Genetische Resistenztestung im Mykobakterien-Labor ein Update MICHAEL WEIZENEGGER ABTEILUNG FÜR MOLEKULARE DIAGNOSTIK BIOPRODUCTS 2016
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- Herbert Fischer
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1 Genetische Resistenztestung im Mykobakterien-Labor ein Update MICHAEL WEIZENEGGER ABTEILUNG FÜR MOLEKULARE DIAGNOSTIK BIOPRODUCTS 2016
2 Inhalte der Präsentation Phänotyp was ist das eigentlich? Was leistet der Genotyp? Was machen wir molekulargenetisch in Heidelberg Testsysteme FluoroType MTBDR, erste Daten NTM DST, molekulargenetisch Zusammenfassung
3 Fallzahlen und Inzidenzen, Deutschland ,2 9,3 8,7 7,9 7,3 6,5 6,1 15,0 13,0 11,0 9,0 7,0 5,0 5,5 5,4 5,4 5,3 5,2 5,3 5,6 3,0 Fallzahlen Inzidenz Quelle: Robert Koch-Institut, Berlin
4 Monotherapie resultiert in einem Scheitern der Behandlung. Bei einem Rezidiv entsteht Resistenz, weil jede Population diese gentischen Varianten schon enthält. (z.b INH, 10-7 RIF) Deshalb erlaubt nur eine medikamentöse Kombinationstherapie eine erfolgreiche Therapie
5 DEFINITION DST PHÄNOTYP Definition Kritische Medikamentenkonzentration : WHO 1963 The critical concentration is defined as the lowest concentration of drug that inhibits > 95% of wild type strains of bacilli that have never been exposed to the drug previously...die Kritische Konzentration ist ein epidemiologischer Parameter um einen Wildtyp Stamm von einem nicht Wildtyp Stamm zu unterscheiden, der in der Lage ist bei höheren Chemotherapeutika-Konzentrationen zu wachsen. Eine einzige Medikamentenkonzentration definiert Empfindlichkeit versus Resistenz. Es gibt keine Differenzierung in hoch, moderat oder niedrige Resistenz Modifiziert Boettger et al
6 DEFINITION DST GENOTYP Die Detektion einer Mutation impliziert jedoch nicht Resistenz! Mutationen sind z.t. zufällig. Mutationen können still sein. Mutationen können spontan ohne Auswirkung sein. Mutationen können Resistenz definieren und den Grad der Empfindlichkeit mit definieren. CAVE: Neue Mutation müssen zuerst mit geeigneten Methoden evaluiert werden
7 Drug Genes Gene function Mutation (%) Isoniazid katg Genotype versus Phenotype inha Catalase peroxidase Enoyl ACP reductase 50-95% 8-43% Rifampicin rpob β subunit of RNA polymerase 95% Pyrazinamide pnca Nicotinamidase/ pyrazinamidase 72-97% Ethambutol embb Arabinosyl transferase 47-65% Streptomycin rpsl rrs gidb S12 ribosomal protein 16S rrna rrna methyltransferase (G527 in 530 loop) 52-59% 8-21% Amikacin/Kanamycin rrs/eis 16S rrna/promoter- acetylation ca.95% Capreomycin tlya 2 -O-methyltransferase Quinolones Ethionamide gyra gryb etaa/etha inha DNA gyrase subunit A DNA gyrase subunit B? 75-94% Flavin monooxygenase 37% 56% PAS thya Thymidylate synthase 36% Modifiziert nach Zhang et al., IUTLD 2009
8 RIFAMPICIN Zuverlässiger Geno- und Phänotyp Genetik: Feherhafte Analyse durch Falsch Resistent durch Stille Mutationen oder durch Mutationen, die vom Test nicht erfasst werden. Phänotyp: Bestimmte Mutationen, mit einer low level Resistenz korreliert, resultieren phänotypisch falsch empfindlich
9 ISONIACID Guter Phänotyp Breites Spektrum an MICs (low, high, moderate) Boettger et al
10 Ethambutol Keine high level Resistenz Schlechte Reproduzierbarkeit des Phänotyps Genotypkorrelation nicht ganz klar Boettger et al 2011
11 PYRAZINAMID Bedeutung wird divers diskutiert. Die genetische Situation ist sehr complex. Sequenzierung ist zur Zeit die Methode der Wahl für den Genotyp
12 Was wird im MVZ Heidelberg mit NAT in der Mykobakteriendiagnostik angeboten? MTBC-Direktnachweis: TB-PCR FluoroType MTB (Hain Lifescience); MTBC-Direktnachweis (als POC Test): GenXpert Rif TB (Cepheid); MTBC-Direktnachweis DST Erstmedikamente: GenoType MTBDRplus (Hain) Alternativmedikamente : GenoType MTBDRsl (Hain) Charakterisierung kultivierter Mykobakterien: GenoType MTBDRplus TB-DST(Hain) GenoType CM (Hain) und Sequenzierung (Spezifizierung aus Kultur) GenoType NTMDR (Hain) Subtypisierung MAC/ M. chelonae-komplex und DST;
13 FluoroLyse: TB-DNS-Isolierung MANUELL 30 Minuten
14 GenoXtract 12: TB-DNS-Isolierung AUTOMATISIERT 40 Minuten
15 FluoroType MTB FLUOROCYCLER/AMPLIFIKATIONSMIX FluoroCycler Add DNA to Master-Mix:
16 FluoroSoftware: TB-Ergebnisse EVALUATION Bild Auswertung
17 FluoroSoftware: TB-Ergebnisse EVALUATION Bild Auswertung
18 WHO Endorsement 2008 GenoType MTBDRplus The Expert Group on molecular line probe assays for rapid screening of patients at risk of MDR-TB considers that there is sufficient generalisable evidence to justify a recommendation on the use of line probe assays for rapid detection of MDR-TB, within country-specific settings, with further operational research to address country specific implementation needs.
19 GenoType MTBDRplus
20 WHO Endorsement 2013 GenoType MTBDRsl V1 1. The Genotype MTBDRsl may be used as a rule-in test for XDR-TB but cannot be used to define XDR- TB for surveillance purposes; 3. The Genotype MTBDRsl may be used to guide infection control precautions while awaiting confirmatory results from conventional phenotypic testing.
21 WHO Endorsement 2016 GenoType MTBDRsl V2 05/12/
22 GenoType MTBDRsl 1.0 GenoType MTBDRsl 2.0 Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. tuberculosis complex (TUB) gyra Locus Control (gyra) gyra wild type probe 1 ( gyra WT1) gyra wild type probe 2 ( gyra WT2) gyra wild type probe 3 ( gyra WT3) gyra mutation probe 1 ( gyra MUT1) gyra mutation probe 2 ( gyra MUT2) gyra mutation probe 3A ( gyra MUT3A) gyra mutation probe 3B ( gyra MUT3B) gyra mutation probe 3C ( gyra MUT3C) gyra mutation probe 3D ( gyra MUT 3D) rrs Locus Control (rrs) rrs wild type probe 1 ( rrs WT1) rrs wild type probe 2 ( rrs WT2) rrs mutation probe 1 ( rrsmut1) rrs mutation probe 2 ( rrs MUT2) embb Locus Control (embb) embb wild type probe 1 ( embb WT1) embb mutation probe 1A ( embb embb mutation probe 1B ( embb colored mar ker MUT1A) MUT1B) Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. tuberculosis complex (TUB) gyra Locus Control (gyra) gyra wild type probe 1 ( gyra WT1) gyra wild type probe 2 ( gyra WT2) gyra wild type probe 3 ( gyra WT3) gyra mutation probe 1 ( gyra MUT1) gyra mutation probe 2 ( gyra MUT2) gyra mutation probe 3A ( gyra MUT3A) gyra mutation probe 3B ( gyra MUT3B) gyra mutation probe 3C ( gyra MUT3C) gyra mutation probe 3D ( gyra MUT3D) gyrb Locus Control gyrb wild type probe ( gyrb WT) gyrb mutation probe 1 ( gyrb MUT1) gyrb mutation probe 2 ( gyrb MUT2) rrs Locus Control (rrs) rrs wild type probe 1 ( rrs WT1) rrs wild type probe 2 ( rrs WT2) rrs mutation probe 1 ( rrs MUT1) rrs mutation probe 2 ( rrs MUT2) eis Locus Control (eis) eis wild type probe 1 ( eis WT1) eis wild type probe 2 ( eis WT2) eis wild type probe 3 ( eis WT3) eis mutation probe 1 ( eis MUT1) colored mar ker 05/12/
23 GenoType MTBDRsl 1.0 GenoType MTBDRsl 2.0 Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. tuberculosis complex (TUB) gyra Locus Control (gyra) gyra wild type probe 1 ( gyra WT1) gyra wild type probe 2 ( gyra WT2) gyra wild type probe 3 ( gyra WT3) gyra mutation probe 1 ( gyra MUT1) gyra mutation probe 2 ( gyra MUT2) gyra mutation probe 3A ( gyra MUT3A) gyra mutation probe 3B ( gyra MUT3B) gyra mutation probe 3C ( gyra MUT3C) gyra mutation probe 3D ( gyra MUT 3D) rrs Locus Control (rrs) rrs wild type probe 1 ( rrs WT1) rrs wild type probe 2 ( rrs WT2) rrs mutation probe 1 ( rrsmut1) rrs mutation probe 2 ( rrs MUT2) embb Locus Control (embb) embb wild type probe 1 ( embb WT1) embb mutation probe 1A ( embb embb mutation probe 1B ( embb colored mar ker MUT1A) MUT1B) Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. tuberculosis complex (TUB) gyra Locus Control (gyra) gyra wild type probe 1 ( gyra WT1) gyra wild type probe 2 ( gyra WT2) gyra wild type probe 3 ( gyra WT3) gyra mutation probe 1 ( gyra MUT1) gyra mutation probe 2 ( gyra MUT2) gyra mutation probe 3A ( gyra MUT3A) gyra mutation probe 3B ( gyra MUT3B) gyra mutation probe 3C ( gyra MUT3C) gyra mutation probe 3D ( gyra MUT3D) gyrb Locus Control gyrb wild type probe ( gyrb WT) gyrb mutation probe 1 ( gyrb MUT1) gyrb mutation probe 2 ( gyrb MUT2) rrs Locus Control (rrs) rrs wild type probe 1 ( rrs WT1) rrs wild type probe 2 ( rrs WT2) rrs mutation probe 1 ( rrs MUT1) rrs mutation probe 2 ( rrs MUT2) eis Locus Control (eis) eis wild type probe 1 ( eis WT1) eis wild type probe 2 ( eis WT2) eis wild type probe 3 ( eis WT3) eis mutation probe 1 ( eis MUT1) colored mar ker 05/12/
24 GenoType MTBDRsl 1.0 GenoType MTBDRsl 2.0 Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. tuberculosis complex (TUB) gyra Locus Control (gyra) gyra wild type probe 1 ( gyra WT1) gyra wild type probe 2 ( gyra WT2) gyra wild type probe 3 ( gyra WT3) gyra mutation probe 1 ( gyra MUT1) gyra mutation probe 2 ( gyra MUT2) gyra mutation probe 3A ( gyra MUT3A) gyra mutation probe 3B ( gyra MUT3B) gyra mutation probe 3C ( gyra MUT3C) gyra mutation probe 3D ( gyra MUT 3D) rrs Locus Control (rrs) rrs wild type probe 1 ( rrs WT1) rrs wild type probe 2 ( rrs WT2) rrs mutation probe 1 ( rrsmut1) rrs mutation probe 2 ( rrs MUT2) embb Locus Control (embb) embb wild type probe 1 ( embb WT1) embb mutation probe 1A ( embb embb mutation probe 1B ( embb colored mar ker MUT1A) MUT1B) Conjugate Control (CC) Amplification Control (AC) M. tuberculosis complex (TUB) gyra Locus Control (gyra) gyra wild type probe 1 ( gyra WT1) gyra wild type probe 2 ( gyra WT2) gyra wild type probe 3 ( gyra WT3) gyra mutation probe 1 ( gyra MUT1) gyra mutation probe 2 ( gyra MUT2) gyra mutation probe 3A ( gyra MUT3A) gyra mutation probe 3B ( gyra MUT3B) gyra mutation probe 3C ( gyra MUT3C) gyra mutation probe 3D ( gyra MUT3D) gyrb Locus Control gyrb wild type probe ( gyrb WT) gyrb mutation probe 1 ( gyrb MUT1) gyrb mutation probe 2 ( gyrb MUT2) rrs Locus Control (rrs) rrs wild type probe 1 ( rrs WT1) rrs wild type probe 2 ( rrs WT2) rrs mutation probe 1 ( rrs MUT1) rrs mutation probe 2 ( rrs MUT2) eis Locus Control (eis) eis wild type probe 1 ( eis WT1) eis wild type probe 2 ( eis WT2) eis wild type probe 3 ( eis WT3) eis mutation probe 1 ( eis MUT1) colored mar ker 05/12/
25 Leistungsdaten Erst- und Zweitmedikamente Direkttestung Test Sens % Spez % Referenz Goldstandard GT MTBDRplus Rifampicin BMC Infect Dis May 20;9:67 Phänotyp Isoniacid GT MTBDRplus BMC Infect Dis May 20;9:68 Phänotyp Chinolone Kanamycin V2.0 Amikain Capreomycin GT MTBDRsl ohne Angabe GT MTBDRsl ohne Angabe GT MTBDRsl GT MTBDRsl J Clin Microbiol Sep;53(9): J Clin Microbiol Sep;53(9): 2013 Expert Group Meeting Report, Expert Group Meeting Report, Phänotyp/Sequen zierung Phänotyp/Sequen zierung Phänotyp Phänotyp 05/12/
26 FluoroType MTBDR (LATE-PCR) DNA Isolierung: FluoroLyse Nachweis von Mycobacterium tuberculosis-dna und Empfindlichkeit gegenüber Rifampicin (rpob) und Isoniazid (inha, katg) 5 Zielbereiche warden amplifiziert: Isolation/Extraction Control (IC) inha katg rpob Internal Marker (IM; correction of melting temperatures) TAT Ca Stunden inklusive DNA Isolierung
27 DNA extraction Workflow PCR reaction preparation Amplification and detection Margaretha de Vos, Stellenbosch University, Capetown, Südafrika
28 FluoroType MTBDR Analysis Software Margaretha de Vos, Stellenbosch University, Capetown, Südafrika
29 FluoroType MTBDR - Validation Sample collection (NHLS, Cape Town, South Africa) 359 Gene Xpert TB positive sputum specimens 203 Rifampicin resistant 156 Rifampicin sensitive 137 smear + 66 smear smear + 36 smear Gene Xpert TB negative sputum specimens (culture confirmed) 113 TB positive cultured isolates Methods of comparison: GenoType MTBDRplus 2.0; Culture/DST; Sequencing Margaretha de Vos, Stellenbosch University, Capetown, Südafrika
30 FluoroType MTBDR - Validation Preliminary data Smear positive specimens Smear negative specimens Culture positive isolates Sensitivity Specificity Sensitivity Specificity Sensitivity Specificity Detection of MTB complex # Detection of Rifampicin resistance* Detection of Isoniazid resistance* # Compared to MGIT culture * Compared to the GenoType MTBDR assay Margaretha de Vos, Stellenbosch University, Capetown, Südafrika
31 GenoType NTM-DR M. avium complex (MAC) M. chelonae M. abscessus complex Identifizierung M. chimaera Subspezies der M. abscessus Gruppe Resistenz Makrolide Resistenz Aminoglykoside
32 GenoType NTM-DR M. avium M. massiliense M. abscessus M. intracellulare M. massiliense M. chimaera M. bolletii M. avium M. intrac./chim.
33 Zusammenfassung MDx wird in der Mykobakteriendiagnostik immer wichtiger und leistungsstärker Leistungsfähige DST Genotypisierung first line und second line verfügbar DST Genotypisierung jetzt auch für MAC und M. chelonae-komplex Für den TBC Nachweis ist Automatisierung und LIS-Anbindung möglich
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