Molekularpathologie Teil 1 Michel Bihl

Transkript

1 PathoBasic Molekularpathologie Teil 1 Michel Bihl

2 Plan 1- Molekularpathologie interaktiv 2- Molekularpathologie dynamisch 3- Molekularpathologie methodisch Sanger Sequenzierung

3 Molekularpathologie interaktiv

4 Molekularpathologie interaktiv

5 Molekularpathologie interaktiv Martini et al. Nature Reviews Clinical Oncology 2011

6 Molekularpathologie interaktiv: Kolonkarzinom KRAS/BRAF/PIK3CA WT = 10-20% Responder KRAS G13 = 10% KRAS K146 =0.5% PIK3CA E545 = 5% Non- Responder KRAS G12 = 30% KRAS Q61=1% PIK3CA H1047=3% BRAF V600 = 5-10% NRAS <1% KRAS/BRAF/PIK3CA WT = 10-20% Martini et al. Nature Reviews Clinical Oncology 2011

7 HS2 Molekularpathologie dynamisch Labor-Aktivität 2005 Lunge 1 Gen (2 Exone = 8 Sequenzen) Kolon 1 Gen (1 Exon = 4 Sequenzen) Heute Lunge Kolon 4 Gene (9 Exone = 36 Sequenzen) 3 Gene (8 Exone = 36 Sequenzen) + Translokation (FISH) Morgen 1 Patient Gene Panel (> 20 Gene)

8 Folie 7 HS2 was wurde dann bei Lunge 2005 untersucht? EGFR ex19 und 21? Hoeller Sylvia;

9 Neue Möglichkeiten durch NGS FFPE Gewebe, Zytologie-Material? gdna DNA Extraktion Amplifizierung Kalibrierung Sequenzierung Analyse Gesamt RNA RNA Extraktion Amplifizierung Kalibrierung Sequenzierung Analyse (Gen+t(:) Ampliseq Cancer Panel KIT for 46 Onkogen und Tumor-Suppressor

10 Untersuchungstechniken Mutations-Screening versus gezielte Mutationsdetektion PCR und Sequenzierung (Sanger oder Pyrosequenzierung) Mutationsspezifische Real-Time PCRs (Qiagen, Roche, Entrogen, etc.) PCR and High-Resolution-Melting Assay PCR, Primerextension und MALDI-TOF PCR, Primerextension und DNA-Chip Analyse (z.b. Infinity) PCR mit Mutationsanreicherung und Sequenzierung PCR und Next-Generation-Sequencing (454, Illumina, IonTorrent, etc.) IHC mit mutationsspezifischen monoklonalen Antikörpern 10-20% 1-15% 5-10% 10% 10% 0.1-1% variabel n.a. Minimaler Tumorzellanteil Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Zimmermann, Zürich

11 Proben in der Pathologie Zytologie (nicht fixiert): BAL, Pleuraflüssigkeit, Zervikalabstrich DNS Extraktion: - Mikrolaser Capture (MLC) - Abkratzen - Zentrifugation Hämatologie: Blut, Knochenmark Aspirat DNS Extraktion: - Mikrolaser Capture (MLC) - Abkratzen - Zentrifugation Histologie (fixiert): Biopsie, Feinnadelbiopsie, Bronchoskopie, Koloskopie DNS Extraktion: - Mikrolaser Capture (MLC) - Abkratzen - Paraffin-Schnitt/Stanzen

12 Molekularpathologie methodisch Abkratzen Stanzen

13 Molekularpathologie methodisch Mikrolaser Capture

14 Molekularpathologie methodisch Einzelstrang 1- Erhitzen (95 C) = Denaturierung Fortgeschrittene Denaturierung Beginnende Denaturierung Duplex

15 Molekularpathologie methodisch

16 Molekularpathologie methodisch

17 Molekularpathologie methodisch Dideoxysequencing Fluorescently labeled DNA fragments move through a capillary.

18 Molekularpathologie methodisch Problem: Heterogenität der Tumorproben Teilweise sehr hoher Anteil nicht-mutierter Zellen (z.b. Entzündungszellen) Tumorzellanteil (%) mut. Allelanteil (%)

19 Molekularpathologie methodisch BRAF Exon 15 WT

20 Molekularpathologie methodisch BRAF Exon 15 WT BRAF Exon 15 p.v600e

21 Molekularpathologie methodisch GNAS1 Exon 8 WT

22 Molekularpathologie methodisch GNAS1 Exon 8 WT GNAS1 Exon 8 p.r201c

23 Molekularpathologie methodisch

24 Molekularpathologie methodisch CKIT Exon 9 p.a502-y503dup CKIT Exon 11 WT?

25 Molekularpathologie methodisch CKIT Exon 9 p.a502-y503dup CKIT Exon 11 p.w557-v559delinsf (homozygot!)

26 Vielen Dank

27 Molekularpathologie dynamisch

28 EGFR Pathway und Medikamente Zugelassene Target-Drugs bei soliden Tumoren Therapeutische Antikörper Bevacizumab (Avastin) Cetuximab (Erbitux) Panitumumab (Vectibix) Trastuzumab (Herceptin) Zielmolekül(e) VEGF EGFR EGFR ERBB2/HER-2/NEU CRC, MammaCa, NSCLC, RCC, etc. CRC, HNSCC CRC Zieltumore MammaCa Pertuzumab (Perjeta) ERBB2/HER-2/NEU MammaCa Ipilimumab (Yervoy) CTLA-4 Melanoma Prof. Zimmermann, Zürich

29 Kinase-Hemmer (niedermolekulare Hemmstoffe) Zielmolekül(e) Erlotinib (Tarceva) Gefitinib (Iressa) Imatinib (Glivec) Vemurafenib (Zelboraf) Sunitinib (Sutent) Sorafenib (Nexavar) EGFR EGFR ckit, PDGFR B-Raf VEGFR, PDGFR, ckit, Flt3, Ret VEGFR, PDGFR, B-Raf, C-Raf, Flt3 NSCLC NSCLC Pazopanib (Votrient) VEGFR, ckit, PDGFR RCC GIST, Melanoma Melanoma RCC, GIST HCC, RCC Vandetanib (Caprelsa) EGFR, VEGFR, Ret TyroidCa Lapatinib (Tyverb) EGFR, ERBB2/HER-2/NEU MammaCa Crizotinib (Xalkori) EML4/ALK, Met NSCLC mtor-hemmer EGFR Pathway und Medikamente Temsirolimus (Torisel) mtor RCC Zieltumore Everolimus (Afinitor) mtor RCC, pancreatic NET

30 EGFR Pathway und Medikamente OS und KRAS Kodon 12/13 Mutationsstatus Zlobec et al. 2010

31 KRAS Untersuchungen Wo sind die Mutation (COSMIC ref.) KRAS Gen Exon 2 Exon 3 Exon 4 Kodon 12 83% von mut. Kodon 13 15% von mut. Kodon % von mut. Kodon % von mut. G12S = 1359 G12R = 853 G12C = 3177 G12N = 1 G12 I = 4 G12 Y = 2 G12F = 50 G12W = 3 G12D = 9267 G12A = 1484 G12V = 6196 G12E = 3 G13C = 230 G13S = 62 G13R = 47 G13N = 1 G13I = 1 G13D = 3500 G13A = 28 G13V = 37 G13E = 4 G13N = 2 Q61K = 40 Q61E = 10 Q61P = 12 Q61R = 59 Q61L = 77 Q61H = 256 Q61D = 1 A146T=81 A146P = 5 A146V = 25 A146G = 1 K147N = 1

32 KRAS Untersuchungen RAS und KIT Untersuchungen am Universitätsspital Basel Tendenz BRAF BRAF-KRAS BRAF-NRAS CKIT-BRAF CKIT CKIT-Exon CKIT-PDGFRA EGFR-KRAS KRAS Mikrosatelliten NRAS 0 1 4

33 KRAS Untersuchungen Problem: Heterogenität der Tumorproben Teilweise sehr hoher Anteil nicht-mutierter Zellen (z.b. Entzündungszellen) Tumorzellanteil (%) mut. Allelanteil (%)

34 KRAS Untersuchungen Tumorheterogenität Intratumorale Heterogenität von KRAS und BRAF Mutationen in primären kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Metastasen MutationsAnalyse für KRAS (Kodon 12/13) und BRAF (Kodon 600) von 48 primären kolorektalen Karzinomen und 32 dazugehörenden Metastasen.

35 KRAS Untersuchungen Tumorheterogenität für KRAS PRIMARY TUMOR- KRAS METASTASIS- KRAS # Result Result 10 wt wt wt wt. wt G12V G12V G12V G12V G12V G12V wt/g12 16 wt wt wt wt wt wt wt wt G12C wt wt C 18 G13C G13C G13C G13C G13C G13C wt wt wt wt wt wt 20 wt. G12D G12D G12D 21 wt wt wt wt G13D wt/ G12D. G13C G13C G13C G13C G13C wt/g1 3D wt wt wt wt wt wt 36 G12C G12C G12C G12C G12C G12C wt wt wt wt wt wt 37 wt wt wt wt. wt G12D G12D G12D G12D G12D G12D

36 KRAS Untersuchungen Tumorheterogenität für KRAS Primärtumor Metastase

37 KRAS Untersuchungen Tumorheterogenität für KRAS Konkordanz Primär vs Metastase Mix an WT und MUT? (Intratumoral) DISCORDANT CONCORDANT 12.5% der Primärtumore und 12.5% der Metastasen zeigten einen Mix aus wt/mut

38 KRAS Untersuchungen Tumorheterogenität für KRAS Heterogenität von primären vs metastasierenden CRC existiert -> führt zu nicht korrekter Klassifizierung in >10% Konsequenzen für die Therapie nicht bekannt Mechanismen der Entwicklung von Tumoren mit heterogenem Tumormarker nicht bekannt

39 KRAS Untersuchungen Tumorheterogenität für BRAF PRIMARY TUMOR- BRAF METASTASIS- BRAF # Result Result 12 wt wt wt wt wt wt V600E V600E V600E V600E V600E V600E 20 V600E wt wt wt wt wt/v600e wt wt wt wt wt wt 21 wt wt wt wt wt wt V600E V600E V600E V600E V600E V600E V V600E E V600E wt. wt/v600e wt wt wt wt wt wt Konkordanz DISCORDANT Mix an WT und MUT? 6,3% der Primärtumore und 0% der Metastasen zeigten einen Mix aus wt/mut CONCORDANT

40 Untersuchungsgut: - Primärtumor-Resektate - Metastasen Proben in der Pathologie KRAS-Mutationsanalyse Indikation: Metastasiertes kolorektales Karzinom (metastasiertes nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom) Formalin-fixiertes und Paraffin-eingebettetes Gewebe (auch ältere Archivblöcke). Untersuchungsdauer: 5-10 Arbeitstage (wird z.z. zweimal pro Woche durchgeführt) Kosten: DNA-Sequenzierung (Tarmed Position ) + Beurteilung (> 30 min) Total 664 Taxpunkte (1 Taxpunkt entspricht z.z CHF.)

41 Proben in der Pathologie DNA Extraktion Paraffin-Schnitt / Stanze Skalpeldissektion LCM Entparaffinieren+trocknen (Speed-Vac) DNA-Extraktionskit (Promega) Rohverdau

42 Entwicklung der Molekularpathologie Beispiel einer Labororganisation

43 Sequenzierungsmethoden Pyrosequencing Q24 1- Seq. Primer hybridization 2- addition of dntp, release PPi 4- apyrase degrades unincorporated dntps and ATP. 5- example of Pyrogram trace 3- ATP sulfurylase converts PPi to ATP - ATP drives conversion of luciferin to oxyluciferin - production of light proportional [ATP] - The light is detected by a CCD chip and seen as a peak Pyrogram

44 Sequenzierungsmethoden Next Generation Sequencing (NGS) Example of Ion Torrent Keine Sequenzierungsfehler durch: H+ Modifizierte Basen Fluoreszierende Basen Laserdetektion Enzymatische Amplifizierungskaskaden

45 Sequenzierungsmethoden Next Generation Sequencing (NGS) Example of Ion Torrent

46 Sequenzierungsmethoden Example für Diagnostik AmpliSeq Cancer Panel nur 10 ng DNA kompatibel mit FFPE Gewebe 190 Amplikons im selben Röhrchen (multiplex PCR Assay) von der extrahierten DNA zum Resultat in 9.5 Stunden molekulare Barcodes reduzieren den Preis und erlauben Proben-multiplexing quantifizierbare Resultate für deep sequencing detektiert Mutationen in heterogenen Proben

47 Sequenzierungsmethoden NGS: AmpliSeq Cancer Panel 46 Gene, 739 Mutationen ABL1 EGFR HRAS NOTCH1 SMARCB1 AKT1 ERBB2 IDH1 NPM1 SMO ALK ERBB4 JAK2 NRAS SRC APC FBXW7 JAK3 PDGFRA STK11 ATM FGFR1 KDR PIK3CA TP53 BRAF FGFR2 KIT PTEN VHL CDH1 FGFR3 KRAS PTPN11 CDKN2A FLT3 MET RB1 CSF1R GNAS MLH1 RET CTNNB1 HNF1A MPL SMAD4

48 Surveyor und Sequenzierung

49 Surveyor und Sequenzierung SURVEYOR Mutation Detection Kits

50 Surveyor und Sequenzierung EU RAS Mutation Detection Options Test IVD Status TBIO^ Surveyor scan KRAS(RAScan)* CE-IVD KRAS ex2 KRAS ex3 KRAS ex4 NRAS ex2 NRAS ex3 NRAS ex4 TBIO^ Surveyor scan NRAS (RAScan)* CE-IVD Sanger Sequencing QiagentherascreenKRAS RGQ PCR Kit TBIO^ Surveyor scan KRAS * RUO only PMA, CE-IVD, IVD (Japan) CE-IVD c12,6xmt c13,1xmt Qiagen PyroMark KRAS CE-IVD c12,6xmt c13,1xmt c61, 4xMT not c59 QiagenPyroMarkNRAS CE-IVD c12,6xmt c13,1xmt c61, 4xMT not c59 Randox KRAS,BRAF,PIK3CA CE-IVD c12,6xmt c13,3xmt c61, 4xMT not c59 c146, 2xMT NGS (LifeTech) Ampliseq Panel RUO only not c59 not c117 NGS (Illumina) TruSeq Panel RUO only Green shaded panels represent exons interrogated if alleles defined, shown in black font; specific alleles not measured shown in in red font ^= Transgenomic Biotechnologies *= Requires Sanger sequencing to confirm a positive screening result (primers generate product that can be sequenced directly) 49

51 Surveyor und Sequenzierung Testing Strategy Paradigms 1. Reflex approach: Conduct existing KRAS testing and for those ~60% of patients that are wild-type, reflex to test for any exons/codons not tested a. Reflex option, CE-IVD: Transgenomic (TBIO) RAScan (requires confirmation of MT by Sanger sequencing, expect this to occur on average in one exon per six patients) b. Reflex option, RUO/Laboratory Developed Test: Sanger sequencing of all exons not tested 2. Test for all KRAS and NRAS exons in parallel: a. CE-IVD: Transgenomic (TBIO) RAScan (requires confirmation of MT by Sanger sequencing, expect this to occur on average in one exon for 50% of patients) i. On average, 1 exon to be subjected to Sanger sequencing for each two patients b. RUO/Laboratory Developed Test: Sanger Sequencing of all exons (requires 7 amplicons to be sequenced) i. Seven sequencing runs per patient (unless staging of exons conducted) c. RUO/Laboratory Developed Test: Next Generation Sequencing of all exons in parallel i. Exons tested in parallel (together with additional oncogenes) (NB: Currently LifeTech panel missing NRAS c59 and c117; Illumina missing NRAS exon 4) 50

52 Surveyor und Sequenzierung Surveyor Scan Analysis Results in >90% Fewer Sequencing Runs than Sanger Alone (# s based on replicate analyses) Pt. Method First Results Repeats/ Patient Repeat Process Repeat Results Total Sequencing Runs $ Cost Time 10 Sequencing (10 samples, 7 amplicons, 2 x bidirectional ) 280 seq. Runs Reextraction due to insufficient DNA 1 sample, 7 amplicons x 2 bidirectional/ re-extracted sample 28 seq. runs/sample re-extracted (# reanalyzed patients x 28) High ++++ Pt. Method First Results First Results Repeat Process Repeat Results Total Sequencing Runs $ Cost Time 10 WAVE screen (10 samples, 7 amplicons, 2 x SURVEYOR Nuclease digestion) 140SURVEYOR Scan Analyses: Detects mutations in amplicons, only 1 amplicon needs to be sequenced per patient 20seqrxns assuming 50% negative for KRAS Exon 2 1 sample, 7 amplicons, 2 x SURVEYOR digestion. Only positive amplicon sequences 2 x bidirectional 0-4 seq. runs/sample re-extracted (dependent on KRAS Exon2 status) 20 + (number reanalyzed that are not KRAS Exon2 mutant positive x 4) Low + Transgenomic-2013 Prepared for internal use and for European operations only 51

53 Surveyor und Sequenzierung Features and Benefits of 551 Features 1. Simple to use 2. Not allele-specific 3. Sensitive and specific 4. Only CE-IVD kit currently available 5. Rapid turn around time 6. Cost-effective Benefits 1. CEIVD Patients and clinicians can rely on results from validated test 2. Highly trained personnel not needed; assay results easy to interpret 3. Can detect all mutations in region of interest 4. Identifies patients most likely to benefit from panitumumab and those best suited to alternate regimens 5. Patients can be treated in a timely manner 6. Scanning technology identifies only those samples that need to be sequenced Transgenomic-2013 Prepared for internal use and for European operations only 52

54 Surveyor und Sequenzierung Hands on Time Process Time Extraction Pyrosequencing: 24 samples/run < 5 min ~35 min Amplification < 5 min ~85 min 2x Load and Go < 15 min 25 min Results total min/sample Infinity : 24 samples/run Hands on Time < 5 min < 5 min < 5 min Process Time ~35 min ~85 min 240 min Dideoxysequencing: 192 samples/runs Hands on Time Process Time < 5 min ~35 min < 5 min ~85 min 2x 40 min 360 min Surveyor Detection Kit: 24 samples/runs (estimation) < 5 min < 5 min < 5 min Hands on Time Process Time ~35 min ~85 min 45 min? Wenn mutiert, Pyroseq. : ~85 min 25 min

55 Surveyor und Sequenzierung Pyrosequencing INFINITI Dideoxysequencing RF U rati o G G1 3A 7 0 Neg G1 3C Neg G1 3D Neg G1 3R Neg G1 3S 23 0 Neg G1 3V Neg SURVEYOR Scan K-RAS G12V 15% G G1 2A 65 G1 2C 34 G1 2D 29 0 G1 2F 10 G1 2R 69 G1 2S 33 G1 2V Neg Neg Neg Neg Neg Neg Pos WT? REVEAL Kit KRAS Exon 2

56 Zusammenfassung RAS Untersuchungen besonders die KRAS Mutations- Analyse ist nötig für die Planung von vielen neuen Therapiestrategien (personalized medicine) KRAS Mutationsanalyse muss insbesondere bei CRC mit neuen molekularen Biomarkern ergänzt werden (zusätzlich zu PIK3CA und BRAF) KRAS Mutationen beeinflussen das Ansprechen auf Cetuximab oder Panitumumab (Martini et al.) Unterschiedliche KRAS Mutationen beeinflussen das OS unterschiedlich (Zlobec et al.)

57 Vielen Dank