L A B O R L I M B A C H
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- Sarah Böhme
- vor 7 Jahren
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1 Tuberkulose 1) Mikrobiologisches Untersuchungsmaterial Es ist eine Kombination verschiedener klassischer Methoden notwendig: Anamnese, Bildgebung, Materialgewinnung, ggf. invasive Verfahren, Mikroskopie, Kultur, Nukleinsäureamplifikation (NAT), ggf. immunologische Verfahren (Interferon-γ-Release Assay, z.b. Quantiferon -Test). Bei noch nicht gesicherter Diagnose und einfacher Probengewinnung sind mindestens 3 Proben an 3 verschiedenen Tagen für Mikroskopie, Kultur und NAT zu entnehmen. In diagnostisch besonders schwierigen Fällen kann eine größere Anzahl von Proben angezeigt sein. Sputum Erstes Morgensputum durch Abhusten aus tiefen Atemwegen mit möglichst geringer Speichelkontamination Keine Mundspülung vor Sputumgewinnung, kein Sammelsputum (wenn notwendig: maximaler Zeitraum 1Stunde) Sputuminduktion mit 5-10% NaCl-Inhalation möglich, Cave: Infektionsgefahr durch Aerosole Bronchoskopie ist bei Erwachsenen, bei Kindern Magennüchternsekret, vorzuziehen Bronchialsekret Bronchoskopisch gewinnen Trachealsekret von intubierten Patienten oder Trachealtubus wegen Kontamination mit Begleitkeimen weniger sinnvoll. Cave: Lokalanästhetika bei Bronchoskopie, möglicherweise Verfälschung des Ergebnisses wegen Bakterizidie 2-5 ml 2-5 ml (mind. 2ml) BAL Möglichst gezielt betroffenes Segment lavagieren Recovery-Flüssigkeit ohne weitere Behandlung gesondert für Tb auffangen ml mind. 20 ml Geschützte Bürste und bronchoskopisch gewonnene Biopsie Wegen Gefahr der Austrocknung ca. 0,5 ml steriles physiologisches NaCl zufügen Cave: Lokalanästhetika bei Bronchoskopie, möglichweise Verfälschung des Ergebnisses wegen Bakterizidie. Magennüchternsekret, Magenspülwasser Bei Kindern ist Magennüchternsekret oder-spülwasser der Sputuminduktion vorzuziehen. Bei älteren Kindern und Erwachsenen ist bronchoskopisch gewonnenes Material oder Sputum dem Magensaft vorzuziehen. Magennüchternsekret/ -spülwasser müssen mit Phosphatpuffer neutralisiert werden. (bei Fa. Wörner zu bestellen.) 2-5ml/20-30ml Urin Vorzugsweise Morgenurin nach Einschränkung der Flüssigkeitszufuhr am Vorabend Kein Mittelstrahlurin, kein Sammelurin, nicht aus Urinauffangbeuteln, (Ausnahme Säuglinge, Kleinkinder) Entnahme unter Vermeidung mikrobieller Verunreinigung Mind. 30ml Sperma, Prostatasekret In sterilem Gefäß auffangen, ohne Zusatz versenden Stuhl Stuhlproben nur bei Patienten mit zellulärem Immundefekt untersuchen Endoskopisch gewonnene Biopsien sind bei Verdacht auf Darm-TB vorzuziehen Seite 1 von 9 1-2g
2 Menstrualblut Gynäkologisch gewinnen und zu gleichen Teilen mit sterilem Wasser versetzen Blut Nur Vollblut (Citratblut), Untersuchung nur sinnvoll bei Patienten mit zellulärem Immundefekt, das Citratblut wird im Labor in Blutkulturmedien überführt, Bebrütungsdauer: 8 Wochen Die Blutprobe muss im Fieberanstieg entnommen werden! 5-10ml Knochenmark Knochenmarkbiopsate und aspirate sind zu behandeln wie Blut (Citratzusatz) Abstrichtupfer/ Wundmaterial Abstrichtupfer sind im Regelfall nicht geeignet, Alternativen wie Punktion, Biopsie etc. sind überlegen und vorzuziehen. Falls kein Punktat/Biopsie eingeschickt werden kann, so viel Material wie möglich mit dem Tupfer aufnehmen, für die allgemeine Bakteriologie weiteren Abstrich entnehmen. Gewebe, Biopsien So viel Material wie möglich gewinnen, Probe mit Zusatz von steriler, physiologischer NaCl vor Austrocknung schützen.(ohne Formalin) Gewebeprobe immer auch histologisch untersuchen! Körperflüssigkeiten (Punktionen, Aspirate, Exsudate) Liquor, nativ- nicht in BK-Flaschen! Andere Körperflüssigkeiten (Pleuraexsudat, Perikardflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Abszesspunktat) Blutige Proben evtl. Zusatz von Citrat erforderlich, so viel wie möglich entnehmen! 2) Interferon-Gamma-Release Assays (IGRA, z.b. Quantiferon ) Indikation: Gezielte Testung nach Risiko-Kontakt mit einem Indexfall, bei Personen >15Jahre, die Testung sollte ca. 6-8 Wochen nach dem Kontakt stattfinden, ggf. Testung direkt nach Kontakt um Ausgangswert zu haben. Testung im Rahmen der verpflichtenden arbeitsmedizinischen Vorsorge Suche nach einer latenten Tuberkuloseinfektion vor einer immunsuppressiven Therapie Bei V.a. auf eine aktive TB, ersetzt aber nicht den kulturellen Nachweis! Untersuchungsmaterial und Präanalytik des QuantiFERON-TB Gold -Testes Die speziellen Abnahmeröhrchen müssen im MVZ Labor Dr. Switkowski, Wagner, Dr. Bauermann in Berlin angefordert werden (Tel ). Bitte nur so viele anfordern wie benötigt werden, da bei uns die Spezialröhrchen nur in gleicher Anzahl wie Laborteste vorrätig sind. Blut in Spezialröhrchen abnehmen (schwarze Markierungslinie), danach 10x über Kopf hinund herdrehen, nicht schütteln, Röhrchen sollten bei Abnahme C haben. Option 1: Röhrchen vor Inkubation innerhalb 16 Stdunden verschicken (17-27 C), Abnahme kurz vor Eintreffen des Laborkuriers. Option 2: Inkubation bei 37 C für Stunden, danach 15 min zentrifugieren, anschließend Versendung der Röhrchen innerhalb von 3 Tagen zum Labor. Die Proben nicht kühlen oder einfrieren; Lagerung und Probentransport erfolgt bei Raumtemperatur. 3 x 1ml Seite 2 von 9
3 3) Epidemiologie der Tuberkulose Weltweit verzeichnete die WHO ,7 Millionen neue Erkrankungen mit 1,4 Millionen Todesfällen, darunter Kinder und Jugendliche unter 14 Jahren von denen gestorben sind. Trotz erheblicher Erfolge in den letzten 10 Jahren erhält etwa nur ein Viertel der Erkrankten weltweit eine ausreichende medikamentöse Therapie. Deutschland gehört neben anderen westlichen Industriestaaten zu den Ländern mit niedriger Tuberkulose- Inzidenz (5,3 Neuerkrankungen/ Einwohner/Jahr) (Abb.1) was allerdings kein Anlass zur Entwarnung ist, da die Migration aus Ländern mit hoher Tuberkulose-Inzidenz auch für die Epidemiologie in den westlichen Industriestaaten von Bedeutung ist. Besonders in den Stadtstaaten Berlin (9,3/ Einwohner/Jahr), Hamburg (8,8) und Bremen (8,5) liegen die Inzidenzen deutlich über dem bundesweiten Durchschnitt von 5,3. Auch in den Bundesländern Hessen (7,2) und Nordrhein-Westfalen (6,1) sind überdurchschnittliche Inzidenzen zu verzeichnen, was in Hessen vorwiegend auf den Ballungsraum Rhein/Main-Gebiet und in Nordrhein-Westfalen auf das Rheinland sowie das Ruhrgebiet zurückzuführen ist. Abb. 1 Weltweit kommt es zu einem Anstieg der Resistenzrate der Tuberkuloseerreger gegen Antituberculotica der ersten Wahl (Isoniazid: INH; Rifampicin: RMP; Ethambutol: EMB; Streptomycin: SM; Pyrazinamid: PZA). Besonders gefürchtet ist hierbei die Multi-drug-resistance, (MDR) (Abb. 2) gegen die wirksamsten Antituberculotica INH und RMP, diese kann molekularbiologisch bereits bei Verdacht von Patienten aus Risikobereichen direkt im Untersuchungsmaterial nachgewiesen werden. Zusätzlich kommt es zu einem Anstieg von XDR-TB-Stämmen (Extensively-Resistant TB). Diese Resistenz beinhaltet die MDR-Resistenz und eine zusätzliche Resistenz gegen ein Fluoroquinolon und eines oder mehrere der folgenden i.v.-medikamente: Amikacin, Kanamycin, Capreomycin. Seite 3 von 9
4 Abb. 2 4) Mikrobiologischer Untersuchungsgang bei Anforderung Mykobakterien Mikroskopie (nicht bei Urinen und Stuhl) Kulturelle Anzucht der Erreger, bei positivem kulturellem Befund folgt die Identifizierung und Resistenzbestimmung. Untersuchung mittels Nukleinsäureamplifikation (NAT), diese muss gesondert angefordert werden Anzüchtung der Mykobakterien Diese erfolgt mit einer Flüssigkultur (Bactec MGIT (Mycobacteria growth indicator tube) von BD Diagnostics) und zwei Festkulturen. Das MGIT zeigt eine schnellere Anzüchtungszeit im Vergleich zur Festkultur, Proben mit einem hohen Gehalt an Mykobakterien können schon nach 7 bis 8 Tagen positiv sein, während Festkulturen meistens zeitverzögert Wachstum zeigen Zur Therapie-Verlaufskontrolle sollte frühestens nach ca. 4 Wochen eine erneute kulturelle Untersuchung angefordert werden. Die Resistenzbestimmung der Tuberkulosebakterien Diese wird im Regelfall ebenfalls mit der MGIT-Methode durchgeführt und benötigt ca Tagen. Sie kann durch die oben erwähnten molekularbiologischen Untersuchungen ergänzt werden. Folgende Antituberkulotika werden getestet: Prothionamid. Ethambutol, Isoniazid, Rifampicin und Streptomycin. Die Resistenzprüfung wird vom ersten angezüchteten Stamm durchgeführt. Wenn nach 2-monatiger Therapie Mykobakterien weiterhin anzüchtbar sind, muss eine erneute Resistenzprüfung durchgeführt werden. Seite 4 von 9
5 Bei resistenten Isolaten werden Medikamente der zweiten Wahl (z. B. Prohionamid, Cycloserin, Quinolone, Makrolide, Aminoglykoside etc.) ausgetestet. Hierzu werden die Isolate an das NRZ für Mykobakterien nach Borstel versandt. Die Identifizierung der angezüchteten Mykobakterien Diese erfolgt molekularbiologisch mittels Hybridisierung, sowohl für die typischen Mykobakterien als auch für die Nichttuberkulösen Mykobakterien (NTM). Für Sonderfälle werden biochemische Teste vorgehalten. Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAT) zum Direktnachweis von Tuberkuloseerregern im Originalmaterial Die im Labor Limbach durchgeführten Methoden haben eine Sensitivität und Spezifität bei mikroskopisch positiven Proben bei jeweils 100%. Bei mikroskopisch negativen Proben liegt die diagnostische Sensitivität (d. h. NAT im Vergleich zu Kultur und Krankheitsgeschichte) bei 90,5%, die Spezifität bei 99%. Alle NAT-Methoden weisen eine wesentlich höhere Sensitivität als die Mikroskopie auf, sind aber weniger sensitiv als die Kultur, die daher immer mit angefordert werden sollte. Die Untersuchung mittels NAT muss separat angefordert werden und ist indiziert bei: I. Mikroskopisch negativen Proben bei klinisch begründetem V. a. eine Tuberkulose, (3 Proben von einem Patienten erhöhen die Sensitivität auf fast 100%) II. Mikroskopisch positiven und zweifelhaften Proben (Differenzierung M. tuberculosis-komplex und Nichttuberkulöse Mykobakterien, NTM) III. Untersuchungsmaterial von besonders gefährdeten Patienten z.b. AIDS, Kleinkinder, generalisierte Erkrankung, V.a. tuberkulöse Meningitis IV. Schwer gewinnbaren Materialien z.b. Biopsien, Liquor, V. Bei Verdacht auf eine MDR- oder XDR-Tuberkulose und bei einer HIV-assoziierten Tuberkulose, hier sollte aus dem Originalmaterial molekularbiologisch die Resistenz auf INH und Rifampicin bestimmt werden. Bei Nachweis einer INH- und Rifampicin- Resistenz, sollte eine weitere molekularbiologische Untersuchung zur Bestimmung der Resistenzgene von Fluorchinolonen, Ethambutol und Aminoglycosiden durchgeführt werden. Diese Untersuchungen müssen speziell angefordert werden! (Ergebnis liegt innerhalb eines Tages vor) Grenzen der NAT: Die NAT ist nicht geeignet zur Therapiekontrolle. (abgestorbene Keime oder DNA von geschädigten Bakterien werden auch nachgewiesen) Die NAT kann keine Aussage über die Infektiosität machen! 5) Therapie und Infektionsverhütung der Tuberkulose 2012 wurden durch das Deutsche Zentralkomitee zur Bekämpfung der Tuberkulose (DZK) und die Deutsche Gesellschaft für Pneumologie und Beatmungsmedizin (DGP) neue Empfehlungen zur Therapie, Chemoprävention und Chemoprophylaxe der Tuberkulose im Erwachsenen- und Kindesalter herausgegeben. Die Empfehlungen zur Infektionsprävention bei Tuberkulose wurden 2012 vom DZK in der Zeitschrift Der Pneumologe publiziert. Die Therapieempfehlung des DZK für die Erkrankung mit einem sensiblen Stamm M. tuberculosis lautet: Seite 5 von 9
6 Erwachsene Standard-Kurzzeittherapie (6 Monate): Initialphase (2 Monate) Isoniazid (INH) + Rifampicin (RMP) + Pyrazinamid (PZA) + Ethambuthol (EMB) oder Streptomycin(SM) Stabilisierungsphase (4 Monate) Isoniazid (INH) + Rifampicin (RMP) Kinder: Initialphase (2 Monate) INH + RMP + PZA Stabilisierungsphase (4 Monate) INH + RMP 6) Diagnose einer Latenten Tuberkulose-Infektion (LTBI) mittels Interferon-Gamma-Release Assays (IGRAs) (QuantiFERON-TB Gold In-Tube, ELISA) und T-SPOT.TB ELISPOT) In Deutschland verlaufen die meisten TB-Infektionen als latente Infektionen (LTBI) d. h. als Infektion mit Persistenz vitaler Bakterien im Organismus ohne Organbefund, bzw. ohne Erkrankung. Bei den immunologischen Testen werden die TB-spezifischen Antigene ESAT-6, CFP-10 und TB 7.7 (QuantiFeron-TB Gold-Test) bzw. ESAT-6 und CFP-10 (T-SPOT.TB) verwendet, die nur bei M. tuberculosis und M. bovis vorkommen. Sie fehlen bei den für BCG-Impfstoffe verwendeten Stämmen, sowie bei den Nichttuberkulösen Mykobakterien (NTM) (Ausnahme: M. kansasii, M. marinum, M. szulgari M. flavescens). Testverfahren Nachweis der Interferon-ץ-Bildung von T-Effektorzellen, die mit den oben genannten für M. tuberculosis spezifischen Antigenen stimuliert werden. Die Blutentnahmeröhrchen des QuantiFERON-TB Gold -Tests im Teströhrchen sind mit einer Kombination der o.g. Antigene beschichtet, die die T-Zellen in der Vollblutprobe des Patienten stimulieren. Bei vorausgegangenem Kontakt mit M. tuberculosis schütten die T-Zellen das Zytokin ץ- Interferon (ץ- IFN ) in das Plasma aus, das mittels eines ELISA-Tests gemessen wird. Bei dem T-SPOT.TB -Test werden die M. tuberculosis-spezifischen T-Zellen im peripheren Blut nachgewiesen. Die im Testansatz vorhandenen spezifischen Antigene von M. tuberculosis führen zu einer Aktivierung der Effektor-T-Lymphozyten, die mittels ELISPOT-Technologie nachgewiesen werden. QuantiFERON-TB Gold In-Tube : Sensitivität 81-84% Spezifität 99% (d.h. fast keine falsch pos.!) T-SPOT.TB : Sensitivität 88-89%, Spezifität 86% Tuberkulin-Hautreaktion Sensitivität 70% Zusätzlich wird die generelle Stimulierbarkeit der T-lymphozytären IFN-ץ-Bildung untersucht, um falsch negative Testergebnisse zu verhindern. Auf diese Weise ist zusätzlich auch eine Aussage hinsichtlich der T-Zellvermittelten Immunitätslage möglich. Seite 6 von 9
7 Ein negatives IGRA-Ergebnis schließt eine TB-Infektion nicht zu 100% aus! Die IGRA-Teste können nicht zwischen aktiver TB und LTBI unterscheiden- Der Test ist nicht geeignet zur Therapiekontrolle Verdacht auf LTBI Verdacht auf aktive TB IGRA oder TB- Hauttest (THT) bei Kindern <5Jahre positiv negativ Diagnose unwahrscheinlich, evtl. dennoch Kontrolle nach 6-8Wo, bzw.12 Wo bei Kindern. Direkt Anamnese, Bildgebung, weitere Diagnostik (Mikroskopie, Kultur, PCR) (ohne vorher IGRA) negativ Unterschiedliches Vorgehen je nachdem, ob TB dennoch wahrscheinlich oder nicht Bildgebung und evtl. weitere Diagnostik positiv negativ Chemoprävention (nur IGRA pos.) Positiv V.a. aktive TB, weitere Diagnostik erforderlich TB-Diagnose bestätigt Indikationen für den Interferon-Gamma-Release Assay (IGRA, z.b. Quantiferon ): Gezielte Testung nach Risiko-Kontakt mit einem Indexfall, bei Personen >15 Jahre, idealerweise direkt nach Kontakt (Ausgangswert), falls dieser negativ ausfällt: Wiederholung der Untersuchung nach ca. 6-8 Wochen. Testung im Rahmen der verpflichtenden arbeitsmedizinischen Vorsorge Suche nach einer latenten Tuberkuloseinfektion vor einer immunsuppressiven Therapie Bei V.a. auf eine aktive TB als ergänzende Untersuchung, ersetzt aber nicht den kulturellen Nachweis! Vorteile der IGRA-Teste Die Teste werden durch eine frühere BCG-Impfung nicht beeinflusst Infektionen mit den meisten NTM zeigen keine Kreuzreaktion im TB-Test (Ausnahme: M. kansasii, M. marinum, M. szulgai und M. flavescens) Ein weiterer Besuch des Patienten in der Praxis, wie er zum Ablesen des THT notwendig ist, entfällt Subjektive Einflüsse, die bei der Bewertung des THT eine Rolle spielen können, sind durch das standardisierte Testverfahren ausgeschlossen Unter Berücksichtigung der Kontrollen ist der Test auch bei Patienten mit Immunschwäche (z. B. HIV) einsetzbar Einsetzbar bei Kindern und Kleinkindern < 5 Jahre, wenn der THT positiv war und Kontakt zu Erkrankten stattgefunden hat. Seite 7 von 9
8 Untersuchungsmaterial und Präanalytik des QuantiFERON-TB Gold -Testes Die speziellen Abnahmeröhrchen müssen bei uns angefordert werden (Tel-Nr ). Bitte nur so viele anfordern wie benötigt werden, da bei uns die Spezialröhrchen nur in gleicher Anzahl wie Laborteste vorrätig sind. Blut in Spezialröhrchen abnehmen (schwarze Markierungslinie), danach 10x über Kopf hinund herdrehen, nicht schütteln, Röhrchen sollten bei Abnahme C haben. Option 1: Röhrchen vor Inkubation innerhalb 16 Stdunden verschicken (17-27 C), Abnahme kurz vor Eintreffen des Laborkuriers. Option 2: Inkubation bei 37 C für Stunden, danach 15 min zentrifugieren, anschließend Versendung der Röhrchen innerhalb von 3 Tagen zum Labor. Die Proben nicht kühlen oder einfrieren; Lagerung und Probentransport erfolgt bei Raumtemperatur. 3 x 1 ml Für weitere Fragen stehen wir Ihnen gerne zu Verfügung Tuberkulose-Labor Tel.-Nr Ärztliche Mitarbeiter Tel.-Nr Prof. Dr. H. Hof, Dr. M. Holfelder, Dr. K. Oberdorfer, Dr. S. Schütt, Dr. R. Schwarz, Fr. Singer 7) Literatur Boden, D., M. Weizenegger, K. Benz, W. Ponstingl, M. Hengstler, S. Rüsch-Gerdes, A. Fahr, J. Bartel Reserve Dot -Hybridisierung zur schnellen Identifizierung von Mykobakterien - Spezies aus Kulturmaterial. Clin. Lab. 44: Brossier, F., N. Veziris, C. Truffot-Pernot, V. Jarlier, W. Songakoff Performamce of the Genotype MTBDR line probe assay for detection of resistance to rifampicin and isoniazid in strains of Mycobacterium tuberculosis with low- and high-level resistance. J. Clin. Microbiol. 44 : Deutsches Zentralkomitee zur Bekämpfung der Tuberkulose. Empfehlungen zur Therapie, Chemoprävention und Chemoprophylaxe der Tuberkulose im Erwachsenen- und Kindesalter. Pneumologie 2012; 66: Georg Thieme Verlag KG Stuttgart New York Detjen A et al Immunologische Diagnostik der Tuberkulose-Interferon-ץ-Tests. Monatsschrift Kinderheilkd 154: p Diel R et al Evidence-based comparison of commercial Interferon- Release Assays for detecting active TB. Chest 137 (4) p Diel R et al. Neue Empfehlungen für die Umgebungsuntersuchungen bei Tuberkulose Pneumologie Online- Publikation: 2011 DIN , , , , Tuberkulosediagnostik. DIN Deutsches Institut für Normung e. B. Berlin (Beuth) DIN Methodenspezifische Anforderungen an den Nukleinsäurenachweis von Mycobacterium Seite 8 von 9
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