 4: Kultivierung von Ze llen in Transwellplatten. PBMZ der unteren Kammer sind von den NK-Zellen der oberen Kammer durch eine semipermeable Membran getrennt. Kommunikation kann lediglich über lösliche Faktoren, nicht jedoch über Zell- Zell-Kontakt erfolgen. DZ: Dendritische Zelle; NK: Natürliche Killer-Zelle; PBMZ: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut; PPD: Purified Protein Derivative Statistische Auswertung Die Daten der Balkendiagramme wurden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Einzelne Daten wurden als repräsentative Resultate den Diagrammen vorangestellt. Zur Bestimmung der statistischen Signifikanz p zwischen zwei unterschiedlich behandelten Kulturen, wurde der Student s t Test angewandt. Die Unterschiede wurden als signifikant betrachtet wenn p 0,05 (*), sehr signifikant wenn p 0,01 (**) und hoch signifikant wenn p 0,001 (***).

26 20 Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1 Identifikation von proliferierenden Natürlichen Killerzellen T-Lymphozyten expandieren klonal, wenn sie mit ihrem spezifischen Antigen stimuliert werden. Um zu klären, ob neben T-Lymphozyten auch NK-Zellen proliferieren, wurde ein CFSE-Verdünnungstest mit frisch isolierten PBMZ etabliert. Anschließend wurden die proliferierten Zellen phänotypisch charakterisiert Optimierung des CFSE-Verdünnungstests für primäre humane Blutzellen Konzentration des Fluorochroms PBMZ wurden mit dem fluoreszierenden Farbstoff CFSE gefärbt und für 6 Tage mit Extrakt von Mycobacterium tuberculosis (MTB-Extrakt) stimuliert. Bei proliferierten Zellen halbiert sich der Farbstoff bei jeder Zellteilung und die Abnahme der Fluoreszensintensität wird am Durchlusszytometer detektiert. Die CFSE-Konzentration von 1 µm führte zu einem starken Fluoreszenzsignal, so dass die Grenzen der gefärbten Zellpopulation nicht dargestellt werden konnten (Abb.5A). Um zwischen ruhenden und sich teilenden Zellen zu unterscheiden, ist die Darstellung der gesamten Zellpopulation notwendig. Daher wurde die CFSE- Konzentration im folgenden Experiment auf 0,5 µm halbiert. Dadurch verringerte sich die Fluoreszenzintensität der Zellen, die daraufhin besser abgrenzbar und beurteilbar wurden (Abb. 5B). In nachfolgenden Experimenten wurde daher eine CFSE-Konzentration von 0,5 µm verwendet.

27 21 Ergebnisse A CFSE: 1µM 2% B CFSE: 0,5µM 5% FSC FSC CFSE CFSE Abbildung 5: Einfluss der CFS E-Konzentration auf die Färbeintensität PBMZ wurden in einer 24-Well-Platte in einem Volumen von 400µl mit dem Antigen MTB- Extrakt (10µg/ml) stimuliert. An Tag 6 wurden Zellen am Durchflusszytometer hinsichtlich der Proliferation analysiert. (A) Zur Färbung wurde eine C FSE-Konzentration von 1µM verwendet. (B) Zur Färbung wurde eine CFS E-Konzentration von 0,5µM verwendet. CFSE: Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester; FSC: Forward Scatter; MTB-Extrakt: Extrakt von Mycobacterium tuberculosis; PBMZ: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut Konzentration der Lymphozyten Um den Anteil der proliferierenden Zellen (Abb. 5) zu vergrößern, wurde die Zellkonzentration verändert. Dazu wurden anstatt PBMZ in einer 24-Well- Platte 1, PBMZ in einer 96-Well-Rundbodenplatte kultiviert, wodurch sich die Zellzahl von pro mm 2 auf 1, Zellen pro mm 2 verringerte. Beide Ansätze wurden mit PPD stimuliert und die Proliferation am Durchflusszytometer an Tag 6 gemessen. In 6 voneinander unabhängigen Experimenten wurde eine Steigerung der Proliferation von durchschnittlich 13% auf 27% (p=0,03) erreicht (Abb. 6). Die Identifikation von Subpopulationen innerhalb proliferierender Zellen wird durch eine hohe Teilungsrate erleichtert, so dass die nachfolgenden Experimente stets mit einer Konzentration von 1, Zellen pro mm 2 in einer 96-Well-Rundbodenplatte durchgeführt wurden.

28 22 Ergebnisse A Zellen/mm 2 9% B 1, Zellen/mm 2 29% FSC FSC CFSE CFSE Abbildung 6: Einfluss der Zellkonzentration auf die Proliferation. Nach einer 6- tägigen Stimulation mit PPD (10µg/ml) wurden PBMC mit dem Durchflusszytometer hinsichtlich ihrer Proliferation analysiert. (A) Der Dotplot zeigt das Ergebnis der Proliferationsmessung, wenn Zellen/mm 2 in einer 24-Well-Platte inkubiert werden. (B) Der Dotplot zeigt das Ergebnis der Proliferationsmessung, wenn 1, Zellen/mm 2 in einer 96-Well-Rundbodenplatte inkubiert werden. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives Experiment von 6 mit ähnlichem Ergebnis. CFSE: Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester; FSC: Forward Scatter; PBMC: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut; PPD: Purified Protein Derivative Auswahl eines Stimulus zur Induktion der Lymphozytenproliferation Um die Proliferation von NK-Zellen und T-Zellen zu untersuchen, musste ein Stimulans gefunden werden, welches zuverlässig zu einer T-Zell-Aktivierung führt. Die Proliferation von T-Zellen lässt sich durch folgende Substanzen induzieren: 1. Interleukine (z.b. IL-2) vermitteln eine antigenunabhängige Proliferation über Zytokinrezeptoren. 2. Mikrobielle Antigene (MTB-Extrakt, PPD) werden von APZ präsentiert und lösen eine MHC-restringierte T-Zell-Proliferation aus. 3. Superantigene (z.b. Staphylokkoken-Enterotoxin-B (SEB)) führen zur antigenunabhängigen Aktivierung aller T-Zellen, deren TZR aus einer bestimmten Vβ - Kette besteht. Ein geeignetes Stimulans wurde ermittelt, indem CFSE-gefärbte PBMZ mit IL-2, PPD oder SEB inkubiert wurden. An Tag 6 erfolgte die Proliferationsmessung am Durchflusszytometer. Es wurde eine antigenunabhängige Proliferation von 29% auf die Stimulation mit IL-2 bzw. 65% auf die Stimulation mit SEB, sowie eine

29 23 Ergebnisse antigenspezifische Proliferation auf PPD von 11% beobachtet (Abb. 7). In 4 voneinander unabhängigen Experimenten zeigte sich eine durchschnittliche Proliferation von 29% (IL-2), 69% (SEB) und 8% (PPD). Die Inkubation in Zellkulturmedium alleine diente als Negativkontrolle und induzierte keine Aktivierung. Erwartungsgemäß war SEB ein besserer Stimulus als das mikrobielle Antigen PPD. Diese Ergebnisse unterstreichen die Validität der Methode, da sie eine vergleichende Analyse verschiedener Stimulatoren erlaubt. unstimuliert IL-2 PPD SEB 0,1% 29% 11% 65% FSC FSC FSC FSC CFSE CFSE CFSE CFSE Abbildung 7: Aktivierung von PBMC durch unterschiedlichen Stimulanzien. Jeweils 1, PBMC wurden in einer 96-Well-Rundbodenplatte mit IL-2 (1000 U/ml), PPD (10µg/ml) und SEB (5µg/ml) stimuliert. An Tag 6 wurde die Proliferation von je Ansatz mit dem Durchflusszytometer untersucht. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives Experiment von 4 mit ähnlichem Ergebnis. CFSE: Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester; FSC: Forward Scatter; IL-2: Interleukin-2; MTB-Extrakt: Extrakt von Mycobacterium tuberculosis; PBMC: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut; PPD: Purified Protein Derivative; SEB: Staphylokokken-Enterotoxin-B Als Stimulans für alle folgenden Versuche wurde das Antigen PPD ausgewählt, da die NK-Zell-Proliferation im Zusammenhang mit der antigenspezifischen T- Zell-Aktivierung untersucht werden sollte Bedeutung von DZ für die Lymphozytenproliferation Um die NK-Zell-Proliferation zu untersuchen ist eine ausgeprägte T-Zell- Aktivierung erforderlich. Zur Optimierung der T-Zell-Aktivierung wurden PBMZ zusammen mit unreifen DZ inkubiert. DZ sind sehr potente APZ und stimulieren nicht nur den TZR, sondern liefern über die CD80/CD28-Interaktion

30 24 Ergebnisse kostimulatorische Signale, wodurch die T-Zell-Aktivierung entscheidend verstärkt wird. Um DZ zu gewinnen wurden Monozyten aus PBMZ isoliert und separat mit IL-4 und GM-CSF zu unreifen DZ stimuliert. Nach 24 h wurden die differenzierten unreifen DZ wieder mit den verbliebenen PBMZ kokultiviert und mit PPD stimuliert. Um die T-Zell-Aktivierung von Monozyten und DZ miteinander zu vergleichen, wurden PBMZ mit und ohne Zugabe von DZ mit verschiedenen Antigenen stimuliert und die Proliferation nach 6 Tagen gemessen. Pro Ansatz wurden 1, PBMZ alleine oder PBMZ zusammen mit bestrahlten unreifen DZ in einer 96- Well-Rundbodenplatte inkubiert. Für diese Versuche wurden unterschiedliche Antigene ausgewählt. Zur Stimulation verwendeten wir PPD, MTB-Extrakt, Totallipid und Tetanus-Toxoid (TT). PPD ist ein Peptidantigen, welches aus den wasserlöslichen Fraktionen von Mycobakterium avis bzw. Mycobakterium bovis gewonnen wird. MTB-Extrakt ist ebenfalls ein Peptidantigen und besteht aus den Eiweissbestandteilen von M.tb. Eine Proliferationsreaktion auf diese Peptidantigene wird in Spendern erwartet, die bereits Kontakt mit Mykobakterien hatten, so dass sich Gedächtniszellen bilden konnten. Ein immunologisches Gedächtnis wird sowohl durch eine Infektion mit typischen oder atypischen Mykobakterien als auch nach früherer Tuberkulose-Schutzimpfung mit Bacille Calmette-Guérin induziert. Dagegen besteht Totallipid ausschliesslich aus freien Lipiden, die aus Mykobakterien-Lysaten durch Chloroform-Mathanol gewonnen wurden. Bisher ist noch nicht abschliessend geklärt, ob die Immunantwort gegen M. tb auch die Reaktion auf Lipide beinhaltet. TT ist ein Peptid, welches als Impfantigen gegen Clostridium tetani verwendet wird. Daher verfügen die meisten Spender über TTspezifische Gedächtniszellen, so dass nach Stimulation mit TT eine Proliferation in den meisten Proben zu erwarten ist. Im CFSE-Verdünnungstest zeigte sich nach 6-tägiger Inkubation, dass DZ in allen Ansätzen zu einer signifikanten Proliferationssteigerung im Vergleich zu nicht DZ-exponierten PBMZ führten (Abb.8). In 6 voneinander unabhängigen

31 25 Ergebnisse Experimenten stieg der Anteil proliferierter Zellen nach MTB-Extrakt-Stimulation von 14% auf 33% (p=0,03) und nach Totallipid-Stimulation von 3% auf 16% (p=0,02). Durch die Kokultur mit DZ erhöhte sich die Proliferation nach PPD- Stimulation von 5% auf 27% (p=0,007). Auch die Stimulation auf das Antigen TT hob die Proliferation in Anwesenheit von DZ von 5% auf 12% an (p=0,047). Daraus folgt, dass DZ unabhängig vom Antigen sehr gute APZ sind. A unstimuliert 0% MTB Totallipid PPD TT 24% 10% 2% 1% B FSC 51% 36% 41% 23% + DZ CFSE Abbildung 8: Bedeutung von DZ auf die Lymphozytenproliferation: In diesem Experiment wurde die Proliferation von PBMZ alleine mit der Proliferation von PBMZ zusammen mit DZ auf die Stimulation mit unterschiedlichen Antigenen verglichen. Nach 6-tägiger Inkubation wurden je Ansatz Zellen am Durchflusszytometer analysiert. (A) Diese 5 Dotplots zeigen die Ergebnisse der Proliferationsmessung, wenn PBMZ mit MTB-Extrakt (10µg/ml), Totallipid (10µg/ml), PPD (10µg/ml) und TT (10µg/ml) stimuliert werden. (B) Diese Dotplots zeigen die Ergebnisse der Proliferationsmessung wenn PBMZ zusammen mit DZ mit oben genannten Antigenen inkubiert werden. Die Abbildung zeigt ein repräsentatives Experiment von 6 mit ähnlichem Ergebnis. CFSE: Ca rboxyfluoreszein Succinimidyl Ester; DZ: Dendritische Zellen; FSC: Forward Scatter; MTB: Extrakt von Mycobacterium tuberculosis; PBMZ: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut; PPD: Purified Proteine Derivative; TT: Tetanustoxoid. Auf Basis dieser Versuche, wurden für die nächsten Experimente folgende Standardbedingungen definiert: 1. Zur Zellfärbung wurde eine 0,5 µm CFSE-Lösung verwendet. 2. Die Inkubation der PBMZ mit DZ erfolgte in einer 96-Well- Rundbodenplatte. 3. Zur Stimulation wurde das mykobakterielle Antigen PPD verwendet. 4. PBMZ wurden im Verhältnis 1:0,3 mit DZ kokultiviert.

32 26 Ergebnisse Mit diesem standardisierten Versuchsaufbau wurde in 18 voneinander unabhängigen Experimenten die PPD-spezifische Proliferation nachgewiesen. Durchschnittlich proliferierten 25% ± 9,15% (p< 0,001) der PPD-stimulierten PBMZ (Abb.9B). A 0,7% Medium 23l PPD FSC FSC CFSE CFSE B Medium PPD Abbildung 9: PPD-spezifische Lymphozytenproliferation nach Standardisierung der Bedingungen. Als Standardbedingung für alle weiteren Experimente gelten: PBMZ und unreife bestrahlte DZ wurden mit PPD (10µg/ml) inkubiert. Nach 6 Tagen erfolgte die Analyse von Zellen am Durchflusszytometer. Als Negativkontrolle diente die Inkubation in Medium ohne Zusatz (A) Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Ergebnis, wenn PBMZ nach Standardbedingungen stimuliert werden. (B) In dieser Abbildung ist die durchschnittliche Proliferation( ) sowie die Einzelmessungen ( ) der PPD-stimulierten Lymphozyten in 18 voneinander unabhängigen Experimenten dargestellt. CFSE: Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester; DZ: Dendritische Zellen; FSC: Forward Sca tter; PBMZ: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut; PPD: Purified Protein Derivative; : 1 Experiment; : Mittelwert; ***: hochsignifika ntes Ergebnis Phänotypische Charakterisierung proliferierender Zellen

33 27 Ergebnisse Nachdem eine valide Methode zur Messung der PPD-spezifischen Proliferation von PBMZ etabliert worden war, war das nächste Ziel die phänotypische Charakterisierung der aktivierten Zellen. Insbesondere sollten NK-Zellen und T- Zellen innerhalb der proliferierten Zellen anhand ihrer Oberflächenmarker identifiziert werden. PBMZ wurden mit CFSE gefärbt und 6 Tage mit PPD stimuliert. Anschließend wurden fluoreszierende Antikörper zur Darstellung des T-Zell-spezifischen CD3- Rezeptors und des NK-Zell-spezifischen CD56-Rezeptors verwendet. Am Durchflusszytometer wurden die Proliferation (CFSE-Färbung) und die Oberflächenmarker simultan detektiert. Dazu wurde ein Fenster auf die proliferierten CFSE-niedrigen Zellen gelegt und die ausgewählten Zellen anhand ihrer Oberflächenmarker dargestellt. Es zeigte sich, dass von den proliferierten Zellen 60% T-Zellen, 26% NK-Zellen und 7% NKT-Zellen waren (Abb. 10). A PPD B nur Zellen aus R1 26% T-Zellen 60% NKT-Zellen 7% FSC CD3 Rd NK-Zellen 26% CFSE CD56 Abbildung 10: Charakterisierung der proliferierten Zellen innerhalb der PBMZ. PBMZ wurden für 6 Tage mit PPD stimuliert und anschließend sowohl die Proliferation als auch die Oberflächenmarker der proliferierten Lymphozyten bestimmt. Dazu wurden Zellen am Durchflusszytometer analysiert. (A) In diesem Dotplot wurde ein Fenster auf die pr oliferierten PBMZ gelegt. Die proliferierten Lymphozyten stellen sich somit in der Region 1 (R1) dar. (B) Der Dotplot zeigt nur die pr oliferierten Zellen aus R1. Zusätzlich werden die einzelnen Lymphozyten populationen anhand einer CD3- /CD56-Oberflächenfärbung identifiziert. Die Abbildung zeigt ein Experiment von 10 mit vergleichbarem Ergebnis. CD: Cluster of differentiation; CFSE: Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester; FSC: Forward Scatter; NK: Natürliche Killer-Zelle; NKT: Natürl iche Killer-T-Zelle; PBMZ: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut; R1: Region 1; SSC: Sideward Scatter; T: T-Zelle.

34 28 Ergebnisse Bei 10 unabhängigen Spendern wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt: Tabelle 2: Durchschnittliche Proliferation der einzelnen Subpopulationen innerhalb der PBMZ mit Standardabweichung und Spannweite in 10 voneinander unabhängigen Experimenten. NK-Zellen: Na türl iche Killerzellen; NKT -Zellen: Na türl iche Killer T-Zellen; PBMZ: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut Zellpopulation M ittelwert Standardabweichung Spanne T-Zellen 54% ±10% 35 bis 74% NK-Zellen 20% ±14% 5 bis 38% NKT-Zellen 13% ±10% 1 bis 42% Dieser Ausgangspunkt leitete zur Kernfrage der vorliegenden Arbeit: Was ist der Mechanismus hinter der NK-Zell-Aktivierung nach Stimulation von PBMZ mit mikrobiellen Antigenen? Nachweis der Proliferation aufgereinigter NK-Zellen Zunächst wurde die Möglichkeit geprüft, dass NK-Zellen direkt durch PPD aktiviert werden. Eine Aktivierung könnte z.b. über die Bindung an TLR oder bisher unbekannte Mechanismen erfolgen. Deshalb wurden aufgereinigte NK- Zellen mit PPD inkubiert und die Proliferation im CFSE-Verdünnungstest bestimmt. Voraussetzung für dieses Experiment war die Isolation von NK-Zellen aus PBMZ Anreicherung der NK-Zellen Ziel der NK-Zell-Isolierung war es, eine aufgereinigte CD56-positive Population mit einem sehr hohen NK-Zell-Anteil zu gewinnen. Gleichzeitig sollte der Anteil an CD3-positiven Zellen äusserst gering sein, um eine mögliche Reaktion auf die Aktivität von NK-Zellen und nicht auf T-Zell-Verunreinigungen zurückführen zu können. Dazu wurden alle Zellen der PBMZ - abgesehen der NK-Zellen - mit Fe 2+ -

35 29 Ergebnisse haltigen Antikörpern markiert. Durch die Passage durch ein Magnetfeld gelang die Separation von Antikörper-markierten Zellen und NK-Zellen. Vor der NK- Zell-Depletion wurde die Ausgangspopulation der PBMZ mit dem Durchflusszytometer auf ihren NK-Zell-Anteil untersucht. Dieser betrug in 43 voneinander unabhängigen Experimenten durchschnittlich 9% (Abb. 11A). Die durchflusszytometrische Untersuchung nach der NK-Zell-Aufreinigung zeigte einen durchschnittlichen NK-Zell-Anteil von 91% (Abb. 11B). Der Anteil an T- Zellen in der aufgereinigten Population war vernachlässigbar (<0,5%). Mit diesem Verfahren konnte zuverlässig eine für unsere Zwecke ausreichend reine NK-Zell- Population gewonnen werden.

36 30 Ergebnisse A PBMZ vor NK-Zell- Aufreinigung aufgereinigte NK-Zellen CD3 11,7% CD3 94,2% CD56 CD56 C % in 60 n le e 40 - Z K N 20 0 vor Aufreinigung nach Aufreinigung Abbildung 11: Reinheit der NK-Zellen nach Aufreinigung. Aus PBMZ wurden durch magnetische Aufreinigung NK-Zellen isoliert. (A) In diesem Dotplot werden PBMZ vor der Aufreinigung auf ihre Zellzusammensetzung analyisert. NK-Zellen sind CD56- positiv, T-Zellen CD3-positiv und NKT-Zellen CD3- und CD56-positiv. (B) Hier ist die NK-Zell-Ausbeute nach magnetischer Aufreinigung eines repräsentiativen Spenders dargestellt. (C) Die Abbildung zeigt den durchschnittlichen NK-Zell-Anteil vor und nach Aufreinigung in 43 voneinander unabhängigen Experimenten mit Darstellung des Standardfehlers. CD: Cluster of differentiation; NK-Zellen: Natürliche Killerzellen; PBMZ: mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut Einfluss von PPD auf die Proliferation der NK-Zellen Aufgereinigte NK-Zellen sind in vitro schwierig zu kultivieren. Falsch negative Messergebnisse als Folge von absterbenden NK-Zellen, mussten daher durch eine Positivkontrolle ausgeschlossen werden. Dazu eignet sich das proliferativ wirksame Zytokin IL-2. Die optimale IL-2-Konzentration, wurde durch eine Titration ermittelt (Abb. 12).

37 31 Ergebnisse A unstimuliert IL-2 (100 U/ml) IL-2 (1000 U/ml IL-2 ( U/ml) 1,2% 42% 54% 58% FSC CFSE B 80 % in n 60 le e - Z K 40 N t e r ie r 20 life r o p U/ml 1000 U/ml U/ml Abbildung 12: Einfluss der IL-2-Konzentration auf die NK-Zell-Proliferation. CFSEgefärbte NK-Zellen wurden mit IL-2 Konzentrationen von U/ml stimuliert und die Proliferation nach 6 Tagen durchflusszytometrisch ermittelt. (A) Darstellung der NK-Zell-Proliferation auf unterschiedliche IL-2-Konzentrationen von einem repräsentativen Experiment (B) Durchschnittliche NK-Zell-Proliferation auf unterschiedliche IL-2 Konzentration in 4 voneinander unabhängigen Experimenten. CFSE: Carboxyfluoreszein Succinimidyl Ester; FSC: Forward Scatter; IL-2: Interleukin-2; NK-Zellen: Natürliche Killerzellen; *:signifikantes Ergebnis; ***: hochsignifikantes Ergebnis. CFSE-gefärbte NK-Zellen wurden mit IL-2-Konzentrationen von 100 U/ml bis U/ml stimuliert. Die Ergebnisse zeigen eine signifikante Steigerung der NK-Zell-Proliferation bei Erhöhung der IL-2-Konzentration auf 100 U/ml (p=0,008) und 1000 U/ml (p=0,01). Eine weitere Steigerung der Konzentration bis auf U/ml IL-2 hatte keinen zusätzlichen Effekt. Daher wurde in nachfolgenden Experimenten die Positivkontrolle mit einer IL-2-Konzentration von 1000 U/ml durchgeführt. Um jetzt den Effekt von PPD auf aufgereinigte NK-Zellen zu untersuchen, wurden CFSE-gefärbte NK-Zellen mit PPD (10µg/ml) inkubiert. Nach 6 Tagen wurde die CFSE-Verdünnung am Durchflusszytometer untersucht. Die Auswertung zeigte,