Tiber die chemische Natur des Papains. II.(1) Reinigung des Papains durch Taka-Amylase.

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1 534S. Okumura. [Vol. 13, No. 8, Tiber chemische Natur des s. II.(1) Reigung des s durch Taka-. Von Shigeo OKUMURA.* (Egegangen Mfchner Adsorption Erfolge(2) Schule hat Reigung an Tonerde durchzuffihren damit erzielt. nung Vor kurzem beobachtet, fast vollig haben dass aus seer tischen Wirkungen besitzt., Wahrend "Symplex" loslich. mittels Da Akabori Nuklesdure weitgehende konzentrierten da, im sowie gefallt Taka-amylase schwer, bessere bisher ergibt als ph = 5 fliessen. geht lasst Wahrend lost Restlosung 'fiber. Hilfe nennenswerten Der so gewon- - beiden enzyma- hohem Reheitsgrade leicht Salzlosungen ses genannten worden. loslich leicht Symplexes Autoren Der Verfasser fiber den -dass these Arbeitsweise angewten ee dabei e erreicht des s ur d gefunden, --Symplex" wird. Bdung den mit kee teressante Erschei Taka-amylaselosung Kasimoto(3) auflosen konnten, Reigung s vermutlich Nieschlag hat sich bemfiht, Reigung Nieschlag durchzuffihren, Erfolge des versucht, Akabori Kasimoto(3) das durch Zugabe nenen --Nieschlag Symplex im Sn R. Willstatters, ee am 18. Juli 1938.) fiblichen Methoden. 2 N Essigsaure-Acetat-Puffer " Saule dem Alumiumoxyd Adsorbens enthalt durch- festgehalten nun wird, das zu etwa 40%, angewten Menge sehr hohen Reheitsgrade Aktivitatserhohung steigt immer mehr zwar bis zum Zwanzigfachen Anfangsaktivitat. Das so gereigtes folge Entfernung Begleitstoffe sehr unbestig koaguliert bei Dialyse gegen zum grossen Teil. Wird Adsorptionsrestlosung durch Zugabe festem Ammoniumsulfat auf Sattigung gebracht, dabei entstene Nieschlag wenig * Friiher Shigeo MAEDA. (1) I. Mitteilung: s Bullet, 12 (1937), 319. (2) Z. physiol. Chem., 138 (1924), 184; 164 (1927), 10. (3) J. Chem. Soc. Japan, 59 (1938), 563; s Bullet, 13 (1938), 453. aufgelost

2 1938] Uber chemische Natur des s. gegen destilliertes bei 50 dialysiert, II.535 Koagulierung des Enzyms bis zu eem gewissen Grade zu vermeiden. Aus Innenlosung Dialyse wird durch Fallung mit Aceton e hochgereigtes praparat gewonnen, das 48.46% C, 7.03% H 13.7% N enthalt. Der Tryptophangehalt betragt 1.39%, also um Halfte weniger als des Ausgangspraparats (3.43%). Wahrend im gereigten Praparat SH-Reaktion mit Nitroprussidnatrium we vor noch nach dem Beheln mit Blausaure positiv verlauft, das Praparat, wie aus Tabelle 2 ersichtlich, durch Blausaure aktivierbar. se Aktivierung beobachtet nur bei mehrstundiger Ewirkung des Enzyms auf Gelate, nicht bei Anfangsverdauung. Auf Grund obigen Tatsachen glaubt Verfasser Anhaltspunkte dafiir gewonnen zu haben, dass Blausaureaktivierung des s nicht auf Aufspaltung dem Enzymkomplex enthaltenen -S-SGruppen SH-Gruppen beruht,(4) wie bisher zahlreichen Arbeiten ausschliesslich angenommen worden, sonn auf Entfernung des Hemmungskorpers, im Lauf Verdauung entsteht o im praparat vorkommt. Das vielleicht e spezielles Prote, das ee Aldehyd-Gruppe, kee -S-S- Gruppen o SH-Gruppen tragt, wie Verfasser schon I. Mitteilung erortert hat. Beschreibung Versuche. I. Darstellung Taka-amylaselosung. 50 g. Taka-amylase wurden 200 c.c. gelost, mit 235 c.c. Methanol versetzt dem abgeschiedenen Nieschlag abzentrifugierten wieum 367 c.c. Methanol zugefiigt. Der hierbei gewonnene zweite Nieschlag wurde abzentrifugiert, im wenig gelost, mittels eer Kollodiumhulse gegen destilliertes dialysiert Innen- Aussenlosung Dialyse zur Reigung angewt. II eheit wert. Der Verfasser defiert jenige Enzymmenge als -Eheit [P-(e)], unter den nachstehenden Verdauungsbedgungen een COOH-Zuwachs entsprechend 1 c.c. eer 0.2 N KOH ergibt. Als Mass fur den Reheitsgrad wird -Wert [P-(w)] vorgeschlagen, welcher Anzahl -Eheiten 10 mg. Praparat angibt. Ausf4hrung Bestimmung. Ee Mischung 5 c.c. 5%aiger Gelatelosung, 5 c.c. N/5 Essigsaure-Acetat-Puffer (2)H= 5) (5 - x)c.c. destilliertem versetzt mit x c.c. zu bestimmenden unbekannten Menge losung (Gesamtvolumen 15 c.c.). Nachdem Mischung 10 Muten bei 36 verblieben, (4) W. Grassn, Z. angew. Chem., 44 (1931),105; Biochem. Z., 279 (1935),131; Th. Bers, Ergeb. Enzymforsch., 4 (1935),68; Z. physiol. Chem., 220 (1933),209; 222 (1934), 177; E. Maschn, ibid., 219 (1933), 99; 228 (1934), 141; Biochem. Z., 277 (1935),97.

3 536S. Okumura. wird sie darf denn halb graphisch [Vol. 13, No. S, unter Zusatz Formol titriert. Bei Bestimmung -Eheit COOH-Zuwachs nicht fiber 0.2 Milliaquivalent (1.0 c.c. 0.2 N KOH) steigen; COOH-Zuwachs bei den erwahnten Verdauungsbedgungen nur nerobigen Grenze verwten Enzymmenge proportional, wie Abb. 1 dargestellt. Abb. 1. menge Grad Hydrolyse. III. Vorreigung des s. 100 g. Helspapa wurden mit 500 c.c. destilliertem durchgeschiittelt, 4-5 Stunden bei Zimmertemperatur stehen gelassen, abzentrifugiert mittels eer Kollodiumhfilse 17 Stunden lang bei 5 gegen dialysiert. Aus Innenlosung (SH-Reaktion war sehr deutlich) wurde das durch Zusatz Aceton gefallt fiber Schwefelsaure unter Vakuum getrocknet (SH-Reaktion war sehr schwach). 50 g. des getrockneten s ([P-(e)]= 390, [P-(w)]= 0.06) wurden 250 c.c. N Essigsaure-Acetat-Puffer vom ph = 5 gelost, zweimal mit je 30 g. Alumiumoxyd behelt, abzentrifugiert Restlosung sowohl Enzymmenge als auch Reheitsgrad bestimt. Mittels ser Behlung kann den Reheitsgrad auf das Doppelte steigern ([P- (e) ] = 330, [P-(w)]= 0.14). IV. Reigung des s durch. (1) Versuche mit Innenflussigkeit Dialyse Taka-amylase. Versetzt 100 c.c. losung ([P- (e) ] = 132, [P- (w) ] = 0.14) mit eer iiberschiissigen Menge 10 %iger Taka-amylaselosung, so entsteht e dunkelbrauner --Nieschlag N1, welcher abzentrifugiert wird. Aus dem Filtrat lasst sick durch Zugabe fiffachen Menge destillierten s zweite Nieschlag N2 fallen. Der erste Nieschlag N1 wird 2N Essigsaure-Acetat-Puffer vom ph = 5 aufgelost nun durch ee mit Al2O3 gefiillte Rohre, welche vor Adsorption mit selben Pufferlosung gewaschen worden, sehr langsam hdurchgesaugt. Dabei wird auf dem Adsorbens festgehalten, wahrend das Restlosung geht. Nach dreimaliger Adsorption wird das durch Zugabe festem Ammoniumsulfat ausgesalzen Suspension daraufh mehrere Stunden eem kalten Raum absitzen gelassen. klare obere Fliissigkeit wird mit eem Heber abgetrennt Suspension mittels eer Kollodiumhnlse bei 5 dialysiert. Innenfliissigkeit filtriert ab, fallt

4 1938] fiber chemisehe Natur des s. II.537 mit dem sechsfachen Volumen an Aceton trocknet im Vakuum c Schwefelsaure. E wie oben gereigtes praparat zeigt een -Wert Der zweite Nieschlag N2 wird gleicher Weise behelt, wobei fast dasselbe Resultat ([P-(w) ] = 1.36) gewonnen wird. Experimente wird Tabelle 1 schematisch angegeben. (2) Versuche mit Aussenfliissigkeit Dialyse Taka-amylase. Versuche mit Aussenamylase ( Aussenfliissigkeit Dialyse) ergaben fast gleiche Resultate. Tabelle V. Aktivierung des gereigten (Trockengewicht 2.6 mg. pro 1 c.c.) hzu, lasst 2 Stunden Lang eem s. fiigt 1. Thermostaten Zu 10 c.c. Adsorptionsrestlosung 10 c.c. eer 3%igen Blausaurelosung 36 voraktivieren, versetzt dann 80 c.c. 5%ige Gelat-losung, pipettiert nach verschiedenen Zeitraumen je 10 c.c. ab priift Aktivitat mit Hilfe Formoltitration. Versuchsresultate sd Tabelle 2 zusammengestellt.

5 538[Vol. 13, No. 8, Tabelle 2. An ser Stelle mochte ich Herrn Prof. S. Akabori Herrn K. Kasimoto fur ihre liebenswurdigen Ratschlage freundliche Unterstiitzung meen herzlichen Dank aussprechen. Chemisches Institut Kaiserlichen Universitat zu Osaka.