5 Nucleinsäuren: Struktur und Organisation

Transkript

1 95 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation Zusammenfassung ucleinsäuren sind hochmolekulare olynucleotide. Sie gelten als Schlüsselmoleküle des Lebens, denn sie enthalten die genetische Information. In allen Zellen ist die Desoxyribonucleinsäure (DA) die Gensubstanz. Bausteine der ucleinsäuren. Die ucleinsäuren sind aus den Basen Adenin, Guanin, ytosin und Thymin bzw. Uracil, den Zuckern Desoxyribose (in DA) bzw. Ribose (in RA) und hosphorsäure aufgebaut. Die hosphorsäure bildet als Diester die Brücke zwischen den Zucker-Resten. Die genetische Information ist in der Sequenz der Basen enthalten. Diese determiniert die Aminosäure-Sequenz von roteinen. Sie ist in einem ode verschlüsselt, bei dem eine Folge von drei Basen eine Aminosäure festlegt. Mittlersubstanz zwischen DA und rotein ist eine informationstragende RA, die sogenannte Messenger-RA (abgekürzt mra). yrimidin- und urin-basen können im rganismus aus kleinen Bausteinen aufgebaut werden. Der Abbau der urin-basen führt zur arnsäure. Die DA bildet Makromoleküle von sehr großer Länge. Durch die Wirkung von Restriktionsendonucleasen kann die DA an spezifischen Sequenzen gespalten werden. Für die Raumstruktur der DA gilt das Watson-rick-Modell der Doppelhelix: Zwei ucleinsäure-einzelstränge sind als Schraube umeinander verdreht. In dem so entstehenden Doppelstrang sind die Basen stets paarweise angeordnet, wobei Thymin mit Adenin und ytosin mit Guanin durch Wasserstoff-Brücken in Wechselwirkung treten. Diese Basenpaarung erklärt die identische Replikation, wobei ein Strang jeweils den anderen eindeutig determiniert, sowie die Informationsübertragung (Transkription) auf die mra. Die hromosomen der Eukaryonten bestehen aus DA und roteinen. Grundstruktur ist das ucleosom, das aus istonen und DA aufgebaut ist. Die bakterielle DA ist ringförmig geschlossen. athobiochemisch spielen die ucleinsäuren neben den funktionellen Folgen von Mutationen im Genom bei folgenden Erkrankungen eine Rolle: Gicht ist durch erhöhte arnsäure-konzentrationen im Blut gekennzeichnet (yperurikämie). Sie ist meist Folge einer ierenfunktionsstörung mit verminderter renaler learance der arnsäure, selten beruht sie auf Enzymdefekten des urinstoffwechsels. Das Lesch-yhan-Syndrom ist eine genetisch bedingte Erkrankung, bei der die Wiederverwertung von urin-basen gestört ist. Das betroffene Enzym ist die ypoxanthin-guanin-hosphoribosyltransferase. Adenosin-Desaminase-Mangel und ucleosid-hosphorylase-mangel führen zu Störungen der Bildung von T- und B-Lymphozyten. Bei verschiedenen Autoimmunerkrankungen werden Antikörper gegen Bestandteile des Zellkerns (DA, Ribonucleoprotein-artikel, istone) gefunden. Übersicht 5.1 Desoxyribonucleinsäure als Träger genetischer Information Bausteine der ucleinsäuren rimärstruktur der ucleinsäuren Raumstruktur der Desoxyribonucleinsäure Analyse der DA-Struktur hromosomenstruktur athobiochemie 112 Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

2 96 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation Die ucleinsäuren wurden 1869 von Miescher in Lymphocyten (aus Eiter) entdeckt. Ihre biologische Bedeutung blieb lange Zeit unbekannt, bis Avery, MacLeod und Mcarty (1944) den Beweis für ihre genetische Funktion erbrachten und Watson und rick 1953 im rinzip der Basenpaarung den Schlüssel zur Informationsübertragung fanden. Die ucleinsäuren gelten als die Schlüsselmoleküle des Lebens, denn sie enthalten die genetische Information. ucleinsäuren sind chemisch olynucleotide. Sie sind aufgebaut aus heterozyklischen Basen, Kohlenhydrat und hosphorsäure. Wir unterscheiden nach der Art des Kohlenhydrats die 1. Desoxyribonucleinsäuren, DS bzw. DA abgekürzt, mit 2-Desoxyribose als Kohlenhydrat, und 2. Ribonucleinsäuren, RS oder RA abgekürzt, welche Ribose als Kohlenhydrat enthalten. Dieser rein chemischen Unterscheidung entspricht biologisch eine verschiedene Funktion: Die Desoxyribonucleinsäure stellt das Substrat der genetischen Information dar, die Ribonucleinsäuren sind an der Biosynthese der roteine unmittelbar beteiligt. 5.1 Desoxyribonucleinsäure als Träger genetischer Information Das Gen als Einheit der Vererbung. Die Erbfaktoren oder Gene sind zunächst als biologische Einheiten definiert worden, und zwar durch die Fähigkeit zur Merkmalsauslösung, zur identischen Reproduktion und zur Mutation. Im Erbexperiment wird das Verhalten bestimmter erblicher Merkmale (z. B. aarfarbe, morphologische Besonderheiten, Stoffwechselfunktionen u. a.) untersucht. Die Erbfaktoren oder Gene sind auf den hromosomen lokalisiert und werden nach den Mendel-Gesetzen vererbt. Die Tatsache, dass die Gene unverändert von Generation zu Generation weitergegeben werden, oft an viele tausend achkommen und an Millionen von Zellgenerationen, zwingt dazu, ihnen die Fähigkeit zur identischen Replikation zuzuschreiben. Als sehr seltenes Ereignis beobachtet man plötzliche Veränderungen der Erbfaktoren. Das veränderte Gen wird in dieser Form weitergegeben. Solche Mutationen sind ursächlich an der Evolution beteiligt. 5.1 DA-Menge verschiedener Genome *. rganismus Basenpaare ca. Erdkröte (Bufo bufo) 6, Maus (Mus musculus) 3, Mensch (omo sapiens) 2, Fruchtfliege 1, (Drosophila melanogaster) Acker-Schmalwand 7, (Arabidopsis thaliana) efe (Saccharomyces cerevisiae) 2, Escherichia coli (Bakterien) 3, hloroplasten (Tomate) 1, Mitochondrien (efe) 0, Mitochondrien (Mensch) 1, Bakteriophage l 4, Affenvirus SV 40 5, lasmid pbr322 4, * bei Eukaryonten ist der haploide hromosomensatz angegeben. Desoxyribonucleinsäure (DA) als Gensubstanz. Den Beweis dafür, dass die DA die genetische Information trägt, haben die klassischen Experimente zur Transformation von Bakterien (Avery, MacLeod, Mcarty 1944) geliefert. Das transformierende Agens erwies sich als hochmolekulare DA. DA ist bei Bakterien, vielen Viren und höheren rganismen die genetische Substanz. Die DA-Menge und damit der Umfang der Information ist allerdings bei Viren, Bakterien und höheren rganismen (und innerhalb dieser Gruppen) sehr verschieden, wie 5.1 zeigt. Bei Bakterien kennt man neben dem ringförmigen hromosom noch kleinere ringförmige DA-Moleküle, die lasmide genannt werden. Sie sind oft in mehreren Kopien vorhanden, können unabhängig von der chromosomalen DA repliziert und bei der Zellteilung an die Tochterzellen weitergegeben werden. In den Zellen höherer rganismen ist DA, d. h. genetisches Material, nicht nur in den hromosomen des Zellkerns, sondern auch ringförmig in Mitochondrien und in den lastiden der flanzen enthalten. Grundprinzip der Informationsübertragung durch ucleinsäuren ( Zentrales Dogma der Molekularbiologie ). Ein DA-Strang besteht aus einer Folge von ucleotiden (s. u.), die sich in ihrem Basenanteil unterscheiden. Im Doppelstrang sind zwei DA-Stränge helikal umeinander gewunden, wobei die Basen nach innen zeigen und jeweils Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

3 5.2 Bausteine der ucleinsäuren 97 komplementäre Basen einander gegenüberliegen (s. S. 104). Für die Informationsübertragung durch ucleinsäuren gelten die folgenden rinzipien: Die genetische Information ist in der DA als Sequenz der Basen codiert; die vier Basen Adenin, Guanin, ytosin und Thymin bilden gewissermaßen ein Alphabet mit den vier Buchstaben A, G, und T. ach dem rinzip der aarung komplementärer Basen (A paart mit T, G paart mit ) vermag jede dieser Basen die korrespondierende Base eindeutig zu determinieren. Damit kann die Information beliebig weitergegeben und übertragen werden: Die ucleinsäuren haben die Fähigkeit zur Selbstinstruktion, die identische Reduplikation (Replikation) gehorcht dem rinzip der Basenpaarung. Die genetische Information determiniert die Aminosäure-Sequenz von roteinen. Sie ist in einem ode verschlüsselt, bei dem eine Folge von drei Basen eine Aminosäure bedeutet (s. S. 142). Mittlersubstanz zwischen DA und rotein ist eine informationstragende RA, die sogenannte Messenger-RA (Boten-RA); abgekürzt mra. Die Zusammenhänge sind in 5.1 schematisch dargestellt. Wichtig ist, dass danach der Fluss der Information von der ucleinsäure zum rotein verläuft, nie umgekehrt. Die gesamte in der DA codierte Erbinformation eines rganismus bezeichnet man als Genom. Es enthält nicht nur Informationen für die proteincodierende mra, sondern auch für andere RA-Arten wie Transfer-RA und ribosomale RA; auch die DA-Abschnitte, welche die Information für diese weiteren RA-Arten enthalten, werden als Gene bezeichnet. Es gibt ferner DA-Sequenzen, an denen regulatorische Faktoren, z. B. im Rahmen der Kontrolle der RA-Synthese, angreifen, und es gibt noch andere Sequenzen, an denen keine RA- Synthese (Transkription) stattfindet. Inwieweit diese eine funktionelle Bedeutung haben, ist im Einzelnen noch nicht geklärt. DA DA DA reverse Transkription mra Enzym- rotein Substrat Replikation Transkription Translation Stoffwechsel rodukt 5.1 Grundprinzip der Informationsübertragung durch ucleinsäuren. ach oben ist die identische Replikation dargestellt, nach unten der Fluss der Information über mra und rotein, hier ein Enzymprotein, welches in den Stoffwechsel eingreift. In Klammern: Umkehr der Transkription bei RA-Tumorviren. 5.2 Bausteine der ucleinsäuren Die Bausteine der hochmolekularen ucleinsäure sind die ucleotide. Sie können im Körper selbst aufgebaut werden und sind, wie bereits erwähnt, aus einer Base, einem Zucker und hosphorsäure zusammengesetzt. Durch -glykosidische Verbindung einer Ribose oder 2- Desoxyribose mit einer ucleinbase entsteht ein ucleosid. Ein ucleotid ist der -hosphorsäureester eines ucleosids. Die Basen. In den ucleinsäuren kommen urin-basen und yrimidin-basen vor ( 5.2). Ihre amen und Formeln sind in 5.2 aufgeführt. Das Thymin ist typischer Bestandteil der DA; Uracil wird praktisch nur in RA gefunden. ypoxanthin ist in erster Linie ein rodukt des urin-stoffwechsels, aber es wird (wie auch andere seltene Basen) in tra gefunden. Der Zucker. Wie schon erwähnt, kennt man Desoxyribonucleinsäure (DA) mit 2-Desoxyribose als Zucker, und Ribonucleinsäure (RA) mit Ribose als Zucker ( 5.2). Ein Gen ist ein Abschnitt einer ucleinsäure, der die Information für ein rotein oder ein RA-Molekül enthält. Bei diploidem hromosomensatz kann ein Gen in zwei Ausprägungen vorliegen; diese nennt man Allele. Die Gesamtheit der Erbinformation eines rganismus bezeichnet man als dessen Genom. Base-Zucker-hosphat ucleosid ucleotid Die ucleoside bestehen aus einem Zucker und einer -glykosidisch damit verknüpften urin- oder yrimidin-base. Sie haben Trivialnamen, die von denen der Basen abgeleitet sind und bei yrimidin- Derivaten auf -idin, bei den urin-ucleosiden auf -osin enden. Zur Unterscheidung von der Bezifferung der Basen mit einfachen Ziffern Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

4 98 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation urin 2 b-d-ribose yrimidin 2 b-d-desoxyribose 5.2 Grundstruktur der ucleinsäure-bausteine. werden die -Atome des Zuckers mit 1' bis bezeichnet (s. die Formelzusammenstellung in 5.2). Die ucleotide sind hosphorsäureester der ucleoside. Die - hosphate haben wir bereits als Bestandteil der oenzyme kennen gelernt (S.77 ff.). Die hosphorsäure wird gemäß einer internationalen Vereinbarung durch ein großes abgekürzt. Wir werden dies meist zusätzlich durch eine rote Unterlegung kenntlich machen. Während zum Aufbau der ucleotid-oenzyme oftmals Vitamine nötig sind (s. 4.1, S. 73), können deren ucleotid-bestandteile und die Bausteine der ucleinsäuren im rganismus selbst aufgebaut werden. Seltene Bausteine der ucleinsäuren. Außer den lange bekannten Bausteinen findet man in manchen ucleinsäuren (vor allem bei Bakteriophagen und in der Transfer-RA, s. u.) seltene Basen bzw. 5.2 Die wichtigste ucleinbasen und ucleotide. urin-derivate Basen: Adenin (Ade) 2 Guanin (Gua) ypoxanthin (yp) ucleoside: ' 1' ' 2' Adenosin (A) Guanosin (G) Inosin (I) yrimidin-derivate 2 Basen: ytosin (yt) Uracil (Ura) 3 Thymin (Thy) 2 ucleoside: 2 4' ' ' 2' ytidin () Uridin (U) Thymidin (dt) Seltene ucleoside 2 seudouridin (y) Dimethylguanosin (m 2 G) 2 Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB ) Ribose 6 -Isopentenyladenosin (ia)

5 5.2 Bausteine der ucleinsäuren 99 ucleoside. ierzu gehören u. a. 5-Methylcytosin, die am Stickstoff methylierten Basen der auptnucleotide, das 6 -Isopentenyl-adenosin und das seudouridin, bei dem das -1 der Ribose mit dem -5 des yrimidin-rings über eine --Bindung verknüpft ist ( 5.2, unterste Zeile). Auch einige seltene ucleoside sind in 5.2 mit aufgeführt. Diese seltenen Bausteine entstehen durch nachträgliche Modifizierung. Synthese und Abbau der yrimidine Die yrimidin-biosynthese ( 5.3) beginnt mit der Bildung von arbamoylphosphat durch die cytoplasmatische arbamoylphosphat- Synthetase II (das mitochondriale Enzym des arnstoffzyklus, S. 211, wird mit I beziffert) (1). arbamoylphosphat, eine Verbindung mit hohem Gruppenübertragungspotenzial, reagiert mit Aspartat zum arbamoyl-aspartat (2), welches in einer Gleichgewichtsreaktion (3) zum Dihydroorotat zyklisiert. In tierischen Zellen sind alle drei Enzymaktivitäten (arbamoylphosphat-synthetase, Aspartat-Transcarbamoylase und Dihydroorotase) in einer einzigen eptidkette verankert. Die Synthetase und die Dihydroorotase werden allosterisch reguliert, nicht aber die Aspartat-Transcarbamoylase. Dihydroorotat wird nun zum rotat dehydriert (4), und dieses reagiert mit 5-hosphoribosyl-1-diphosphat (R) zum rotidin-- phosphat (5), welches zum Uridin--phosphat (UM) decarboxyliert wird (6). Die weitere hosphorylierung zum UT geschieht durch spezifische Kinasen mit AT als hosphat-donor. Allgemeines zur omenklatur. Die omenklatur der ucleotide haben wir bereits am Beispiel der Adenosinphosphate (AM, AD, AT) kennen gelernt (s. S. 83). Die übrigen ganz entsprechend aufgebauten ucleosidphosphate werden in analoger Weise bezeichnet und abgekürzt, wobei das ucleosid meist nur mit dem ersten Buchstaben abgekürzt wird; so steht G für Guanosin, für ytidin usw. Die Desoxyribonucleotide, die als Bausteine der DA wichtig sind, werden durch Vorsetzen von d gekennzeichnet, also dam für Desoxyadenosinmonophosphat, dt für Desoxycytidintriphosphat. Aus Gründen der Einheitlichkeit kürzt man das Thymidin mit dt ab, da es ein Desoxyribonucleosid ist. Das seudouridin wird mit dem griechischen Buchstaben y bezeichnet. 3 + Glutamin 2 AT 1 2 arbamoylphosphat 2 AD + i Glutamat + 2 Aspartat T i 2 Aspartat-Transcarbamoylase 3 Dihydroorotase Dihydroorotat Glu Gln AD + i + + AT + 2 DF 7 Methylen-TF UT 2 AD + 4 UM 2 AD R 2 6 rotat 5 i 2 rotidin-- dtm 8 dum 5.3 Biosynthese der yrimidin-ucleotide. Sie verläuft über Uridin--phosphat (UM). Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

6 100 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation Regulation der Aspartat-Transcarbamoylase bei E. coli. Im Gegensatz zu Eukaryonten liegen bei E. coli drei getrennte roteine vor, von denen besonders die Aspartat-Transcarbamoylase für die Regulation von Bedeutung ist. Sie besteht hier aus 6 Untereinheiten. Das Enzym wird durch T allosterisch gehemmt und durch AT stimuliert. Die de-novo-synthese des Enzyms wird durch T gehemmt ( 3.19c, S. 67). Die anderen yrimidine gehen aus Uridin-Derivaten hervor. Die T- Synthase (7) wandelt die -Gruppe am -Atom 4 des Uridintriphosphats mit Ammoniak oder Glutamin in die Amino-Gruppe um, wodurch ytidintriphosphat entsteht. Die Thymidin-Derivate werden mit ilfe der Thymidylat-Synthase (8) durch Methylierung von Uridin- bzw. Desoxyuridinmonophosphat mit 5, 10 Methylentetrahydrofolat synthetisiert (zur Regenerierung von Methylen-TF s. 4.19, S. 89). Uracil 2 2 Dihydrouracil AD + + AD Abbau des Uracils b-alanin 2 2 -arbamoylb-alanin 2 3 Der Abbau des Uracils ( 5.4) verläuft als Umkehrung der Biosynthese, d. h. der Ring wird partiell hydriert und zwischen -3 und -4 hydrolytisch geöffnet. Da jedoch beim Übergang rotsäure fi Uridin 2 abgespalten wird, erscheint als Abbauprodukt nicht Aspartat, sondern das Decarboxylierungsprodukt b-alanin. Synthese und Abbau der urine Die Biosynthese des urin-rings ( 5.5) verläuft wesentlich umständlicher als jene der yrimidine. Zwei rinzipien sind bemerkenswert: Erstens vollzieht sich die Synthese am Ribose-5-phosphat-Teil des ucleotids, zweitens erfolgt der Aufbau des Rings aus kleinsten Einheiten; das größte Bruchstück ist ein Glycin-Molekül, alle anderen - oder -Atome werden einzeln eingeschoben. Aus 5.5 und der Erläuterung dazu geht das Wesentliche hervor. (Zur Übersicht über den urin-stoffwechsel s. a. 5.28, S. 114.) Die Regulation der urin-biosynthese erfolgt in erster Linie bei der Bildung des 5-hosphoribosylamins, die von der Glutamin-R- Amidotransferase katalysiert wird (Reaktion 1 in 5.5). Dieses Enzym wird durch die ucleotide AM, GM und IM allosterisch gehemmt; sind also ausreichend Mononucleotide die Endprodukte dieses Biosyntheseweges vorhanden, dann ist die Synthese abgeschaltet. Abbau der urin-basen ( 5.6). Im Stoffwechsel entstehen stets freie urin-basen. Ebenso entstehen bei der Verdauung aus den ucleinsäuren ucleoside und freie Basen, die in die Stoffwechselprozesse einbezogen werden. Soweit die urin-basen nicht wieder verwendet werden (Salvage-athway, s. u.), werden sie zur arnsäure oxidiert, welche beim Menschen die Endstufe des urin-abbaus darstellt. Wie 5.6 zeigt, wird dabei Adenosin zunächst zu Inosin desaminiert. Durch phosphorolytische Abspaltung der Ribose entsteht ypoxanthin, das weiter zu Xanthin oxidiert wird. Vom Guanosin wird zunächst die Ribose abgespalten, das Guanin wird dann zu Xanthin desaminiert. Die xidation von ypoxanthin und von Xanthin zu arnsäure ( 5.6) wird durch die Xanthin-xidase bewirkt. Dieses Enzym ist ein Flavoprotein von sehr geringer Substratspezifität, das z. B. auch Formaldehyd zu Ameisensäure oxidieren kann. Die Reaktion ist sauerstoffabhängig. Bei den meisten Säugetieren wird die arnsäure weiter abgebaut zu Allantoin oder Allantoinsäure; beim Menschen und Menschenaffen wird sie jedoch unverändert ausgeschieden. Die methylierten Xanthine haben pharmakologisches Interesse (Theophyllin = 1,3-Dimethylxanthin, offein = 1,3,7-Trimethylxanthin. Manche Analoga der urine (6-Thioguanin, 6-Mercaptopurin) werden als hemotherapeutika gegen Tumoren verwendet. eben der Reduktion auf Diphosphat-Ebene gibt es bei manchen Bakterien einen Stoffwechselweg, bei dem die Triphosphate durch ein obalamin-oenzym zu den Desoxynucleosidtriphosphaten reduziert werden. Auch hierbei ist Thioredoxin beteiligt. Bildung der Desoxyribonucleotide. Die Desoxyribonucleotide, die als Bausteine für die DA wichtig sind, entstehen durch reduktive Entfernung der 2'--Gruppe. Die Reaktion, katalysiert durch die Ribonucleotid-Reduktase, vollzieht sich bei den yrimidin- und urin- ucleotiden in gleicher Weise auf der Stufe der Diphosphate. Wasserstoff-Donor für die Reduktion ist das Thioredoxin, ein rotein aus 106 Aminosäuren (S. 81). Es enthält zwei reaktionsfähige S-Gruppen, Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

7 5.2 Bausteine der ucleinsäuren 101 AM, GM, IM Glutamin Glutamat 2 1 i 5-R hosphoribosylamin Glycin 2 AT AD + i Formyl-TF 3 TF 2 2 Glutamin Glutamat 4 AT AD + i Aspartat AT AD + i Fumarat 10 -Formyl-TF Aspartat TF 2 Inosinmonophosphat (IM) GT GD + i 10 Fumarat AD + AD Glutamat Glutamin 12 2 Adenosin monophosphat (AM) Guanosin monophosphat (GM) i + AM AT Xanthosin--phosphat 5.5 Biosynthese der urin-ucleotide. Durch die Glutamin-R-Amido-Transferase wird zunächst eine Aminogruppe (aus Glutamin) auf 5-hosphoribosyl-1-diphosphat übertragen (1). Dabei entsteht 5-hosphoribosylamin, an das nun Glycin in Säureamid- Bindung angegliedert wird (2). An dieses Gerüst werden nun die einzelnen Atome angelagert. In Reaktion (3) wird ein 1 -Fragment vom 10 -Formyl-Tetrahydrofolat auf den Amino-Stickstoff des Glycins übertragen, dann wird der Sauerstoff der Glycinamid-Bindung durch Stickstoff ersetzt (4, 2 -Donor ist auch hier wieder Glutamin). In der Reaktion 5 wird der Fünfring geschlossen. In einer weiteren Reaktion (6) wird eine arboxy-gruppe an -6 eingeführt, die aus Bicarbonat stammt; die Reaktion benötigt keine Biotinaktivierte arboxy-gruppe. Die arbonsäure wird nun in das Amid umgewandelt (7), wobei Aspartat den Stickstoff liefert. In Reaktion 8 wird eine Formyl-Gruppe vom 10 -Formyl-Tetrahydrofolat eingefügt, um den Sechsring zu schließen (9); das rodukt ist Inosin-- phosphat (IM). Beim Übergang in Adenosin--phosphat (AM) liefert Aspartat den Stickstoff (10), Adenylosuccinat ist Zwischenprodukt. Der Übergang in Guanosin--phosphat (GM) erfolgt durch Wasseranlagerung in 2,3-Stellung, Dehydrierung der ydroxy- Gruppe zum Xanthosin--phosphat (11) und Amidierung zu GM (12), wobei Glutamin 2 -Donor ist. Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

8 102 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation Guanosin Adenin ART Guanin Xanthin arnsäure AM GM 2 i 2 i Allantoin i Rib Xanthin- xidase 2 2 i 2 3 i Rib AM Adenosin Inosin Guanin ypoxanthin GRT GM bzw. IM AM IM 5.7 Wiederverwertung von urin-basen. ART: Adenin-hosphoribosyltransferase, GRT: ypoxanthin-guanin-hosphoribosyltransferase. ypoxanthin i 2 2 Allantoinsäure 5.6 Abbau der urin-ucleotide. die an der Reduktion des Zuckers mitwirken. Das oxidierte Thioredoxin (-S-Form) kann durch AD wieder reduziert werden. Wiederverwertung der urin- und yrimidin-basen ( 5.7). Die im Stoffwechsel entstehenden freien urin-basen werden zum Teil wieder verwertet, und zwar durch einen Stoffwechselweg, der im Englischen Salvage athway genannt wird. Die wichtigste Reaktion hierbei ist die Bildung der ucleotide aus 5-hosphoribosyl-1-diphosphat (R) und den entsprechenden urin-basen. ierfür gibt es zwei verschiedene Enzyme, eine für Adenin spezifische hosphoribosyltransferase (ART) und eine hosphoribosyltransferase, die ypoxanthin und Guanin als Substrate akzeptiert (GRT). Eine solche hosphoribosylierung der freien Basen wurde für die yrimidine bisher nur im Falle von Uracil beschrieben, weiterhin eine hosphorylierung von entsprechenden ucleosiden. 5.3 rimärstruktur der ucleinsäuren Die ucleinsäuren sind kettenförmige Makromoleküle. Ihre Bausteine sind die ucleotide. ¾hnlich wie bei den roteinen kann man verschiedene Stufen der molekularen rdnung unterscheiden: 1. Die rimärstruktur ist die Sequenz der ucleotide bzw. Basen; in dieser Sequenz liegt die Information, die die DA bzw. RA trägt. 2. Die Sekundärstruktur ist hier definiert als die Folge der aarung komplementärer Basen (z. B. in der tra als kleeblattförmige Darstellung, s. S. 141). 3. Die Tertiärstruktur bezeichnet die vollständige Raumstruktur mit bekannter osition aller Atome (z.b. die DA-Doppelhelix, aber auch die räumliche Anordnung des tra-kleeblatts als hakenförmige Struktur). rimärstruktur der Desoxyribonucleinsäure (DA). Die ucleinsäuren sind chemisch olynucleotide: Zahlreiche ucleoside sind durch hosphorsäure (in Diesterbindung) miteinander verknüpft. Da bei den Desoxyribonucleosiden, die wir zunächst betrachten, die Stellung 1' der Desoxyribose durch die Base, die Stellung 4' durch den furanoiden Ring besetzt ist, kann die hosphorsäure nur die ydroxyle 3' und miteinander verknüpfen. Aus dieser Art der Kettenbildung ergeben sich zwei definierte Enden des ucleinsäure-moleküls: ach einer Übereinkunft schreibt man die Kette so, dass das - -Ende, das noch einen hosphat-rest trägt, links, das 3'--Ende rechts steht. Das -Ende mit den ersten fünf Desoxynucleotiden eines DA-Strangs ist in 5.8a dargestellt. Bei einer anderen Darstellung wird die Fischer-rojektion der Ribose oder Desoxyribose durch einen senkrechten Strich, die hosphorsäure durch ein symbolisiert ( 5.9). Als Basen sind in 5.8a die urin-derivate Adenin und Guanin und die yrimidin-derivate ytosin und Thymin aufgeführt. Das Vorkommen von Thymin kennzeichnet die Desoxyribonucleinsäure, Ribonucleinsäuren enthalten stattdessen Uracil ( 5.8b). In der DA stehen Adenin und Thymin im Molverhältnis 1:1, ebenso Guanin und ytosin. Damit sind in doppelsträngiger DA stets gleich viele urin- und yrimidin-basen vorhanden. Wie später gezeigt wird, ist dies eine logische Konsequenz der Basenpaarungsregeln. Molekülgröße. Die Länge der DA-Ketten kann außerordentlich groß sein. Es hat sich eingebürgert, als Maß für die Kettenlänge die Zahl der Basen (bei Doppelsträngen: Basenpaare) in Einheiten von je 1000, d. h. in Kilobasen (kb) anzugeben (s. 5.1, S. 96). Man kann natürlich auch die relative Molekülmasse M r (S. 15) als Einheit wählen; zur Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

9 5.3 rimärstruktur der ucleinsäuren 103 a b Guanin Adenin 3 2 Thymin 2 2 Adenin 2 2 ytosin 2 Uracil 2 2 Adenin 2 2 ytosin 3 2 Thymin 3' 3' 5.8 Struktur der ucleinsäuren. a Formelausschnitt eines DA-Strangs mit hosphat am -Ende. Kurzschreibweise dieser Sequenz: pdg-dt-d-da-dt oder d(pgptppapt) oder GTAT. b Formelausschnitt eines RA-Strangs mit hosphat am -Ende. Umrechnung sei angegeben, dass die mittlere Molekülmasse einer ucleotid-einheit 310 beträgt; näherungsweise rechnet man oft mit 330 (3 ucleotide zu M r 1000). Die DA einzelner hromosomen ist aus einer einzigen Doppelhelix aufgebaut. Diese erreicht zum Beispiel bei dem längsten der vier hromosomen von Drosophila melanogaster eine Länge von ca. 26 mm und ist aus Basenpaaren aufgebaut. Das ringförmige hromosom des Bakteriums Escherichia coli enthält 3800 kb, und eine der kleinsten Virusnucleinsäuren, die des Affenvirus SV 40, ist nur 5230 Basenpaare lang (s. a. 5.1). rimärstruktur der Ribonucleinsäuren (RA). Sie sind ganz ähnlich aufgebaut wie die DA, bestehen also ebenfalls aus zahlreichen ucleosiden, die durch hosphorsäure über die 3'- und die -- Gruppe miteinander verknüpft sind. Das rinzip ist in der 5.8b dargestellt. Man unterscheidet nach ihrer Funktion verschiedene Klassen von Ribonucleinsäuren: Transfer-RA (tra), ribosomale RA (rra), Messenger-RA (mra) und weitere RA-Arten (wie z. B. die Vorläufer von mra, prä-mra bzw. hnra, heterogeneous nuclear RA) oder kleine Kern-RA-Arten, small nuclear RA, (snra), deren Funktion bei der Besprechung der Transkriptionsmechanismen (S. 128) beschrieben wird. Wir behandeln diese verschiedenen Ribonucleinsäuren an späterer Stelle (Kap. 6); hier sei nur erwähnt, dass sie nicht nur verschiedene Funktionen besitzen, sondern auch verschieden lang sind. Im Vergleich zu Messenger-RA und ribosomaler RA sind Transfer-Ribonucleinsäuren kleine Moleküle, sie bestehen aus circa 90 ucleotiden und enthalten relativ viele seltene Basen. In den Ribosomen höherer G T A T 3' 5.9 Sequenzdarstellung einer ucleinsäure. Der senkrechte Strich symbolisiert die Ribose oder Desoxyribose, steht für hosphorsäure. Länge der verschiedenen RA-Arten. Anzahl ucleotide tra 8090 mra je nach codiertem rotein rra (5S, 5,8S, 18S, 28S) snra (U1-U6 snra) Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

10 104 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation 3 Zucker Thymin Zucker Adenin rganismen findet man vier verschiedene ribosomale Ribonucleinsäuren, nach ihren Sedimentationskonstanten als 5S-, 5,8S-, 18S- und 28S-rRA bezeichnet (s. 6.5, S. 144). Die Messenger-Ribonucleinsäuren (mra) stellen eine heterogene Gruppe mit Kettenlängen von einigen 100 bis zu mehreren 1000 kb dar. Im Zellkern findet man Vorstufen der mra, die aus noch sehr viel größeren Molekülen bestehen. 3 Zucker ytosin Zucker Guanin 5.10 Basenpaarung durch Wasserstoff-Brücken. Die glykosidischen Bindungen zum Zucker stehen einander nicht diametral gegenüber, sondern bilden einen Winkel. drib 3 Lactam ( Keto ) drib 3 Lactim ( Enol ) 5.11 Lactam- und Lactim-Form des Thymins. a b große Furche kleine Furche 3' A T G G A T G G A T 3' 2nm 3,4nm 5.12 Basenpaarung der DA. a Schema der Basenpaarung. Die komplementären Stränge haben entgegengesetzte olarität. b Räumliche Struktur der Doppelhelix. 5.4 Raumstruktur der DA Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB ) Watson und rick haben aufgrund der von hargaff bestimmten Basenzusammensetzung und der von Franklin und Wilkins ermittelten Röntgendaten ein Modell entwickelt, das die Grundlage der modernen Molekularbiologie geworden ist. Basenpaarung. Dem Strukturmodell liegt die Annahme zugrunde, dass je zwei Basen durch Wasserstoff-Brückenbindungen (s. S. 2) miteinander in Beziehung treten; das ist bei dem aar Adenin-Thymin und bei Guanin-ytosin möglich. Dabei werden zwischen A und T zwei und zwischen G und drei Wasserstoff-Brückenbindungen ausgebildet ( 5.10). Durch diese Basenpaarung werden zwei olynucleotid-stränge zusammengehalten; gleichzeitig bestimmt jede der Basen den entsprechenden artner, so dass ein Strang die vollständige Sequenz der Basen im anderen Strang festlegt. In 5.12 ist das dargestellt; jedes Basensymbol korrespondiert nur mit einem bestimmten artner und bestimmt ihn damit. Kurze und lange Symbole verdeutlichen, dass immer eine yrimidin- mit einer urin-base paart. Die Basenpaarung kann nur stattfinden, wenn alle jeweils beteiligten Basen in der Lactam-(Keto-)Form vorliegen ( 5.11). Die Doppelhelix. Denkt man sich das zweisträngige Band verdrillt, so erhält man ein ungefähres Abbild vom Watson-rick-Modell der Desoxyribonucleinsäure: Zwei DA-Einzelstränge (oder zwei älften des Moleküls) sind in Form eines Doppelstranges so zu einer rechtsgängigen Schraube miteinander verdreht, dass eine Windung ca. 10 Basenpaare enthält (Grund- oder B-Konformation, s. u.). Eine Schemazeichnung des Modells zeigt 5.12b. Die Basenpaare liegen horizontal, dadurch können ihre p-eiektronen über van-der-waals- Kräfte in Wechselwirkung treten. Diese Stapelung der Basen (engl. base stacking) trägt wesentlich zur Stabilität der Konformation bei. Die Zucker-Fünfringe und die hospho-diester-brücken bilden den äußeren Mantel der Schraube, deren Durchmesser etwa 2 nm beträgt. Die beiden Stränge haben entgegengesetzte olarität (= Richtung vom zum 3'-Ende). Wie schon das Schema der Basenpaarung ( 5.10) zeigt, stehen die beiden Zuckerreste sich nicht diametral gegenüber. Dies führt dazu, dass die Windungen der beiden elices z. T. weiter entfernt sind, z. T. näher beieinander liegen. Es gibt deshalb eine große (breite) Furche und eine kleine oder schmale Furche auf der berfläche der DA- Doppelhelix ( 5.12b und 5.13a). A- und B-Konformation. eben der Grundform der DA, welche als B- DA bezeichnet wird, wurde bei geringerer ydratisierung eine parakristalline A-DA beobachtet, bei der die Basen gegenüber dem Zucker-hosphat-Gerüst geneigt erscheinen und eine vollständige Windung 11 Basenpaare umfasst. Wie die B-DA, so entspricht auch die A-DA einer rechtsgängigen Schraube. ach dem rinzip der Basenpaarung können auch RA-RA-Doppelstränge und DA-RA-ybrid-Doppelstränge ausgebildet werden.

11 5.4 Raumstruktur der DA 105 RA-RA-Doppelstränge und DA-RA-ybrid-Doppeltränge besitzen eine A-Form. Die unterschiedlichen Raumstrukturen von A- und B-DA beruhen in erster Linie auf verschiedenen Konformationen der Desoxyribose unter den jeweiligen ydratationsbedingungen: In A-DA liegt das - 3' der Desoxyribose über der Ebene des Furanrings ( 3 '-endo), in B- DA ist das Desoxyribose-Molekül in der 2 '-endo-konformation (das -2' liegt über der Ringebene [zur Raumstruktur von Zucker-Molekülen s. S. 230]). Im RA-Molekül verhindert die -Gruppe an 2 ' das Entstehen einer B-Form eines RA-RA- oder RA-DA-Doppelstrangs. Z-Konformation der DA. Im Watson-rick-Modell bilden beide Stränge rechtsgewundene Schrauben. Es ist auch eine Form mit entgegengesetzter Schraubenrichtung möglich. Sie wird als Z-Konformation bezeichnet, weil hier das Zucker-hosphat-Gerüst zick-zackförmig geknickt vorliegt ( 5.13b). Vieles weist darauf hin, dass in Eukaryonten-hromosomen einzelne Abschnitte in Z-Konformation vorliegen können. Dies wird begünstigt durch Sequenzen, in denen urin- und yrimidin-basen abwechselnd aufeinander folgen. Wenn umgebende DA durch ihre Überspiralisierung einen Zwang auf solche DA ausübt, könnte es hier zur Ausbildung von Z-DA- a b 5.3 Vergleich der verschiedenen DA-Formen. B-DA A-DA Z-DA Windungsrichtung rechtsgängig rechtsgängig linksgängig elixdurchmesser 2,37 nm 2,55 nm 1,84 nm Länge pro Windung (Ganghöhe) 3,54 nm 2,53 nm 4,56 nm Basen pro Windung 10, Kalottenmodell von B- und Z-DA. a B- DA, b Z-DA. Die Zucker-hosphat-Bindungen sind hervorgehoben und zeigen die Umkehrung der Schraubenwindung sowie ihren geknickten Verlauf in der Z-DA (nach A. Rich). Abschnitten kommen. Der Übergang von B-DA zur Z-DA erfolgt besonders leicht in G-reichen Abschnitten; er lässt sich in vitro durch hohe Salzkonzentration erzielen. Denaturierung der DA. ¾hnlich wie bei der Erwärmung von roteinen ebenvalenzen gelöst werden und die native Konformation verloren geht (Denaturierung, s. S. 35), so bleibt auch die Struktur des Doppelstrangs nicht stabil. Erwärmt man die DA auf etwa 70 bis 90 8, so beobachtet man eine Aufspaltung des Doppelstrangs zu Einzelsträngen durch Lösung der Wasserstoff-Brückenbindungen. Dabei ändern sich die physikalischen Eigenschaften (u. a. Viskosität, Lichtabsorption, s. 5.14). Man hat dieses Aufbrechen der elixstruktur mit dem Schmelzvorgang verglichen, bei dem das Kristallgitter zusammenbricht, und spricht in diesem Sinne vom Schmelzpunkt der DA. Er ist abhängig von der Basenzusammensetzung; eine Greiche DA hat einen höheren Schmelzpunkt, da sich zwischen G und drei Wasserstoff-Brücken ausbilden können. Renaturierung. Unter geeigneten Bedingungen lassen sich denaturierte DA-Abschnitte wieder zu Doppelsträngen zusammenfügen. Die Geschwindigkeit dieser Renaturierung ist umso größer, je mehr gleichartige Sequenzen in einem ucleinsäure-gemisch vorhanden sind. Man drückt die Geschwindigkeit der Reassoziation durch ein rodukt aus DA-Konzentration und Renaturierungszeit, den sogenannten o t-wert aus. Die o t-kurven haben eine große Rolle bei der Analyse der DA auf repetitive Sequenzen gespielt (s. S. 111). ybridisierung. ucleinsäuren, die über längere Strecken des Moleküls eine komplementäre Basensequenz besitzen, können sich zu relative Absorption bei 260nm 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 oly d(at) native DA mit AT- und G- Basenpaaren Temperatur ( ) T m 90 oly d(g) 5.14 DA-Schmelzkurve. Die mittlere Schmelztemperatur (T m, auch Schmelzpunkt genannt) hängt von der Basenzusammensetzung ab. (oly d[at] und oly d[g] sind synthetische olydesoxynucleotide, die ausschließlich G- bzw. AT-Basenpaare aufweisen.) Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

12 106 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation + Elektrophorese (Auftrennung der DA nach Fragmentgröße) Übertragung der DA- Fragmente auf eine itrocellulose-membran ( Blot ) ybridisierung mit markierter, definierter DA (ybridisierungs-sonde) Identifizierung von DA-Abschnitten (Southern-Blot) Eine einfache Form der Identifizierung von DA-Abschnitten durch ybridisierung wurde von E. M. Southern entwickelt. ierzu spaltet man die zu untersuchende DA an spezifischen Stellen (durch Restriktionsendonucleasen, s. u.) in Fragmente verschiedener Größen und trennt diese durch Elektrophorese in einem geeigneten Trägermaterial (Agarose, s. Kap. 17.6) nach ihrer Größe auf. Aus dieser Agarose kann man die DA nach Denaturierung auf DAbindende Membranmaterialien (z. B. itrocellulose) übertragen. Wegen der Analogie zum Löschblatt (engl. blotting paper) wird die Methode als Southern- Blot bezeichnet. ach der Fixierung der DA auf der itrocellulose-membran kann diese dann der vorgesehenen ybridisierungssonde ausgesetzt werden. Die markierte Sonde wird nur dort binden, wo sie komplementäre DA vorfindet, und kann z. B. durch Autoradiographie genau lokalisiert werden ( 5.15). In gleicher Weise kann RA elektrophoretisch aufgetrennt, auf Membranfilter übertragen und durch eine geeignete Sonde aufgespürt werden. Diese Methode wird in Anlehnung an die Southern-ybridisierung als orthern-verfahren bezeichnet. Ganz analog bezeichnet man die Identifizierung membrangebundener, elektrophoretisch aufgetrennter roteine mit ilfe von Antikörpern als Western-Blot (s. S. 42) Autoradiographische Identifizierung des hybridisierten Fragments 5.15 rinzip des Southern-Blot (ybridisierungsanalyse nach elektrophoretischer Auftrennung von ucleinsäuren). Doppelschrauben zusammenlagern, die aus je einem Strang von jeder ucleinsäure bestehen. Wenn die beiden Stränge aus verschiedenen Genomen stammen oder aus einem DA- und einem RA-Strang zusammengesetzt sind, bezeichnet man dies als ybrid-bildung. Sie kann sowohl zwischen Einzelsträngen zweier strukturell verwandter DA-Moleküle (z. B. Gene für homologe roteine aus verschiedenen Tierarten) als auch zwischen einem Molekül DA und einem komplementären RA-Molekül eintreten. Das rinzip der ybridisierung kann zum achweis einer bestimmten DA oder RA in einem ucleinsäure-gemisch dienen. ierzu wird eine einzelsträngige DA oder RA, welche zur Sequenz der gesuchten ucleinsäure komplementär ist, in markierter Form (zum Beispiel durch Einbau radioaktiver Isotope) als ybridisierungssonde verwendet. Zur ybridisierungsanalyse muss die zu untersuchende DA einzelsträngig angeboten werden. Dies wird durch Alkalibehandlung oder Erhitzen über die Denaturierungs-Temperatur erreicht. Die Einzelstrang-DA wird dann bei geeigneter Temperatur (die unterhalb der Denaturierungs-Temperatur liegen muss) mit der markierten Sonden-ucleinsäure zur ybridisierung gebracht. Durch geeignete Trennmethoden werden dann die ybride von verbliebenen Einzelsträngen getrennt und markierte DA-DA- oder DA-RA-ybride nachgewiesen (s. 5.15). 5.5 Analyse der DA-Struktur Wie bei den olypeptid-ketten, so ist auch bei DA die Ermittlung ihrer Sequenz eine Voraussetzung zum Verständnis ihres räumlichen Aufbaus und ihrer Funktion. Angesichts der Dimensionen der DA galt die Sequenzermittlung lange Zeit als unlösbare Aufgabe. Erst Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

13 5.5 Analyse der DA-Struktur 107 nach 1975 wurden effizientere Methoden zur Sequenzbestimmung der DA entwickelt. Wie bei den roteinen wird das Makromolekül zunächst in größere Bruchstücke zerlegt. 3' G A T G G T A G 3' vu ll Spaltung durch Desoxyribonucleasen. Bei der enzymatischen Spaltung von ucleinsäuren wird die hosphorsäurediester-bindung hydrolytisch gelöst. Wie bei den roteinasen (s. S. 200) unterscheidet man Exonucleasen, die vom Ende der Kette her ucleotid für ucleotid freisetzen, und Endonucleasen, die innerhalb der Kette mehr oder weniger spezifisch spalten. Viele ucleasen (z. B. Dase I) greifen spezifisch Doppelstrang-DA an, andere (z. B. Exo-Dase I und Endonuclease S 1 ) vermögen nur einzelsträngige DA zu spalten. Die lange bekannten Dasen, die man etwa im ankreas findet, spalten die hochmolekularen ucleinsäuren in kleine Bruchstücke; es sind Verdauungsenzyme. Die Restriktionsendonucleasen haben für die Strukturaufklärung der DA eine große Bedeutung erlangt. Es sind bakterielle Enzyme, die sehr spezifisch für bestimmte Basensequenzen sind. Diese Sequenzen sind, wie 5.16 zeigt, meist zentralsymmetrisch; man nennt sie in einem solchen Fall alindrom. Andere Erkennungsstellen weisen im Zentrum unsymmetrische Bereiche auf oder weichen völlig von dem alindrom-aufbau ab. Bisher wurden mehr als 500 verschiedene Restriktionsendonucleasen beschrieben. Sie werden mit amensabkürzungen der erkunftsbakterien benannt. Falls aus einer Spezies mehrere verschiedene Enzyme isoliert werden können, werden diese mit römischen Ziffern durchnummeriert (z. B. vu I und vu II aus roteus vulgaris); 3' G A T A T T A T A G 3' Eco RI 5.16 Die Spaltung der DA durch Restriktionsendonucleasen führt häufig zu versetzten Enden. In dem gezeigten Beispiel resultieren überhängende -Enden (z. B. bei Spaltung durch Eco RI). Andere Enzyme erzeugen stumpfe Enden (z. B. bei Spaltung durch vu II), wiederum andere führen zu überhängenden 3'-Enden. alindrom bezeichnet ursprünglich Wörter, die von vorn und hinten gelesen dasselbe ergeben, wie Anna oder Reliefpfeiler. Spaltstellen-Kartierung. Voraussetzung für die Anwendung der Restriktionsendonucleasen für die DA-Analyse ist ein geeignetes einheitliches DA-räparat, das nicht zu lang ist. Ein wichtiges ilfsmittel zur Gewinnung geeigneter DA in ausreichender Menge ist die Klonierung in Bakteriophagen oder bakteriellen lasmiden geworden (s. S. 173 ff.). Restriktionsfragment-Längen-olymorphismus (RFL) Die Größenanalyse von DA-Fragmenten nach Spaltung mit Restriktionsenzymen ( 5.16) kann, zusammen mit der Southern-Blot-ybridisierung, dazu dienen, Variationen in der Verteilung von Restriktionsschnittstellen im Genom verschiedener Individuen (oder in den beiden Allelen eines Individuums) nachzuweisen: Zunächst lässt man die DA durch ein Restriktionsenzym schneiden. Anschließend sucht man mit ilfe einer ybridisierungssonde nach einem bestimmten DA-Abschnitt. Entsprechend der Anordnung der Schnittstellen in der Umgebung dieses DA-Abschnitts zeigt die Sonde Fragmente unterschiedlicher Länge an ( 5.17). Falls eine Korrelation eines derartigen Restriktionsfragment-Längen-olymorphismus (RFL) mit einer genetisch bedingten Erkrankung besteht, ist die RFL-Analyse von diagnostischer Bedeutung. Allel A a b c AA ABBB kb 5.17 rinzip des RFL-achweises. In Allel A spaltet ein bestimmtes Restriktionsenzym an den Stellen a, b und c, so dass Fragmente von 2 kb und 1 kb entstehen. Beide Fragmente reagieren in der Southern-Blot-ybridisierung (rechts im Bild) mit einer markierten Sonde, welche komplementäre Abschnitte zu beiden Fragmenten enthält. Wenn in Allel B eine weitere Spaltstelle (d) zwischen a und b hinzukommt, wird das 2-kb-Fragment in zwei Teilfragmente gespalten, die beide von der Sonde erfasst werden. Bei Vorliegen der Allele A und B sind alle 4 Fragmente nachweisbar. 2kb 1kb Allel B a d b c 1,5 kb 0,5kb 1kb Sonde + 2,0 1,5 1,0 0,5 Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

14 108 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation T T A T A A T A G A T T A A T T G T G A G DA-Sequenzierung mit unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Didesoxynucleotiden. Jedes entsprechende DA-Fragment ist an seinem Ende markiert und wird beim Verlassen des Elektrophorese-Gels basenspezifisch registriert. at man eine geeignete DA isoliert, dann kann man durch Spaltung mit Restriktionsendonucleasen Bruchstücke erhalten, die z. B. durch Gelelektrophorese nach Molekülgröße getrennt werden können. Durch überlappende Spaltung mit mehreren ucleasen kann man die Spaltstücke einander zuordnen und schließlich eine Karte der Spaltstellen aufstellen. Sequenzierung der DA. Für die Sequenzermittlung von DA wird bevorzugt die Methode von Sanger benutzt (Didesoxymethode). Sie basiert darauf, anhand des zu sequenzierenden Stranges komplementäre Tochterstränge unter Verwendung radioaktiv markierter Desoxyribonucleotide in getrennten Ansätzen zu synthetisieren, wobei jedoch durch Zugabe von ucleotid-analoga, die zum Kettenabbruch führen, eine vollständige Synthese verhindert wird. Die auf diese Weise erzeugten unterschiedlich langen Fragmente können dann elektrophoretisch aufgetrennt werden, und anhand des Autoradiogramms kann die Sequenz abgelesen werden (s. 5.19). Inzwischen wurden Verfahren entwickelt, bei denen mit farblich unterschiedlich fluoreszierenden Didesoxynucleotiden die Synthese terminiert wird. Dadurch können die Synthesen gemeinsam durchgeführt werden. Die durch anschließende Elektrophorese getrennten Syntheseprodukte lassen sich dann anhand ihrer Fluoreszenz bei Anregung mit einem Argon-Laser identifizieren, wenn sie das Gel verlassen. Die Sequenz der Farben entspricht der Basensequenz ( 5.18). Didesoxymethode zur DA-Sequenzierung (Sanger) Die Synthese wird mit DA-olymerase an der zu sequenzierenden, einzelsträngigen DA durchgeführt (zur DA-Synthese s. S. 120 ff.). Zum Kettenabbruch wird in getrennten Ansätzen neben den normalen 2'-Desoxyribonucleosidtriphosphaten (davon eines radioaktiv oder durch Fluoreszenz markiert) jeweils eines der vier ucleotide als 2',3'-Didesoxynucleosidtriphosphat eingesetzt. Wird nun dieses Analogon in den wachsenden Strang eingebaut, kann die Kette wegen des Fehlens der 3'--Gruppe am Zucker nicht mehr weiter wachsen. Die Konzentrationen an Desoxyribonucleosidtriphosphaten und ihren 2',3'-Analogen müssen so gewählt werden, dass nach dem Zufallsprinzip das gesamte Spektrum der jeweils möglichen Kettenlängen erreicht werden kann. a b 3' G ATGTTTAG GT AG rimer zu sequenzierende DA + DA-olymerase I + dat, dtt, dt, dgt + ddat + ddtt + ddt + ddgt c GTAGA GTAGAAA T GTAGAA GTAGAAA GTAG GTAGAAAT d + A T G GTAGAAATG GTAGAAATGG abgelesene Sequenz 3' G G G T A A T A T A T G 3' gesuchte Sequenz 5.19 Sequenzierung nach Sanger. a Die zu sequenzierende DA wird mit einem rimer hybridisiert (kurzes DA-Fragment, das komplementär zum Ende der zur sequenzierenden DA ist und als Anfangsstück zur DA-Synthese dient, s. S. 121). b Die DA wird auf vier Ansätze verteilt und jeweils DA-olymerase hinzugegeben sowie die vier Desoxynucleosidtriphosphate (dat, dgt, dt, dtt), von denen eines radioaktiv markiert ist. Zusätzlich wird jedem Ansatz ein 2',3'-Didesoxynucleotid hinzugegeben (ddat, ddgt, ddt, ddtt). c Die Didesoxynucleotide führen in den vier Ansätzen an unterschiedlichen Stellen zum Kettenabbruch. Gezeigt sind nur die neusynthetisierten Ketten. d Durch Elektrophorese werden die Syntheseprodukte aufgetrennt, nach Autoradiographie (oder durch Fluoreszenzmessung, s. 5.18) kann die Sequenz abgelesen werden. Die gesuchte Sequenz ist zur abgelesenen Sequenz komplementär. Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

15 5.6 hromosomenstruktur 109 Bedeutung der DA-Sequenzen. Die große Bedeutung, die der DA- Sequenzierung beigemessen wird, hat viele Gründe. Wie schon erwähnt, steckt in der DA auch die genetische Information und damit die Kenntnis über die rimärstruktur der roteine. Die DA- Sequenzierung erleichtert also die Bestimmung der rimärstruktur von roteinen und, davon ausgehend, die Erforschung ihrer Funktionsweise. Sie ermöglicht die Erkennung von Mutationen (s. u.) und kann damit pathobiochemische Mechanismen erklären. Die DA- Sequenzen geben aber nicht nur Aufschluss über proteincodierende Abschnitte, sondern auch über solche Abschnitte, die an der Regulation der Genexpression beteiligt sind und als Angriffsort vielfältiger Signale wirken. Wir werden auf solche Sequenzen in späteren Abschnitten eingehen. ucleotid-sequenz der RA. Zwar wurden ionierarbeiten zur Sequenzermittlung von ucleinsäuren an RA durchgeführt (zuerst an tra für Alanin und tra für Serin), inzwischen ist die aufwändige Sequenzierung von RA-Molekülen allerdings von geringerer Bedeutung: Durch die Entwicklung der Techniken zur Genklonierung (s. S. 173 ff.) und zur DA-Sequenzierung kann die RA-Sequenz aus dem entsprechenden Gen (oder der entsprechenden cda, s. S. 175) abgelesen werden. Sequenzierung von ganzen Genomen. Der Fortschritt der Klonierungstechniken (s. S. 173 ff.) und der Sequenzierungsmethoden ermöglicht im rinzip die Aufklärung der gesamten genetischen Information einzelner prokaryonter oder eukaryonter rganismen. Damit sind neben den Strukturen genfreier DA-Abschnitte, die bei Eukaryonten den weit überwiegenden Anteil der DA ausmachen, auch die Sequenzen aller Gene des jeweiligen rganismus verfügbar. Aus den Sequenzen der DA-Abschnitte, welche die Strukturen von roteinen bestimmen, können damit die Sequenzen sämtlicher potenziell verfügbarer roteine abgeleitet werden; man fasst diese in Analogie zum Genom unter dem Begriff roteom zusammen. ach verschiedenen Virus- und Bakterien-Genomen wurde als erstes Eukaryonten-Genom die gesamte DA-Sequenz der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae aufgeklärt. Die Sequenz des humanen Genoms wurde 2001 publiziert. 5.6 hromosomenstruktur rokaryonten-hromosom. Die Bakterien haben meist nur ein hromosom, welches als sogenanntes ucleoid einen Teil des Innenraums der Bakterienzelle einnimmt. Dabei ist die DA zum Teil mit basischen roteinen verknüpft, die in ihrer Zusammensetzung eine entfernte Verwandtschaft zu chromosomalen roteinen der Eukaryonten aufweisen. Die gesamte Erbinformation ist in einer einzigen ucleinsäure-elix untergebracht, welche beim Darmbakterium E. coli aus etwa 4 Millionen Basenpaaren aufgebaut und zu einem Ring geschlossen ist. Auch die kleineren genetischen Einheiten der lasmide und der Viren sind meist ringförmig. In Eukaryontenzellen besitzen Mitochondrien und hloroplasten ringförmige DA-Moleküle. Diese tragen Gene für einen Teil der roteine dieser rganellen sowie Gene für mitochondriale rra und tra. Ringförmige DA kann, wie 5.20 zeigt, zu einer Superhelix verdrillt werden, wenn einer der beiden DA-Stränge gespalten, um den anderen herumgeführt und wieder neu verknüpft wird. Umgekehrt kann superhelikale DA zu entspannter DA relaxiert werden. ierzu bedarf es bestimmter Enzyme, die als DA-Topoisomerasen klassifiziert werden. Enzyme, die vorübergehend nur einen der beiden DA- Stränge spalten, werden Topoisomerase I genannt, während Topoisomerase vom Typ II beide Stränge spaltet. Die bakterielle Topoisomerase II wird auch als Gyrase bezeichnet. Sie verdrillt das Molekül unter Spannung. Die Energie hierzu kommt aus der Spaltung von AT. Da Topoisomerase II an der DA-Replikation beteiligt ist, können spezifische emmstoffe der bakteriellen Topoisomerase II (Gyrase- emmer) als Antibiotika eingesetzt werden. Inhibitoren der Topoisomerasen I und II von Eukaryonten werden als ytostatika verwendet. Eukaryonten-hromosom. Das Wort hromosom bezeichnet ursprünglich die schleifenförmigen, stark färbbaren Strukturen, die im Verlauf der mitotischen Kernteilung sichtbar werden. Jedes hromosom enthält ein Molekül doppelsträngiger DA, ist also eine genetische Einheit. Die DA würde in gestreckter Form einige Zentimeter lang sein; durch basische roteine (istone) und andere Kernproteine (icht-istone, s. u.) wird sie so verpackt, dass schließlich die mikroerfordert kein AT nat nad + ni 5.20 Bildung einer Superhelix durch eine DA-Topoisomerase II (DA-Gyrase). Zum Verdrillen der zirkulären DA müssen hosphodiester-bindungen gelöst und nach Rotation wieder geknüpft werden; dazu ist AT erforderlich. Für die umgekehrte Reaktion (Relaxation) benötigt das Enzym kein AT. Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

16 110 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation a b 2B 2B DA A 140 2A Modell eines ucleosomen-ore-artikels, welcher aus einem iston-ktamer und DA (146 ucleotidpaare) besteht (a). In Anwesenheit von iston 1 (b) wird die DA vollständig ein zweites Mal um das ktamer herumgeführt (166 ucleotidpaare) und am Eintritts- und Austrittsort versiegelt. Diese Bindung wird durch die zentrale globuläre Domäne des 1-Moleküls vermittelt. Die exakte 1-osition in diesem Bereich ist noch strittig. (Bild a nach Kornberg RD, Klug A. The ucleosome. Sci.Am ) iston-ktamere der ore-artikel werden durch Wechselwirkungen der zentralen, globulären Domänen der ore-istone (2A, 2B, 3 und 4) gebildet (s. 6.29, S. 238). Die - terminalen Abschnitte der ore-istone (je nach istonart ca. 20 bis 40 Aminosäuren lang) sind nicht in die kompakte ktamer-struktur eingebunden (in 5.21 nicht gezeigt). Sie sind besonders reich an basischen Aminosäuren und gehen mit DA ionische Wechselwirkungen ein. iston-modifikationen (u. a. Acetylierung, Methylierung) finden in erster Linie an diesen -terminalen Domänen statt und leisten einen wichtigen Beitrag zur Regulation der Genexpression (s. S. 138). ieran ist auch die Modifikation durch Ubiquitin beteiligt, sie steht hier nicht im Zusammenhang mit dem roteinabbau. skopisch sichtbaren hromosomen entstehen. Das Massenverhältnis DA zu rotein beträgt ungefähr 1:1. Im Interphase-Kern ist die Struktur der hromosomen stark aufgelockert; sie erfüllen als hromatin mehr oder weniger gleichmäßig den Kernraum, behalten aber ihre Identität. hromatinbereiche, die dichter gepackt sind und bei der histologischen Analyse intensiver gefärbt sind, werden im Gegensatz zum lockeren Euchromatin als eterochromatin bezeichnet. hromatin-struktur. Im hromatin liegt die DA überwiegend als Komplex mit istonen (s. u.) vor. Es gibt fünf verschiedene iston- Klassen, die mit 1, 2A, 2B, 3 und 4 bezeichnet werden; ihre Sequenz ist für mehrere Spezies bekannt. DA und istone sind zu ucleosomen organisiert, die im Elektronenmikroskop sichtbar gemacht werden können. Sie bestehen neben einem 1-Molekül aus einem ktamer der istone 2A, 2B, 3 und 4, die je zweimal vertreten sind. Um dieses iston-aket ist die DA in 1 3 / 4 Windungen herumgewickelt ( 5.21). Man bezeichnet den ucleoprotein-komplex aus iston-ktamer und 146 Basenpaaren DA als ore-artikel; ein Stück DA von ca. 20 bis 80 Basenpaaren dient als Verbindungsstück (Linker) zur nächsten ore-struktur. Durch die Bindung von iston 1 an diesen Linker wird die DA mit weiteren ca. 20 Basenpaaren nun vollständig um das iston-ktamer herumgeführt (hromatosom: iston-ktamer Basenpaare DA + 1). Der verbleibende Rest der Linker-DA stellt die Verbindung zum nächsten hromatosom her. Im hromatin sind die erlschnüre aus ucleosomen nochmals zu einer Überstruktur organisiert ( 5.22). Der Durchmesser dieser Faser höherer rdnung beträgt 30 nm. eben dieser sehr regelmäßigen Struktur wurden auch kugelige ucleosomenaggregate in der 30-nm- Faser beschrieben. In einer nächsthöheren Stufe der rganisation sind größere hromatin-abschnitte (30 bis 100 kb) durch Wechselwirkung mit roteinen des Zellkerns zu schleifenförmigen Domänen organisiert. Diese Schleifenanordnung könnte von funktioneller Bedeutung sein, indem sie eine abschnittsweise Beschränkung von Aktivierungs- oder Inaktivierungsschritten am hromatin ermöglicht. istone. istone sind kleine, basische roteine, die sich in Größe und rimärstruktur unterscheiden. Die Aminosäure-Sequenzen der einzelnen iston-klassen haben sich im Verlauf der Evolution außerordentlich konservativ verhalten. Das Extrembeispiel, das iston 4, das aus 102 Aminosäuren aufgebaut ist, weist bei den zuerst untersuchten Sequenzen aus Erbsenkeimlingen und Kalbsthymus nur den Austausch von zwei Aminosäuren auf. Auch die übrigen istone sind in ihren rimärstrukturen weitgehend konserviert, allerdings liegen sie (besonders 1) auch innerhalb einzelner Zelltypen in mehreren leicht variierten Subtypen vor. istone können an einigen definierten Aminosäure-Seitenketten modifiziert werden. So können spezifische Lysin-Reste acetyliert, andere methyliert werden. Serin und Threonin an bestimmten Stellen einzelner istone können phosphoryliert werden. Eine Modifikation von 2A und 2B kann durch Ubiquitin erfolgen (s. S. 201). Dieses eptid von 76 Aminosäuren Länge kann mit seiner -terminalen arboxy-gruppe peptidartig an einen spezifischen Lysin-Rest im jeweiligen iston angeknüpft werden. Eine andere Modifizierung der istone (in erster Linie 1 und 2B) ist die AD-Ribosylierung, die auch von anderen roteinen bekannt ist (z. B. die AD-Ribosylierung von G-roteinen durch holera-toxin, s. S. 481). Insbesondere die Acetylierung wurde inzwischen als wichtiger Teilschritt der Genregulation erkannt. icht-iston-roteine. Außer den istonen sind noch andere roteine mit der DA vergesellschaftet. Man fasst sie unter dem Begriff der icht-iston-roteine zusammen. Aus deren Vielfalt ist eine Gruppe Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

17 5.6 hromosomenstruktur 111 a b c d 5.22 Die Ebenen der hromatinstruktur. Die 30nm DA (a) bildet mit iston-ktameren die ore- artikel der ucleosomen (b) aus, welche durch Linker-DA miteinander verknüpft werden. 1- istone vervollständigen ore-ucleosom und Linker-DA zum vollständigen ucleosom und bewirken die rganisation der perlschnurartigen ucleosomenketten zu Strukturen höherer rdnung (c), die auch als 30-nm-Fasern bezeichnet werden. ier sind die 1-istone der einzelnen ucleosomen zum Inneren der spiralig aufgebauten 30-nm-Faser hin orientiert. Diese hromatinfasern sind schleifenartig an roteine der Kernmatrix gebunden (d) und bilden dadurch hromatindomänen aus. Die DA solcher Domänen kann nach Entfernung der istone in Form langer, kontinuierlicher Schleifen, die am Gerüst der Matrixproteine gebunden sind, nachgewiesen werden (im unteren 2nm 10 nm rotein-matrix Teil von d schematisch dargestellt). Ein solcher Gerüst-rotein-Komplex wird in Metaphase-hromosomen gefunden. Während der Interphase sind die Gerüstproteine nicht aggregiert. Im oberen ubiquitär vorkommender roteine wegen ihres elektrophoretischen Teil des Bildes ist zu erkennen, dass die hromatindomänen den regelmäßigen Aufbau der 30- Laufverhaltens als MG-roteine (high mobility group) zusammengefasst worden. rinzipiell muss man zu den icht-iston-roteinen nm-faser aufweisen oder aufgelockert vorliegen alle im hromatin mit der DA, den istonen oder der neugebildeten können. (Abb. c modifiziert nach Thoma, Koller, RA assoziierten roteine rechnen, die in einer hromatin-räparation Klug, J. ell Bio. 1979;83:403. Abb. d modifiziert enthalten sein können. Dazu zählen dann auch DA- und RA- nach Doenecke, aturwiss. Rundschau 1983; olymerasen, Regulationsfaktoren, die die Transkription und die 36:432.) rozessierung der RA (Kap. 6.2) kontrollieren, Gerüstproteine, an denen hromatin-domänen fixiert sind, und viele andere roteine, die die eterogenität der icht-iston-gruppe bestimmen. Riesenchromosomen. ormalerweise enthalten Zellkerne die Menge DA, die dem zweifachen haploiden hromosomensatz (d. h. 2n) entspricht. Ist die DA-Menge größer als 2n z. B. 4n oder höher, so spricht man von olyploidie. In den Speicheldrüsen mancher Insekten (auch bei Drosophila) ist der Grad der olyploidie sehr hoch, er erreicht Werte von n. Diese sogenannte olytänisierung kommt dadurch zustande, dass nach der DA-Replikation die Zellen nicht in eine Mitose eintreten. Die vielfach replizierten hromatiden (die dem Einzelchromosom im normalen Zellkern entsprechen) sind zu Bündeln geordnet und der Länge nach parallel aneinander gelagert. Man kann in diesen Riesenchromosomen Querscheiben erkennen, die besonders reich an DA sind, und Interbanden-Abschnitte, die weniger DA enthalten. Auch in den Riesenchromosomen liegt die DA in verknäuelter und verpackter Form vor. rte mit hoher Transkriptionsaktivität an den Riesenchromosomen sind im Lichtmikroskop erkennbar als uffs oder als Balbiani-Ringe ( 5.23); wir kommen darauf bei der Besprechung der Transkription zurück (s. S. 137) Riesenchromosom von hironomus pallidivitatus. Die hier gezeigten uffs (BR1BR3) werden auch als Balbiani-Ringe bezeichnet (aus: Grossbach U. in: Results and roblems in ell Differentiation. Vol. 8. Biochemical Differentiation in Insect Glands. eidelberg: Springer; 1979). Genamplifikation. In einigen speziellen Fällen wird noch ein weiteres rinzip angewandt, um genetisches Material für bestimmte Aufgaben zu vervielfachen. So findet man in den ozyten mancher Amphibien ribosomale Gene in mehreren tausend Kopien im Zellkern, aber außerhalb der hromosomen. Sie werden offenbar extrachromosomal repliziert. Eine Amplifikation wurde auch bei Säugerzellen beobachtet. In-vitrokultivierte Tumorzellen reagierten auf die Zugabe eines Folsäure- Antagonisten (s. S. 117) mit einer Amplifikation des Dihydrofolat- Reduktase-Gens. Repetitive Sequenzen der Eukaryonten-DA. Die Struktur-Gene, die bestimmte Aminosäure-Sequenzen codieren, sind normalerweise nur Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

18 112 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation 5.24 Transkription ribosomaler Gene in ocyten des Krallenfroschs Xenopus laevis. Man erkennt die fortschreitende Verlängerung der RA- Moleküle an den rra-genen. Jede der hier gezeigten Transkriptionseinheiten entspricht einem Gen für ein rra-vorläufer-molekül (s. S. 126). Die Ableserichtung der dicht gedrängten RA-olymerasen geht von der jeweiligen feilspitze aus. Zwischen den rra-genen liegen nicht transkribierte Abschnitte (aus: Trendelenburg MF et al. in: istochemistry and ell Biology. eidelberg: Springer; 1996). in einer einzigen Kopie im haploiden Genom enthalten. Zur Klasse der repetitiven Sequenzen gehören die rra-gene, die in der ähe des ucleolus-rganisators lokalisiert sind. Man stellt sich vor, dass die Anhäufung der rra-gene an dieser Stelle dazu dient, bei Bedarf große Mengen der ribosomalen RA bilden zu können, denn die Transkription kann an vielen Stellen gleichzeitig stattfinden, wie in 5.24 zu erkennen ist. Repetitive DA-Abschnitte waren ursprünglich durch die Untersuchung der Renaturierungskinetik von DA-Fragmenten definiert worden, die man durch mechanische Scherkräfte erhalten hatte. Mit der Einführung der Restriktionsendonucleasen und der DA-Sequenzierungsmethoden konnten mehrfach im Genom vorkommende Abschnitte näher charakterisiert werden, die zum Teil in der ähe von Genen vorkommen. So wurde bei Säugern eine Familie von untereinander sehr ähnlichen Sequenzen beschrieben, die sehr häufig Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym Alu I enthalten. eben dieser als Alu I-Familie bezeichneten Gruppe von DA-Sequenzen gibt es andere, welche durch bevorzugte Schnitte mit anderen Enzymen gekennzeichnet sind (z.b. die Kpn I-Familie des Menschen). Sowohl die Alu-I- als auch die Kpn-I-Elemente gehören zu den eingeschobenen (interspersed) Sequenzen, die nach ihrer Länge als SIE oder LIE (short bzw. long interspersed nuclear elements) bezeichnet werden (s. Randspalte und S. 168). DA-Abschnitte mit sehr häufig wiederholten ucleotid-folgen unterscheiden sich aufgrund ihrer monotonen Basenfolge oft in ihrer Dichte von der auptmenge der DA und können deshalb durch Dichtegradienten-Zentrifugation abgetrennt werden. Man sieht neben der auptbande einige kleine Satelliten-Banden und bezeichnet deshalb diese hochrepetitive DA auch als Satelliten-DA. SIE. Im menschlichen Genom gibt es über Abschnitte, die zur Alu-Genfamilie gehören. Diese DA-Abschnitte haben Sequenzähnlichkeit zur 7SL-RA der Signal-Erkennungspartikel (s. S. 148) und sind von kurzen Sequenzabschnitten flankiert, die zwischen einzelnen Alu-Elementen verschieden sind. Sie machen circa 10 % des humanen Genoms aus und werden auch als SIE (short interspersed nuclear elements) bezeichnet. Zu den SIE- und LIE-Abschnitten s. auch Seite 168. DA-Fingerabdruck. Unter den nicht-codierenden Abschnitten des Genoms kommen häufig wiederholte, kurze Sequenzabschnitte vor (sog. Minisatelliten), deren Verteilung und Wiederholungsfrequenz für das jeweilige Genom spezifisch ist. Eine markierte Sonde, die solche Minisatelliten-Abschnitte erkennt, kann im Southern-Blot (s. S. 106) einer DA nach Spaltung mit einem Restriktionsenzym ein für das jeweilige Individuum spezifisches Muster hybridisierender Banden anzeigen. Die DA von achkommen zeigt ein ybridisierungsmuster, welches entweder der väterlichen oder mütterlichen Fragmentverteilung entspricht. 5.7 athobiochemie Störungen im Stoffwechsel der ucleinsäuren und ihrer Bausteine, der ucleotide und der urin- und yrimidinbasen, können wegen der großen biologischen Bedeutung dieser Stoffklasse sehr verschiedene Krankheiten verursachen. Die häufigste Krankheitsursache sind Genmutationen mit der Folge einer veränderten Struktur oder Funktion eines roteins, z. B. eines Enzyms oder eines Transportproteins. Diese durch Genmutationen verursachten Krankheiten werden in den Kapiteln der entsprechenden Stoffklassen und Stoffwechselwege besprochen. 5.4 Erkrankungen, die auf Störungen im Stoffwechsel der ucleinsäuren beruhen. Molekulare Ursache Erkrankung Störungen des urinstoffwechsels mit yperurikämie gestörte Uratausscheidung klassische Gicht (multiple Gendefekte) GRT-Mangel Lesch-yhan-Syndrom, Kelley-Seegmiller-Syndrom R-yperaktivität Kelley-Seegmiller-Syndrom Störungen des urinstoffwechsels ohne yperurikämie ART-Mangel 2,8-Dihydroxyadenin-ephrolithiasis Xanthin-xidase-Mangel Xanthinurie, Xanthin-ephrolithiasis ADA-Mangel und -Mangel Lymphopenie, zellulärer Immundefekt AM-Desaminase-Mangel Myopathie Störungen des yrimidinstoffwechsels UM-Synthetase-Mangel hereditäre rotacidurie Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

19 5.7 athobiochemie 113 Eine zweite Gruppe von Störungen betrifft Synthese und Abbau der ucleoside, sowie Bildung und Ausscheidung des Endprodukts arnsäure im Stoffwechsel der ucleinsäuren. Innerhalb dieser Gruppe kann man zwischen Störungen mit dem Leitsymptom einer erhöhten arnsäurekonzentration im Blut (yperurikämie) und solchen, bei denen die arnsäurekonzentration normal oder vermindert ist, unterscheiden. Eine Übersicht über diese Krankheitsgruppe gibt 5.4. eben diesen Störungen des ucleinsäurenmetabolismus als Krankheitsursache liegt die medizinische Bedeutung dieses Stoffwechsels auch in der gezielten Veränderung im Stoffwechsel der ucleinsäuren durch harmaka. Diese harmaka werden besonders bei der hemotherapie von Tumoren eingesetzt. Störungen des urinstoffwechsels mit yperurikämie Gicht. Die klassische Gicht, die beim Erwachsenen, vorzugsweise bei Männern, auftritt, ist die häufigste Störung des urinstoffwechsels mit yperurikämie. Man unterscheidet eine primäre und sekundäre Gicht. Die primäre Gicht tritt ohne Vorkrankheiten auf; ihre Ursache ist eine Störung der Uratausscheidung durch die iere und nicht, wie früher für die klassische Gicht des Erwachsenen angenommen, eine gesteigerte de-novo-urinsynthese. Die sekundäre Gicht ist Folge anderer Krankheiten, z. B. einer iereninsuffizienz mit verminderter renaler Uratausscheidung oder von Krankheiten mit gesteigertem Zellumsatz und gesteigerter urinproduktion, z. B. Tumoren und Leukämien. Beim Gesunden wird in der iere das im Glomerulus abfiltrierte Urat im proximalen Tubulus nahezu vollständig rückresorbiert, jedoch in weiter distal gelegenen Abschnitten des proximalen Tubulus erneut sezerniert und wieder rückresorbiert ( 5.25). In der Bilanz werden 90 bis 93 % des glomerlulär filtrierten Urats bei der assage durch den Tubulus resorbiert. Die Urat-learance beim Gesunden ist dementsprechend sehr klein. Beim Kranken mit primärer Gicht ist die Uratausscheidung im Urin in Beziehung zum Uratspiegel vermindert und die Urat-learance ist stark eingeschränkt: Bei gleicher Uratkonzentration im lasma scheiden Gicht-atienten ca. 40 % weniger Die renale learance einer Substanz X ist definiert als das Blutplasmavolumen (ml), das pro Zeiteinheit (min) durch die iere von X befreit ( geklärt ) wird. Sie wird berechnet nach der Formel X = V U U X X X = learance der Substanz X (ml min 1 ) V U = Urinvolumen (ml min 1 ) U X = Konzentration von X im Urin (mg ml 1 ) X = Konzentration von X im Blutplasma (mg ml 1 ) proximaler Tubulus Glomerulus 100 % Filtration 98%100% Reabsorption 0%2% Sekretion 50% renale Uratausscheidung [mmol/min] ormal Gicht 8%12% 40%44% Reabsorption Exkretion 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Uratkonzentration im lasma [mmol/l] 5.25 Bidirektionaler Transport von Urat im proximalen Tubulus der iere. Bei Gicht ist die Ausscheidung von Urat, wahrscheinlich durch verminderte Sekretion, eingeschränkt Beziehung zwischen Uratkonzentration im Blutplasma und Uratausscheidung im Urin bei Gesunden und Gichtkranken. Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )

20 114 5 ucleinsäuren: Struktur und rganisation Glutamin Formyl-TF 3 Formyl-TF GM Guanin 11, 12 R , 9 IM 2 4, 5 7 Xanthin arnsäure Glycin ypoxanthin (Lactim-Form) 5.27 Gichttophus bei chronischer Gicht. Glutamin Aspartat 10 AM Allopurinol Xanthin- xidase 5.28 Synthese und Abbau von urin-ucleotiden (Details in 5.5 u. 5.6, S. 101). Die ummern entsprechen denen in 5.5. Adenin ART AM R i Guanin ypoxanthin GRT GM bzw. IM 5.29 Störung der GRT beim Lesch-yhan- Syndrom (GRT: ypoxanthin-guanin-hosphoribosyltransferase, vgl. S. 102). Urat aus als Gesunde; die lasmakonzentration bei Gicht-Kranken muss ca. 2 mg/dl höher sein als bei Gesunden, um die gleiche renale Uratausscheidung zu erreichen ( 5.26). Die Art des renalen Defektes ist ungeklärt. Er kann in einer gesteigerten Resorption, einer verminderten Sekretion oder einer Kombination von beiden Transportveränderungen begründet sein. Sowohl Resorption als auch Sekretion sind aktive, energieabhängige Transportvorgänge. Die meisten, derzeit bekannten Fakten sprechen eher für eine verminderte Sekretion als für eine gesteigerte Absorption als Ursache der Gicht. Der Defekt in der iere ist die Folge multipler Genmutationen, wobei einige autosomal dominant, andere X-chromosomal vererbt werden. Das Krankheitsbild der klassischen Gicht kann sich als akuter Gichtanfall oder als chronische Gicht manifestieren. Beim akuten Anfall führt die Ablagerung von Uratkristallen in einem Gelenk (Knorpel) und den umgebenden Weichteilen (Gelenkkapsel, Sehnen) zu sehr heftigen Schmerzen und Entzündungsreaktionen, da Granulocyten einwandern, Uratkristalle phagocytieren und als Reaktion hierauf proinflammatorische Eikosanoide und ytokine freisetzen. Bei der chronischen Gicht steht die Zerstörung des Gelenkknorpels durch Uratablagerungen im Vordergrund. Degenerative Gelenkveränderungen mit Bewegungseinschränkungen und Schmerzen sind die Folge. In gelenknahen Weichteilen und im Knorpel, z. B. an der hrmuschel, sind die Uratablagerungen als gelbliche Knoten (Gichttophi) sichtbar ( 5.27). In der iere können sich bei chronischer Gicht Uratsteine bilden. Uratablagerungen im ierenparenchym führen zu Funktionseinschränkungen der iere, die in eine iereninsuffizienz münden können. Zur Therapie des akuten Gichtanfalls wird seit der Antike olchicin erfolgreich eingesetzt. Das Alkaloid hemmt wahrscheinlich über das mikrotubuläre System die Einwanderung der Granulocyten und dadurch die Schmerzattacken. Bei der Therapie der chronischen Gicht hat sich Allopurinol sehr bewährt. Dieses Strukturanalog von ypoxanthin ist ein emmstoff der Xanthin-xidase ( 5.28). Anstelle von arnsäure werden Xanthin und ypoxanthin ausgeschieden, die im Vergleich zu arnsäure besser wasserlöslich sind, so dass sich keine Mikrokristalle im Gewebe, keine Gichttophi und keine ierensteine bilden. Ferner werden bei der chronischen Gicht harmaka eingesetzt, die die Uratausscheidung durch die iere steigern. ypoxanthin-guanin-hosphoribosyltransferase-mangel (GRT-Mangel). Die durch dieses Enzym katalysierte Reaktion ist in 5.7 (S. 102) dargestellt. Sie dient der Wiederverwendung der urinbasen ypoxanthin und Guanin unter Bildung von Inosin- bzw. Guanosinmonophosphat (Salvage-athway, S. 102). Bei verminderter Enzymaktivität ( 5.29) werden die urinbasen, die nicht wieder zur Resynthese von ucleinsäuren verwendet werden können, zu arnsäure abgebaut, deren lasmakonzentration ansteigt. Da bei GRT- Mangel auch hosphoribosyl-yrophosphat (R) vermindert verbraucht wird, steht es für die eusynthese von ucleinsäuren vermehrt zur Verfügung; darüber hinaus aktiviert R die Glutamin-R-Amidotransferase, das Schrittmacherenzym der urinsynthese (S. 100). Das für die GRT codierende Gen ist auf dem X-hromosom lokalisiert. Mehr als 100 verschiedene Mutationen sind bekannt, die unterschiedliche Reduktionen der Enzymaktivität zur Folge haben. Bei vollständigem Ausfall entsteht das Lesch-yhan-Syndrom, bei dem die Symptome einer chronischen Gicht mit neurologischen Symptomen (gestörte Motorik durch Spastik, horeoathetose) und mit einer Tendenz zur Selbstverstümmelung kombiniert sind. Der Zusammenhang der neurologischen Symptome mit dem Enzymdefekt ist ungeklärt. Wenn eine Restaktivität des Enzyms von mindestens 10 % erhalten ist, resultiert das Kelley-Seegmiller-Syndrom mit einer schon Doenecke u.a., Karlsons Biochemie und athobiochemie (ISB )