Infektiosität, Therapieansprechen und Resistenztestung unter Einbindung der molekularen Diagnostik. Doris Hillemann NRZ Borstel
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- Juliane Ritter
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1 Infektiosität, Therapieansprechen und Resistenztestung unter Einbindung der molekularen Diagnostik Doris Hillemann NRZ Borstel
2 Korrelation zwischen Mikroskopie und Infektiosität
3 Wie infektiös ist ein Patient mit einer mikroskopisch negativen, kulturell positiven TB? Index- Fall Alle Mikroskopie negativ Mikroskopie positiv QFT-positiv T-Spot.TB-positiv Kontakt- Zahl P-Wert P-Wert zeit N % N % auf Trend auf Trend 8 Std , ,4 >8-40 Std , ,2 >40 Std , ,9 Alle ,2 0, ,7 0, Std ,8 6 5,7 >8-40 Std ,6 5 7,0 >40 Std , ,1 All ,5 0, ,7 0, Std , ,5 >8-40 Std , ,4 >40 Std , ,0 Alle ,4 0, ,4 0,0001 Diel et al., Chest 2009; 135 (4):
4 Infektiosität mikroskopisch-negativer Tuberkulosepatienten Risiko einer aktiven Erkrankung bei Kontaktpersonen von mikroskopisch negativen und positiven Indexfällen, die im IGRA eine Konversion zeigen RR= 0.98 (0.35 to 2.7) p =0.96 RR= 4.8 (2.6 to 8.8) p <0.001 Haldar P, et al. Thorax 2013;68: doi: /thoraxjnl
5 Könnte man die Mikroskopie durch den Xpert MTB/RIF ersetzen?
6 Infektiosität: Mikroskopie versus Xpert MTB/RIF Eine positive Mikroskopie gibt Auskunft darüber, wie infektiös der Patient ist Cycle threshold value (C T )= Anzahl der PCR-Zyklen, nach der eine Probe ein messbares positives Amplifikat aufweist Rn Cycle threshold value threshold Cycles
7 Könnte man die Mikroskopie durch den Xpert MTB/RIF ersetzen? Mikroskopie: Gradierung (+/-, +, ++, or +++) TTCP: time to culture positivity Quantitative PCR (Xpert MTB/RIF): C t -Wert?? Maß für die Infektiosität mikroskopisch positiv C T 30,5 mikroskopisch negativ Colleen F. Hanrahan, Am J Respir Crit Care Med 2014
8 PCR als Verlaufskontrolle? 1 14% falsch positiv Bis zu einem Jahr nach Therapie Theron 2016 CID
9 PCR als Verlaufskontrolle? Flüssigkultur PCR Nutzung der quantitativen Daten: Xpert assay für das Monitoring der TB Therapie Shenai 2016 Plos One
10 MTB Isolierung, Identifizierung und Resistenztestung Wachstum von TB Bakterien, Identifizierung Tage Res. 1st-line Medikamente 1-2 Wochen MDR Res. 2nd-line Medikamente 1-2 Wochen XDR 4-7 Wochen Molekulare Methoden 1-2 Tage MDR/XDR Die Verkürzung der Zeitspanne bis zur Detektion der TB Bakterien Adäquate Therapie Transmission resistenter Stämme
11 Molekulare Basis der Antibiotika Resistenz bei M. tuberculosis Antibiotikum Gen Funktion % Resistenz Isoniazid katg inha ahpc-promotor Katalase-Peroxidase Enoyl-ACP-Reduktase Alkyl-Hydroxid-Peroxidase % ca. 25 % ca. 10 % Rifampicin rpob ß-Untereinheit der RNA- > 95 % Polymerase Fluorquinolone gyra/b DNA-Gyrase A/B 80-90% Amikacin Capreomycin Kanamycin rrs tly eis 16S rrna Methylase N-Acetyltransferase Ca. 80%?? LPA Resistenz Sensitivität Spezifizität rpob katg inha RMP 98.1% 98.7% INH 84.3% 99.5% Meta-Analysis: Ling et al., Eur Respir J 2008
12 Alle Mutationen in der rpob hot spot Region führen zu Resistenz? Mut D516V Mut H526Y Mut H526D Mut S531L GeneXpert L533P H526L H526N, A532V D516Y L511P L511P, M515I?
13 33-jähriger Patient aus Georgien Resistente Tuberkulose? Probe 1: MTB nachgewiesen Rif Resistenz nachgewiesen Probe 1: MTB nachgewiesen Rif Resistenz nicht nachgewiesen??????
14 Diskrepante Ergebnisse Laborfehler? Sample Mix-up (Verwechslung) DNA/Kreuzkontamination Kontamination
15 Diskrepante Ergebnisse Heteroresistenz? Was ist das? Die Anwesenheit von zwei M. tuberculosis Stämmen: einem resistenten und einem sensiblen Weitere Vorgehensweise? Ausschluss einer Verwechslung Wiederholte Testung einer neuen Probe mittels Xpert MTB/Rif und MTBDRplus Phänotypische Resistenzbestimmung
16 MTBDRplus Heteroresistenz WT Bande nicht nachweisbar Mutationsbande nachweisbar WT Bande nachweisbar Mutationsbande nachweisbar Xpert MTB/Rif zeigt erst dann eine Rif Resistenz an, wenn das Mischungsverhältnis 90% resistent und 10% sensibel ist
17 Das diagnostische Netzwerk für TB und NTM in Deutschland Überblick über das diagnostische Spektrum und die Versorgungsstruktur 1. Synergien nutzen 2. Effizientere Datenübermittlungen 3. fachlicher Austausch / Kommunikation 4. Aktualisierung der Adressdatenbank Kenntnisse der epidemiologischen Lage 1. sorgfältige Diagnosestellung 2. gesetzliche Meldepflichten 3. Zusammenarbeit zwischen Laboren, Gesundheitsämtern und öffentlichem Gesundheitsdienst
18 Der Fragebogen zur Laborinventur Primärisolierung 1. Wie viele Proben werden Ihnen zur Primärisolierung zugeschickt? pro Jahr 2. Welche Dekontaminationsmethode verwenden Sie? 3. Welche Färbung verwenden Sie? Auramin ZN 3a. Bitte spezifizieren Sie andere Kinyau n Andere 4. Welches Flüssigkultursystem verwenden Sie? MGIT (BD) BACTEC/Alert (Biomerieux) A nd er es Keines 4a. Bitte spezifizieren Sie anderes 5. Welche Festnährböden setzen Sie standardmäßig an? 5a. Bitte spezifizieren Sie andere 6. Welche Zusendungen bebrüten Sie standardmäßig bei 30 Grad? Löwenstein- Jensen Stonebrink 7. Führen Sie Nukleinsäureamplifikationstests für TB an Primärmaterial durch? Ja Nein 7 H 10 Andere Themen: Primärisolierung Differenzierung 7a. Wenn ja, welche Methode verwenden Sie? 8. Führen Sie Nucleinsäureamplifikationstests für Resistenztesting an Primärmaterial durch? Ja Nein Resistenzbestimmung TBC 8a. Wenn ja, welche Methode verwenden Sie? 9. Führen Sie Nucleinsäureamplifikationstests für NTM an Primärmaterial durch? Ja Nein Resistenzbestimmung NTM 9a. Wenn ja, welche Methode verwenden Sie? Teilnahme an Ringversuchen Differenzierung 10. Wie viele Kulturen zeigen Wachstum von säurefesten Stäbchen? 11. Wie viele Kulturen werden als MTBC differenziert? Jahr Jahr pro pro Verbesserung der Ringversuche 12. Wie viele Kulturen werden als NTM differenziert? Jahr pro 13. Führen Sie die Differenzierung in Ihrem Labor durch? Ja Nein Biochemi 13a Wenn ja, welche Methode verwenden Sie zur Differenzierung? PCR Basierend MALDI-TOF sche Verfahre Anderen n 13b Bitte spezifizieren Sie anderen 13c Bitte erläutern Sie welche PCR basierende Methode Sie einsetzten (z.b. HAIN CM, in house 16S PCR ) Resistenzbestimmung TBC 14. Führen Sie TBC first-line Resistenzbestimmung in Ihrem Labor durch? Ja Nein 14a Wenn ja wie viele TBC first-line Resistenzbestimmungen führen Sie durch? pro Jahr
19 Zusammenfassung Infektiosität abhängig von Bakterienlast, Dauer und Intensität des Kontaktes Korrelation zwischen C t -Wert, TTCP und Mikroskopie Ersatz der Mikroskopie durch die PCR perspektivisch möglich PCR als Verlaufskontrolle nicht sinnvoll Anwendung verschiedener Methoden der molekularen Resistenztestung schnelles und zuverlässiges Resistenzergebnis MDR und XDR Ergebnis in einem Tag
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