Die Duale Aktivität des Insulinrezeptors: Mechanistische Untersuchungen an der rekombinanten Insulinrezeptorkinase

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1 Die Duale Aktivität des Insulinrezeptors: Mechanistische Untersuchungen an der rekombinanten Insulinrezeptorkinase Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Norbert Tennagels aus Ratingen 1998

2 Berichterstatter: Prof. Dr. H.W. Klein Priv.-Doz. Dr. O. Martini Tag der mündlichen Prüfung:

3 Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von September 1995 bis April 1998 am Institut für Biochemie an der Universität zu Köln unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. H.W. Klein angefertigt.

4 Sonja und meinen Eltern

5 Abkürzungsverzeichnis Verzeichnis der Abkürzungen µl Mikroliter µm Mikromolar Abb. Abbildung AcNPV Autographa california nuclear polyhedrosis virus ADP Adenosin-5 -Diphosphat AMP Ampicillin AMP-PNP Adenylyl-imidodiphosphat ATP Adenosin-5 -triphosphat Bp Basenpaar(e) bzw. beziehungsweise Ci Curie cpm counts per minute(zählimpulse pro Minute) d. h. das heißt Da Dalton DNA Desoxyribonucleinsäure DTT Dithiothreitol E. coli Escherichia coli EC 50 Konzentration mit halbmaximalem Effekt EDTA Ethylendiamintetraacetat et al. et alii Faktor Xa Restriktionsprotease Faktor Xa FPLC Fast Performance Liquid Chromatography g Erdbeschleunigung (9.81 m x s -2 ) Gab-1 Grb2-associated binder-1 GAB-CT C-Terminus des Gab-1 Proteins (Aminosäure: ) Mittlere Domäne des Gab-1 Proteins (Aminosäure ) GSH reduziertes Glutathion GST Glutathion-S-Transferase GST-CT Fusionsprotein mit IR-C-Terminus GST-CTphe Fusionprotein mit IR-C-Terminus mit den Aminosäuresubstitutionen: Y1316F, Y1322F GST-CTthr Fusionprotein mit IR-C-Terminus mit den Aminosäuresubstitutionen: Y1316T, Y1322T GST-Ex20 Fusionsprotein mit der vom Exon 20 kodierten Aminosäuresequenz GST-JM Fusionsprotein mit IR-Juxtamembrananteil hirs-1 p30 rekombinantes Fragment von hirs-1 HPLC High Performance Liquid Chromatography IR Insulinrezeptor IRKD Insulinrezeptorkinase-Domäne IRKD-D1120A Insulinrezeptorkinase-Domäne mit Aminosäuresubstitution: D1120A IRKD-HIS Insulinrezeptorkinase-Domäne mit N-terminaler Histidin- Affinitätsmarkierung IRKD-K1018A Insulinrezeptorkinase-Domäne mit Aminosäuresubstitution: K1018A IRKD-Y1151F Insulinrezeptorkinase-Domäne mit Aminosäuresubstitution: Y1151F IRKD-Y1316/22F Insulinrezeptorkinase-Domäne mit den Aminosäuresubstitutionen: Y1316F, Y1322F IRKD-Y1316/22T Insulinrezeptorkinase-Domäne mit den Aminosäuresubstitutionen: Y1316T, Y1322T IRKD-Y960/1316/22T Insulinrezeptorkinase-Domäne mit den Aminosäuresubstitutionen: Y960F, Y1316T, Y1322T IRS-I bzw. IRS2/IRS 3 Insulinrezeptor-Substrat I bzw. 2/3

6 Abkürzungsverzeichnis kbp Kilobasenpaar kda Kilo-Dalton l Liter M mol/l, Molar MAD2 mitotic arrest deficient protein MapK map-kinase MapKK bzw. Mek map kinase kinase min Minute ml Milliliter Mr relatives Molekulargewicht n. B. nicht bestimmt PCR Polymerase chain reaction PH-Domänen pleckstrin-homologe-domänen Pi anorganisches Phosphat PI3-Kinase Phosphatidylinositol-3-Kinase PMSF Phenylmethylsulfonylchlorid ps bzw. Ser-P Phosphoserin PTB-Domänen Phosphotyrosin bindene Domänen PTPase Proteintyrosinphosphatase PVDF Polyvinyldifluorid py bzw. Tyr-P Phosphotyrosin rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur RTK Rezeptor-Tyrosinkinasen s. siehe SDS Natriumdodecylsulfat SDS-Gel SDS-Polyacrylamidgel SDS-PAGE SDS-Polyacrylamidgel-Elelektrophorese sec. Sekunde Sf9 Spodoptera frugiperda SH2- bzw. SH3-Domäne src-homologe Domäne 2 bzw. 3 Shc src homology 2 (-collagen related)-protein SHPTP2 bzw. Syp Src homology-protein tyrosin phosphatase 2 Sos Son of sevenless-protein Tab. Tabelle TCA Trichloressigsäure Tricin N-Tris[hydroxymethyl]methylglycin Tris Tris[hydroxymethyl]aminomethan Triton X-100 PEG-(9.6)-p-t-octylphenylether ÜNK Übernachtkultur vgl. vergleiche z. B. zum Beispiel

7 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 4 2 Einleitung Die Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen Insulin, Metabolismus und Glukose Homöostase Biosynthese und Struktur des Insulinrezeptors Der Mechanismus der Kinaseaktivierung Die Serin- und Threoninphosphorylierung der Insulinrezeptorkinase Signalwege des Insulinrezeptors Die Termination des Insulinrezeptor-Signals Die lösliche Insulinrezeptorkinase als Modellenzym Fragestellung der Arbeit 26 3 Konstruktion, Expression und Reinigung der Insulinrezeptorkinase-Domäne Das Baculovirus-Expressionssystem Konstruktion des Transfervektors pvl-irkd Herstellung und Isolierung rekombinanter Baculoviren Zeitverlauf der Proteinexpression der löslichen Insulinrezeptorkinase Reinigung der löslichen Insulinrezeptorkinase IRKD Konstruktion, Expression und Reinigung abgewandelter Kinasekonstrukte Konstruktion der Transfervektoren pvl-irkd-k1018a, pvl-irkd-y1316/22f, pvl-irkd-y1316/22t Expression und Reinigung der Kinasekonstrukte IRKD-K1018A, IRKD-Y1316/22F und IRKD-Y1316/22T 32 4 Charakterisierung der gereinigten IRKD Bestimmung des apparenten Molekulargewichtes und des Phosphorylierungsstatus des Enzyms Bedingungen für die Autophosphorylierungsreaktion der IRKD Ionenabhängigkeit der Autophosphorylierungsreaktion ATP-Abhängigkeit der Autophosphorylierungsreaktion Aktivierung der Autophosphorylierung durch Poly(Lysin) und Histon 2b Konzentrationsabhängigkeit der Autophosphorylierung ph- und Temperaturoptimum der Autophosphorylierung 41 5 Die Duale Aktivität der Insulinrezeptorkinase Methoden zum Nachweis von Phosphoaminosäuren Die Duale Aktivität der Insulinrezeptorkinase in der Autophosphorylierung Abhängigkeit der IRKD-Serinphosphorylierung von den Reaktionsbedingungen Zeitverlauf der Autophosphorylierung Identifizierung der Autophosphorylierungsstellen der Insulinrezeptorkinase Die Methode der Phosphopeptidkartierung Vergleich der Autophosphorylierungsstellen der IRKD, IRKD-Y1316/22F, IRKD-Y1316/22T und IRKD-Y960/1316/22F Einfluß der Poly(Lysin)-Stimulierung auf die Verteilung der Phosphate in der IRKD Identifizierung der Serinphosphorylierungsstellen des humanen Insulinrezeptors in situ Die Serinphosphorylierung der IRKD-K1018A 59 1

8 Inhaltsverzeichnis 6 Die Duale Kinaseaktivität der IRKD in der Substratphosphorylierung Konstruktion, Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen Das Gluthation-S-Transferase-Expressionssystem in E. coli Konstruktion, Expression und Reinigung der GST-Fusionsproteine GST-JM, GST-Ex20,GST-CT, GST-CTphe und GST-CTthr Expression und Reinigung der Fusionsproteine Kinetische Konstanten der Substratphosphorylierung Einfluß von Substraten auf die Autophosphorylierung der IRKD Die Serinphosphorylierung exogener Substrate Die Serinphosphorylierung des C-terminalen Fusionsproteins GST-CT Die Serinphosphorylierung des C-terminalen Fusionsproteins GST-CTphe Die Serinphosphorylierung des hirs-1 p Die Serinphosphorylierung von Gab Die Substratphosphorylierung synthetischer Peptide 84 7 Die Transiente Phosphorylierung der IRKD Untersuchungen zum ATP-Umsatz der Phosphotransferasereaktion Die transiente Phosphorylierung der IRKD Die Chase-Reaktion mit der IRKD Zeitverlauf der transienten Phosphorylierung der IRKD Identifizierung der transienten Phosphorylierungsstellen in der IRKD Die transiente Phosphorylierung der IRKD-Y1316/22F und IRKD-Y1316/22T Die transiente Phosphorylierung der IRKD-K1018A Substratphosphorylierungen unter Pulse-Chase-Bedingungen Phosphorylierung der GST-Fusionproteine GST-CT, GST-Ex20 und GST-JM unter Pulse-Chase-Bedingungen Phosphorylierung des hirs-1 p30 unter Pulse-Chase-Bedingungen Die transiente Phosphorylierung in Gegenwart des vorphosphorylierten hirs-1 p Diskussion Expression und Reinigung der IRKD Die enzymatischen Eigenschaften der löslichen Insulinrezeptorkinase Allgemeine Charakterisierung der löslichen Insulinrezeptorkinase Die Autophosphorylierungsreaktion Die Substratphosphorylierung Die transiente Phosphorylierung Die duale Aktivität der löslichen Insulinrezeptorkinase Allgemeine Charakterisierung der Serinphosphorylierung Mechanistische Aspekte zur dualen Aktivität der Insulinrezeptorkinase Mögliche Bedeutung der Serinphosphorylierung Methoden Molekularbiologische Methoden Konstruktion der Transfervektoren pvl-irkd-y1316/22f und pvl-irkd-y1316/22t Konstruktion der E. coli-expressionsvektoren pgst-ctphe und pgst-ctthr Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen aus E. coli Proteolytische Spaltung der GST-Fusionsproteine und Reinigung der Peptide Expression und Reinigung der löslichen Insulinrezeptorkinase IRKD und ihrer Varianten Expression im Baculovirus-Expressionssystem 142 2

9 Inhaltsverzeichnis Zellkultur Infektion, Proteinexpression und Ernte von Sf9-Zellen Reinigung der löslichen Insulinrezeptorkinase FPLC-Anionenaustauschchromatographie FPLC-Hydrophobe Interaktionschromatographie mit Phenylsepharose Reinigung durch FPLC-Gelfiltration mit Superose Protein-Biochemische Methoden Transfer und immunologischer Nachweis von Proteinen auf PVDF-Membran Proteinbestimmung Bestimmung des apparenten Molekulargewichtes durch Gelfiltration Phosphorylierungsreaktionen Bestimmung des Phosphateinbaus Phosphoaminosäure- und Nukleotidanalyse Tryptische Spaltung von Proteinen im SDS-Gel Phosphoaminosäureanalysen Nukleotidanalyse HPLC-Analyse tryptischer Peptide der Insulinrezeptorkinase Reinigung phosphorylierter Proteine von nicht umgesetztem radioaktiv markiertem ATP Reinigung des in-situ radioaktiv markierten humanen Insulinrezeptors Zellkultur In situ labeling und Ernte der Zellen Immunpräzipitation Computeranalyse Material Chemikalien Radiochemikalien Antikörper und Enzyme Nukleinsäuren Plasmidvektoren Oligonukleotide Chromatographie Bakterien, Zell-Linien, Viren, Kulturmedien und -zusätze Molekulargewicht-/Längenstandards Kit-Systeme Verbrauchsmaterial Laborausstattung Literatur Anhang Experimentelle Daten zu Kapitel 4: Charakterisierung der gereinigten IRKD Experimentelle Daten zu Kapitel 5: Die Duale Aktivität der Insulinrezeptorkinase in der Autophosphorylierung Experimentelle Daten zu Kapitel 6: Die duale Aktivität der IRKD in der Substratphosphorylierung Experimentelle Daten zu Kapitel 7: Die transiente Phosphorylierung der IRKD 180 3

10 Zusammenfassung 1 Zusammenfassung Eine lösliche Insulinrezeptorkinase (IRKD, 45,7 kda, Arg 941 -Ser 1343 ) und verschiedene, durch ortsspezifische Mutagenese veränderte Varianten (IRKD-K1018A, IRKD-Y1316/22F, IRKD- Y1316/22T, IRKD-Y960/1316/22F) wurden kloniert und im Baculovirus-Expressionssystem exprimiert: Die Enzyme können durch sequentielle Anionenaustausch-, hydrophobe Interaktionsund Gelfiltrationschromatographie zur Homogenität gereinigt werden. Die Ausbeuten an gereinigtem Protein aus 100 ml Zellsuspension (10 8 Zellen) sind für alle Konstrukte vergleichbar und betragen 0,25-0,5 mg Protein. Der Einfluß der Reaktionsbedingungen auf die enzymatischen Eigenschaften der gereinigten IRKD wurde untersucht: Das Enzym zeigt seine maximale Aktivität bei 5 mm MgCl 2 und 5 mm MnCl 2, einem ph-wert von 7,5 und einer Temperatur von 20 C. Die kinetischen Konstanten K m und V max für ATP werden mit 135 µm und 230 nmol min -1 mg -1 bestimmt. Der Phosphateinbau ist unabhängig von der Enzymkonzentration, kann aber durch die Anwesenheit von Polykationen um den Faktor zwei gesteigert werden. Die Substratphosphorylierungsreaktion wurde charakterisiert: Die höchsten katalytischen Effizienzen zeigen die aus dem Insulinrezeptor und seinen Signalproteinen (IRS-1, Gab-1) abgeleiteten rekombinanten Fragmente. Der Austausch der beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Phenylalanin bewirkt eine Erhöhung der V max -Werte in der Substratphosphorylierungsreaktion. Die Anwesenheit exogener Substrate führt zu einer Inhibition der IRKD-Autophosphorylierung. Die halbmaximale Hemmung tritt bei Substratkonzentrationen um die jeweiligen K m -Werte ein. Die duale Aktivität der Autophosphorylierung der löslichen Insulinrezeptorkinasen wurde untersucht: Die Autophosphorylierung führt zur Phosphatinkorporation in Tyrosin- und Serinreste. Die beobachtete Serinphosphorylierung ist abhängig von der Kinaseaktivität und der Tyrosinphosphorylierung zeitlich nachgeschaltet. Sie besitzt die gleiche Stöchiometrie wie die Serinphosphorylierung des aus Humanplazenta gereinigten Insulinrezeptors. Weder der Austausch der Tyrosinreste in der Juxtamembran- noch in der C-terminalen Domäne bewirkt eine Änderung in der Kinetik der Reaktion. Die beobachtete Serinphosphorylierung ist auf die Phosphorylierung der beiden im C-Terminus lokalisierten Serinreste Ser 1275 und Ser 1309 zurückzuführen. Ihre Besetzung ist in dem aus Humanplazenta gereinigten Insulinrezeptor nach Autophosphorylierung in vitro nachweisbar. In Zusammenarbeit mit Dr. Maassen (Leiden, NL) ergeben in situ-labeling - Experimente den Hinweis, daß die beobachtete Serinautophosphorylierung auch in intakten Zellen stattfinden kann. Die duale Aktivität der Autophosphorylierung wurde auf die Substratphosphorylierungsreaktion übertragen: Die IRKD katalysiert die Tyrosin- und Serinphosphorylierung in der kinaseinaktiven IRKD-K1018A, in einem aus dem C-Terminus des Insulinrezeptors abgeleiteten GST-Fusionsprotein und in rekombinanten Fragmenten aus IRS-1 und Gab-1. Dabei ist die Effizienz der Serinphosphorylierung abhängig von der Substratkonzentration. Die Substitution der Tyrosinphosphorylierungsstellen des C-terminalen Fusionproteins gegen Phenylalanin führt noch zur Phosphorylierung der in diesem Substrat enthaltenen Serinphosphorylierungsstellen und zeigt in Bezug auf die Serinphosphorylierung dieselben kinetischen Konstanten wie das unveränderte GST-Fusionsprotein. 4

11 Zusammenfassung Die Kinetik der Autophosphorylierung der IRKD wurde charakterisiert: Während der Reaktion ist ein ständiger ATP-Umsatz erkennbar. Dieser ist abhängig von der Kinaseaktivität und besitzt einen biphasischen Verlauf. In der initialen Phase ist der Phosphotransfer auf das Enzym und die gebildete ADP-Menge äquimolar, im weiteren Verlauf der Reaktion zeigt der Phosphateinbau in das Enzym eine Sättigung, die Bildung von ADP hält weiter an. Die Autophosphorylierung der löslichen Kinasen wurde unter Pulse-Chase Bedingungen untersucht: Die IRKD unterliegt einer transienten Phosphorylierung an Tyrosinresten der C-terminalen Domäne und der katalytischen Domäne. Dies ist ein Resultat einer intrinsischen Phosphataseaktivität des Enzyms und nicht auf eine Dephosphorylierung durch exogene Phosphatasen zurückzuführen. Die Reaktion wird durch Kinaseinhibitoren oder hohe Substratkonzentrationen gehemmt und ist abhängig von der Anwesenheit von ATP. Pulse-Chase-Experimente in Anwesenheit stöchiometrischer Substratmengen erweitern die Beobachtung transienter Tyrosinphosphorylierung auch auf Substrate. 5

12 Einleitung 2 Einleitung 2.1 Die Familie der Rezeptor-Tyrosinkinasen In allen vielzelligen Organismen wird durch ein kompliziertes Kommunikationssystem gewährleistet, daß Wachstum, Differenzierung und Stoffwechsel einer großen Zahl von Zellen in den verschiedenen Organen und Geweben aufeinander abgestimmt sind. Die Kommunikation tierischer Zellen ist nicht nur auf den direkten Zell-Zell-Kontakt beschränkt (Bennet et al. 1985), sondern erfolgt auch über größere Entfernungen. Bestimmte Zellen bilden und sezernieren Signalmoleküle, die über das Kreislaufsystem zu entfernten Erfolgsorten gelangen (humorale Kontrolle). Dabei werden primär zwei Klassen von Signalmolekülen unterschieden. Die lipidlöslichen Hormone (Steroide und Thyroxine) diffundieren durch die Plasmamembran und werden von bestimmten Proteinen gebunden, die im Cytosol oder im Zellkern als Hormonrezeptoren fungieren. Der gebildete Hormon-Rezeptor-Komplex ist in der Lage, über Wechselwirkungen mit spezifischen Promotorsequenzen die Transkription bestimmter Gene zu induzieren oder zu reprimieren (Gronemeyer 1992). Die zweite Hormongruppe umfaßt Peptidhormone und nicht lipophile Hormone (Katecholamine), die die Plasmamembran nicht durch Diffusion passieren können. Ihre Wirkung wird durch membranintegrale Rezeptoren vermittelt, die eine hochaffine extrazelluläre Hormonbindungsstelle, einen lipophilen Transmembranbereich und eine intrazelluläre Effektor-Domäne besitzen (Pawson 1993). Eine wichtige Gruppe dieser Transmembranrezeptoren sind die sogenannten Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK), die auf der extrazellulären Seite große, glykolysierte Ligandenbindungsdomänen und intrazellulär eine Tyrosinkinasedomäne besitzen. Im allgemeinen kontrollieren sie Wachstums- und Differenzierungsprozesse (Yarden et al. 1988). Die Ligandenbindung bewirkt die Aktivierung der Tyrosinkinase und führt zur Autophosphorylierung des Rezeptors und zur Phosphorylierung exogener Substrate. Infolge dieser Aktivierung kommt es dann zu Interaktionen zwischen dem Rezeptor und einer Vielzahl von Signalproteinen, die in einem komplexen Netzwerk letztendlich Zellwachstum und Zelldifferenzierung regulieren. Durch strukturelle Homologien ihrer extrazellulären Domäne lassen sich die bisher rund 50 bekannten Rezeptor-Tyrosinkinasen in vier Klassen einteilen (Lemmon und Schlessinger 1994, Abb. 2.1); werden strukturelle Motive der intrazellulären katalytischen Domäne berücksichtigt, können acht Subfamilien unterschieden werden (Hanks und Quinn 1991). Cys.-D. Faltbl.-D. Kinase-D. Insertion (100 AS) EGF-R Insulin-R IGF-R PDGF-R CSF-R FGF-R Abb 2.1: Schematische Übersicht über die Tyrosinkinaserezeptor-Familie. Cys.-D.: Cysteinreiche Domäne; Faltbl.-D.: β-faltblattreiche Domäne; Kinase-D.: Kinase-Domäne (nach Ullrich und Schlessinger 1990) 6

13 Einleitung Rezeptoren der Klasse I (Epidermal Growth Factor-Rezeptor, EGF-R) und II (Insulin-Rezeptor, IR, Insulin Like Growth Factor-Rezeptor, IGF-R, Insulin Related Receptor, IRR) enthalten extrazellulär zwei homologe cysteinreiche Domänen, Rezeptoren der Klasse III (Platelet Derived Growth Factor- Rezeptor, PDFG-R, Colony Stimulating Factor-Rezeptor, CSF-R) und IV (Fibroblast Growth Factor- Rezeptor, FGF-R) enthalten fünf bzw. drei β-faltblattreiche, immunglobulinähnliche Domänen (Ullrich und Schlessinger 1990). Die extrazellulären Domänen sind für die Bindung des Wachstumsfaktors verantwortlich, scheinen aber auch einen Anteil an der für die Rezeptoraktivierung wichtigen Dimerisierung zu haben. Mit Ausnahme der Rezeptoren der Klasse II, die durch den Insulinrezeptor oder den Insulin-Like-Growth-Faktor Rezeptor repräsentiert werden, sind alle RTKs monomere Polypeptidketten, die die Plasmamembran mit einer hydrophoben α-helix durchspannen. Der intrazelluläre Bereich kann in einen Juxtamembran-Bereich, eine katalytischen Domäne und einen C-terminalen Bereich eingeteilt werden. Bei Vergleich der Aminosäuresequenzen ergibt sich in der Aminosäuren umfassenden Kinasedomäne die größte Homologie der RTK, die in 11 Subdomänen eingeteilt werden kann. Dabei finden sich 14 Aminosäurereste, die in allen bisher untersuchten RTKs konserviert zu sein scheinen (Hanks et al. 1991). Subdomäne I und II beinhalten die ATP-Bindungsstelle, die durch die Konsensus-Sequenz Gly-x-Gly-xx-Gly-x (15-20) -Lys repräsentiert wird. Der Austausch der Aminosäure Lysin gegen eine andere Aminosäure verhindert beispielsweise beim Insulinrezeptor die ATP-Bindung und führt zur Inaktivierung der Kinase und zu einem Verlust der biologischen Aktivität (Chou et al. 1987; Ebina et al. 1987; McClain et al. 1987, Tennagels 1995, Al-Hasani et al. 1997). Eine weitere invariante Aminosäure stellt eine Glutaminsäure in Subdomäne III dar, die wahrscheinlich an der Koordination der γ-phosphorylgruppe des ATP beteiligt ist. Der nächste hochkonservierter Bereich findet sich in Subdomäne VIb und stellt den sogenannten katalytischen Loop der Kinase dar (Aminosäureabfolge: HRDLAARN). Dabei wird dem Aspartat-Rest die Funktion der katalytischen Base zugesprochen, die Sequenz LAARN dient der Substraterkennung und Bindung. Der Aspartatrest im DFG-Motiv in der Subdomäne VII ist, wie die Glutaminsäure (Subdomäne III), an der Chelation der zweiwertigen Metallkationen beteiligt. Die gesamte Subdomäne wird auch als Aktivierungs- Loop bezeichnet. Sowohl bei Serin/Threoninkinasen als auch Tyrosinkinasen finden sich hier Phosphorylierungsstellen, die nach einer Besetzung zu einer Erhöhung der katalytischen Aktivität der Enzyme führen. Dem Aktivierungs- Loop folgt der sogenannte P+1- Loop, der an der Substratbindung und -erkennung beteiligt ist. Daneben wird in dieser auch als Subdomäne VIII bezeichneten Region ein Glutaminsäurerest gefunden, der zusammen mit den hochkonservierten Aminosäuren Asparaginsäure in Subdomäne IX und Arginin in Subdomäne XI durch elektrostatische Wechselwirkungen den katalytischen Loop stabilisiert. Interessanterweise sind, mit Ausnahme der Sequenz des katalytischen Loops, alle beschriebenen Aminosäurereste auch in der Familie der Protein-Serin/Threonin-Kinasen vorhanden und hochkonserviert. In einem späteren Kapitel wird basierend auf den bisher vorliegenden Röntgenstruktur-Analysen noch einmal genauer auf Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen Tyrosin- und Serin/-Threoninkinasen eingegangen (Kap. 2.6). Dem Juxtamembranbereich und der C-terminalen Domäne kommen regulatorische Funktionen zu. So können sie Tyrosinphosphorylierungsstellen beinhalten, die SH2- Domänen enthaltenden Proteinen als Bindungsstelle dienen, oder Motive vorhanden sein, die an der Kinaseaktivierung beteiligt sind. Allen Rezeptorklassen ist gemeinsam, daß die Bindung des Liganden zur Autophosphorylierung der verschiedener Tyrosinreste führt. Infolge kommt es zur Aktivierung der Kinase und zur Phosphorylierung von zellulären Substraten oder zur Ausbildung von Signalkomplexen mit anderen Molekülen, die letztendlich zu mitogenen oder metabolischen Effekten in den Zielzellen führen. 2.2 Insulin, Metabolismus und Glukose Homöostase Das Peptidhormon Insulin ist ein wichtiger Regulator einer Vielzahl von Stoffwechselprozessen im Organismus von Vertebraten und Invertebraten (LeRoith et al. 1981). Im Menschen wird das Hormon ausschließlich von den B-Zellen der Langerhans schen Inseln im Pankreas hergestellt (Zawalich und Rasmussen 1990, Froesch und Schoenle 1994) und bei steigenden Blutglukose-Konzentrationen in den Blutstrom des Organismus freigesetzt. Beim Menschen führen Blut-Glukosekonzentrationen 7

14 Einleitung > 7,5 mm zur Sekretion von Insulin. Dabei wird die initiale Aufnahme von Glukose in die B-Zellen und ihre Umwandlung in Glukose-6-Phosphat als sensorisches Signal für die Hormonfreisetzung verstanden (Matschinsky 1990). Über den Blutstrom gelangt es zu seinen primären Wirkorten, dem Fett-, Muskel- und Lebergewebe, entfaltet seine physiologischen Wirkungen aber auch in anderen Geweben. So stimuliert es die Aufnahme von Hexosen, Ionen und Aminosäuren (Myers und White 1996), reguliert viele Schlüsselenzyme des Glukose-Stoffwechsels (Hubbard und Cohen 1993), kontrolliert die Proteinexpression auf der Ebene der Translation und Transkription (O Brien und Granner 1991) und führt zur Induktion von Zellwachstum (Straus et al. 1984). Durch Stimulierung der Glukose-Aufnahme in die Skelettmuskulatur, dem Leber- und Fettgewebe und verstärkter Glykolyse und Glykogensynthese sowie Supression von Glykoneogenese und Glykogenabbau sorgt es dafür, daß die Blut-Glukose-Konzentration im Menschen auf 4,4-6,6 mm konstant gehalten wird. Die physiologischen Effekte von Insulin werden auf zellulärer Ebene durch die Bindung des Hormons an seinen Rezeptor eingeleitet. Der Insulinrezeptor ist ein komplexes integrales Membranglykoprotein mit unterschiedlichen funktionellen Domänen und auf Zellen nahezu aller Gewebetypen vorhanden (Ginsberg 1977). Störungen in der Insulin-Signalkette manifestieren sich in der Stoffwechselkrankheit Diabetes mellitus. Grundlage ist hier entweder die Störung der Insulinsynthese (Insulin dependent diabetes melitus, IDDM) oder ein Fehler in der Rezeptor vermittelten Signalweiterleitung (non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM). Beide Formen sind durch stark erhöhte Blutglukosespiegel charakterisiert und führen bei Nichtbehandlung langfristig zu Retinopathie, Nephropathie, Neuropathie und Gefäßerkrankungen. Speziell die Mechanismen, die pathogenetisch zur NIDDM führen, sind außerordentlich vielseitig und bis auf wenige Ausnahmen noch nicht definiert. Die Ursache liegt in dem noch immer nicht vollständig aufgeklärtem Signalnetzwerk, welches für die spezifische Weiterleitung des Insulinsignal in der Zelle verantwortlich ist. Ein Verständnis der Krankheit ist daher unbedingt abhängig von den molekularen und biochemischen Mechanismen, die dieser durch den Insulinrezeptor vermittelten Signaltransduktion zu Grunde liegen. 2.3 Biosynthese und Struktur des Insulinrezeptors Der humanen Insulinrezeptors wurde erstmals von Cuetrecasas (1972) durch Insulin-Affinitätschromatographie aus Plazentagewebe gereinigt. Die Sequenzierung tryptischer Peptide des gereinigten Moleküls und daraus abgeleitete Nukleotidsonden ermöglichte 13 Jahre später zwei Arbeitsgruppen unabhängig voneinander die Klonierung der korrespondierenden cdna (Ullrich et al. 1985, Ebina et al. 1985). Der Insulinrezeptor ist das Produkt eines Gens, das auf dem kurzen Arm des Chromosoms 19 (19p7) lokalisiert ist (Yang-Feng et al. 1985). Es umfaßt etwa 150 kbp und enthält 22 Exons und 21 Introns (Seino et al. 1989, Seino et al. 1990). Nach der Transkription können durch alternatives Spleißen des Exons 11 zwei mrna-formen entstehen. Sie kodieren für zwei einzelsträngige Präprorezeptormoleküle (hir-a und hir-b), die sich in ihrer Länge um 12 Aminosäuren in der Nähe des C-Terminus der α-untereinheit unterscheiden (Seino und Bell 1989). Die physiologische Bedeutung der beiden Isoformen für den Organismus ist nicht vollständig geklärt. Allerdings scheinen Unterschiede in der Insulinaffinität und der Endocytose zu bestehen (Mosthaf et al. 1990, 1991; Vogt et al. 1991; Bennecke et al. 1992, Yamaguchi et al. 1992). Die Isoform hir-a wird hauptsächlich in der Leber gefunden, während im Muskel und in Leukozyten die Isoform hir-b überwiegt (Bennecke et al. 1992). Nach der Translation im rauhen endoplasmatischen Reticulum und umfangreichen posttranslationalen Prozessierungen im Golgi-Apparat entsteht aus zwei Vorläufermolekülen der glykosylierte, in α- und β-untereinheit gespaltene und durch Disulfidbrücken verbundene funktionelle Insulinrezeptor, der die Plasmamembran durchspannt (Olefsky 1990). Der native Insulinrezeptor ist ein Homodimer, dessen Monomere sich ihrerseits aus einer α- und einer β-untereinheit zusammensetzen. Das apparente Molekulargewicht des Holorezeptors in der SDS- PAGE wird mit kda angegeben, das Molekulargewicht der α-untereinheit beträgt ca. 130 kda, die der β-untereinheit ca. 90 kda (Ullrich et al. 1985). Der Komplex wird durch zwei Klassen von Disulfidbrücken stabilisiert. Disulfidbrücken der Klasse I sind Reduktionsmitteln gut zugänglich und verbinden die beiden α-untereinheiten; Cystinbrücken der Klasse II können nur unter denaturie- 8

15 Einleitung renden Reaktionsbedingungen getrennt werden und verbinden α- und β-untereinheit eines Monomers miteinander (Massague et al. 1982, Böni-Schnetzler et al. 1986, Sweet et al. 1987). Durch Markierung mit N-Ethylmaleinimid und ortspezifische Mutagenese konnten die beiden Cysteinreste Cys 524 und Cys 682 als die verantwortlichen Klasse I Cysteine identifiziert werden (Lu und Guidotti 1996). Die Anzahl und die Position der Cysteine, die für die Klasse II Bindung verantwortlich sind, sind noch unbekannt, allerdings deuten Untersuchungen von Cheatham und Kahn (1992) auf eine Beteiligung des Cys 647 an der α-β Verbindung hin. Der Rezeptor läßt sich funktionell und morphologisch in drei Bereiche untergliedern. Der extrazelluläre Bereich übernimmt die Funktion der Insulinbindung und enthält die 723 Aminosäuren lange α-untereinheit und etwa ein Drittel der 620 Aminosäuren langen β-untereinheit. Beide Domänen sind N- und O-glykosyliert. Diese Oligosaccharidstrukturen spielen wahrscheinlich eine Rolle für die korrekte Zielsteuerung, Prozessierung und Internalisierung des Rezeptors. Bei Mutanten mit fehlender N-Glykosylierung werden Störungen in der Signaltransduktion beobachtet (Collier et al. 1993; Leconte et al. 1994). Den Transmembrananteil bilden 23 Aminosäuren in Form einer α-helix, die den extrazellulären und den intrazellulären Anteil der β-untereinheit miteinander verbindet. Der Austausch dieser Domäne gegen homologe Bereiche anderer Rezeptoren führt zu keinem Funktionsverlust. Die Untersuchung der Kinaseaktivität in rekonstituierten Membranvesikeln unterschiedlicher Lipidzusammensetzung und Mutageneseexperimente belegen dennoch die entscheidene Rolle dieses Bereiches für die Signalweiterleitung durch die Membran (Kahn 1993). Der cytoplasmatische Bereich der β-untereinheit besteht aus 403 Aminosäuren und kann in die Juxtamembran-, die Tyrosinkinase- (katalytische) und die C-terminale Domäne unterteilt werden. Insulin α-untereinheit -S-S- hochaffine Hormon- Bindungsstelle niederaffine Hormon- Bindungsstelle Plasmamembran -S-S- -S-S- Transmembran-Domäne β-untereinheit Tyr 953/960 Lys 1018 Tyr 1146/1150/1151 Juxtamembran-Domäne ATP-Bindungsstelle Katalytische Domäne Ser 1275/1309 Tyr 1316/1322 C-terminale Domäne Abb. 2.2: Schematische Organisation des humanen Insulinrezeptors (verändert nach Kayatz 1993) 9

16 Einleitung Dieselben strukturellen Eigenschaften finden sich auch bei anderen Rezeptoren. Wie der Insulinrezeptor stellen der Insulin-Like-Growth-Faktor Rezeptor I (IGF-1-R), der Insulin-related-Rezeptor (IRR), der Rous-sarcoma-related-Rezeptor (ROS-R) und der Leukozyten-Tyrosinkinase-Rezeptor (LTK-R) über Cystinbrücken verbundene homodimere Rezeptoren dar. Die einzelnen Moleküle zeigen in ihrer katalytischen Domäne weitestgehende Übereinstimmung, unterscheiden sich aber durch ihre jeweiligen extrazellulären Domänen und die C- bzw. N-terminalen Strukturen in der cytoplasmatischen Untereinheit. Diese Verschiedenartigkeit führt zum einen zu der Fähigkeit, andere Hormone zu binden, zum anderen zu Unterschieden in der Signalweiterleitung dieser Rezeptoren (Hunter und Lindberg 1994). Einen ähnlichen Aufbau weisen auch die IR-homologen Rezeptoren der Maus (Flores-Riveros et al. 1989) und der Fruchtfliege Drosophila melanogaster (DosIR; Fernandez- Almonacid et al. 1987) auf. Allerdings zeigte erst kürzlich die Aufklärung der Genstruktur des DosIR, daß der native Rezeptor zusätzlich zu den zum humanen Insulinrezeptor vergleichbaren Bereichen eine 368 Aminosäure lange C-terminale Extension enthält, die hohe Homologien zum humanen Insulinrezeptorsubstrat I aufweist (Ruan et al. 1995, Fernandez et al. 1995). Müller et al. (1998) berichten von der Klonierung eines Insulin-bindenden Proteins aus Saccharomyces cerevisiae. Zusammen mit einem 70 kda Protein formt dieses 53 kda Protein große, 300 kda umfassende Signalkomplexe. Insulinstimulierung bewirkt dabei die Phosphorylierung der kleinen Untereinheit an Serinresten, wohingegen die große Untereinheit ausschließlich Tyrosinphosphorylierung aufzuweisen scheint. 2.4 Der Mechanismus der Kinaseaktivierung Der molekulare Mechanismus der Kinaseaktivierung ist bislang noch nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, daß die Bindung des Hormons Insulin an die α-untereinheiten des Rezeptors eine Konformationsänderung bewirkt, die, über den Transmembrananteil vermittelt, zu der Aktivierung der Rezeptorkinase führt. In Abwesenheit von Insulin scheint der extrazelluläre Anteil einen inhibitorischen Effekt auf die Kinase auszuüben, da die Entfernung der Ligandenbindungdomäne durch proteolytischen Verdau die Kinase aktiviert (Shoelson et al. 1988). Die lösliche Form der Insulinrezeptorkinase, die nur den cytoplasmatischen Teil der β-untereinheit umfaßt, ist konstitutiv aktiv (Ellis et al. 1987, Herrera et al. 1988, Villalba et al. 1989). Ein generelles Prinzip für die Aktivierung monomerer Rezeptor-Tyrosinkinasen ist die durch Ligandenbindung induzierte Dimerisierung (Lemmon und Schlessinger 1994). Dimere Liganden, wie PDGF oder CSF-1, binden gleichzeitig an zwei Rezeptormonomere und induzieren dadurch die Vernetzung und Kinaseaktivierung. Der Mechanismus der Dimerisierung von monomeren Liganden, wie EGF oder FGF, ist noch nicht vollständig geklärt, es wird aber angenommen, daß die Bindung des Liganden zu einer Konformationsänderung führt, die dann in der Dimerisierung resultiert (Lemmon et al. 1997). Obwohl der Insulinrezeptor bereits als funktionelles Dimer vorliegt, scheint das Prinzip der Kreuzvernetzung übertragen werden zu können. Jede α-untereinheit besitzt zwei verschiedene Insulinbindungsdomänen, 1α und 2α, die durch eine cysteinreiche Domäne voneinander getrennt werden. Das asymmetrische Insulinmolekül besitzt ebenfalls zwei Domänen, die eine unterschiedliche Affinität zu der 1α- oder 2α- Domäne des Rezeptors aufweisen. Demzufolge bindet eine Domäne des Liganden an die eine 1α- Domäne, während die zweite Domäne mit der 2α-Domäne der anderen α-untereinheit interagiert (De Meyths et al. 1993, De Meyths 1995). Die extrazelluläre Hormonbindung bewirkt vermutlich eine Veränderung der relativen Anordnung der α-untereinheiten und der intrazellulären Bereiche zueinander (Petruzelli et al. 1984, Herrera und Rosen 1986, Perlman et al. 1989, Flörke et al. 1990, O Hare et al. 1990, Maddux und Goldfine 1991, Waugh und Pilch 1989). Diese Konformationsänderungen führen zur Aktivierung der intrazellulären Tyrosinkinaseaktivität und zur Autophosphorylierung von mindestens 6 der 13 cytoplasmatischen Tyrosinreste der β-untereinheit, die in verschiedenen Domänen lokalisiert sind. Die Phosphorylierung umfaßt Tyr 953 und Tyr 960 (möglicherweise auch Tyr 972 ) im Juxtamembranbereich, Tyr 1146, Tyr 1150 und Tyr 1151 in der katalytischen Domäne und zwei Tyrosinreste in der C-terminalen Domäne, Tyr 1316 und Tyr 1322 (Tornqvist et. al. 1987, Tavare und Denton 1988, White et al. 1988, Feener et al. 1993, Kohanski et al. 1993, Cann et al. 1997). 10

17 Einleitung Aufgrund der dimeren Struktur des Rezeptors stellt sich die Frage nach einer trans-phosphorylierung zwischen den beiden β-untereinheiten oder einer cis-phosphorylierung innerhalb einer Domäne dieser Phosphorylierungsstellen. Untersuchungen von Herrera et al. (1988) und Villalba et al. (1989) an löslichen Insulinrezeptorkinasen machen einen cis-mechanismus für eine maximale Kinaseaktivität wahrscheinlich. Dafür sprechen auch Ergebnisse von Mortensen et al. (1991) und Lu et al. (1997), die zeigen, daß die Dimerisierung des Rezeptors nicht für die Besetzung der einzelnen Phosphorylierungsstellen entscheidend ist. Untersuchungen an Insulinrezeptorhybriden aus kinaseaktiven und kinaseinaktiven Monomeren geben dagegen Hinweise auf einen trans-phosphorylierungsmechanismus (Treadway et al. 1991; Frattali et al. 1992; Leavy-Toleando 1994). Die Ergebnisse von Cobb et al. (1989), die eine Abhängigkeit der Kinasereaktion einer löslichen Insulinrezeptorkinase von der Viskosität des Mediums finden, entsprechen diesen Beobachtungen. Laut Kohanski (1993) sind diese Beobachtungen auf die Verwendung von Polykationen zurückzuführen, die eine Aggregation der Kinasemoleküle bewirken und somit dem trans-mechanismus den Vorzug geben. Die Analyse der Autophosphorylierung mit kinaseaktiven und inaktiven Rezeptorchimären deuten auf die Existenz beider Mechanismen für den nativen Insulinrezeptor (Shoelson et al. 1991, Frattali et al. 1992). Die Untersuchungen von Cann und Kohanski (1997) belegen, daß es kinetische Unterschiede in der Besetzung der Phosphorylierungsstellen gibt. Sie demonstrieren, daß die Besetzung der N-terminalen Phosphorylierungsstellen Tyr 960 und Tyr 953 einem cis-phosphorylierungsmechanismus unterliegt, während die Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen und der C-terminalen Domänen durch eine trans-phosphorylierung bedingt ist. Die Autophosphorylierung bewirkt eine Steigerung der Kinasetransferaseaktivität um den Faktor durch die Erhöhung des V max -Wertes der Phosphotransferase-Reaktion (White et al. 1984, Kwok et al. 1986, Lehr 1995, Al-Hasani 1995). Die durch die Autophosphorylierung induzierte Aktivierung bleibt auch nach Entfernung des Hormons erhalten (Rosen et al. 1983). Kinetische Studien in situ und in vitro belegen, daß den Tyrosinresten in der katalytischen Domäne eine maßgebliche Rolle in der Rezeptorkinaseaktivierung zukommt. Dabei zeigen Untersuchungen von White und Kahn (1989) und Zhang et al. (1991), daß für die biologische Aktivität des Rezeptors die Phosphorylierung zweier Tyrosine ausreichend ist. Der konsequente Austausch der Tyrosinreste gegen Phenylalanin durch ortsspezifische Mutagenese führt, parallel mit der Abnahme der katalytischen Aktivität zu einem Verlust der biologischen Aktivität des Rezeptors (Murakami und Rosen 1991; Vogt et al. 1991; Wilden et al. 1992; Ouwen et al. 1994). Die Reihenfolge der Besetzung der einzelnen Tyrosinphosphorylierungsstellen wird kontrovers diskutiert. 1 H-NMR-spektroskopische Studien von Levine et al. (1991) an einem Peptid aus der katalytischen Domäne, welches alle drei Phosphorylierungsstellen enthält, belegen die Phosphorylierung des Tyr 1150 in einem trans-phosphorylierungsmechanismus. Infolge findet dann die Besetzung der Tyrosinreste Tyr 1151 und Tyr 1146 statt. In vitro und in situ Studien anderer Autoren zeigen, daß eine initiale trans- Phosphorylierung an dem Tyrosinrest Tyr 1150 erfolgt, im weiteren findet dann die Besetzung des Tyr 1146 und Tyr 1151 statt (Tornqvist et al. 1988, White et al. 1988, Dickens und Tavare 1992, Tavare und Dickens 1991, Wei et al. 1995). Nach Phosphorylierung der Tyrosinreste in der katalytischen Domäne kommt es dann zur Besetzung der Phosphorylierungsstellen im Juxtamembranbereich und in der C-terminalen Domäne. Die Auflösung der Kristallstruktur der nichtphospholierten und der phosphorylierten katalytische Domäne der Insulinrezeptorkinase hat einen entscheidenen Beitrag zum Verständnis der Funktion und dem Katalysemechanismus der Kinasedomäne beigetragen (Hubbard et al. 1994, Hubbard 1997). Die Untersuchungen wurden mit einem Enzym durchgeführt, welches 306 Aminosäuren umfaßt (Val Lys 1271 ) und zwei Substitutionen (Cys 969 Ser und Tyr 972 Phe) enthält. Damit fehlen dem Molekül 27 Aminosäuren der Juxtamembran-Domäne und 72 Aminosäuren der C-terminalen Domäne, so daß nur die drei Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne enthalten sind. Die Gesamtstruktur dieser Domäne ist der von Serin-/Threoninkinasen sehr ähnlich (Taylor et al. 1995, Abb. 2.3). Sie besteht im wesentlichen aus einer kleinen N-terminalen Domäne, die über eine einzige Schleife mit einer großen C-terminalen Domäne verbunden ist. Das aktive Zentrum liegt in einer Spalte zwischen diesen beiden Domänen. Der N-terminale Bereich ist vornehmlich durch β-faltblatt-strukturen ausgezeichnet. Er enthält die ATP-Bindungsstelle mit dem glycinreichen Loop (zwischen Faltblatt β1 und β2) und dem invarianten Lysin Lys 1018 (Faltblatt β3). Die Glycinreste 11

18 Einleitung Gly 991, Gly 993 und Gly 996 übernehmen die Rolle der Ladungstrennung der α- und β-phosphatreste des ATP, das invariante Lysin 1018 koordiniert die beiden Phosphorylgruppen. In einem α-helikalen Abschnitt (αc) ist der invariante Glutamatrest Glu 1035 enthalten, der für eine zusätzliche Koordination des Mg 2+ -ATP verantwortlich gemacht wird. Der C-terminale Bereich zeichnet sich dagegen eher durch α-helikale Strukturen aus. Er enthält den katalytischen Loop (HRDLAARN) mit der katalytischen Base Asp 1120, der Substraterkennungsequenz LAARN und den DFG- Loop, dem die Rolle eines Metall-Chelators zugesprochen wird. Beide Motive finden sich in β-faltblattstrukturen eingebettet und sind der Spalte zwischen N-terminaler und C-terminaler Domäne zugewandt (katalytischer Loop zwischen β6 und β7, DFG-Motiv zwischen β8 und β9). Die Spalte wird von dem sogenannten Aktivierungs- Loop durchspannt. Er beinhaltet die drei Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne. In der nichtphosphorylierten Kinase blockiert er sowohl die ATP-Bindungstasche der N-terminalen als auch den katalytischen Loop der C-terminalen Domäne. Dabei scheint der Tyrosinphosphorylierungsstelle Tyr 1150 eine Schlüsselrolle zuzukommen. Dieser Rest ist dem aktiven Zentrum zugewandt und durch Wasserstoffbrücken mit der katalytischen Base und der Asparaginsäure Asp 1148 verbunden. Demnach scheint im ersten Schritt der Kinaseaktivierung eine trans- Phosphorylierung dieses Restes erfolgen zu müssen, der zur Freigabe des aktiven Zentrums führt und die ATP- und Substratbindung ermöglicht. Diese Hypothese wird durch die Kristallstruktur der phosphorylierten Kinasedomäne unterstützt. Infolge der Autophosphorylierung kommt es zu dramatischen Änderungen in der Konformation der Kinase. Die Phosphorylierung bewirkt eine Rotation der N- terminalen Domäne um 21 parallel zur Molekülachse. A B Abb. 2.3: Gesamtansicht der Kristallstruktur der katalytischen Domäne der Insulinrezeptorkinase. A: Darstellung der phosphorylierten Domäne als Bändermodell. α-helicies sind in rot, β-faltblätter in blau dargestellt. Die ATP-Bindungsdomäne ist gelb, der katalytische Loop grün, das Peptid-Substrat pink und AMP-PNP schwarz hervorgehoben. B: Überlagerung der phosphorylierten und nichtphospholierten Domäne. Die Struktur der nichtphospholierten Domäne und ihr Aktivierungs- Loop sind in orange bzw. rot, die phosphorylierte Form und ihr Aktivierungs- Loop sind in grün bzw. blau dargestellt. Nomenklatur nach Ebina et al (aus Hubbard, S.R. (1997) EMBO J., 16, S. 5574). 12

19 Einleitung Der Aktivierungs- Loop reorientiert sich aus dem aktiven Zentrum, wobei die phosphorylierten Tyrosinreste Tyr 1150 und Tyr 1151 durch verschiedene Wasserstoffbrücken und aromatischen Wechselwirkungen mit Resten aus der C-terminalen Domäne diese Position stabilisieren. Alleine der Tyrosinrest Tyr 1146 scheint keine Proteinkontakte zu haben und ist dem Lösungsmittel zugewandt. In der Kokristallisation mit dem ATP-Analogon AMP-PNP, Magnesium und einem 18 Aminosäure langem Peptidsubstrat, welches eine potentielle Tyrosinphosphorylierungsstelle des humanen IRS-1 in einem YMxM-Motiv enthält (Sun et al. 1991, Shoelson et al. 1992), wird die ternäre Struktur des Enzym- Substrat-Komplexes deutlich (Abb. 2.3). Der Nukleotidrest wird über verschiedene Wasserstoffbrücken am N-terminalen Loop gebunden. Zwei Magnesiumionen koordinieren dabei die Sauerstoffgruppen der Phosphatreste des ATP. Das Substrat ist über Wasserstoffbrücken mit dem C-terminalen Ende des Aktivierungs- Loop verbunden. Interessanterweise ergibt die Analyse der Kristallstruktur aber keine Wechselwirkungen mit der Nukleotidbindungsdomäne. Die γ-phosphorylgruppe des ATP- Analogons ist sehr weit entfernt von der Hydroxylgruppe des Tyrosinrestes im Substrat, wodurch ein direkter In-line Phosphotransfer ausgeschlossen scheint. Dennoch postuliert Hubbard, daß nur Tyrosinreste aufgrund ihrer langen Seitenkette die Möglichkeit besitzen, daß aktive Zentrum des Enzyms zu erreichen (Kap. 2.6). Die Funktion, die den einzelnen Tyrosinphosphorylierungsstellen im Juxtamembranbereich, katalytischer und C-terminale Domäne zukommt, ist in den letzten Jahren durch vielfältige Untersuchungen demonstriert worden. Dem Juxtamembranbereich kommt eine bedeutende Rolle in der Rezeptor vermittelten Signaltransduktion zu. Das in dieser Domäne enthaltene Tyrosin Tyr 960 ist an der Interaktion des Rezeptors mit den Signalproteinen IRS-1 und Shc beteiligt. Der Austausch dieser Aminosäure gegen Phenylalanin oder die Deletion von 12 Aminosäuren ( ) führt zu einer reduzierten Signalübertragung in situ, hat aber keinen Einfluß auf die katalytische Aktivität der Kinase in vitro (White et al. 1988, Backer et al. 1992, Kuburagi et al. 1993, Danielsen und Roth 1996). Die verminderte Insulinwirkung wird auf eine reduzierte Phosphotransferaseaktivität gegenüber diesen Signalproteinen zurückgeführt. Die Überexpression von IRS-1 in CHO-Zellen kann die biologische Aktivität dieser Mutanten wiederherstellen (Chen et al. 1995). Sequenzvergleiche mit anderen Rezeptorkinasen, die ebenfalls in der Lage sind, IRS-1 zu phosphorylieren, zeigen eine Konsensussequenz (NPXY-Motiv), der eine Rolle bei der Interaktion mit der Proteinbindungdomäne (PTB: protein tyrosine binding domaine) des IRS-1 und Shc zugesprochen wird (Keegan et al. 1994, Sun et al. 1995, Wolf et al. 1995). Rezeptoren, denen diese Sequenz fehlt, sind nicht in der Lage, IRS-1 zu phosphorylieren (Myers et al. 1996). Untersuchungen von Rezeptormutanten, denen die Tyrosinreste Tyr 953 und Tyr 960 fehlen, belegen die Beteiligung dieser Aminosäuren an der Rezeptorendocytose (Backer et al. 1990, Rajagopalan et al. 1991). Die Rolle der Tyrosinreste in der katalytischen Domäne in der Rezeptoraktivierung wurde bereits eingehend erläutert. Daneben gibt es Hinweise, daß diese Phosphorylierungsstellen an Protein-Protein- Interaktionen beteiligt sind. Experimente mit dem Two Hybrid -System in Hefe haben ergeben, daß Wechselwirkungen dieser Phosphorylierungsstellen mit einer Region des Signalproteins IRS-2 bestehen (He et al. 1996, Sawka- Verhelle 1996). Weitere Analysen zeigen zudem die Interaktion dieser Domäne mit den SH2- Domänen von GRB10 und SHP-2 (O Neill et al. 1996, Frantz et al. 1997, Kharitonenkov et al. 1995). Der C-terminalen Domäne werden regulatorische Funktionen in der Katalyse und Aufgaben in der Signaltransduktion zugesprochen. Die Phosphatinkorporation in die C-terminale Domäne beträgt bis zu 40 % der Gesamtphosphorylierung (Tornqvist et al. 1987; Tavare und Denton 1988; White et al. 1988; Lee et al. 1993, Al-Hasani 1995). Dabei wird dieser Phosphorylierung und einem sehr hydrophilen Bereich (Aminosäure ) die Aufgabe einer Feinregulierung in der Autophosphorylierung zugesprochen (Biener und Zick 1990, Yan et al. 1993, Baron et al. 1995). Der Austausch der Tyrosine Tyr 1316 und Tyr 1322 gegen Phenylalanin oder die Deletion der C-terminalen Domäne führt in vitro zu einer Änderung der kinetischen Eigenschaften der Kinase. Deletionen bewirken eine Erniedrigung des K m -Wertes und eine Erhöhung des V max -Wertes (Quirk et al. 1995). Wird ein gegen den C-Terminus gerichteter Antikörper in der Substratphosphorylierungsreaktion verwendet, welches zu einer Nichtbesetzung der hier vorhandenen Tyrosinphosphorylierungsstellen führt, wird eine Erhöhung der apparenten V max -Werte, aber keine Änderung in den K m -Werten erhalten. Die Autoren postulieren daher die Möglichkeit einer Konformationsänderung in der C-terminalen Domäne als 13

20 Einleitung Voraussetzung für eine effektive Substratphosphorylierung (Gual et al. 1996). Von Al-Hasani et al. (1994) konnte gezeigt werden, daß die Phosphorylierung der Tyrosine im C-terminalen Bereich einer transienten Phosphorylierung unterliegt, die auf eine intrinsische Phosphataseaktivität des Insulinrezeptors zurückzuführen ist. Diese Daten sind in Einklang mit Beobachtungen von Gruppuso et al. (1992), der diese Dephosphorylierung H 1 -NMR-spektoskopisch verfolgen konnte. Die Funktion dieser transienten Phosphorylierung ist unklar, könnte aber eine regulatorische Funktion in der Signaltransduktion übernehmen. Die Mutationen im C-terminalen Bereich scheinen in situ zu verstärkten mitogenen und reduzierten metabolischen Effekten zu führen (Maegawa et al. 1988; Takata et al. 1992; Ando et al. 1992, Pang et al. 1994). Allerdings konnte Myers et al. (1991), unter der Verwendung anderer Zellinien, keinen Unterschied in der biologischen Aktivität des verkürzten bzw. mutierten Rezeptors feststellen. Die Ursache für die Änderung der biologischen Aktivität ist sehr wahrscheinlich in den vielfältigen Interaktionen begründet, die die C-terminale Domäne mit Signalproteinen eingehen kann. Untersuchungen von Levy-Toleando et al. (1994) und Van Horn et al. (1994) zeigen, daß die Bindung der SH2- Domäne der p85-untereinheit der Phosphatidolinositol-3'-Kinase (PI-3-Kinase) an den C-Terminus zu einer Aktivierung ihrer Kinasefunktion führt. Dafür scheint vor allem die Bindung an Tyr 1322 verantwortlich zu sein (Staubs et al. 1994) Dieselbe Arbeitsgruppe zeigt auch die Interaktion von SH-PTP2, einer Tyrosinphosphatase, mit diesem phosphorylierten Tyrosinrest. Untersuchungen von Myers et al. (1995) ergeben aber, daß in Zell-Linien ohne IRS-1 nach Insulinstimulierung keine PI-3-Kinase- Aktivität feststellbar ist. Die Autoren folgern daher, daß die Aktivierung dieses Signalweges hauptsächlich über die Bindung der p85-untereinheit an IRS-1 erfolgt. Eine direkte Interaktion von Tyr 1322 mit dem Adapterprotein Grb10 konnte von Hansen et al. (1996) aufgezeigt werden. Dieses Signalprotein verfügt über eine Pleckstrin homologe (PH) und Prolinreiche Domäne und scheint für die Signalkomplexbildung am Rezeptor verantwortlich zu sein (Laviola et al. 1997, Liu und Roth 1998). Das kürzlich identifizierte hmad2 bindet ebenfalls an der C-terminalen Region des Rezeptors, allerdings ist eine Phosphorylierung keine Voraussetzung für diese Interaktion (O Neill et al. 1997). Aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit mit einem in Hefe identifizierten und in der Regulation des Zellzyklus beteiligten Proteins vermuten die Autoren eine vergleichbare Funktion. 2.5 Die Serin- und Threoninphosphorylierung der Insulinrezeptorkinase Neben der Tyrosinphosphorylierung der cytoplamatischen Untereinheit des Insulinrezeptors wird in Folge der Rezeptoraktivierung und Autophosphorylierung eine Serin- und Threoninphosphorylierung beschrieben. In situ führt die Stimulation mit Insulin oder Phorbolestern zur Serinphosphorylierung der β-untereinheit des Rezeptors (Kasuga et al. 1982, Häring et al. 1984, Pang et al. 1985, White et al. 1985, Jacobs und Cuatrecasas 1986, Smith et al. 1988, Takayama et al. 1988, Pillay et al. 1991). Kinetische Studien in intakten Zellen zeigen, daß die beobachtete Serinphosphorylierung zeitlich der Tyrosinphosphorylierung nachfolgt (White et al. 1984). Neben der in situ Phosphorylierung wurde von vielen Autoren auch eine Serinphosphorylierung in vitro beschrieben, die nach Insulinstimulierung des gereinigten Rezeptors auftritt (Zick et al. 1983, Balloti et al. 1986, Smith et al. 1988, Biener und Zick 1990, Lewis et al. 1990a, Tavare und Dickens 1991, Pillay und Siddle 1991, Heidenreich et al. 1994) Diese Serinphosphorylierung ist durch folgende Eigenschaften charakterisiert: (1) sie ist abhängig von der Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors, d. h. sie ist durch Insulin induzierbar und kann durch Tyrosinkinaseinhibitoren wie die Tyrosinphosphorylierung des Rezeptors beeinflußt werden, (2) sie ist der Tyrosinphosphorylierung zeitlich nachfolgend und (3) unabhängig vom Reinheitsgrad der Rezeptorpräparation. Diese Ergebnisse sprechen gegen eine dem Insulinrezeptor locker assoziierte Serinproteinkinase sondern vielmehr für eine intrinsische Serinkinaseaktivität des Insulinrezeptors. Eine Kinase, die für diese Phosphorylierungen verantwortlich ist, konnte bislang nicht eindeutig identifiziert werden. Als mögliche Kandidaten werden verschiedene Isoformen der Proteinkinase C (Coghlan und Siddle 1993, Müller et al. 1991), die camp abhängige Proteinkinase (Issad et al. 1991), ein Caseinkinase I ähnliches Enzym (Rapuano und Rosen 1991) und die PI-3-Kinase (Tanti et al. 1994, Freund et al. 1995) betrachtet. Darüberhinaus wurde von Lewis et al. (1990), Ahn et al. (1993), Coghlan et al. (1994) und Tavare et al. (1991) eine durch die Protein- 14

21 Einleitung kinase C vermittelte Threoninphosphorylierung beschrieben. Asamoah et al. (1995) beschrieben die Reinigung einer dem Insulinrezeptor assoziierten Serinkinase aus Humanplazenta. Demnach scheint die Möglichkeit einer exogenen Serin- bzw. Threoninphosphorylierung zwar gegeben, die Hypothese, daß die Insulinrezeptorkinase selber Serinphosphorylierung katalysieren kann, konnte aber in einer Reihe von Untersuchungen zweifelsfrei bestätigt werden. Baltensperger et al. (1994) konnten demonstrieren, daß ein im Baculovirus-Expressionssystem überexprimierter und gereinigter Insulinrezeptor dieselben Charakteristika wie der aus Humanplazenta gereinigte Insulinrezeptor bezüglich der Serinphosphorylierung aufweist. Untersuchungen von Tauer et al. (1996) bestätigten diesen Befund. Die Expression eines Insulinrezeptors mit einem rekombinanten Vacciniavirus belegen eine intrinsische Serinkinaseaktivität des Enzyms. Für den gereinigten Insulinrezeptor aus Humanplazenta konnte gezeigt werden, daß die Serinphosphorylierung unabhängig vom Reinheitsgrad ist (Heidenreich et al. 1994). Auch eine lösliche Insulinrezeptorkinase, welche über das Baculovirus-Expressionssystem hergestellt wurde, zeigte in der Autophosphorylierungsreaktion die Phosphorylierung an Serinresten (Al-Hasani 1995, Tennagels 1995, Al-Hasani et al. 1997). Im Gegensatz dazu belegten die Untersuchungen mit kinaseinaktiven Varianten dieser löslichen Kinase, daß sowohl Tyrosin- als auch Serinphosphorylierung unbedingt abhängig von der Kinaseaktivität sind. Der Austausch der invarianten Aminosäure Lysin 1018 in der ATP-bindenden Domäne oder der katalytischen Base Asp 1120 gegen Alanin führten in der Autophosphorylierungsreaktion weder zur Phosphatinkorporation in Serin- noch in Tyrosinreste und demonstrierten damit die Abwesenheit einer exogenen Serinkinaseaktivität in den gereinigten Enzymfraktionen (Tennagels 1995, Al-Hasani et al. 1997, Kessler 1998). Für andere Mitglieder der Insulinrezeptorfamilie (trk-b Rezeptor, IGF-I Rezeptor), aber auch für den EGF-Rezeptor, konnte ebenfalls eine Serinautophosphorylierung beschrieben werden (Beemelmanns 1997, Magg 1997, Affüpper 1998). Die löslichen Kinasen dieser Rezeptoren zeigten die gleichen Charakteristika in der Serinautophosphorylierung wie der Insulinrezeptor oder seine lösliche Kinase. In allen Fällen war die beobachtete Serinphosphorylierung unabhängig von Reinheitsgrad oder der verwendeten Reinigungsmethode, der Tyrosinphosphorylierung zeitlich nachgeschaltet und einzig abhängig von der Kinaseaktivität. Der Einsatz von Tyrosinkinaseinhibitoren oder der Austausch der katalytischen Base oder des invarianten Lysin in der ATP-Bindungsstelle führte in allen Fällen zu einem inaktiven Enzym, welches weder Tyrosin- noch Serinphosphorylierung zeigte (Beemelmanns 1997, Magg 1997, Affüpper 1998, Wirth 1998). Bislang wurden zehn verschiedene Serinreste und ein Threoninrest als Phosphorylierungsstellen in der β-untereinheit des Insulinrezeptors beschrieben (Tab. 2.1). Die Phosphorylierungsstellen finden sich in allen drei Domänen des cytoplasmatischen Anteils des Insulinrezeptors, viele davon im C-terminalen Bereich. Die Positionen der phosphorylierten Serin- und Threoninreste wurden dabei in den meisten Fällen durch den Vergleich der Retentionszeiten von synthetischen Phosphopeptiden mit radioaktiv markierten tryptischen Phosphopeptiden des Insulinrezeptors nach Autophosphorylierung in situ oder in vitro nach HPLC- Analyse oder zweidimensionaler Elektrophorese erhalten. Autoren, die die beobachtete Serinphosphorylierung einer exogenen Serinkinaseaktivität zuschreiben, analysierten dagegen die Fähigkeit partiell gereinigter Insulinrezeptorfraktionen, synthetische Peptide an Serin- oder Threoninresten zu phosphorylieren. Als Serinautophosphorylierungsstellen werden in der Literatur die C-terminalen Serinreste Ser 1293 und/ oder Ser 1294 (Lewis et al. 1990a, Tavare et al. 1991, Baltensperger et al. 1992) oder Ser 1275 und Ser 1309 diskutiert (Al-Hasani et al. 1997). Letztere konnten durch direkte Sequenzierung tryptischer Phosphopeptide einer autophosphorylierten löslichen Insulinrezeptorkinase identifiziert werden, während erstere durch den Vergleich der Retentionszeiten synthetischer Phosphopeptide mit tryptischen Phosphopeptiden eines autophosphorylierten Rezeptors nach HPLC-Analyse identifiziert wurden. Die von Al-Hasani beschriebenen Serinautophosphorylierungsstellen konnten auch in gereinigtem Insulinrezeptor aus Humanplazenta (Magg 1995) und einer anderen Variante der löslichen Kinase nachgewiesen werden (Tennagels 1995). Daneben wird für den Insulinrezeptor eine weitere Autophosphorylierungsstelle im Juxtamembranbereich postuliert (Heidenreich 1995, Magg 1994, Kayatz 1994), allerdings konnte diese noch nicht näher identifiziert werden. Für eine hier lokalisierte Serinphosphorylierung sprechen auch Ergebnisse von Nölle und Wieber, welche nach Austausch der beiden C-terminalen Serinreste gegen Aspartat oder der Deletion des C-Terminus eine Serinphosphorylierung im Enzym finden (Nölle 1998, Wieber 1998). 15

22 Einleitung Serin-/Threoninphosphorylierungsstelle Domäne im hir Rezeptor verantwortliche Referrenz aus Kinase Ser 955, Ser 956 Juxtamembran CHO PKCα Feener et al Liu und Roth 1994a Ser 994 katalytisch HEK923? Strack et al Ser 1023, Ser 1025 katalytisch CHO PKCα Liu und Roth 1994b Ser 1078 katalytisch Humanplazenta 41 kda Protein Asamoah et al Thr 1148 katalytisch Humanplazenta PK CK2 Marin et al Ser 1275, Ser 1309 C-Terminus Rezeptorkinase intrinsisch Al-Hasani et al Baculo-System Ser 1293, Ser 1294 C-Terminus NIH-3T3 CHO Baculo-System intrinsisch Lewis et al. 1990a Tavare et al Baltensperger et al Ser 1315 C-Terminus COS CHO CHO Thr 1336 C-Terminus NIH-3T3 CHO PKC PKCα - PKCα Lewis et al Coghlan et al Feener et al Lewis et al. 1990b Ahn et al Coghlan et al Tavare et al Tab. 2.1: Serin- und Threoninphosphorylierungsstellen in der cytoplasmatischen Untereinheit des Insulinrezeptors. Angegeben sind die identifizierten Phosphorylierungsstellen, die Quelle des untersuchten Rezeptorproteins und die von den Autoren dafür verantwortlich gemachte Kinase. Nomenklatur der Aminosäuren nach Ullrich et al Bislang konnte der Serinphosphorylierung auf Rezeptorebene keine eindeutige biologische Funktion zugeordnet werden. Während einige Autoren ihr einen negativen Einfluß auf die Auto- und Substratphosphorylierung der Rezeptorkinase zuschreiben (Takayama et al. 1988, Häring et al. 1986, Anderson und Olefsky 1991, Torrosian et al. 1993), konnten andere diesen Effekt nicht bestätigen (Jacobs und Cuatrecasas 1986, Bottaro et al. 1989, Pillay et al. 1991, Quentmeier et al. 1993, Coghlan und Siddle 1993, Chin et al. 1993). Allerdings zeigt sich bei der Verwendung unterschiedlicher Zell- Linien, daß auch Unterschiede in den Phosphorylierungsmustern der Serin- und Threoninphosphorylierung bestehen (Feener et al. 1994, Pillay et al. 1991, Duronio und Jacobs 1990, Tavare et al. 1988). Der Einzelaustausch der Serinreste Ser 994 bzw. Ser 1023, Ser 1025 und Ser 1309 gegen Alanin bewirkt eine Erhöhung der Rezeptorautophosphorylierung nach Insulinstimulation in situ (Strack et al. 1997). Dabei scheint dem Serinrest Ser 994 aufgrund seiner Lokalisation in der Nähe der ATP-Bindungsstelle eine inhibitorische Rolle zuzukommen. Die Phosphorylierung dieser Aminosäure durch die Proteinkinase C soll eine verminderte ATP-Bindung bewirken. Neben der Beeinflußung der katalytischen Aktivität der Kinase scheint die Serinphosphorylierung auch die Wechselwirkung mit Signalproteinen zu beeinflußen. Die lösliche Insulinrezeptorkinase zeigt nach Autophosphorylierung der C-terminalen Serinphosphorylierungsstellen eine deutlich geringere Assoziation mit einer rekombinanten SH2- Domäne der p85-untereinheit der PI-3 Kinase (Parvaresch persönliche Mitteilung), für die eine Bindung an den phosphorylierten Tyrosinrest Tyr 1322 beschrieben werden konnte (Staubs et al. 1994). Demnach könnte die intrinsische Serinkinaseaktivität der Insulinrezeptorkinase möglicherweise einen homologen Desensitivierungsmechanismus in der Rezeptor-vermittelten Signalweiterleitung darstellen. Bei der Möglichlichkeit der Insulinrezeptorkinase in der Autophosphorylierung sowohl Serin als auch Tyrosin als Phosphatakzeptor zu nutzen, ergibt sich die Frage nach einem Katalysemechanismus, der sowohl die Phosphorylierung der aliphatischen als auch der aromatischen Aminosäurereste zuläßt. Bis vor kurzem galt die Meinung, daß Proteinkinasen entweder die Phosphorylierung von Serin-/Threoninresten oder Tyrosinresten katalysieren können. Sie wurden daher in die Gruppe der Serin-/Threoninkinasen oder der Tyrosinkinasen eingeteilt. Sequenzvergleiche von Vertretern beider Gruppen zeigten neben Gemeinsamkeiten aber auch Unterschiede im Aufbau der katalytischen 16

23 Einleitung Domäne. Diese befinden sich im sogenannten katalytischen Loop, dem Aktivierungs- Loop und dem sogenannten P+1- Loop beider Kinasen. Während der katalytische Loop von Tyrosinkinasen durch die Aminosäuresequenz HRDLAARN charakterisiert ist, findet sich in Serin/Threoninkinasen die Sequenz HRDLKPEN. Im Aktivierungs- Loop unterscheiden sich die beiden Kinasefamilien in den hier vorhandenen Phosphorylierungsstellen. Während Serin/Threoninkinasen hier einen oder mehrere phosphorylierbare Serin- und oder Threoninreste besitzen, finden sich bei Tyrosinkinasen ein oder mehrere Tyrosinphosphorylierungsstellen. Mit diesen Unterschieden wurde die unterschiedliche Spezifität der Kinasen begründet. Neu identifizierte Proteinkinasen wurden dann alleine aufgrund von Sequenzvergleichen ihrer Primärsequenz mit denen schon bekannter und klassifizierter Proteinkinasen in eine der beiden Gruppe eingeordnet. Mit der Entdeckung sogenannter dualer Proteinkinasen mußte die Möglichkeit dieser Klassifizierung neu überdacht werden (Lindberg et al. 1992). So wurde z. B. die Proteinkinase wee1 aus Schizosaccharomyces pombe aufgrund ihrer Primärsequenz in die Gruppe der Serin-/Threoninkinasen eingeordnet. Allerdings zeigte die biochemische Charakterisierung dieses Enzyms, daß es in der Lage ist, nach Serinautophosphorylierung, einen Tyrosin- und Threoninrest in der p34 cdc2 -Kinase zu phosphorylieren (Featherstone und Russel 1991). Dadurch scheint die Aktivität dieser im Zellzyklus involvierten Kinase negativ beeinflußt zu werden (Lundgren et al. 1991, Parker et al. 1991). Auch die MAPK Kinase (MEK) zeigt duale Spezifität, ist aber aufgrund ihrer Primärsequenz der Familie der Serin-/ Threoninkinasen zugeordnet. Nach Aktivierung ihrer katalytischen Aktivität durch die Phosphorylierung zweier Serinreste durch die Serinkinase Raf phosphoryliert das Enzym einen Tyrosin- und einen Threoninrest in der MAP Kinase (Zhang et al. 1995, Payne et al. 1991), welches zur Aktivierung dieser Kinase führt (Anderson et al. 1990, Zhang et al. 1995). Dabei scheint die Phosphorylierung des Substrates einem distributivem Mechanismus zu unterliegen. Nach Tyrosinphosphorylierung dissoziert das Substrat von der Kinase ab und wird erst im nächsten Schritt an Threonin phosphoryliert. Beide Phosphorylierungen sind aber unbedingte Voraussetzung für eine maximale Aktivierung der MAP Kinase (Ferrell und Bhatt 1997). Diese Beobachtungen definieren den Begriff einer dualspezifischen Kinase. Diese sollte in der Lage sein, sowohl phenolische als auch aliphatische Hydroxyaminosäuren in Substraten phosphorylieren zu können (Lindberg et al. 1992). Die strukturellen Voraussetzungen des katalytischen Zentrums für einen Phosphotransfer auf Serin/Threonin oder Tyrosin sollten sehr verschieden sein. In der Tat ergibt der Vergleich dieser Region in der Röntgenstruktur der phosphorylierten IRKD mit der bekannten Struktur der camp abhängigen Proteinserinkinase (capk) einige strukturelle Merkmale, die das unterschiedliche Phosphorylierungsverhalten beider Enzyme erklären könnten (Abb. 2.4). Die Analyse der Substratspezifität der Insulinrezeptorkinase mit synthetischen Peptiden zeigt, daß die Kinase Substrate bevorzugt, in denen ein oder zwei saure Aminosäurereste der Tyrosinphosphorylierungsstelle voranstehen und welcher dann ein oder mehrere hydrophobe Aminosäure folgen (Shoelson et al. 1992, Songyang et al. 1995). Diese Aussage läßt sich mit der Kristallstrukturanalyse in Übereinstimmung bringen. Neben verschiedenen basischen Aminosäureseitenketten im N-terminalen Loop (Lys 1073, Arg 1077 und Lys 1080 ) finden sich auch einigen hydrophobe Seitenketten im C-terminalen Loop (Val 1161 und Leu 1207 ), die ein Substrat mit den beschriebenen Eigenschaften durch Wasserstoffbrücken und hydrophoben Wechselwirkungen stabilisieren können. Im Gegensatz dazu finden sich in der capk viele negativ geladene Aminosäureseitenketten, so daß die zu phosphorylierende aliphatische Aminosäure bevorzugt in einer positiv geladenen Aminosäureumgebung lokalisiert sein muß (Taylor et al. 1995). Wird die räumliche Anordnung der beiden Aktivierungs- Loops miteinander verglichen, zeigt sich eine identische Konformation. Dabei nimmt der phosphorylierte Threoninrest Thr 197 der capk strukturell zu dem Tyrosinrest Tyr 1151 des IR eine vergleichbare Stellung ein. Weiterhin ist zu erkennen, daß der Aktivierungs- Loop nicht direkt an der Substraterkennung und -bindung beteiligt ist. Aus dieser und der Beobachtung, daß die Umgebung des Tyrosinrestes im Substrat (negativ geladene Aminosäure in +1 Stellung zum Tyrosin, gefolgt von hydrophoben Aminosäuren in -1 Position) nicht unbedingt zwingend für eine effektive Phosphorylierung zu sein scheint (Shoelson et al. 1992, Songyang et al. 1995), folgert Hubbard, daß die Konformation des P+1 Loops die maßgebliche strukturelle Determinante für die Spezifität der IRKD- Tyrosinkinase darstellt. In der Tat finden sich hier zwischen Serin/Threoninkinasen und Tyrosinkinasen große Unterschiede in der Aminosäureabfolge. 17

24 Einleitung A B Abb. 2.4: Konformation des phosphorylierten Aktivierungs- Loop der IRKD im Vergleich zum phosphorylierten Aktivierungs- Loop der camp abhängigen Proteinkinase. Der Aktivierungs- Loop ist in grün, der katalytische Loop in orange und das Peptidsubstrat in pink dargestellt. Nomenklatur nach Ebina et al (aus Hubbard, S.R. (1997) EMBO J., 16, S. 5576). In der IRKD werden Wasserstoffbrücken zwischen diesem Bereich und dem Substrat gefunden, die zeigen, daß nur eine Tyrosinseitenkette lang genug ist, um in das katalytische Zentrum zu gelangen. Dabei scheint der Prolinrest Pro 1160 eine wichtige Stellung einzunehmen. Ein weiterer Unterschied in der Substraterkennung besteht in der katalytischen Domäne. In Serin/Threoninkinasen findet sich hier ein konservierter Lysin-, in Tyrosinkinasen ein Argininrest. Beide Aminosäuren sind über Wasserstoffbrücken mit dem Substrat verbunden (Taylor et al. 1995). Allerdings ergibt sich aus diesen Beobachtungen nicht unbedingt die eine alleinige Spezifität der IRKD für Tyrosinreste. Allen Erkenntnissen zufolge besitzen duale Kinasen eine sehr hohe Flexibilität in ihren aktiven Zentrum (Knighton et al. 1993, Bossemeyer et al. 1993, Taylor et al. 1995). Untersuchungen mit konformationssensitiven Antikörper zeigen, daß gerade dieser Bereich in der Rezeptorkinase eine hohe Beweglichkeit ausmacht (Herrera und Rosen 1986). Ferner beantwortet das Modell nicht die Frage nach der Reihenfolge in der Besetzung der einzelnen Tyrosinphosphorylierungsstellen in dem Aktivierungs- Loop des Enzyms. Möglicherweise ergeben sich vollkommen andere strukturelle Verhältnisse bei der Besetzung nur einer oder zwei Tyrosinphosphorylierungsstellen, wodurch sich auch Änderungen in der Konformation es P(+1)- Loops ergeben sollten. Studien über den in situ Phosphorylierungsstatus der Kinase zeigen, daß wahrscheinlich nur zwei der drei Tyrosinphosphorylierungsstellen besetzt sind (White 1998). Ferner kann auch nicht die Frage nach einem Einfluß der Juxtamembran- und der C-terminalen Domäne auf die Struktur der katalytische Domäne beantwortet werden. Letzendlich bleiben damit Zweifel, ob die vorliegende Kinasestruktur tatsächlich die Spezifität für Tyrosinreste begründet. Das eine solche Differenzierung nicht möglich ist, zeigen die Sequenzvergleiche bisher bekannter Serin/Threoninkinasen, die eine duale Spezifität besitzen. Sie zeigen keine Sequenzhomologie zueinander, die über die Homologie zu anderen Serin/Threoninkinasen hinausgeht (Lindberg et al. 1992). 18

25 Einleitung 2.6 Signalwege des Insulinrezeptors Bei allen bisher untersuchten Rezeptortyrosinkinasen führt die Bindung des Liganden zur Tyrosin- Autophosphorylierung des Rezeptors. Diese Autophosphorylierung bewirkt zum einen die Aktivierung des Rezeptors und führt zur Phosphorylierung exogener Substrate, zum anderen können diese Autophosphorylierungsstellen Bindungsstellen für andere Signalproteine darstellen. In allen Fällen kommt es zur Ausbildung von Signalkomplexen, die zur spezifischen Signalweiterleitung führen. Dabei spielen vor allen Dingen Protein-Protein-Interaktionen eine Rolle, die über spezifische Strukturmotive vermittelt zur Aktivierung oder Inaktivierung einzelner Enzyme führen können. Den sogenannten Src-homologen Domänen (SH2) kommt eine besondere Schlüsselrolle in der Erkennung phosphorylierter Tyrosinreste zu. Dieses Motiv aus 100 Aminosäuren wurde erstmals von Sadowsky et al. (1986) in in der Tyrosinkinase pp60 src beschrieben. Strukturell bestehen SH2-Domänen aus einer zentralem β-faltblattstruktur, aus mehreren anti-parallelen Strängen, die von zwei α-helices flankiert wird (Kurian und Cowburn 1997, Xu et al. 1997). Bindungstudien mit Phosphotyrosin enthaltenden Peptiden und Röntgenstruktur-Analysen haben gezeigt, daß die Region, die von SH2-Domänen erkannt wird, nur 4-5 Aminosäuren umfaßt. Die Aminosäuren C-terminal von dem phosphorylierten Tyrosinrest bestimmen dabei die Selektivität der SH2-Domäne (Fantl et al. 1992, Songyang et al. 1995, Huyer et al. 1995, Fauman et al. 1996). Ein charakteristisches Erkennungsmotiv stellt die Sequenz YXXM (Pawson 1995). SH2-Domänen werden in vielen cytoplasmatischen Signalproteinen gefunden (Liu und Roth 1998). Häufig besitzen sie enzymatische Aktivität oder können die anderer Proteine beeinflussen, andere wiederum stellen Adapterproteine dar. Ein weiteres wichtiges Motiv für die Protein-Protein-Interaktion ist die SH3-Domäne, ein konservierter Bereich von Aminosäuren (Koch et al. 1991). Proteine, die eine SH2-Domäne tragen, beinhalten oftmals auch dieses strukturelle Modul, dessen Bindungsspezifität sich auf Prolinreiche Sequenzen erstreckt (Rickles et al. 1994). Pleckstrin homologe Domänen (PH-Domänen) werden in einer Vielzahl von Signal- und Cytoskelettproteinen gefunden. Die genaue Funktion dieser 100 Aminosäure umfassenden Domäne ist unbekannt, es gibt jedoch Hinweise, daß sie an der Translokation von Proteinen zur Plasmamembran beteiligt sind (Lefkowitz 1993, Pawson 1995). Die 200 Aminosäure umfassende PTB-Domäne scheint wie die SH2-Domäne spezifische Phosphotyrosinreste zu binden. Dabei stellt die Sequenzabfolge NPXpY ein bevorzugtes Bindungsmotiv dar (Kavanaugh und Williams 1994). Für den Insulinrezeptor werden einige direkte Interaktionen mit Signalproteinen beschrieben (s. Kap. 2.5), allerdings ist der entscheidende Schritt in der Signalweiterleitung die Phosphorylierung sogenannter Insulinrezeptorsubstrate, die ihrerseits als Adaptermoleküle für eine Reihe von Signalproteinen dienen (Kahn 1998). Die Verwendung von Adapterproteinen in der Signalweiterleitung bringt mehrere Vorteile mit sich. Gemessen an den vielfältigen metabolischen und mitogenen Effekten, die Insulin vermittelt, stellt die Möglichkeit, verschiedene Proteine durch ein Rezeptormolekül phosphorylieren zu können, eine Vervielfältigung des biologischen Signals dar und eliminiert damit die stöchiometrische Begrenzung zwischen Rezeptoranzahl und vorhandenen Bindungspartnern. Das Insulinrezeptorsubstrat-1 (IRS-1) wurde als erstes Adapterprotein des Insulinrezeptors identifiziert (White et al. 1985). Das menschliche IRS-1 (hirs-1) wird von einem einzigen Exon auf dem Chromosom 2 (2q36-37) kodiert und besitzt ein rechnerisches Molekulargewicht von 132 kda (Araki et al. 1993). Die Tatsache, daß in transgenen Mäusen mit homozygot defektem IRS-1 Locus die Signalweiterleitung durch den Insulinrezeptor nicht vollständig zum Erliegen kommt (Araki et al. 1994), führten zur Klonierung des Insulinrezeptorsubstrates 2 (hirs-2). Das Protein ist um etwa 10 kda größer als hirs-1 und wird von einem einzigen Exon in der Nähe des Genlokus des hirs-1 kodiert (Sun et al. 1995). Neben diesen beiden Vertretern wurden weitere Proteine identifiziert, die wegen struktureller Homologien in die IRS-Familie eingeordnet werden müssen. IRS-3 besitzt ein Molekulargewicht von 60 kda und N-terminal eine PH- und eine PTB-Domäne (Smith-Hall et al. 1997, Lavan et al. 1997). Diese Domänen finden sich auch in IRS-4, ein 160 kda-protein, welches aus menschlichen Nierenzelle isoliert werden konnte (Lavan et al. 1997). Röntgenstruktur-Analysen zeigen, daß IRS-1 mit seiner PTB-Domäne an das phosphorylierte NPXY-Motiv eines Peptids bindet, das einen Ausschnitt aus der Juxtamembranregion des Rezeptors beinhaltet (Eck et al. 1996). Daneben gibt es Hinweise, daß die PH-Domäne eine Rolle bei der Assoziation der Proteine mit dem 19

26 Einleitung aktivierten Rezeptor spielt (Yenush et al. 1996). Die PH-Domäne wird darüber hinaus auch für die Bindung an Phospholipide verantwortlich gemacht, die eine Rekrutierung der IRS-Proteine an der Membran ermöglichen könnte (Myers et al. 1995). Die folgenden C-terminalen Regionen sind nicht sehr stark konserviert, beinhalten aber mehrere Tyrosin- und Serinphosphorylierungsstellen. IRS-1 enthält 21 potentielle Tyrosinphosphorylierungsstellen und über 30 potentielle Serin/Threoninphosphorylierungsstellen (Sun et al. 1991). Das Protein zeigt in situ eine hohe basale Serinphosphorylierung, die nach Insulinstimulation noch weiter erhöht wird (Sun et al. 1992). Von den Tyrosinphosphorylierungsstellen werden mindestens acht vom Insulinrezeptor phosphoryliert (Sun et al. 1993). Das IRS-2 enthält 22 potentielle Tyrosinphosphorylierungsstellen, von denen 14 identische Sequenzumgebungen zeigen wie IRS-1 (Lavan et al. 1997). Ein weiteres Adapterprotein stellt das 1996 entdeckte Gab-1 Protein dar (Holgado-Madruga et al. 1996). Das Molekül trägt eine N- terminale PH-Domäne, der zwei SH3-Domänen folgen und mehrere Tyrosinphosphorylierungstellen. Dieses Protein ist auch an Signalweiterleitung des EGF-Rezeptors beteiligt. Infolge multipler Tyrosinphosphorylierungen der Proteine der IRS-Familie durch den Insulinrezeptor kommt es zur Ausbildung von Signalkomplexen mit Signalproteinen, die an die Phosphorylierungsstellen binden. Dabei ergeben sich aufgrund der Vielfalt der Adapterproteine, der Phosphorylierungsstellen und der Bindungspartner eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten (Abb. 2.5). Plasmamembran p85 p110 Gab-1? Shc? Grb2 Sos - Aminosäuretransport - Na/K ATPase - Glykolyse - Apoptose Anti- Lipolyse? PDE?? Nck p85 p110 Akt Fyn IRS-1 (2/3/4) Syp SHPS-1? Grb2 Sos Dynamin mtor/raft Rezeptor- Endozytose Ras craf-1 MEK GSK3 p70 S6K Glut4? Glykogen Synthase?? 4E-BP1/Phas-I eif4e MAPK Glykogensynthese Glukosetransport Protein- Synthese Zellwachstum und Differenzierung Abb. 2.5: Bisher bekannte Signalwege des Insulinrezeptors bei der Vermittlung seiner mitogenen und metabolischen Effekte. 20

27 Einleitung Als eines der wichtigsten Schlüsselenzyme gilt die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K). Das Enzym besteht aus einer katalytischen Untereinheit (p110), die mit einer regulatorischen Untereinheit (p85) assoziiert ist. Für beide Untereinheiten werden verschiedene Isotypen gefunden (White 1998). Die Bindung der regulatorischen Untereinheit mit seinen beiden SH2-Domänen, bevorzugt an das phosphorylierte Tyrosin in dem Motiv YMXM, bewirkt die Aktivierung der katalytischen Untereinheit (Backer et al. 1992). Diese Konsensussequenz ist einmal im Insulinrezeptor, neunmal im IRS-1 und IRS-2 und zweimal im IRS-3 vorhanden. Bisher konnte aber eine direkte Protein-Protein- Interaktion der p85-untereinheit nur mit dem Insulinrezeptor (Staubs et al. 1994) und dem IRS-1 nachgewiesen werden (Backer et al. 1992). Das Enzym katalysiert die Phosphorylierung von Membran-gebundenen Inositolresten. Dhand et al. (1994) konnte zusätzlich eine intrinsische Serin/Threoninkinaseaktivität aufzeigen, die möglicherweise auch eine Serinphosphorylierung des IRS-1 bewirkt (Tanti et al. 1994). Die durch die PI3K beeinflußten Signalwege sind sehr vielseitig und scheinen sowohl mitogene als auch metabole Wege zu umfassen. Infolge der PI3K-Aktivierung kommt es z. B. zur Translokation von Glut4, einem Glukosetransporter, zur Plasmamembran (Rodnick et al. 1992, Satoh et al. 1993, Hara et al. 1994) und damit zur Glukoseaufnahme in die Zelle (Quon et al. 1995, Kotani et al. 1995). Desweiteren aktiviert das Enzym die Serinkinase AKT (auch PKB genannt), deren gesteigerte Aktivität zur Regulation der Glykogensynthase führt (Khon et al. 1995, Alessi et al. 1996). Daneben stimuliert es die Proteinsynthese von Stoffwechselenzymen durch Aktivierung der p70-s6k, die zur Phosphorylierung verschiedener Transkriptionsfaktoren führt (Cheatham et al. 1994, Hara et al. 1995). Weitere Prozesse, wie Aktivierung der Fettsäuresynthese durch Regulation der camp Phopsphodiesterase (PDK, Moule et al. 1995) oder Regulation des Cytoskeletts (Kotani et al. 1995b) werden ebenfalls beeinflußt, die genauen Signalwege sind hier aber noch unverstanden. Grb2 (Growth factor receptor binding protein) ist ein Adapterprotein ohne enzymatische Aktivität und beeinhaltet eine SH2- und zwei SH3-Domänen (Lowenstein et al. 1992). Mit seinen SH3-Domänen bildet es einen Komplex mit Sos, einem GTP-Austauschfaktor für Ras. Insulin induziert die Assoziation des Grb-Sos Komplexes mit IRS-1 und Ras, induziert den Austausch von GDP-Ras zu GTP- Ras und aktiviert damit die MAP-Kinase-Kaskade (Roberts et al. 1992). Patti et al. (1995) konnten die Interaktion des Grb-Sos-Komplexes auch für das IRS-2 nachweisen. Infolge kommt es zur Aktivierung verschiedener Serin/Threoninkinasen, die letztendlich zu Zellwachstum und DNA- Synthese führen (Moller et al. 1992, Sakaue et al. 1995). Studien mit inaktivem Ras-Protein, deletierten Grb oder Knock-out von IRS-1 führen konsequenterweise zur Termination der durch diese Kinase induzierten mitogenen Effekte, haben aber keinen Einfluß auf die durch Insulin vermittelten metabolen Wirkungen (Sakaue et al. 1995, Waters et al. 1993, Lazar et al. 1995). Interesanterweise findet sich in der MAP-Kinase-Kaskade mit MEK eine Kinase mit dualer Aktivität (Anderson et al. 1990). Ihre Aktivierung führt zur Autophosphorylierung an Tyrosin, Serin und Threonin und katalysiert wiederum die Phosphorylierung der MAPK an Threonin und Tyrosin. Grb2 assoziiert nach Insulinstimulation auch mit Dynamin (Ando et al. 1994). Aufgrund der Beteiligung dieses Proteins an der EGFR-Endozytose (Wang et al. 1996) wird daher angenommen, daß Grb-Dynamin auch bei der Insulinrezeptor-Internalisation beteiligt ist. Shc (src homology 2/α-collagen related protein) ist ein Adapterprotein, welches in verschiedenen Isoformen vorliegen kann (Bork et al. 1995). Das Protein wird nach Insulinstimulation an Tyrosinresten phosphoryliert (Giorgetti et al. 1994) und ist ebenfalls in der Lage, den Grb-Sos-Komplex über einen Tyrosinrest zu binden (Sasaoka et al. 1996). Damit stehen für die Ras-Aktivierung zwei alternative Wege zur Verfügung. Die Überexpression von IRS-1 oder Shc zeigt, daß beide Proteine um den in der Zelle vorhandenen Grb2-Pool kompetetieren. Der Grund hierfür ist zur Zeit noch nicht geklärt, hängt aber möglicherweise von einer gewebe- oder zellspezifischen Expression beider Proteine ab (Sasaoka et al. 1996). Syp (Src homology-protein tyrosin phosphatase 2, SH-PTP2) ist eine cytoplasmatische Tyrosinphosphatase, die zwei SH2-Domänen enthält. Für dieses Protein wurde eine Bindung an den aktivierten Insulinrezeptor (Kharitonenkov et al. 1995), an IRS-1 (Khune et al. 1993) und IRS-2 (Patti et al. 1995) nachgewiesen. Daneben ist die Assoziation an andere Wachstumsfaktor-Rezeptoren bekannt (Freeman et al. 1992, Feng et al. 1993, Lechleider et al. 1993). Daneben bindet es an ein integrales 21

28 Einleitung Membranprotein (SHPS-1), welches ein direktes Substrat für den Insulinrezeptor darstellen könnte (Yamao et al. 1997). Dabei wird ihre Möglichkeit, an verschiedenen Signalmolekülen zu binden, als ein Mittel angesehen, eine Phosphataseaktivität in verschiedenen Kompartimenten zu positionieren (White 1998). Die Funktion dieses Moleküls wird kontrovers diskutiert. Einerseits schreibt man ihm die Vermittlung von Signalen zu, da die Expression einer katalytisch inaktiven Mutante zur Inhibition der MAP-Kinase-Kaskade führt (Yamauchi et al. 1995, Noguchi et al. 1994, Sasaoka et al. 1994). Andererseits könnte das Enzym zur Dephosphorylierung von IRS-1 führen und damit zur Attenuation des Insulinsignales beitragen (Arrandale et al. 1996, Mendez et al. 1996). 2.7 Die Termination des Insulinrezeptor-Signals Ebenso wie die Aktivierung verschiedener Signalkaskaden durch den Insulinrezeptor ist deren Beendigung von entscheidener Bedeutung. Einen wichtigen Beitrag leisten hier Proteinphosphatasen, die spezifisch zur Dephosphorylierung einzelner Proteine führen. Proteinphosphatasen können generell in vier Klassen eingeteilt werden, wobei die Klasse der Proteintyrosinphosphatasen (PTP) zu den am besten charakterisierten zählt. Diese Enzyme sind an vielen Signalwegen, die zu Wachstum, Stoffwechsel oder Zelldifferenzierung führen, beteiligt (Maegawa et al. 1993). PTP besitzen eine 230 Aminosäure umfassende Domäne, welche die charakteristische Konsensussequenz (I/V)HCXAGXGR (S/T)G beinhaltet (Goldstein 1996). Die von ihnen vermittelte Dephosphorylierung von Tyrosinresten verläuft über einen katalytischen Cysteinrest (Guan und Dixon 1990) in einem Säure-katalysierten in line -Mechanismus. Die strukturelle Grundlage bildet dabei das Motiv C(x) 5 R, wobei ein dem Cystein benachbartes Histidin das Thiolatanion stabilisiert (Zhang et al. 1994). Die Reaktion erfolgt über den Angriff des Thiolatanions auf die trigonale pyramidale Struktur, die die Phosphatgruppe mit der Aminosäureseitenkette kennzeichnet. Dabei wirkt eine Asparaginsäure als katalytische Säure. Über einen pentakovalenten Übergangszustand kommt es dann zur Ausbildung eines Thiolphosphatintermediates. Nach dem Angriff von Wasser, der ebenfalls über einen trigonal bipyramidalen Zustand verläuft, werden anorganischem Phosphat und das Thiolatanion erhalten. Die Beendigung des Insulinsignals durch den Einfluß von Proteinphosphatasen kann auf drei Ebenen erfolgen: (1) Auf Ebenen der Insulinrezeptorkinase durch Dephosphorylierung der für die Kinaseaktivität bedeutsamen Tyrosinreste der katalytischen Domäne (2) oder Dephosphorylierung von Tyrosinphosphorylierungsstellen, die für eine direkte Interaktion mit Signalmolekülen verantwortlich sind und (3) auf Ebene der Signalproteine durch Modulation ihres Phosphorylierungsstatus. Die molekularen Mechanismen und die beteiligten Phosphatasen, die die Attenuation vermitteln, sind allerdings noch nicht vollkommen analysiert bzw. identifiziert. Der Rezeptor wird nach Hormonbindung und Autophosphorylierung sehr schnell internalisiert und kann in tubulovesikulären Strukturen (Endosomen) im Cytosol nachgewiesen werden. Endosomen vermitteln die Sortierung und Prozessierung vieler Hormon-Rezeptorkomplexe und scheinen eine Rolle in der Signaltransduktion und Termination zu spielen (Baass et al. 1995, Bevan et al. 1996). Nach Aktivierung von Protonenpumpen und einer dadurch erreichten ph-verschiebung im Endosom kommt es zu einer Dissoziation des Hormons vom Rezeptor, welches anschließend durch eine spezifische Insulinprotease degradiert wird (Authier et al. 1996). Kinetische Untersuchungen in situ und in vitro zeigen aber, daß der vom Hormon befreite Rezeptor weiterhin Tyrosinkinaseaktivität besitzt (Khan et al. 1986, Khan et al. 1989, Backer et al. 1989, Klein et al. 1987, Kublaoui et al. 1995, Whang et al. 1996). Dabei ist bemerkenswert, daß im Cytosol weiterhin die Interaktion mit IRS-1 oder der PI3-Kinase nachgewiesen werden kann (Bevan et al. 1995, Kelly et al. 1993). Demnach ist also nicht alleine die Dissoziation von Insulin für eine Beendigung des Rezeptorsignals entscheidend, vielmehr muß noch eine spezifische Dephosphorylierung erfolgen, die zur Beendigung des Hormonsignals führt. Aufgrund vieler in vitro Studien ist bekannt, daß die Dephosphorylierung der Tyrosine in der katalytische Domäne zur Inaktivierung der Insulinrezeptorkinase führt (Kap 2.4). In situ Studien zeigen, daß diese Domäne ein sehr sensitives Ziel von Phosphatasen darstellt. Allerdings konnten noch keine Enzyme identifiert werden, die diese spezifische Dephosphorylierung bewirken (Drake und Posner 1998). In der Diskussion stehen die Proteintyrosinphosphatasen Syp (SH-PTP2, Feng et al. 1993), LAR, LRP, PTP1B und RPTP-κ (Goldstein et al. 1998). Dabei ist bemerkenswert, daß in Folge der 22

29 Einleitung Dephosphorylierung des internalizierten Rezeptors kurzfristig eine erhöhte Tyrosinkinaseaktivität beobachtet wird (Wang et al. 1996, Burgess et al. 1992). Der Mechanismus, der zu dieser Aktivierung der Kinase führt, ist bislang nicht verstanden. Untersuchungen mit C-terminalen Deletionmutanten (Maegawa et al. 1988, Bernier et al. 1994, Tavare et al. 1992) oder Substitution der beiden Phosphorylierungsstellen Tyr 1316 und Tyr 1322 zeigen einen Anstieg sowohl in der Autophosphorylierung als auch in der exogenen Tyrosinkinaseaktivität des Rezeptors in situ. Demnach scheint eine PTPase- Aktivität zunächst die Dephosphorylierung dieser Phosphorylierungsstellen zu bewirken. Interessanterweise wurde von mehreren Arbeitsgruppen über eine intrinsische Phosphataseaktivität des Insulinrezeptors und seiner löslichen Kinase berichtet (Kole et al. 1988, Grupposo et al. 1992, Al-Hasani et al. 1994, Cobb et al. 1989). Dabei wird in allen Fällen im Verlauf der Autophosphorylierungsreaktion über eine Dephosphorylierung des Enzyms berichtet, die nicht durch die Anwesenheit exogener Phosphatasen begründet werden kann. Während Cobb et al. (1989) diese Dephosphorylierung der Rückreaktion von ADP und Phosphoenzym zu Dephosphoenzym und ATP zuschreiben, konnten Gruppuso et al. (1992) eine Neusynthese von ATP nicht detektieren. Letztere Beobachtung wird durch Untersuchungen von Heidenreich (1995), Matthey (1993) und Al-Hasani (1995) unterstützt, die während der Autophosphorylierung die Freisetzung von anorganischem Phosphat nachweisen können. Dabei konnte im Reaktionsansatz weder eine exogene Phosphatase- noch eine ATPase-Aktivität nachgewiesen werden, vielmehr ist die Aktivität des Enzyms entscheidend und in einer intrinsischen Phosphataseaktivität begründet. In diesem Zusammenhang konnte Al-Hasani (1995) zeigen, daß diese intrinsische Phosphataseaktivität primär auf die beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen einwirkt. Allerdings scheinen auch weitere Tyrosinreste in der katalytischen Domäne und in der Juxtamembrandomäne davon betroffen zu sein (Heidenreich 1995, Kayatz 1994, Magg 1995, Al-Hasani 1995). Möglicherweise kommt dieser intrinsischen Dephosphorylierungsaktivität eine Rolle in der Signalweiterleitung der Rezeptorkinase zu. Kole et al. (1988) berichten zudem, daß sich diese Dephosphorylierung nicht alleine auf die Insulinrezeptorkinase beschränkt, sie beobachten diese auch bei einem vorphosphorylierten Substrat. Auch für andere Rezeptor-Tyrosinkinasen konnte eine solche intrinsische Phosphataseaktivität nachgewiesen werden (Beemelmanns 1997, Magg 1997, Affüpper 1997), allerdings ist in allen Fällen eine mechanistische Grundlage für eine Erklärung zur Zeit nicht gegeben. Auf Ebene der Regulation von Signalproteinen finden sich zahlreiche Beispiele, die die Bedeutung von Proteinphosphatasen belegen, in vielen Fällen sind die dafür verantwortlichen Enzyme aber noch nicht bekannt. So bewirkt die Dephosphorylierung von Grb2 durch die PTPase LRP die Dissoziation des Grb2-Sos-Komplexes und terminiert somit die Signalweiterleitung durch die MAP-Kinase-Kaskade (den Hertog et al. 1994). Syp (SH-PTP2) wird die Fähigkeit zugesprochen, Tyrosinreste in IRS-1 zu dephosphorylieren (Kuhne et al. 1994, Ugi et al. 1994). Auch in der MAP-Kinase-Kaskade scheinen eine Vielzahl von PTPasen beteiligt, die zur Abschaltung dieses Signalweges führen (Hunter 1995). Raf wird in vitro durch die Proteinserinphosphatase PP1 dephosphoryliert, die Dephosphorylierung des Serinrestes in der Mek-Kinase oder des Threoninrestes der Map-Kinase durch PP2a führt zur Inaktivierung dieser Enzyme (Nakielny et al. 1992, Anderson et al. 1990). Neben der Beendigung einzelner Signalwege durch Proteindephosphorylierung finden sich in der Literatur einige Beispiele, die belegen, daß auch eine zusätzliche Serinphosphorylierung verschiedener Signalmoleküle eine Rolle in der Termination des Insulinrezeptorsignals spielen könnte. Diskutiert werden hierbei Mechanismen, die zu einer reduzierten Kinaseaktivität des Rezeptors, einer Verhinderung der Phosphorylierbarkeit bestimmter Phosphorylierungsstellen oder die Unterbindung von Protein-Protein-Interaktionen führen. Die Aktivierung des Insulinrezeptorsignalweges führt auf Rezeptorebene zu einer erhöhten Serinphosphorylierung der β-untereinheit (s. Kap. 2.5). Dabei soll die Phosphorylierung des Serinrestes Ser 994 in der katalytischen Domäne zu einer Verminderung der Kinaseaktivität führen (Strack et al. 1997). Ferner scheint Serinphosphorylierung der beiden C-terminalen Serinreste Ser 1275 und Ser 1309 eine reduzierte Assoziation der SH2-Domäne der regulatorischen Untereinheit der PI3K zu bewirken (Pavaresch, unveröffentlicht). Auch für IRS-1 wurde eine erhöhte Serinphosphorylierung nach Insulinstimulation nachgewiesen (Tanti et al. 1994). Mothe und Van Oberghen (1996) zeigen in diesem Zusammenhang, daß die Phosphorylierung von vier Serinresten in der zentralen Domäne des Moleküls zu einer Reduktion der PI3K-Aktivität führt, die wahrscheinlich in einer Unterbindung der Protein-Protein- 23

30 Einleitung Interaktion mit der SH2-Domäne der regulatorischen Untereinheit der PI3K begründet ist. Die verantwortliche Kinase ist aber noch nicht identifiziert. Tranissijevik et al. (1993) belegen eine Phosphorylierung von Serin- und Threoninresten im IRS-1 durch die Caseinkinase II. Die Phosphorylierungsstellen liegen im N-terminalen Bereich des Moleküls und scheinen eine Interaktion der PH-Domäne mit dem Rezeptor zu unterbinden. 2.8 Die lösliche Insulinrezeptorkinase als Modellenzym Aufgrund seiner molekularen Komplexität und einem aufwendigem Reinigungsverfahren aus Humanplazenta, bei geringer Ausbeute, sind der Analyse der strukturellen Organisation und katalytischen Aktivität des Insulinrezeptors Grenzen gesetzt. Die Klonierung der cdna durch Ullrich et al. (1985) und Ebina et al. (1985) ermöglichte die Expression großer Mengen des intakten durch Mutagenese veränderten Rezeptors in Vertebratenzell-Linien und vereinfachte die Untersuchungen zum Mechanismus und der Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion erheblich. Die Möglichkeit, α- und β-untereinheit getrennt als funktionelle Moleküle im Baculovirus-Expressionssystem darzustellen, erlaubt in Verbindung mit Mutagenesetechniken eine detaillierte Untersuchung der Insulinbindung, der Kinaseaktivität und Protein-Protein-Interaktion. Die sogenannte lösliche Insulinrezeptorkinase liegt nach der Reinigung als Monomer vor und enthält in ihrer unmodifizierten Form die cytoplasmatische Aminosäuresequenz des humanen Insulinrezeptors. Das Enzym zeigt konstitutive Phosphotransferaseaktivität (Ellis et al. 1988, Herrera et al. 1988, Cobb et al. 1989, Villalba et al. 1989). Die Reaktion ist, analog dem Insulinrezeptor, von der Gegenwart divalenter Kationen abhängig, das ph-optimum liegt bei ph 7,5-8, das Temperaturoptimum bei C. Die maximale Phosphatinkorporation liegt zwischen 3 und 6 mol Phosphat pro mol Enzym (Argetsinger und Schafer 1992, Kohanski, 1993a). Die Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierung kann durch Stimulation mit Polykationen (Poly(Lysin) oder Protamin) um den Faktor gesteigert werden (Rosen und Lebwohl 1988). Verschiedene Autoren vermuten, daß ihre Anwesenheit Molekülaggregation stimuliert und damit die trans-phosphorylierung zwischen den einzelnen Molekülen bewirkt (Kohanski 1993a, Yan et al. 1993). In Abwesenheit der Poly(Kationen) wird dagegen eine Konzentrationsunabhängigkeit in der Autophosphosphorylierung beobachtet, woraus andere Autoren einen cis-autophosphorylierungsmechanismus ableiten (Kohanski 1993b, Herrera et al. 1988, Villalba et al. 1989). Allerdings scheint hiervon nur die Phosphorylierung des Juxtamembranbereiches betroffen (Cann und Kohanski 1997), die Besetzung der Tyrosine der katalytischen Domäne und des C-Terminus erfolgt in trans. Kinetisch betrachtet ähnelt die durch Polykationen stimulierte Reaktion der insulinstimulierten Autophosphorylierungsreaktion, allerdings ist die Initialgeschwindigkeit im Vergleich zum Insulinrezeptor deutlich erhöht (Heidenreich et al. 1994, Kohanski 1993a). Im Gegensatz dazu entspricht die nicht stimulierte Reaktion der basalen Kinaseaktivität des Rezeptors (Kohanski 1993a). Die Analyse der Besetzung einzelner Tyrosinautophosphorylierungsstellen zeigt, daß alle für den Rezeptor beschriebenen Tyrosinreste zugänglich sind und phosphoryliert werden können (Al-Hasani et al. 1997, Cann und Kohanski 1997). Allerdings ergeben sich Unterschiede in der Verteilung der Phosphate in die einzelnen Positionen. Während im Insulinrezeptor nach Autophosphorylierung in situ die vollständige Besetzung der katalytischen Domäne nicht beobachtet werden kann, scheint in der löslichen Kinase die tris-form (alle Tyrosinreste in der katalytischen Domäne sind phosphoryliert) voll ausgeprägt (White 1998, Magg 1995, Al-Hasani 1995). Im Gegensatz dazu ist der Anteil der Phosphate in der Juxtamembrandomäne im Insulinrezeptor höher als im löslichen Enzym. Möglicherweise bewirkt die Abwesenheit der Transmembrandomäne oder der monomere Status des Moleküls diesen Effekt (Cann und Kohanski 1997, Al-Hasani 1995). Auch in der Reihenfolge der Besetzung der Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne ergeben sich im Vergleich zum Insulinrezeptor Unterschiede. Für den Insulinrezeptor wird die Phosphorylierung des Tyr 1150 und dann in Folge die Besetzung der Tyrosine Tyr 1146 und Tyr 1151 erhalten (s. Kap. 2.4). Im Gegensatz dazu ergibt sich für die lösliche Kinase die Reihenfolge Tyr 1151, Tyr 1150 und Tyr 1146 (Nölle 1998). 24

31 Einleitung In der Autophosphorylierungsreaktion der löslichen Kinase wird, in Analogie zum gereinigten Insulinrezeptor (Heidenreich et al. 1994), die Phosphatinkorporation in Serinreste beobachtet (Ellis et al..1988, Al-Hasani 1995, Tavare et al. 1991, Tennagels 1995). Während Ellis et al. (1988) und Tavare et al. (1991) diese Serinphosphorylierung einer exogenen Serinkinase zuschreiben, belegen die Studien von Al-Hasani (1995), daß es sich bei dieser Phosphorylierung um eine intrinsiche Eigenschaft des Enzyms handelt. Die Anwesenheit von Kinaseinhibitoren (Al Hasani 1995) oder die Inaktivierung der Kinase durch Mutation invarianter Aminosäurereste (Lys 1018 Ala, Tennagels, 1995; Asp 1120 Ala Kessler, 1998) führen zum Verlust der Phosphorylierung von Tyrosin und Serinresten und belegen die Abhängigkeit der Serinphosphorylierung von einer aktiven Kinase. Durch direkte Sequenzierung tryptischer Phosphopeptide konnten die Serinphosphorylierungsstellen Ser 1275 und Ser 1309 identifiziert werden (Al-Hasani et al. 1997). In der Substratphosphorylierung zeigen lösliche Kinasen im Vergleich zum gereinigten Insulinrezeptor vergleichbare kinetische Konstanten. Dabei ergeben sich keine anderen Spezifitäten in der Phosphorylierung von Modellsubstraten, synthetischer Peptide oder natürlichen Substraten, die sich aus Domänen des Insulinrezeptors oder Signalmolekülen wie IRS-1 ableiten. Generell verläuft der Phosphotransfer im Vergleich zum gereinigten Insulinrezeptor mit einer höheren Geschwindigkeit (Al-Hasani 1995, Herrera et al. 1988, Villalba et al. 1989, Cobb et al. 1989). Zusammengefaßt ist die lösliche Insulinrezeptorkinase, aufgrund ihrer vergleichbaren Eigenschaften zum Insulinrezeptor, ein hervoragendes Modellsystem, welches neue Wege im Bezug auf die Analyse der Rezeptorautophosphorylierung und Substratphosphorylierung ermöglicht. Die Bereitstellung großer Mengen an hochreinem Enzym mit Hilfe des Baculovirus-Expressionssystems, erlaubt in Verbindung mit ortspezifischer Mutagenese vielfältige Möglichkeiten der biochemischen Charakterisierung und wird damit auch apparativ aufwendigen Analyseverfahren gerecht. Die H 1 -NMR-spektroskopischen Untersuchungen der Kinasereaktion (Levine et al. 1991), CD-spektroskopische Untersuchungen (Villalba et al. 1989, Kessler 1998) oder die Aufklärung der Kristallstruktur der katalytischen Domäne (Hubbard et al. 1994, Hubbard 1997) sind dafür nur einige Beispiele. 25

32 Einleitung 2.9 Fragestellung der Arbeit Ausgangspunkt für die Untersuchungen waren die beobachtete Serinkinaseaktivität des gereinigten humanen Insulinrezeptors in vitro (Heidenreich 1995). Die gleiche duale Aktivität wurde auch bei seiner im Baculovirus-Expressionssystem dargestellten löslichen Kinase beobachtet, die als Modellsystem von Al Hasani (1995) in unserem Labor etabliert werden konnte. Durch Phosphopeptidkartierung konnten von ihm die Serinreste Ser 1275 und Ser 1309 in vitro als Hauptserinautophosphorylierungsstellen identifiziert werden (Al Hasani et al. 1997). Die in vitro identifizierten Serinautophosphorylierungsstellen Ser 1275 und Ser 1309 sollten in situ nachgewiesen werden. Dazu sollten in situ-labeling -Experimente in Zusammenarbeit mit Dr. Maassen in Leiden durchgeführt und mit der im Labor etablierten Methode der Phosphopeptidkartierung identifiziert werden. Um große Proteinmengen für biochemische und physikalische Analysen der Auto- und Substratphosphorylierungsreaktion zu erhalten, sollte die lösliche Insulinrezeptorkinase IRKD im Baculovirus-Expressionssystem überexprimiert und gereinigt werden. Desweiteren sollten für die verschiedenen mechanistischen Fragestellungen Kinasevarianten mit Aminosäuresubstitutionen durch ortsspezifische Mutagenese generiert und ebenfalls in dem eukaryontischen Expressionssystem dargestellt werden. Mit der gereinigten löslichen Kinase und der verschiedenen Varianten sollten weitergehende Charakterisierungen der intrinsischen Serinkinaseaktivität durchgeführt werden. Die beobachtete Serinphosphorylierung beschränkte sich nur auf die Autophosphorylierungsreaktion. Für die Charakterisierung der IRKD als eine Kinase mit dualer Spezifität ist aber unbedingt der Nachweis einer enzymkatalysierten Serinphosphorylierung in einem exogenen Substrat erforderlich. Für kinetische Untersuchungen der Substratphosphorylierungsreaktion sollten rekombinante Substrate in E.coli hergestellt, gereinigt und charakterisiert werden. Mit der gereinigten löslichen Kinase und der verschiedenen Varianten sollten Analysen ihrer Substratphosphorylierungsreaktionen erfolgen, um Bedingungen zu finden, die eine Serinphosphorylierung in Substraten erlauben. Eine weitere Besonderheit des Insulinrezeptors und seiner löslichen Kinase war eine beobachtete intrinsische Phosphatase-Aktivität, die vor allem die C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen in der Autophosphorylierungsreaktion betraffen (Heidenreich 1995, Al Hasani et al. 1994). Bislang war unklar, ob diese Phosphataseaktivität auf die Autophosphorylierungsreaktion beschränkt ist und ob Verbindungen zwischen den beiden Mechanismen, intrinsische Serinkinaseaktivität und Phosphataseaktivität, bestehen. Mit der gereinigten löslichen Kinase und der verschiedenen Varianten sollten weitergehende Charakterisierungen der beobachteten Phosphataseaktivität in der Autophosphorylierungsreaktion durchgeführt werden. Ferner sollte die Frage geklärt werden, ob die Phosphataseaktivität auch in der Substratphosphorylierungsreaktion der Kinase zu beobachten ist. 26

33 Ergebnisse 3 Konstruktion, Expression und Reinigung der Insulinrezeptorkinase-Domäne 3.1 Das Baculovirus-Expressionssystem Baculoviren gehören zu der Gruppe der doppelsträngigen DNA-Viren. Jede Art befällt stammes- und wirtsspezifisch Insekten. Der am besten charakterisierte Virus ist der Autographa californica nuclear polyhedrosis Virus (AcNPV), welcher sich in den Säulenzellen im Darmtrakt der Schmetterlinge Autographa californica und Spodoptera frugiperda (Sf) vermehrt. Die 130 kbp große DNA ist in einer stäbchenförmigen Proteinhülle verpackt, die zusätzlich mit einer Lipidmembran umgeben ist; bis zu 100 solcher Partikel bilden, in einer aus Polyhedrin bestehenden Proteinhülle, das Dauerstadium des Virus (Einschlußkörper; occlussion body). Die Einschlußkörper werden vom Wirt oral aufgenommen und gelangen so in den Verdauungstrakt des Insektes. Dort wird die Polyhedrinhülle abgedaut und die infektiösen Viruspartikel verschmelzen, nach Passieren der peritrophischen Membran, mit der Zellmembran ihrer Wirtszellen. Die hier freigesetzte DNA wandert in den Zellkern und wird nach etwa sechs Stunden (post infection, p.i.) repliziert und transkribiert. In der frühen Phase (10 h p.i.) verlassen vornehmlich stäbchenförmige Partikel durch Knospung die Zelle und infizieren Zellen in ihrer Umgebung; erst im weiteren Verlauf der Infektion kommt es zur Bildung der Einschlußkörper (48 Stunden p.i.). Diese Partikel schützen die eingeschlossenen vor der Inaktivierung. Die Lyse der Zellen setzt nach 72 Stunden ein, die Einschlußkörper werden mit dem Kot ausgeschieden und können bis zu mehreren Jahre außerhalb des Wirtes überdauern. Damit ist das Polyhedrin für den Lebenszyklus des Virus ein sehr wichtiges Protein, unter Zellkulturbedingungen ist es aber weder für die Infektiosität noch für die Replikation der Viren von Bedeutung (Summers und Smith 1987). Ein unter Kontrolle des Polyhedrin-Promoters in das virale Genom eingeschleustes Gen kann daher in hohen Konzentrationen in den Insektenzellen exprimiert und anschließend gereinigt werden (1 g/10 9 Zellen). Der weiterer Vorteil dieses Expressionssystems ist sein eukaryotischer Ursprung. Viele posttranslationalen Modifikationen, wie Faltung, Disulfidbrücken und Glykolysierungen werden von den Insektenzellen korrekt ausgeführt, so daß die gereinigten Proteine auch ihre volle biologische Funktion erhalten. Das Einbringen von Fremd-DNA in die Virus-DNA gelingt durch homologe Rekombination eines die DNA enthaltenen speziellen Transfervektors mit linearisierter AcNPV-DNA. Dazu wird die DNA des zu exprimierenden Proteins in einen Transfervektor kloniert, der homologe Sequenzen zur 5 - und 3 - Region des Polyhedrin-Gens enthält. Durch Kotransfektion von Vektor- und linearisierter AcNPV- DNA, die eine Letal-Deletion in der 3'- flankierenden Region des Polyhedrin-Gens besitzt, kommt es in vivo zu homologen Rekombinationsereignissen, aus denen nur intakte, Fremd-DNA tragende Viren hervorgehen. Die rekombinanten Viren werden mit dem Plaque-assay isoliert und in eine weitere Infektion eingesetzt, bei der anschließend die Zellen auf Expression des Proteins immunologisch überprüft werden. Nach der sukzessiven Erhöhung der Virustiters während mehrerer Passagen in der Zellkultur können die so erhaltenen Viren für die Infektion großer Insektenzellkulturen verwendet werden. 3.2 Konstruktion des Transfervektors pvl-irkd Der Transfervektor pvl-irkd enthält die Sequenz des cytoplasmatischen Bereiches des humanen Insulinrezeptors und kodiert für die Aminosäuren Arg 941 -Ser 1343 (Ullrich et al. 1985). Zusätzlich enthält die 403 Aminosäuren lange Proteinsequenz an Position eins das Initiator-Methionin der Proteinsynthese (Abb. 3.1). Grundlage für dessen Konstruktion war ein Klonierungsvektor, der ein 1599 Bp großes Fragment der cdna des humanen Insulinrezeptors trägt (Position , pucir-pstia, Aretz 1994). Aus diesem wurde das 1378 Bp lange BglI-PstI-Fragment (Gly 947 -Ser 1343 ) zusammen mit einem N-terminalen Linkerfragment, welcher am 5 -Ende eine BamHI- und am 3 -Ende eine BglI- Schnittstelle trug und die fehlenden Aminosäuren Arg 941 -Asp 946 beinhaltete, in den BamHI-PstI- linearisierten bakteriellen Klonierungsvektor puc19 ligiert (puc-irkd). Das 1407 Bp große BamHI- PstI-Fragment wurde anschließend in die Multiklonierungsstelle des Expressionsvektors pvl1393 ligiert (Tennagels 1995). 27

34 Ergebnisse Arg 941 1: mrkrqpdgpl GLYASSNPEY LSASDVFPCS VYVPDEWEVS REKITLLREL 51: GQGSFGMVYE GNARDIIKGE AETRVAVKTV NESASLRERI EFLNEASVMK 101: GFTCHHVVRL LGVVSKGQPT LVVMELMAHG DLKSYLRSLR PEAENNPGRP 151: PPTLQEMIQM AAEIADGMAY LNAKKFVHRD LAARNCMVAH DFTVKIGDFG 201: MTRDIYETDY YRKGGKGLLP VRWMAPESLK DGVFTTSSDM WSFGVVLWEI 251: TSLAEQPYQG LSNEQVLKFV MDGGYLDQPD NCPERVTDLM RMCWQFNPKM 301: RPTFLEIVNL LKDDLHPSFP EVSFFHSEEN KAPESEELEM EFEDMENVPL 351: DRSSHCQREE AGGRDGGSSL GFKRSYEEHI PYTHMNGGKK NGRILTLPRS 401: NPS Ser 1343 Abb. 3.1: Aminosäuresequenz der IRKD. Das Initiator-Methionin der Proteinsynthese ist kleingedruckt. Fettgedruckt sind die Tyrosine, die als Autophosphorylierungsstellen im humanen Insulinrezeptor beschrieben wurden. Im Fett- und Kursivdruck ist das Lysin 1018 dargestellt, welches für die ATP-Bindung des Enzyms essentiell ist. Das Protein enthält 403 Aminosäuren und besitzt ein rechnerischen Molekulargewicht von 45,7 kda. Sequenz nach Ullrich et al. (1985). 3.3 Herstellung und Isolierung rekombinanter Baculoviren Der Transfervektor pvl-irkd wurde zusammen mit der AcNPV-DNA in Sf9-Zellen kotransfiziert und rekombinante Virusklone nach 5 Tagen mit Hilfe des Plaque-assays isoliert. Die Klone wurden zur Infektion von Sf9-Zellen verwendet und nach 3 Tagen geerntet. Die resultierenden Zell-Lysate wurden anschließend auf die Proteinexpression der löslichen Kinasemoleküle durch Western- Blotting mit einen gegen den C-Terminus des Insulinrezeptors gerichteten Antikörpers untersucht. In diesen Analysen zeigte sich in positiven Klonen eine starke Kreuzreaktion mit einem etwa 50 kda großen Protein, welches weder in nicht infizierten Kontrollzellen noch in mit AcNPV-Wildtyp infizierten Zellen nachgewiesen werden konnte. Der Virusklon mit dem stärksten immunologischen Signal (AcNPV-IRKD) wurde durch mehrere Schritte bis zu einem Virustiter von 3 x 10 8 pfu/ml (Plaque forming units/ml) amplifiziert und für die nachfolgende Proteinexpression verwendet ( working stock ). 3.4 Zeitverlauf der Proteinexpression der löslichen Insulinrezeptorkinase Um den Zeitpunkt der maximalen Proteinexpression zu ermitteln, wurden Sf9-Zellen mit dem working stock infiziert und zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion (p.i.) die erhaltenen Zell- Lysate immunologisch durch Western-Blot-Analyse mit einem gegen den C-Terminus des Insulinrezeptors gerichteten Antikörper auf das Vorhandensein der Rezeptorkinase untersucht. Der Versuch wurde in einer 200 ml Suspensionskultur durchgeführt, um Anhaltpunkte für die spätere Proteinexpression im präparativen Maßstab zu erhalten. Der Zeitverlauf der Proteinexpression ist für die IRKD in Abbildung 3.2 dargestellt. Die Expression der IRKD kann deutlich 36 Stunden nach Infektion nachgewiesen werden. (Abb. 3.2, Bahn 4). Die Kreuzreaktion des Antikörpers mit einem Zellprotein im gleichen Molekulargewichtsbereich (Bahn 1) macht eine frühere Bestimmung nicht möglich. Das Expressionsmaximum wird nach 48 Stunden erreicht, bleibt aber darüber hinaus noch weitere 24 Stunden konstant. Nach etwa 80 Stunden kommt es zur viral bedingten Lyse der Zellen, was die Freisetzung der Kinase in das Medium zur Folge hat. Um eine hohe Ausbeute an intaktem Protein zu erhalten, wurden infizierte Zellen daher nach 72 Stunden geerntet. 28

35 Ergebnisse Mr [kda , Abb. 3.2: Zeitabhängige Proteinexpression der IRKD. Eine 200 ml Suspensionskultur (2 x 10 8 Zellen) wurde mit rekombinanten Baculoviren (multiplicity of infection 25) infiziert. Jeweils 1 x 10 6 Zellen wurden zu den angegebenen Zeiten geerntet, in SDS-Probenpuffer lysiert und immunologisch durch Western-Blot-Analyse mit einem gegen den C-Terminus des Insulinrezeptors gerichteten Antikörper auf Proteinexpression untersucht. Aufgetragen wurden jeweils 1, Zellen pro Bahn. Die Zeitpunkt der Zell-Ernte ist in Stunden angegeben. 1: nicht infizierte Zellen 72 h, 2: AcNPV-infizierte Zellen (Wildtyp) 72 h; mit AcNPV-IRKD infizierte Zellen: 3: 24 h, 4: 36 h, 5: 48 h, 6: 72 h nach Infektion. Western-Blot nach 12 % SDS-PAGE, immunologischer Nachweis durch α-gst-ct-antikörper. 3.5 Reinigung der löslichen Insulinrezeptorkinase IRKD Die Reinigung der Rezeptorkinase erfolgte in Anlehnung an Villalba et al. (1989) und Al-Hasani (1995). Dabei werden zwei aufeinanderfolgende chromatographische Verfahren, Anionenaustauschund hydrophobe Interaktionschromatographie, angewandt. Hierbei werden die intrinsischen Eigenschaften des Moleküls, Ladung und Hydrophobizität ausgenutzt. Als zusätzlicher Reinigungsschritt kann eine Gelfiltration durchgeführt werden. Das Ausgangsmaterial für die Reinigung ist die lösliche cytosolische Zellfraktion, die nach dem Zellaufschluß durch Sonifikation, Homogenisation im Elvehjem-Potter, anschließendem Abtrennen unlöslicher Zellbestandteile durch niedertourige Zentrifugation und nachfolgender Ultrazentrifugation erhalten wird. Die Kinase bindet bei neutralem ph-wert an Anionenaustauscher mit stark positiv geladenen quartären Ammoniumgruppen wie MonoQ oder ResourceQ und kann anschließend selektiv durch Anlegen eines NaCl-Gradienten eluiert werden. In Verbindung mit der Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) erweist sich diese Trennmethode als äußerst effektiv, da sich Vorteile wie kurze Trennzeit und hohe Trennschärfe ergeben. Die Kinase eluiert bei einer NaCl-Konzentration von 0,2 mm von der Säule (Abb 3.3 A). Im Durchschnitt wurde in diesem Reinigungsschritt etwa ein Gesamtproteingehalt von 1,6 mg in 3 ml Eluat erreicht. Bezogen auf den Proteingehalt des Zellysats beträgt die Ausbeute 11 %. Die Reinheit der vereinigten Überstände nach Coomassie-Färbung ist in Abbildung 3.1 dokumentiert. Unter Berücksichtigung der angewandten Färbetechnik ergibt sich nach diesem Reinigungsschritt ein Reinheitsgrad von ca. 40 %. Die nachfolgende hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) erlaubt die Trennung von Proteinen aufgrund unterschiedlicher Hydrophobizität. Die Bindung der Proteine an das Säulenmaterial durch hydrophobe Wechselwirkungen wird durch Erhöhung der Ionenstärke im Lösungsmittel verstärkt. Die IRKD bindet an Phenyl-Sepharose vollständig nach 20 %iger Sättigung der MonoQ-Fraktion mit Ammoniumsulfat. Eine vor dem Probenauftrag durchgeführte Zentrifugation führt zur Entfernung einiger Proteine, die unter diesen Bedingungen bereits präzipitieren, die Kinase selbst bleibt jedoch gelöst. Damit wird ein eine zusätzliche Erhöhung des Reinigungsfaktors erreicht (Al-Hasani, 1995, Villalba et al. 1989). 29

36 Ergebnisse A E 280 nm 2 % B E 280 nm % B 100 B 0, , ,2 0, , , Volumen [ml] Volumen [ml] Abb. 3.3: Exemplarische Darstellung der UV-Profile aus der IRKD-Reinigung. Die kinaseaktiven Fraktionen sind durch Balken gekennzeichnet. A: Anionenaustauschchromatographie mit MonoQ. Aufgetragen wurden 10 ml (15 mg Gesamtprotein) cytosolischer Überstand. Die vereinigten, kinaseaktiven Fraktionen wurden nach einer Ammoniumsulfatfällung für die hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) eingesetzt. B: HIC mit Phenyl-Sepharose. Die kinaseaktiven Fraktionen wurden vereinigt und im Centricon 30 eingeengt. Die Elution erfolgt durch Erniedrigung der Ionenstärke des Lösungsmittels, wodurch die Proteine in der Reihenfolge ihrer steigenden Hydrophobizität die Säule verlassen. Wie aus Abbildung 3.3 B ersichtlich, eluiert die Kinase erst bei niedrigen Ionenstärke (50 mm Tris/HCl, ph 7,5) von der Säule. Die die Kinasen enthaltenen Fraktionen wurden anschließend vereinigt und in einem Centricon 30 auf eine Konzentration von 0,45-1 µg/µl eingestellt. Die Gesamtausbeute bei diesem Reinigungsschritt liegt bei ca. 70 %, die vereinigten Fraktionen enthalten die Kinase, unter Berücksichtigung der verwendeten Färbetechnik zu mehr als 95 % (Abb. 3.1). Der Reinigungsverlauf ist in Tabelle 3.1 und Abbildung 3.1 dokumentiert. Fraktion Protein [mg] Volumen [ml] Phosphateinbau [pmol/mg] spez. Akt. für Poly(Glu:Tyr) [nmol min-1 mg-1] Reinigungsfaktor Cytosolischer Überstand n.b Mono Q 1, ,5 Phenyl-Sepharose 0,4 0, ,5 Tab. 3.1: Die Daten beziehen sich auf die Reinigung der IRKD aus 10 8 Zellen. Der spezifische Phosphateinbau und die Substratphosphorylierung von Poly(Glu:Tyr) wurden unter Standardbedingungen durchgeführt (1 mg/ml Poly(Glu:Tyr), 250 µm ATP, 1 µm Poly(Lysin)) und durch die Phosphozellulose-Methode analysiert. 30

37 Ergebnisse 3.6 Konstruktion, Expression und Reinigung abgewandelter Kinasekonstrukte Konstruktion der Transfervektoren pvl-irkd-k1018a, pvl-irkd-y1316/22f, pvl-irkd-y1316/22t Der bakterielle Klonierungsvektor puc-irkd diente zur Generierung einer Vielzahl von Expressionsvektoren, die eine veränderte Basenabfolge und daraus resultierende Punktmutationen im Molekül aufweisen (Gerold 1995, Behle 1997, Koenen und Fried, persönliche Mitteilung, Nölle 1996). Bereits im Rahmen der Diplomarbeit wurde ein Transfervektor für eine lösliche Insulinrezeptor-Kinase hergestellt, in dem das Lysin 1018 gegen Alanin ersetzt wurde (Tennagels 1995). Der Austausch dieser invarianten Aminosäure verhindert die ATP-Bindung und führt zur Inaktivierung der Kinase und zu einem Verlust der biologischen Aktivität (Chou et al. 1987, Ebina et al. 1987, Mc Clain et al. 1987). Zusätzlich wurden für diese Arbeit zwei Transfervektoren konstruiert, in denen die kodierenden Sequenzen für die C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen Tyr 1316 und Tyr 1322 gegen Phenylalanin bzw. Threonin ersetzt wurden. Die Funktion dieser C-terminalen Phosphorylierungsstellen ist nicht völlig geklärt. Die Inkorporation von Phosphat in diese Domäne beträgt sowohl im humanen Insulinrezeptor (Tornqvist et al. 1987; Tavare und Denton 1988; White et al. 1988; Lee et al. 1993) als auch in der löslichen Insulinrezeptorkinase (Al-Hasani 1995) bis zu 40 % der Gesamtphosphorylierung. Der Austausch der Tyrosine Tyr 1316 und Tyr 1322 gegen Phenylalanin oder die Deletion der C-terminalen Domäne führt auf Rezeptorebene in vitro zu einer normalen Kinaseaktivität, in vivo allerdings zu verstärkten mitogenen und reduzierten metabolischen Effekten (Maegawa et al. 1988; Takata et al. 1991; Ando et al. 1992). Myers et al. (1991) konnte, unter der Verwendung anderer Zell-Linien, keinen Unterschied in der biologischen Aktivität des verkürzten bzw. mutierten Rezeptors feststellen. Die Frage welchen Einfluß der Austausch der Tyrosinphosphorylierungsstellen sowohl auf die katalytischen Eigenschaften als auch auf die Autophosphorylierung hat, sollte mit diesen Mutanten untersucht werden. Für die ortsspezifische Mutagenese wurde das Verfahren von Deng und Nickoloff (1992) angewandt. Das Prinzip basiert auf einer Polymerasereaktion mit zwei Oligonukleotid-Primern an einen Strang eines denaturierten Plasmids. Der eine Primer führt dabei die gewünschte Mutation in die klonierte cdna ein (Mutageneseprimer) und schafft gleichzeitig in einer stillen Mutation eine neue, für das Plasmid einmalige Restriktionsschnittstelle. Diese dient zur späteren Identifizierung von Klonen mit einer erfolgreichen Mutagenese, führt aber auf Proteinebene zu keiner Veränderung. Der zweite Primer verändert eine einmalig vorkommende Restriktionsschnittstelle in der Sequenz der Plasmid-DNA, so daß diese nicht mehr vom betreffenden Restriktionsenzym erkannt werden kann (Selektionsprimer). Nach der DNA-Elongation, Ligation und einer ersten Selektion mit einer Restriktionsendonuklease werden Plasmide erhalten, die in einem Strang die Mutationen aufweisen. Die Replikation in dem E.coli-Stamm BMH muts, der einen Defekt im Basenfehlpaarungs-Reparatur-Mechanismus (mismatch repair) aufweist, ergibt einen Plasmid-Pool mit mutierten und nicht mutierten Plasmiden, der einem zweiten selektiven Restriktionsverdau unterzogen wird. Mutierte Plasmide, denen die Schnittstelle für das Restriktionsenzym fehlt, bleiben zirkulär, nicht mutierte Plasmide linearisieren und werden bei der folgenden Transformation des gesamten Ansatzes in E.coli DH5α-Zellen um den Faktor 10 9 schlechter aufgenommen. Die erhaltenen Klone werden von einer Agarplatte einzeln isoliert und als 5 ml Suspensionskultur für 12 Stunden kultiviert. Der anschließenden Präparation von Plasmid-DNA folgt die Identifizierung von Klonen mit der gewünschten Mutation durch Restriktionsanalyse auf die neue, durch den Mutageneseprimer eingeführte Restriktionsschnittstelle. Die Effizienz dieses Mutagenese-Verfahrens liegt zwischen 70 und 90 %. Für die Generierung des Transfervektors pvl-irkd-k1018a wurde ein 29 Bp langer Mutationsprimer verwendet, der der cdna-sequenz des kodogenen Stranges des humanen Insulinrezeptors entspricht. Durch den Austausch der Nukleotide A (Pos. 3052) und A (Pos. 3053) gegen G und C wird eine Änderung der Aminosäuresequenz von Lysin nach Alanin erreicht. Durch einen zusätzlichen Austausch des Nukleotids C (Pos. 3060) gegen T wird zusätzlich in einer stillen Muation eine Restriktionsschnittstelle für die Restriktionsendonuklease HpaI erzeugt, die für den beschriebenen Klonierungsvektor puc-irkd einmalig ist (Tennagels 1995). 31

38 Ergebnisse Für die Generierung der Transfervektoren pvl-irkd-y1316/22f und pvl-irkd-y1316/22t wurden zwei 40 Bp lange Oligonukleotide verwendet, die der cdna Position des kodogenen Stranges des humanen Insulinrezeptors von entsprechen. Durch den Austausch eines oder mehrerer Nukleotide (Tyr 1316 Phe: A (Position 4077) T, Tyr 1322 F: A (Position 4096) T; Tyr 1316 Thr: T (Position 4076) und A (Position 4077) gegen A und C, Tyr 1322 T: (Position 4095) und A (Position 4096) gegen A und C) wird eine Änderung der Aminosäuresequenz von Tyrosin nach Phenylalanin bzw. Threonin erreicht. Ferner wird durch den Austausch des Nukleotides C (Position 4091) gegen T in einer stillen Mutation eine weitere Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease XmnI erzeugt. Für dieses Enzym sind im 4075 Bp großen Ausgangsvektor bereits zwei Schnittstellen vorhanden (Fragmentlänge nach Spaltung: 1121, 2954 Bp), die zusätzliche Schnittstelle erzeugt daher in der Restriktionsanalyse eines mutierten Plasmids ein weiteres DNA-Fragment, welches im Agarosegel eindeutigt identifiziert werden kann (Fragmentlängen nach Spaltung: 1121, 835, 2119 Bp). Nach Durchführung der Mutagenesereaktion wurde die Plasmid-DNA der erhaltenene Klone hinsichtlich ihrer neuen Restriktionsschnittstelle überprüft und die Einführung der Mutationen durch DNA-Sequenzierung nach Sanger (1977) verifiziert. Die sequenzierte DNA der Klone wurde im Fall der K1018A-Mutante mit den Restrikrionsenzymen XhoI und BstXI oder im Fall der IRKD-Y1316/22F und pvl-irkd-y1316/22t mit BstXI und PstI jeweils aus dem puc19 Vektor isoliert und in einen XhoI/BstXI bzw. BstXI/PstI linearisierten puc-irkd subkloniert. Diese Vorgehensweise ist erforderlich, da durch die Verwendung der reparaturdefekten Bakterien in dem Mutagenese-Protokoll sich die Wahrscheinlichkeit erhöht, das weitere, spontan auftretende Mutationen amplifiziert werden. Aus diesen Vektoren wurden anschließend die BamHI/PstI Fragmente, die für die IRKD-K1018A, IRKD-Y1316/22F bzw. IRKD-Y1316/22T kodieren, isoliert und in den BamHI/PstI linearisierten Transfervektor pvl1393 subkloniert Expression und Reinigung der Kinasekonstrukte IRKD-K1018A, IRKD-Y1316/22F und IRKD-Y1316/22T Die jeweiligen Transfervektoren pvl-irkd-k1018a, pvl-irkd-y1316/22f, pvl-irkd- Y1316/22T wurden zusammen mit der AcNPV-DNA in einer Kotransfektion mit Sf9-Zellen verwendet. In Analogie zur IRKD-Expression wurden rekombinante Virusklone durch Western Blotting identifiziert, der Virustiters bis zum working stock amplifiziert und anschließend die Proteinexpression für 72 Stunden durchgeführt. Für die Expression der löslichen Insulinrezeptorkinase IRKD-HIS und IRKD-Y960/1316/22F wurden working stocks verwendet, die mir freundlicherweise von Dr. Al-Hasani und Frau C. Fried zur Verfügung gestellt wurden. Die Reinigung der jeweiligen Kinasekonstrukte erfolgte in Analogie zur Reinigung der IRKD durch Anionenaustausch- (IEX) und hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC). In allen Fällen eluierten die Enzyme bei denselben Ionenstärken von den Säulen, die Reinigungseffizienz war vergleichbar. Eine Ausnahme bildete das Kinase-Konstrukt IRKD-Y1316/22T. Während die Anionenaustauschchromatographie mit derselben Güte durchgeführt werden konnte, erwies sich die nachfolgende Reinigung durch HIC als ungeeignet. Die Kinase eluierte bereits bei sehr hohen Ionenstärken von der Säule, was die Ausbeute an Protein in Puffer niedriger Ionenstärke wesentlich verminderte (Abb. 3.4 A). Um die Ausbeute zu erhöhen, wurden die Fraktionen aus der Anionenaustauschchromatographie, die die Kinase zu einem hohen Anteil enthielten, vereinigt und einer Gelfiltration zugeführt. Die Gelfiltration beruht auf der Annahme, das die Proteine eine ideale globuläre Form annehmen. Daher verteilen sie sich zwischen der Gelmatrix und dem Lösungsmittel entsprechend ihrem Stokes schen Radius. Allerdings verhielt sich das Enzym auch in diesem Reinigungsschritt auffällig. Während die nichtphosphorylierte IRKD und die IRKD-Y1316/22F von der Gelfiltrationssäule in einem distinkten Peak eluieren (Abb. 3.2), verläßt die IRKD-Y1316/22T die Säule in einem nicht aufgelösten Doppelpeak (Abb. 3.4 B). Unter der Berücksichtigung der für die Eichproteine ermittelten Verteilungskoeffizienten K av ergab sich ein apparentes Molekulargewicht, welches in einem Bereich von ca kda liegt. Dies steht im Gegensatz zu dem ermittelten apparenten Molekulargewicht für die nichtphosphorylierte IRKD oder der IRKD-Y1316/22F von 60 kda. 32

39 Ergebnisse A E 280nm 0,10 % B 100 B E 280 nm 0,020 FER ADO BSA OVA CHY RNAse 0, ,015 0, ,010 0, , , Volumen [ml] Volumen [ml] Abb. 3.4: Darstellung der UV-Profile aus der IRKD-Y1316/22T Reinigung. A: HIC mit Phenyl-Sepharose. Aufgetragen wurden 3 ml (2 mg Gesamtprotein) der vereinigten, kinaseaktiven Fraktionen, die nach Anionenaustauschchromatographie (IEX) und Ammoniumsulfatfällung erhalten wurden. Die die Kinase enthaltenden Fraktionen sind durch den Balken gekennzeichnet. B: Die die Kinase enthaltenden Fraktionen aus der IEX wurden vereinigt und eine Gelfiltration mit Superose 12 durchgeführt. Eingezeichnet sind die entsprechenden Absorptionsmaxima der Eichproteine: FER: Ferritin 440 kda, ADO: Aldolase 158 kda, BSA: Rinderserumalbumin 67 kda, OVA: Ovalbumin 43 kda, CHY: Chymotrypsin 25 kda, RNAse: Ribonuklease A 13,7 kda. Kinaseaktive Fraktionen wurden vereinigt und im Centicon 30 eingeengt. 33

40 Ergebnisse 4 Charakterisierung der gereinigten IRKD 4.1 Bestimmung des apparenten Molekulargewichtes und des Phosphorylierungsstatus des Enzyms Zur Dokumentation des Reinigungsverlaufs der IRKD und des Phosphorylierungsstatus des Enzyms wurden Aliquots der einzelnen Reinigungsschritte durch SDS-Page analysiert und anschließend die Kinase durch Western-Blot-Analyse mit einem gegen den C-Terminus des Insulinrezeptors gerichteten Antikörper und einem α-phosphotyrosin-antikörper immunologisch nachgewiesen (Abb. 4.1). Als Kontrolle dienten ein Zell-Lysat nicht infizierter Zellen und die gereinigte, unter Standardbedingungen phosphorylierte IRKD. Die IRKD zeigt in der SDS-PAGE unter reduzierenden (0,1 M DTT) als auch unter nicht reduzierenden Bedingungen (Daten nicht gezeigt) ein apparentes Molekulargewicht von 48 kda. Damit stimmen das berechnete (45,7 kda) mit dem beobachteten Molekulargewicht nahezu überein. A Mr [kda] ,7 75,2 55,3 43,6 35,2 B Mr [kda] ,7 75,2 55,3 43,6 35,2 C Mr [kda] ,7 75,2 55,3 43,6 33, Abb. 4.1: Reinigungsverlauf der IRKD. A: M: Protein-Molekulargewichtsmarker (Broad Range), 1: Cytosolischer Überstand nicht infizierter Zellen, 2: Cytosolischer Überstand infizierter Zellen (72 h p.i.), 3: IEX Fraktion, 4: Phenyl-Sepharose-Fraktion ohne Autophosphorylierungsreaktion 5: Phenyl-Sepharose-Fraktion nach Autophosphorylierungsreaktion (10 min, 1 µm IRKD, 250 µm ATP, 1 µm Poly(Lysin), 5 mm MnCl 2, 5 mm MgCl 2, 50 mm Tris/HCl, ph 7,5), 12 % SDS-PAGE, Proteinfärbung nach Blakesley und Boezi (1977). B: Western-Blot, immunologischer Nachweis durch α-gst-ct-antikörper. C: Western-Blot, immunologischer Nachweis durch α-phosphotyrosin-antikörper. 34

41 Ergebnisse Abweichende Ergebnisse werden bei der Analyse des phosphorylierten Enzym gefunden. In der SDS- PAGE erhöht sich das apparente Molekulargewicht um 5 kda, wobei bis zu drei Phosphoprotein- Banden unterschieden werden können. Die Erhöhung ist wahrscheinlich auf eine verminderte SDS- Bindung zurückzuführen. Im Western Blot mit α-phosphotyrosin-antikörper wird deutlich, daß die Verschiebung des apparenten Molekulargewichtes auf die Phosphorylierung zurückgeführt werden kann. Interessanterweise zeigt das Enzym eine starke Kreuzreaktion mit dem Antikörper im rohen Zell-Lysat infizierter Zellen. Dieses ist ein Ausdruck seiner konstitutiven Kinaseaktivität. Nach Homogenisierung und Ultrazentrifugation ist deutlich die Abnahme des Phosphorylierungsgrades zu erkennen, das gereinigte Enzym zeigt keine Kreuzreaktion mit dem Antikörper. Offensichtlich führt die Aufarbeitung zur Dephosphorylierung des Enzyms durch zelleigene Phosphatasen (Abb. 4.1 C). Eine weitere Möglichkeit zur Bestimmung des apparenten Molekulargewichtes ist die Gelfiltrationsanalyse, bei der das Molekulargewicht des entsprechenden Proteins durch den Vergleich der Retentionszeiten von Markerproteinen mit bekanntem Molekulargewicht erhalten wird. Für die Analyse wurden 10 µg Enzym auf eine FPLC-Gelfiltrationssäule (Superose 12) aufgetragen und die Elution photometrisch bei 280 nm verfolgt. Für das Molekulargewicht ergibt sich anhand des Verteilungskoeffizienten K av ein apparentes Molekulargewicht von etwa 60 kda für das nicht phosphorylierte Enzym (Abb. 4.2 A). Damit zeigt sich ein Unterschied zu dem durch SDS-PAGE ermittelten Molekulargewicht, welcher in der Tertiärstruktur des nativen Proteins begründet sein könnte. In der SDS-PAGE wird angenommen, daß die spezifische Bindung des Detergenz an die Eichproteine und an das zu analysierende Protein gleich ist. Damit wird die Eigenladung des Proteins vernachlässigbar und die Wanderungsstrecke nur noch abhängig von der Größe des Polypeptids. Ausnahmen bilden dabei Glyko- oder Phosphoproteine, die weniger SDS binden als nichtmodifizierte Proteine. Im Gegensatz dazu wird bei der Bestimmung des Molekulargewichts durch Gelfiltration die Annahme gemacht, daß die Proteine eine ideale globuläre Form einnehmen und sich entsprechend ihrem Stokes schen Radius zwischen Gelmatrix und Lösungsmittel verteilen. Eine Änderung oder Abweichung der idealen globulären Struktur kann daher zu Unterschieden bei der Molekulargewichtsbestimmung durch SDS-PAGE und Gelfiltration führen. Interessanterweise werden andere Verhältnisse gefunden, wenn das phosphorylierte Enzym für die Gelfiltration verwendet wird. Das Phosphoenzym eluiert zwischen den Eichproteinen Aldolase (158 kda) und BSA (67 kda). Gegenüber den 60 kda des nicht phosphorylierten Enzyms ergibt sich ein apparentes Mr von 100 kda. Für dieses Verhalten könnte eine Dimerisierung der phosphorylierten Kinase oder eine Konformationsänderung ursächlich sein. Dieselbe Veränderung im apparenten Molekulargewicht konnte auch dann beobachtet werden, wenn die IRKD zusammen mit der kinaseninaktiven Mutante IRKD-K1018A als Substrat in einem 1:1 Verhältnis in einer Phosphorylierungsreaktion eingesetzt und der Ansatz auf der Gelfiltrationssäule aufgetragen wurde (Abb. 4.2 B). Im Gegensatz zur Kontrollreaktion, in der für die IRKD-K1018A und der IRKD ein Molekulargewicht von 60 kda bestimmt wurde, ergab sich nach der Phosphorylierungsreaktion nur ein distinkter Peak im höheren Molekulargewichtsbereich. Diese Beobachtung führte zu einem Experiment, in dem das aktive Enzym für 10 Minuten vorphosphoryliert und nach Abstoppen der Reaktion durch 20 mm EDTA das inaktive Enzym äquimolar zugesetzt wurde. Die Analyse durch Gelfiltration in Gegenwart von EDTA im Laufpuffer zeigte hier das Auftreten eines Doppelpeaks. Demzufolge scheint die Phosphorylierung der kinaseinaktiven Mutante zu einer gleichartigen Molekulargewichtsveränderung wie bei dem aktiven Enzym zu führen. Ferner zeigt das Experiment, daß die Möglichkeit einer Dimerisierung des phosphorylierten Enzyms mit der nichtphosphorylierten IRKD-K1018A auszuschließen ist. Demnach ist die Phosphorylierung entweder Voraussetzung für eine Dimerisierung beider Moleküle oder sie induziert eine Konformationsänderung, die sowohl im aktiven als auch im inaktiven Enzym vergleichbar ist. Für eine Konformationsänderung in Folge der Phosphorylierung spricht die Beobachtung, daß nach Phosphorylierung der C-terminalen Mutante IRKD-Y1316/22F in der Gelfiltrationsanalyse keine Veränderung des apparenten Molekulargewichtes beobachtet wird (Abb. 4.2 C). Die Kinase eluiert sowohl in ihrer nicht phosphorylierten als auch in ihrer phosphorylierten Form bei einem Molekulargewicht von 60 kda von der Säule. Daher kann angenommen werden, daß die Phosphorylierung der beiden C- terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen die Ursache für das veränderte Laufverhalten der IRKD zu sein scheint. 35

42 Ergebnisse A B C 0,0100 FER ADO BSA OVA CHY RNase 0,0100 FER ADO BSA OVA CHY RNase 0,0100 FER ADO BSA OVA CHY RNase E 280nm 0,0075 0,0050 0,0025 IRKD + ATP IRKD - ATP 0, Elutionsvolumen [ml] 0,0075 0,0050 0,0025 IRKD + IRKD-K1018A IRKD + ATP + IRKD-K1018A - ATP IRKD-P + IRKD-K1018A +EDTA 0, Elutionsvolumen [ml] 0,0075 0,0050 0,0025 IRKD Y1316/22F + ATP IRKD Y1316/22F - ATP 0, Elutionsvolumen [ml] Abb. 4.2: UV-Profile nach Gelfiltration mit Superose 12. Eingezeichnet sind die Absorptionsmaxima der Eichproteine: FER: Ferritin (440 kda), ADO: Aldolase (158 kda), BSA: Rinderserumalbumin (67 kda), OVA: Ovalbumin (43 kda), CHY: Chymotrypsin (25 kda), RNAse: Ribonuklease A (13,7 kda). A: Vergleich der UV- Profile, die ohne bzw. nach Autophosphorylierungsreaktion der IRKD erhalten wurden. Eingesetzt wurden jeweils 10 µg Enzym (IRKD: nicht phosphoryliert, IRKD-P: phosphoryliert). B: Vergleich der UV-Profile von IRKD und IRKD-K1018A. Beide Proteine wurden in einem 1:1 Verhältnis eingesetzt (5 µg : 5 µg). IRKD + IRKD-K1018A -ATP: nicht phosphoryliert, IRKD + IRKD-K1018A +ATP: phosphoryliert, IRKD-P + IRKD- K1018A + EDTA: 5 µg IRKD wurden für 10 Minuten vorphosphoryliert, die Reaktion durch Zugabe von 20 mm EDTA beendet und nach Zugabe der kinaseinaktiven Variante die Gelfiltration in Anwesenheit von 50 mm EDTA durchgeführt. C: Vergleich der UV-Profile, die ohne bzw. nach Autophosphorylierungsreaktion der IRKD-Y1316/22F erhalten wurden. Eingesetzt wurden jeweils 10 µg Enzym (IRKD-Y1316/22F: nicht phosphoryliert, IRKD-Y1316/22F-P: phosphoryliert). 4.2 Bedingungen für die Autophosphorylierungsreaktion der IRKD Die lösliche Insulinrezeptorkinase ist im Gegensatz zum Insulinrezeptor ein konstitutiv aktives Enzym. Unter Berücksichtigung dieser Eigenschaft sollten in den folgenden Versuchen die Bedingungen gefunden werden, unter denen die Kinase ihre maximale Phosphotransferaseaktivität in der Autophosphorylierung erreicht. Dabei wurden der Einfluß der zweiwertigen Metallionen Mg 2+ und Mn 2+, der ATP-Konzentration, der Temperatur, des ph-wertes, die Anwesenheit des Polykation Poly(Lysin), des stark positiv geladenen Histon2B und die Konzentrationsabhängigkeit auf die Autophosphorylierung der Kinase untersucht Ionenabhängigkeit der Autophosphorylierungsreaktion Tyrosinkinasen zeigen eine Präferenz für das zweiwertige Metallkation Mangan gegenüber Magnesium (Swarup et al. 1984). Diese Beobachtung scheint sowohl auf die IRKD-HIS wie auch den Insulinrezeptor zuzutreffen, bei denen die Mangan-Abhängigkeit in der Autophosphorylierung eine Optimumskurve zeigt. Allerdings kann die maximale Phosphotransferaseaktivität des Insulinrezeptors als auch des löslichen Enzyms durch die gleichzeitige Anwesenheit von MgCl 2 gesteigert werden. Für den Insulinrezeptor wurden optimale Bedingungen bei 0,5 mm MnCl 2 und 10 mm MgCl 2 gefunden, während die IRKD-HIS ihre maximale Transferaseaktivität bei 5 mm MnCl 2 und 5 mm MgCl 2 erreicht (Schmidt 1991, Al-Hasani 1995). Zur Ermittlung des optimalen Ionenverhältnisses für die Autophosphorylierung wurde die Kinase in Anwesenheit unterschiedlichen Ionenkonzentrationen des einen Metallions bei einer konstanten Ionenkonzentration des anderen Metallions inkubiert, die Reaktion nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS- PAGE aufgetrennt. Nach Lokalisation der radioaktiv markierten Proteine durch Autoradiographie wurde der Phosphateinbau in das Enzym durch Messung der Cerenkov-Strahlung der Gelbanden ermittelt. 36

43 Ergebnisse Abbildung 4.3 zeigt die Abhängigkeit der Autophosphorylierungsreaktion von dem verwendeten Ionenverhältnis. Analog zu den in der Literatur beschriebenen Werten zeigt das Enzym maximale Aktivität, wenn Mg 2+ - und Mn 2+ -Ionen in einem Konzentrationsverhältnis von 5 mm zueinander vorliegen. Höhere Konzentrationen des jeweils anderen Kations führen zu einer Hemmung der Reaktion. 5 Phosphateinbau [mol/mol] Konzentration [mm] MgCl (bei 5 mm MnCl ) 2 2 MnCl 2 (bei 5 mm MgCl 2 ) Abb. 4.3: Abhängigkeit der Autophosphorylierungsreaktion vom eingesetzten Ionenverhältnis. Die Reaktionsansätze enthielten jeweils 5 mm des einen Metallanions und variierende Konzentrationen des anderen Metallanions, 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin) und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE wurden die IRKD-Banden durch Autoradiographie lokalisiert und die Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung bestimmt ATP-Abhängigkeit der Autophosphorylierungsreaktion Die Autophosphorylierungsreaktion der IRKD folgt formal der Gleichung: IRKD + Me 2+ ATP IRKD-P + Me 2+ ADP. Zur Ermittlung der kinetischen Konstanten für ATP wurden die Initialgeschwindigkeiten des Phosphateinbaus in Abhängigkeit der ATP-Konzentration bestimmt. Dazu wurden Autophosphorylierungen in Gegenwart von Poly(Lysin) mit variierenden ATP-Konzentrationen durchgeführt und der Phosphateinbau in das Enzym durch Cerenkov-Zählung der erhaltenen Gelbanden nach einer SDS- PAGE ermittelt (Abb. 4.4). Der apparente K m -Wert kann mit 135 ± 28 µm angegeben werden, für V max -Wert werden 230 ± 23 nmol min -1 mg -1 erhalten. Damit errechnet sich für die Kinase eine Wechselzahl von 10 min -1 (k cat ). Die erhaltenen Werte stimmen in der Größenordnung mit früher berichteten Werten für die lösliche Rezeptorkinase überein (Cobb et al. 1989, Wei et al, 1995) 37

44 Ergebnisse A B 10 2,0 Initialgeschwindigkeit [pmol/min] /V [min/pmol] 1,5 1,0 0, ATP [µm] 0,0 0,00 0,04 0,08 0,12 1/ATP [µm -1 ] Abb. 4.4: Phosphateinbau in der Autophosphorylierungsreaktion der IRKD in Abhängigkeit von der ATP-Konzentration. A: Initialgeschwindigkeiten der Phosphatinkorporation in die IRKD. Die Ansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm Poly(Lysin). Die Reaktionen wurden durch Zugabe des Enzyms gestartet und durch Zugabe von SDS-Probenpuffer nach 0,5 oder 1 Minute beendet. Nach SDS-PAGE wurde die Radioaktivität der Banden durch Messung der Cerenkov-Strahlung bestimmt. B: Lineweaver-Burk Auftragung Aktivierung der Autophosphorylierung durch Poly(Lysin) und Histon 2b Die Phosphotransferaseaktivität der löslichen Insulinrezeptorkinase und des Insulinrezeptors kann durch Polykationen, wie Poly(Lysin) oder Protamin, gesteigert werden (Rosen und Lebwohl 1988, Kohanski 1989, Li et al. 1992, Al Hasani 1995). Allerdings ist der zugrunde liegende Wirkungsmechanismus nicht geklärt. Während Rosen und Lebwohl den stimulatorischen Einfluß auf eine regulatorische Kationenbindungstelle zurückführen, wird von anderen Autoren eine Förderung der Molekülaggregation postuliert, die zu einer intermolekularen Phosphorylierung (trans-phosphorylierung) führt (Kohanski 1989, Li et al. 1992, Yan et al. 1993). Um die maximale Aktivierung der IRKD zu ermitteln, wurde die Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierung in Abhängigkeit der Poly(Lysin)-Konzentration bestimmt. Dazu wurden Autophosphorylierungsreaktionen in Anwesenheit variierender Poly(Lysin)-Konzentrationen durchgeführt (Abb. 4.5 A). Die Reaktionsansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 0,5 und 1 Minute durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE wurde die Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung in den Proteinbanden bestimmt. Abbildung 4.5 A zeigt, daß stöchiometrische Konzentrationen des Polykations zu der Kinase im Vergleich zu der nicht stimulierten Reaktion eine 11fache Beschleunigung der initialen Phosphorylierungsgeschwindigkeit des Enzyms bewirken. Allerdings hat der äquimolare Einsatz des Polykations nur einen geringen Einfluß auf den maximal erreichbaren Phosphorylierungsgrad der Kinase. Das Enzym inkorporierte ohne Poly(Lysin)-Stimulierung etwa 1,5-2 mol Phosphat pro mol Enzym, bei Stimulierung wurden spezifische Phosphateinbauraten von 4-4,5 mol/mol Enzym ermittelt (Abb. 4.3 A, B). Die Möglichkeit, die initiale Phosphorylierungsgeschwindigkeit der Autophosphorylierung durch ein positiv geladenes Molekül zu stimulieren, konnte auch für das 14 kda große Histon 2b (H2b), ein Protein aus dem Kälberthymus, demonstriert werden. In Analogie zum obigen Experiment wurden variierende Konzentrationen des H2b in der Autophosphorylierungsreaktion eingesetzt und die Initialgeschwindigkeiten bestimmt (Abb. 4.5 B). Das Experiment zeigt, das eine 4fache Steigerung der Initialgeschwindigkeit erreicht wird, wenn H2b in einem Konzentrationsbereich von 5-10 µm eingesetzt wird. Daraus resultiert ein maximaler Phosphateinbau von 3,3 mol/mol nach 20 Minuten Reaktionszeit. 38

45 Ergebnisse A Phosphateinbau [mol/mol min -1 ] Poly(Lysin) [µm] B Phosphateinbau [mol/mol] Phosphateinbau 1 min 20 min 0 0,0 0,5 1, Histon 2B [µm] Abb. 4.5: Initialgeschwindigkeit der Phosphatinkorporation der IRKD in Abhängigkeit von der Poly(Lysin)- und H2b-Konzentration. Die Reaktionen wurden durch Zugabe des Enzyms gestartet und nach 1 bzw. 1 und 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Anschließend erfolgte eine SDS-PAGE und die Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität in den Proteinbanden durch Messung der Cerenkov- Strahlung Konzentrationsabhängigkeit der Autophosphorylierung Die Abhängigkeit der Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierung von der Enzymkonzentration kann einen Hinweis auf den Aktivierungsmechanismus der monomeren löslichen Kinase liefern. Verläuft der Phosphateinbau konzentrationsunabhängig und damit linear, kann dies als eine intramolekulare Phosphorylierung der einzelnen oder als intermolekulare Phosphorylierung zwischen bereits dimerisierten Enzymmolekülen gewertet werden. Im Gegensatz dazu würde ein exponentieller Anstieg des Phosphateinbaus in Abhängigkeit der Enzymkonzentration auf einen intermolekularen Phosphorylierungsmechanismus hindeuten, d.h. erst hohe Enzymkonzentrationen führen zur Dimerisierung und damit Aktivierung des Enzyms. Dieser Umstand wird in der Literatur für die lösliche Insulinrezeptorkinase widersprüchlich diskutiert. Während Cobb et al. (1989) eine Konzentrationsabhängigkeit der Autophosphorylierung beobachteten und daher einen trans- Phosphorylierungsmechanismus postulierten, konnten andere dieses Ergebnis nicht bestätigen (Villalba et al. 1989, Kohanski 1993, Al Hasani 1995). Auch die IRKD zeigt keinen exponentiellen Anstieg der Phosphatinkoporation in Abhängigkeit der Enzymkonzentration (Abb. 4.6 A). Dazu wurde die Initialgeschwindigkeit in Abwesenheit von Poly(Lysin) mit variierenden Kinasekonzentrationen im Reaktionsansatz untersucht. Der Phosphateinbau läuft im Konzentrationsbereich von 0,25 bis 4 µm in Abwesenheit von Poly(Lysin) nahezu linear. Das Enzym inkorporierte dabei im Mittel 0,7 mol Phosphat pro mol Molekül nach einer Reaktionszeit von 1 Minute. Der lineare Verlauf deutet demnach auf eine intramolekulare Phosphorylierung. Allerdings besteht auch die Möglichkeit, daß eine Phosphorylierung zwischen bereits bestehenden Dimeren stattfinden könnte. Zur weiteren Untersuchung wurden daher Substratphosphorylierungen der aktiven Kinase IRKD-HIS und der kinaseinaktiven Mutante IRKD-K1018A in variierenden Verhältnissen analysiert (Abb. 4.6 B). Aufgrund der N-terminalen Histidin-Affinitätsmarkierung der IRKD-HIS unterscheiden sich die beiden Moleküle in der denaturierenden SDS-PAGE in ihren Molekulargewichten um etwa 5 kda. Durch diese strukturelle Eigenschaft ist es möglich, beide in einer Phosphorylierungsreaktion zu kombinieren, sie durch Elektrophorese voneinander zu trennen und separat zu analysieren. Für die folgende Untersuchung wurden die beiden Proteine im Verhältnis 9:1, 1:1 und 1:9 in einer Autophosphorylierung in Abwesenheit von Poly(Lysin) eingesetzt und anschließend der Phosphateinbau in dem jeweiligen Molekül nach der SDS-PAGE analysiert (Abb. 4.6 B). Die Summe der Phosphat- 39

46 Ergebnisse inkorporation in beide Moleküle, IRKD-HIS und IRKD-K1018A, ist gemessen an den Kontrollreaktionen ohne Substrat nahezu identisch. Dabei ergibt sich, daß die Verteilung der Phosphate in den einzelnen Molekülen bei den Konzentrationsverhältnissen 1:9 und 5:5 in etwa korreliert, was indirekt auf einen stöchiometrischen Komplex zwischen inaktiven und aktiven Molekül hindeuten könnte. Im 9:1 Ansatz werden etwa 10% der Phosphate in dem inaktiven Molekül wiedergefunden, im 1:1 Verhältnis ergeben sich 32 %. Wird die kinaseinaktive Variante dagegen im Überschuß angeboten, so entspricht der Einbau von 34% nicht dem gegebenen Verhältnis von 1:9. Allerdings ist auch hier die Gesamtphosphatinkorporation verglichen mit der Kontrollreaktion nahezu identisch. A Phosphateinbau [pmol/min] B Phosphateinbau [pmol/min] IRKD-HIS IRKD-K1018A 39,2% 32,1% 11,8% IRKD [µm] 0 1: 0 1 : 9 5 : 0 5 : 5 9 : 0 9 : 1 IRKD-HIS : IRKD-K1018A [pmol : pmol] Abb. 4.6: A: Konzentrationsabhängigkeit der Initialgeschwindigkeit der IRKD-Autophosphorylierung. Die Reaktionsansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 mg/ml BSA als Stützprotein. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 1 Minute durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE wurde die Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung bestimmt. B: Untersuchung der Initialgeschwindigkeit der Auto- und Substratphosphorylierung bei variierenden Konzentrationsverhältnissen von IRKD und IRKD-K1018A. IRKD und IRKD-K1018A wurden in den Konzentrationsverhältnissen 1:9, 5:5 und 9:1 pmol phosphoryliert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der aktiven Kinase gestartet und nach 0,5 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennung der Proteinen durch SDS-PAGE und Lokalisation der Proteinbanden durch Autoradiographie wurde die Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung bestimmt. 40

47 Ergebnisse ph- und Temperaturoptimum der Autophosphorylierung Um das ph- und Temperatur-Optimum der Autophosphorylierung zu ermitteln, wurden Autophosphorylierungen bei unterschiedlichen ph-werten und Temperaturen durchgeführt. Die Ansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP und jeweils 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und die Reaktion nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE und Lokalisation der IRKD-Banden durch Autoradiographie wurde der Phosphateinbau in die Kinase bestimmt. Für das Temperatur-Optimum wurde ein Wert von 20 C ermittelt (Abb. 4.7 A), der maximale Phosphateinbau bei unterschiedlichen ph-werten wurde bei ph 7,5-8 erreicht (Abb. 4.7 B). A 5 B 5 Phosphateinbau [mol/ mol] Phosphateinbau [mol/ mol] Temperatur [ C] ph Abb. 4.7: Abhängigkeit der maximalen Phosphatinkorporation der IRKD von der Temperatur (A) und dem ph Wert (B). A: Für die Untersuchung der Temperaturabhängigkeit wurden die Ansätze vor der Reaktion für 15 min bei der jeweiligen Temperatur inkubiert und durch Zugabe der Kinase gestartet. Nach 20 Minuten wurden Aliquots entnommen, die Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und durch SDS- PAGE aufgetrennt. B: Zur Bestimmung des ph-optimums der Reaktion wurden die Reaktionen bei unterschiedlichen ph-werten in einem Drei-Komponenten-Puffersystem für 20 Minuten durchgeführt. Nach Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer und SDS-PAGE wurde die Radioaktivität der Protein-Banden durch Messung der Cerenkov-Strahlung ermittelt. 41

48 Ergebnisse 5 Die Duale Aktivität der Insulinrezeptorkinase Sowohl für den Insulinrezeptor (IR) als auch die lösliche Insulinrezeptorkinase IRKD-HIS wurde in vitro neben der Tyrosin- eine Serinkinaseaktivität beschrieben (Lewis et al. 1990, Baltensperger et al. 1992, Heidenreich 1995, Al-Hasani 1995, Tauer et al. 1997), die die folgenden Eigenschaften aufweist: Das Ausmaß der Serinphosphorylierung beträgt ca. 25 % der insgesamt inkorporierten Radioaktivität nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten. Die Stöchiometrie der Serinphosphorylierung ist unabhängig vom Reinheitsgrad der IR-Präparation. Die Serinphosphorylierung ist ebenso wie die Tyrosinphosphorylierung abhängig von einer Insulinstimulation. Die Serinphosphorylierung und Tyrosinphosphorylierung der löslichen Kinase werden gleichermaßen durch Polykationen wie Poly(Lysin) stimuliert. Die Serinphosphorylierung ist sowohl beim IR als auch der löslichen Kinase zeitlich der Tyrosinphosphorylierung nachgeschaltet. Die Serinphosphorylierung ist abhängig von der Kinaseaktivität des IR. Diese Eigenschaften deuten entweder auf eine den Kinasen assoziierte Serinkinase, wie es von anderen Gruppen postuliert wird (Zick et al. 1983, Ballotti et al. 1986, Smith et al. 1988, Biener und Zick, 1990, Tavare und Dickens 1991, Pillay und Siddle 1991, Asamoah et al. 1995) oder auf eine der Insulinrezeptorkinase immanente Eigenschaft. Letzterer Befund wird durch die Identifizierung zweier Serinautophosphorylierungsstellen im C-Terminus der Kinase hinreichend unterstützt (Al-Hasani et al. 1997). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Serinkinaseaktivität der löslichen Insulinrezeptorkinase IRKD und abgewandelter Formen dieses Enzyms untersucht, um einen Einblick in den Katalysemechanismus einer Kinase mit dualer Spezifität zu erhalten. 5.1 Methoden zum Nachweis von Phosphoaminosäuren Zur Markierung von Phosphoaminosäuren in Enzymen oder in deren Substraten wird im allgemeinen [γ 32 ]-ATP verwendet. Nach Abschluß der Reaktion wird der überschüssige radioaktive Marker durch SDS-PAGE oder Gelfiltration entfernt und danach eine Partialhydrolyse aufgrund der Säurestabilität der O-Phosphoesterbindung unter sauren Bedingungen durchgeführt (Ringer 1991). Der Nachweis und die Quantifizierung der radioaktiv markierten Verbindungen kann entweder dünnschichtchromatographisch oder elektrophoretisch erfolgen, wobei es, abhängig von der angewandten Methode, zu quantitativen Abweichungen bis zu 5 % kommen kann. In der Dünnschichtchromatographie besitzt Phosphotyrosin die größte Mobilität. Die Phosphoaminosäuren Phosphoserin und Phosphothreonin können dagegen aufgrund gleicher Retardartionsfaktoren (Rf-Wert) nicht getrennt werden (Munoz und Marshall 1990). Allerdings kann die Quantifizierung der radioaktiven Signale im Bereich der Phosphoaminosäuren durch eine relativ starke Hintergrundstrahlung beeinträchtigt werden, welche durch die Migaration nicht hydrolysierter Peptide mit der Lösungsmittelfront bedingt ist. Eine genauere Quantifizierung erlauben die elektrophoretischen Methoden (Ein- und zweidimensionale Elektrophorese), in denen die Auftrennung der Phosphoaminosäuren aufgrund der unterschiedlichen Ladungen erfolgt. Anorganisches Phosphat zeigt die höchste Mobilität, gefolgt von Phosphoserin, Phosphothreonin und Phosphotyrosin (Boyle et al. 1991). Die Identifizierung der radioaktiv markierten Phosphoaminosäuren erfolgt nach Auftrennung über den Vergleich der relativen Mobilitäten mit ninhydringefärbten Phosphoaminosäurestandards. Mit den hier angewandten Phosphoaminosäureanalysen kann aber nur eine apparente Zusammensetzung ermittelt werden. Eine absolute Quantifizierung des Phosphoaminosäure-Gehalts ist nicht möglich, da das Protein unter den Bedingungen der sauren Hydrolyse (6 N HCl, 110 C, 1,5 h) nur zu etwa 25 % in Aminosäuren gespalten wird. Eine Erhöhung der Ausbeute durch eine längere Hydrolysezeit ist nicht möglich, da die Phosphatester-Bindungen von Phosphotyrosin und Phosphoserin unterschiedliche Stabilitäten besitzen (Duclos et al. 1991). Eine längere Hydrolysezeit würde die Ausbeute von Phosphotyrosin und anorganischem Phosphat gegenüber Phosphoserin selektiv begünstigen. 42

49 Ergebnisse 5.2 Die Duale Aktivität der Insulinrezeptorkinase in der Autophosphorylierung Die Serinphosphorylierung ist abhängig von der Kinaseaktivität. Die gleichzeitige Anwesenheit von Inhibitoren wie AMP-PNP, EDTA oder Staurosporin in der Autophosphorylierungsreaktion des Insulinrezeptors oder der löslichen Kinase IRKD-HIS führen in gleichem Maße sowohl zur Inhibition der Tyrosin- als auch der Serinphosphorylierung (Heidenreich 1995, Al-Hasani 1995). Zur Bestätigung der Abhängigkeit der Serinphosphorylierung von der Kinaseaktivität wurde die Kinasevariante IRKD-K1018A konstruiert, in welcher die Aminosäure Lysin 1018 durch Alanin substituiert ist. Der Austausch dieser invarianten Aminosäure im Glycin-reichen Loop (s. Einleitung) verhindert beim Insulinrezeptor die ATP-Bindung und führt zur Inaktivierung der Kinase und somit zu einem Verlust der biologischen Aktivität (Chou et al. 1987, Ebina et al. 1987, Mc Clain et al. 1987). Die IRKD- K1018A kann mittels Anionenaustausch- und hydrophober Interaktionschromatographie mit denselben Reinigungskenndaten wie die aktive IRKD oder die IRKD-HIS zur Homogenität gereinigt werden (s. Kap 3.5, Abb. 3.3). Im folgenden Versuch wurden jeweils 1 µm IRKD, IRKD-HIS und IRKD-K1018A für 30 Minuten in Anwesenheit von 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin), 5 mm MnCl 2, 5 mm MgCl 2, 50 mm Tris/HCl, ph 7,5 inkubiert und die Reaktionen durch Zugabe von SDS- Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE wurden die Proteine durch Färbung des Geles und Autoradiographie lokalisiert. A kda B M IRKD-HIS IRKD Abb. 5.1: Autophosphorylierung der löslichen Insulinrezeptorkinasen und Phosphoaminosäureanalyse der aktiven Enzyme. Mit den gereinigten Kinasen wurden für 30 Minuten Autophosphorylierungsreaktionen durchgeführt, die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und durch Autoradiographie lokalisiert. Von den aktiven Kinasen wurde zudem die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung analysiert. A: links: Coomassie gefärbtes Proteingel der gereinigten Kinasen (aufgetragen sind jeweils 1 µg Protein) rechts: Autoradiographie nach 30minütiger Autophosphorylierungsreaktion. 1, 4: IRKD-HIS, 2, 5: IRKD-K1018A, 3, 6: IRKD B: Zweidimensionale Phosphoaminosäureanalyse der aktiven Kinasen. 43

50 Ergebnisse Im Gegensatz zu den aktiven Kinasekonstrukten zeigt das kinaseinaktive Enzym nach der Autophosphorylierungsreaktion keine Phosphatinkorporation (Abb. 5.1 B). ATP-Konzentration in einem Konzentrationsbereich von 250 µm bis 2,5 mm führten ebenfalls zu keiner Phosphorylierung (Daten nicht gezeigt). Dies zeigt zum einen, daß der Austausch der Aminosäure Lysin gegen Alanin tatsächlich eine Inaktivierung des Enzym bewirkt, die auch nicht durch höhere ATP Konzentrationen aufgehoben werden kann. Andererseits belegt dieses die Abwesenheit einer exogenen Serin- oder Tyrosin- Kinaseaktivität in der gereinigten Enzymfraktion. Im Rahmen einer Diplomarbeit wurde zusätzlich die kinaseinaktive Variante IRKD-D1120A konstruiert (Keßler 1998). In diesem Protein wurde die katalytische Base Aspartat 1120 gegen Alanin substituiert. Die Mutation erlaubt noch die Bindung von ATP, unterbindet aber die Fähigkeit zur Hydrolyse der γ-phosphoesterbindung des Moleküls. Das Protein konnte mit derselben Effizienz wie die aktive IRKD gereinigt werden, zeigte aber ebenfalls keinerlei Phosphatinkorporation in der Autophosphorylierungsreaktion. Die aktiven löslichen Rezeptorkinasen inkorporierten im Mittel 4-5 mol Phosphat pro mol Kinase. Die in den Gelbanden enthaltenen Proteine wurden im Anschluß durch tryptischen Verdau eluiert. Nach saurer Hydrolyse wurde eine zweidimensionale Gelelektrophorese durchgeführt und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung quantifiziert (Abb. 5.1 B). In beiden aktiven Enzymen wird ein Phosphoserinanteil von % gefunden, zusätzlich wurde in der IRKD-HIS ein 3 %iger Phosphothreoninanteil erhalten, welcher aus der Phosphorylierung eines Threoninrestes aus dem Histidin- Fusionsproteinanteil resultiert (Al-Hasani 1995). Im folgenden wurde die Fähigkeit zur Serinphosphorylierung in den Kinasen IRKD-Y1316/22F, IRKD-Y1316/22T und IRKD-Y960F-Y1316/22F unter vergleichbaren Bedingungen untersucht. Dazu wurden Autophosphorylierungsreaktionen für 30 Minuten durchgeführt. Die Reaktionsansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin), 5 mm MnCl 2, 5 mm MgCl 2, 50 mm Tris/HCl, ph 7,5 und 1 µm Kinase. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der jeweiligen Kinase gestartet, nach 30 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Lokalisation der Kinasen durch Autoradiographie und Bestimmung des Phosphateinbaus durch Messung der Radioaktivität im β-counter wurden die erhaltenen Gelbanden durch tryptischen Verdau eluiert und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. Der Austausch der beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Phenylalanin bewirkt im Vergleich zur IRKD eine Veränderung der elektrophoretischen Mobilität des Moleküls. Während die IRKD nach Phosphorylierung als Doppelbande im SDS-Gel detektiert werden kann, zeigt die Kinasevariante nur eine Bande mit einem geringeren apparenten Molekulargewicht (Abb. 5.2 A). Ein vergleichbares Laufverhalten wird auch für die beiden anderen Kinasevarianten IRKD-Y1316/22T und IRKD- Y960F-Y1316/22F beobachtet (Daten nicht gezeigt). Die veränderte elektrophoretische Mobilität von Phosphoproteinen geht wahrscheinlich auf eine erniedrigte spezifische SDS-Bindung der Proteine zurück. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten beträgt die spezifisch inkorporierte Radioaktivität in die IRKD-Y1316/22F 3 mol/mol (Abb. 5.5 C). Dabei führt der Austausch der beiden C-terminalen Tyrosinreste zu keinem Verlust der Serinphosphorylierung. Mit einem Anteil von 38 % an der Gesamtphosphorylierung wird eine spezifische Phosphatinkorporation von 1 mol/mol in Serinreste erreicht (Abb. 5.2 B; Abb. 5.5 C), Threoninphosphorylierung wird nicht detektiert. Die zusätzliche Substitution der Tyrosinphosphorylierungsstelle Tyr 960 gegen Phenylalanin führt in der IRKD- Y960/ F zu einer weiteren Verminderung der spezifischen Phosphatinkorporation, im Mittel werden 2 mol/mol erhalten (Abb. 5.5 E). Der Serinphosphatanteil in diesem Molekül kann mit 42 % angegeben werden ( 0,8 mol/mol, Abb. 5.2 C; Abb. 5.5 D), Phosphothreonin wird nicht detektiert. Der Austausch der beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Threonin resultiert in einer drastischen Änderung der maximalen Phosphatinkorporation, er beträgt nach 30minütiger Reaktionszeit 1,2 mol/mol (Abb. 5.5 E; Abb. 5.5 F). Dabei ist bemerkenswert, daß in dieser Mutante keine Serinphosphorylierung detektiert werden kann. Auch die Substitution der beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Threonin führt nicht zur Phosphorylierung dieser aliphatischen Aminosäurereste (Abb. 5.2 D). 44

51 Ergebnisse A B B ps py 1 2 C D IRKD-Y1316/22F ps py py IRKD-Y960/1316/22F IRKD-Y1316/22T Abb. 5.2: Die Serinphosphorylierung der IRKD-Y1316/22F IRKD-Y1316/22T und IRKD-Y960F- Y1316/22F. Nach 30minütiger Autophosphorylierungsreaktion (1 µm Enzym, 250 µm [γ-32p]atp, 5 mm MnCl 2, 5 mm MgCl 2, 50 mm Tris/HCl, ph 7,5) wurden die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt und die erhaltenen Proteinbanden tryptisch eluiert. Nach Partialhydrolyse erfolgte die Auftrennung der Phosphoaminosäuren durch zweidimensionale Elektrophorsese und Quantifizierung durch den Phosphoimager. py: Phosphotyrosin, ps: Phosphoserin, pt: Phosphothreonin A: Vergleich der elektrophoretischen Mobilität der IRKD (Bahn 1) und der IRKD-Y1316/22F (Bahn 2) in der SDS-PAGE nach 30minütiger Autophosphorylierungsreaktion. Autoradiographie nach SDS-PAGE. B: Phosphoaminosäureanalyse der IRKD-Y1316/22F, C: der IRKD-Y960F-Y1316/22F und D: der IRKD-Y1316/22T. B, C, D: Autoradiographie nach zweidimensionaler Elektrophorese Abhängigkeit der IRKD-Serinphosphorylierung von den Reaktionsbedingungen In den folgenden Experimenten sollte überprüft werden, ob die Serin- und Tyrosinkinaseaktivität der IRKD durch die Reaktionsbedingungen beeinflußt werden kann. Dazu wurden jeweils Autophosphorylierungsreaktionen mit variierenden ATP- und Poly(Lysin)-Konzentrationen, variierender Temperatur und ph-wert für 20 Minuten durchgeführt. Zusätzlich wurde die Kinetik der Reaktion in Anwesenheit von 10 mm MnCl 2 bzw. MgCl 2 analysiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen. Nach dem Beenden der Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer und Auftrennung der Proteine in einer SDS-PAGE, wurde der Phosphateinbau in die Proteine durch Messung der Cerenkov-Strahlung ermittelt und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, daß in allen Fällen die Fähigkeit zur Serinphosphorylierung direkt an die Kinaseaktivität des Enzyms gekoppelt ist. Maximaler Phosphateinbau resultiert auch in der maximalen Inkorporation von Phosphaten in Serinreste. Dabei bleibt im Fall variierender ATP-Konzentrationen und Temperatur das Verhältnis von Phosphotyrosin zu Phosphoserin konstant, in jedem Fall werden etwa 20 % Phosphoserin detektiert (Abb. 5.3 A,B). Bei variierenden ph-werten zeigt das Enzym maximale Phosphatinkorporation bei ph 7,5-8. Unter diesen Bedingungen ist auch die Serinphosphorylierung maximal und erreicht einen prozentualen Anteil von 18 % an der maximalen Phosphatinkorporation. Bei niedrigen ph-werten werden dagegen bevorzugt die Tyrosinreste phosphoryliert (Abb. 5.3 C). 45

52 Ergebnisse A Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser C ATP-Konzentration [µm] B Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser D Temperatur [ C] Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser ph Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser Poly(Lysin) [µm] Abb. 5.3: Abhängigkeit der IRKD-Serinphosphorylierung von den Reaktionsbedingungen. Die Reaktionen wurden unter den jeweiligen Bedingungen für 20 Minuten durchgeführt. Die Enzymkonzentration betrug jeweils 1 µm. Nach dem Beenden der Reaktionen mittels SDS-Probenpuffer und Auftrennung der Proteinen durch SDS- PAGE wurde der Phosphateinbau in die IRKD durch Messung der Cerenkov-Strahlung ermittelt. Im Anschluß erfolgte eine tryptische Elution der Gelbanden und die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung. A: ATP-Abhängigkeit: Die Ansätze enthielten variierende ATP-Konzentrationen, 1 µm Poly(Lysin), 5 mm MgCl 2, 5 mm MnCl 2 und 50 mm Tris/HCl ph 7,5. B: Temperaturabhängigkeit: Die Ansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, 5 mm MgCl 2, 5 mm MnCl 2 und 50 mm Tris/HCl ph 7,5. Die Reaktion wurde nach vorheriger Inkubation der Reaktionsansätze für 15 Minuten bei der jeweiligen Temperatur durch Zugabe der Kinase gestartet. C: ph-abhängigkeit: Die Reaktionsansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin), 5 mm MgCl 2, MgCl 2 und ein Drei-Komponenten-Puffersystem (0,1 M Kac, 0,05 M Tris, 0,05 M BisTris). Mit dem Puffersystem kann unter vergleichbaren Bedingungen ein ph-bereich von 6,4-7,9 abgedeckt werden. D: Poly(Lysin)-Abhängigkeit: Die Reaktionsansätzen enthielten variierende Poly(Lysin)-Konzentrationen, 250 [γ-32p]atp, 5 mm MgCl 2, MgCl 2, Tris/HCl ph 7,5. Ein Unterschied im Verhältnis von Phosphoserin und Phosphotyrosin wird auch in Abhängigkeit von der Poly(Lysin)-Konzentration beobachtet (Abb. 5.3 D). Der Versuch zeigt, daß unter nahezu äquimolaren Konzentrationsverhältnissen (IRKD zu Poly(Lysin)) der Phosphorylierungsgrad der Kinase maximal ist. Die Anwesenheit von 1 µm Poly(Lysin) führt zu einer Verdopplung der inkorporierten Radioaktivität. Der Anteil an phosphorylierten Serinresten beträgt ca. 22 %. Dagegen wird in der 46

53 Ergebnisse nicht stimulierten Kinase keine signifikante Serinphosphorylierung beobachtet, höhere Poly(Lysin)- Konzentrationen wirken sich ebenfalls nachteilig auf die Serinphosphorylierung aus. Eine Besonderheit zeigten die Untersuchungen zur Abhängigkeit der Serinphosphorylierung von der verwendeten Ionensorte (Abb. 5.4) In Anwesenheit von 5 mm MgCl 2 und MnCl 2 ist die Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierung maximal. Die Verwendung von 10 mm MgCl 2 oder MnCl 2 führt zu einer Reduktion um 15 bzw. 20 %. Nach 20 Minuten Reaktionszeit werden in Gegenwart beider Metallkationen 4,5 mol Phosphat pro mol IRKD inkorporiert, die maximalen Einbauraten unter Verwendung von nur MgCl 2 oder MnCl 2 betragen 4,2 bzw. 3,7 mol/mol. Im Gegensatz dazu ist die Initialgeschwindigkeit und die maximale Einbaurate der Serinphosphorylierung bei Verwendung von 10 mm MgCl 2 stark erhöht. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten erreicht sie einen Anteil von nahezu 50 % der Gesamtphosphorylierung. Die Verwendung von MnCl 2 resultiert nach 20 Minuten Reaktionszeit in einer Phosphatinkorporation von 3,7 mol pro mol Kinase. Der prozentuale Serinphosphatanteil beträgt 22 % der Gesamtphosphatinkorporation und ist damit dem der Reaktion, bei welcher beide Metallkationen eingesetzt wurden, vergleichbar. 5 4 Phosphateinbau [mol/mol] mm MgCl 2, 5 mm MnCl 2 Gesamteinbau 10 mm MgCl 2 Gesamteinbau 10 mm MnCl 2 Gesamteinbau P-Ser P-Ser 1 P-Ser Zeit [min] Abb. 5.4: Zeitabhängigkeit der Serinphosphorylierung von den eingesetzten Metallionen. Die Ansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin), 10 mm MgCl 2 bzw. 10 mm MnCl 2 oder 5 mm MgCl 2 und 5 mm MnCl 2. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 µm Kinase gestartet und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen. Nach Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer und SDS- PAGE wurde die inkorporierte Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung ermittelt, anschließend eine tryptische Elution der Gelbanden durchgeführt und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung analysiert. 47

54 Ergebnisse 5.3 Zeitverlauf der Autophosphorylierung Um den Zeitverlauf der Autophosphorylierung näher zu charakterisieren, wurden Autophosphorylierungsreaktionen mit der IRKD und den Kinasevarianten IRKD-Y1316/22F, IRKD-Y1316/22T und IRKD-Y960/1316/22F untersucht. Dabei wurde auch der Einfluß der Poly(Lysin)-Stimulierung analysiert. Die Reaktionen erfolgten jeweils bei einer Reaktionstemperatur von 25 C und einem ph-wert von 7,5 in 50 mm Tris/HCl mit 5mM MnCl 2, 5 mm MgCl 2 in An- oder Abwesenheit von 1 µm Poly(Lysin). Die [γ- 32 ]ATP-Konzentrationen betrugen 250 µm, die Kinasekonzentration 1 µm. Nach dem Start der Reaktion durch Zugabe des jeweiligen Enzyms wurde zu verschiedenen Zeitpunkten ein Aliquot entnommen, die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS-PAGE getrennt. Die Kinasebanden wurden durch Autoradiographie in den getrockneten Gelen identifiziert, ausgeschnitten und die inkorporierte Radioaktivität durch Messung der Cerenkov- Zählung im β-counter quantifiziert. Im Anschluß erfolgte eine tryptische Elution der Gelbanden, die partielle Hydrolyse der erhaltenen Peptide und eine dünnschichtchromatographische Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung. Der Phosphateinbau in die IRKD gleicht einer Sättigungskurve (Abb. 5.5 A). Der maximale Phosphateinbau der Poly(Lysin)-aktivierten Kinase beträgt nach 30 min 4,4 ± 0,2 mol/mol, die Halbwertszeit der Reaktion liegt bei 25 Sekunden. Die aus dem linearen Bereich der Kurve ermittelte Initialgeschwindigkeit ergibt 161 nmol min -1 mg - 1. Ohne Poly(Lysin)-Stimulation ist die Sättigung des Phosphateinbaus nach 30 Minuten noch nicht erreicht, die Halbwertszeit der Reaktion muß daher mit > 5 Minuten angegeben werden. Der nach dieser Zeit ermittelte Phosphateinbau beträgt 2,1 mol/mol, die Initialgeschwindigkeit 26 nmol min -1 mg -1 (Abb. 5.5 B). Nach Austausch der beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Phenylalanin ergibt sich für die IRKD-Y1316/22F ein maximaler Phosphateinbau von 2,95 ± 0,1 mol/mol (Abb. 5.5 C). Die Halbwertszeit der Reaktion liegt bei 5 Minuten, die Initialgeschwindigkeit kann mit 88 nmol min -1 mg -1 angegeben werden. Unterbleibt die Stimulation durch Poly(Lysin), erreicht das Enzym nach 30 Minuten einen spezifischen Phosphateinbau von 0,89 mol/mol. Die Halbwertszeit der Reaktion beträgt etwa 1 Minute, die Initialgeschwindigkeit 13,3 nmol min -1 mg -1 (Abb. 5.5 D). Das Enzym IRKD-Y960F-Y1316/22F, welches die drei Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne enthält, zeigt in der Anwesenheit von Poly(Lysin) einen maximalen Phosphateinbau von 2 mol/mol. Die Halbwertszeit der Reaktion beträgt etwa 15 Sekunden, die Initialgeschwindigkeit ist mit 87 nmol min -1 mg -1 der der Kinase IRKD- Y1316/22F vergleichbar (Abb. 5.5 E). Die Kinase IRKD-Y1316/22T inkorporiert nach 20 Minuten Reaktionszeit 1,2 ± 0,2 mol Phosphat pro mol Enzym. Die Halbwertszeit der Poly(Lysin) stimulierten Reaktion beträgt etwa 15 Sekunden, die Initialgeschwindigkeit 41,3 nmol min -1 mg -1. Ohne Poly(Lysin)-Stimulation ergibt sich eine maximale Phosphatinkorporation von 0,3 mol/mol und eine Halbwertszeit von 30 Sekunden. Die Initialgeschwindigkeit beträgt etwa 5,8 nmol min -1 mg -1 (Abb F). Im Gegensatz zu den Unterschieden für die kinetischen Konstanten der Gesamtphosphorylierung, ergeben sich für die Serinphosphorylierung der Kinasen IRKD, IRKD-Y1316/22F und IRKD- Y960/1316/22F nahezu identische kinetische Daten. In allen Fällen wird in Anwesenheit des Polykations Poly(Lysin) die Serinphosphorylierung der Enzyme durch eine Sättigungskurve beschrieben, die in der initialen Phase der Reaktion der Tyrosinphosphorylierung zeitlich nachzufolgen scheint. Die Halbwertszeiten der Serinphosphorylierung betragen ca. 5-7,5 Minuten. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten werden an der Gesamtphosphorylierung gemessen, 28 % Phosphoserin in der IRKD, 38 % in der IRKD-Y1316/22F und 42 % in der IRKD-Y960/1316/22F detektiert. Aus diesen relativen Anteilen ergeben sich damit spezifische Phosphateinbauraten von 1,2 mol/mol für die IRKD, 1,1 mol/mol für die IRKD-Y1316/22F und 0,85 mol/mol für die IRKD-Y960/1316/22F. Aus dem linearen Anteil der Kurven können die Initialgeschwindigkeiten der Serinphosphorylierung für die IRKD mit 3,2 nmol min -1 mg -1, für die IRKD-Y1316/22F mit 3,5 nmol min -1 mg -1 und für die IRKD-Y960/1316/22F mit 2,7 nmol min -1 mg -1 angegeben werden. Unter Berücksichtigung der geringen Signalstärke und dem damit verbundenen relativ großen Fehler in der Quantifizierung des Phosphoserinsignals in der chromatographischen Analyse sind sie damit nahezu vergleichbar. 48

55 Ergebnisse A 5 IRKD + Poly(Lysin) B 5 IRKD - Poly(Lysin) Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Tyr P-Ser Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser C Zeit [min] D Zeit [min] 5 IRKD-Y1316/22F + Poly(Lysin) 5 IRKD-Y1316/22F - Poly(Lysin) Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Tyr P-Ser E Zeit [min] Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser F Zeit [min] IRKD-Y960/1316/22F + Poly(Lysin) 5 5 IRKD-Y1316/22T +/- Poly(Lysin) Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Tyr P-Ser Phosphateinbau [mol/mol] + Poly(Lysin) - Poly(Lysin) Zeit [min] Zeit [min] Abb. 5.5: Zeitverlauf der Autophosphorylierung der löslichen Rezeptorkinasen. Die Autophosphorylierungen wurden in An- oder Abwesenheit von 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP durchgeführt. Zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennen der Proteine durch SDS-PAGE wurde der Phosphateinbau in die Enzyme bestimmt und eine Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung durchgeführt. A: IRKD + Poly(Lysin). B: IRKD - Poly(Lysin). C: IRKD-Y1316/22F + Poly(Lysin). D: IRKD-Y1316/22F - Poly(Lysin). E: IRKD-Y960/1316/22F + Poly(Lysin). E: IRKD-Y1316/22T +/- Poly(Lysin). 49

56 Ergebnisse Im Vergleich zu den Poly(Lysin) stimulierten Reaktionen ist die Serinphosphorylierung in Abwesenheit des Polykations in allen Enzymen deutlich reduziert. In der initialen Phase der Reaktion liegt der prozentuale Anteil der Serinphospholierung bei in allen Kinasen bei 2-4 % der Gesamtphosphorylierung, für die letzten Zeitwerte konnte ein relativer Anteil von 5-7 % gemessen werden. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Enzymen kann in der IRKD-Y1316/22T weder in An- oder Abwesenheit von Poly(Lysin) Phosphatinkorporation in Serinreste oder Threoninreste detektiert werden. Tabelle 5.1 faßt noch einmal die ermittelten Initialgeschwindigkeiten der Autophosphorylierungsreaktion der Kinasen zusammen. Aus dem Vergleich der einzelnen Geschwindigkeiten ergibt sich, daß Poly(Lysin) die Tyrosin- und Serinphosphorylierung der einzelnen Enzyme in etwa um denselben Faktor beeinflußt. Dieses spricht zum einen für eine gleichartige Wirkung des Polykations auf die einzelnen Enzyme, zum anderen zeigt dieser identische Effekt, daß die beobachtete Serinphosphorylierung auf eine intrinsische Eigenschaft der Kinasen zurückgeführt werden kann. Enzym Reaktion Geschwindigkeit mit Poly(Lysin) [nmol min -1 mg -1 ] Geschwindigkeit ohne Poly(Lysin) [nmol min -1 mg -1 ] Aktivierungs- Faktor Gesamt ,2 IRKD Tyrosinphosphorylierung 157,8 25,6 6,2 Serinphosphorylierung 3,2 0,44 7,2 Gesamt ,8 IRKD-Y1316/22F Tyrosinphosphorylierung 84,5 12,5 6,76 Serinphosphorylierung 3,5 0,47 7,4 Gesamt 87 n.b. - IRKD-Y960/1316/22F Tyrosinphosphorylierung 84,3 n.b. - Serinphosphorylierung 2,7 n.b. - Gesamt ,8 IRKD-Y1316/22T Tyrosinphosphorylierung ,8 Serinphosphorylierung Tab 5.1: Einfluß von Poly(Lysin) auf die Initialgeschwindigkeiten der Tyrosin- und Serinphosphorylierung. Die Initialgeschwindigkeiten der jeweiligen Reaktionen wurden aus den linearen Anteilen der Graphen aus Abb. 5.5 und Anhang III.2 Tab III 4-7 bestimmt. 5.4 Identifizierung der Autophosphorylierungsstellen der Insulinrezeptorkinase Die Methode der Phosphopeptidkartierung Die Methode der Phosphopeptidkartierung wurde von Al-Hasani (1995) für die lösliche Insulinrezeptorkinase IRKD-HIS entwickelt. Die Autophosphorylierung dieser Kinase, die über eine N- terminale Histidin-Affinitätsmarkierung verfügt, führt zur Besetzung von Tyrosin- Serin- und zu einem geringen Anteil an Threoninresten (Abb. 5.1 B). Eine vollständige tryptische Spaltung des autophosphorylierten Enzyms liefert theoretisch 48 Peptide, von denen 29 potentielle Phosphorylierungsstellen an Tyrosin, Serin und Threonin beinhalten. Die Auftrennung des Phosphopeptid- Gemisches durch HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie (SAX1000-8/46) mit einem zweistufigen Salzgradient führt zur Separation von 14, Radioaktivität enthaltenden Fraktionen. Dabei werden 90 % der aufgetragenen Ausgangsradioaktivität wiedererhalten. Die Sequenz der darin enthaltenen Phosphopeptide konnte Al-Hasani (1995) durch direkte Edman-Sequenzierung ermitteln. Somit ist es möglich, jedem einzelnen Elutionspeak im Chromatogramm die entsprechende Aminosäuresequenz und Phosphorylierungsstelle der IRKD-HIS zuzuordnen. Mit diesem Verfahren konnten alle bekannten Tyrosinphosphorylierungsstellen des C-Terminus und der katalytischen Domäne (partiell oder teilweise phosphoryliert) nachgewiesen werden. Daneben wurden ein phosphoryliertes Threonin-Peptid und ein phosphoryliertes Tyrosinpeptid nachgewiesen, welche dem N-terminalen Poly(His)-Anteil der Kinase entstammen. Allerdings konnte keine Aussage über die Besetzung der Phosphorylierungsstellen im Juxtamembranbereich der Kinase 50

57 Ergebnisse getroffen werden. Wichtiger war die Identifizierung von zwei Phosphopeptiden, die ausschließlich an den Serinresten Ser 1275 und Ser 1309 phosphoryliert waren und somit als Serinautophosphorylierungsstellen dieser löslichen Rezeptorkinase beschrieben werden konnten. Der Vergleich dieses Elutionsprofils mit den korrespondierenden Profilen der IRKD und des aus Humanplazenta gereinigten Insulinrezeptors zeigte, daß die Autophosphorylierungsreaktionen dieser Enzyme in der identischen Besetzung der Autophosphorylierungsstellen resultiert (Tennagels 1995, Magg 1997). Neben den Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne und des C-Terminus konnten auch die beiden Phosphoserin enthaltenen Fraktionen gefunden werden, die mit den Retentionszeiten der an Serin phosphorylierten Peptide Ser 1275 und Ser 1309 übereinstimmten. (Al-Hasani et al. 1997). In Tabelle 5.2 sind die Sequenzdaten der ausgeprägtesten Signale aus dem Elutionsprofil der IRKD-HIS zusammengefaßt. Fraktion ermittelte Aminosäuresequenz Position der Domäne Sequenz (hir) Phosphoaminosäuren (hir) a DGGSSpLGFK Ser1309 CT b SYpEEHIPYpTHMNGGK Tyr1316, Tyr1322 CT vollständig phosphoryliert c DIYpETDYpYpR Tyr1146, Tyr1150, Tyr1151 KD partiell phosphoryliert (mono KD) d DIYpETDYpYpR Tyr1146, Tyr1150 oder Tyr1146, KD Tyr1151 phosphoryliert (Bis 1 KD) e DIYETDYpYpR Tyr1150 und Tyr1151 (Bis 2 KD) KD f APESpEELEMEFEDMENVPLR Ser1275 CT g DIYpETDYpYpR Tyr1146, Tyr1150, Tyr1151 vollständig phosphoryliert (tris KD) KD Tab 5.2: Sequenz, Position in der Aminosäuresequenz und die enthaltenen Phosphoaminosäuren der einzelnen Fraktionen der HPLC-Chromatographie. CT: C-terminale Domäne, KD: katalytische Domäne, Yp: Phosphotyrosin, Sp: Phosphoserin. (Al-Hasani et al. 1997, Nomenklatur nach Ullrich et al. 1985) Ein Nachteil dieser Methode ist, daß die prozentuale Verteilung der Phosphate in einzelne Phosphorylierungsstellen nur als apparente Größe betrachtet werden kann. So werden z.b. bei der Analyse des für 30 Minuten autophosphorylierten Enzyms nur etwa 10 % der Radioaktivtät in den korrespondierenden Peaks wiedergefunden, in der Phosphoaminosäureanalyse des Gesamtproteins werden dagegen ca. 25 % erhalten. Der Grund für diese Abweichung liegt mit aller Wahrscheinlichkeit in einer nicht vollständigen tryptischen Spaltung des Proteins, da auch in anderen Fraktionen, wenn auch zu geringeren Anteilen, Serinphosphorylierung detektiert werden kann (Al-Hasani 1995) Vergleich der Autophosphorylierungsstellen der IRKD, IRKD-Y1316/22F, IRKD-Y1316/22T und IRKD-Y960/1316/22F Die durch gezielte Punktmutationen veränderten Kinasen IRKD-Y1316/22F, IRKD-Y960/1316/22F und IRKD-Y1316/22T wurden durch die Methode der Phosphopeptidkartierung untersucht, um Einflüsse der Punktmutationen auf die Besetzung der Autophosphorylierungsstellen zu studieren. Dazu wurden, wie unter 5.3 beschrieben, Autophosphorylierungsreaktionen mit jeweils 1 µm Enzym für 30 Minuten durchgeführt, die Kinasen nach SDS-PAGE tryptisch aus dem getrockneten Gel eluiert und die erhaltenen Peptide durch Anionenaustausch-Chromatographie getrennt. Die Identifizierung der einzelnen Phosphorylierungsstellen erfolgte über den Vergleich mit den Retentionszeiten der IRKD (Abb. 5. 6). In den Profilen aller Chromatogramme können, bedingt durch die eingefügten Mutationen, Unterschiede in den relativen Höhen einzelner Peaks und auch die Abwesenheit einzelner Signale beobachtet werden. Die Tabelle in Abbildung 5.6 B faßt eine quantitative Analyse der Verteilung der Phosphate in die einzelnen Phosphorylierungsstellen zusammen. Die Berechnungsgrundlage ist die Radioaktivität der entsprechenden Fraktionen, bezogen auf die insgesamt eluierte Radioaktivität. Die 51

58 Ergebnisse Ausbeuten der einzelnen Chromatographieläufe betrug in allen Fällen ca. 90 %, allerdings muß mit einer gewissen Selektivität in den Ausbeuten einzelner Peptide und einer nicht vollständigen tryptischen Spaltung gerechnet werden, so daß die Werte nur als apparent anzusehen sind. A a b c d e f g IRKD Radioaktivität IRKD- Y1316/22F IRKD- Y960/1316/22F IRKD- Y1316/22T B Fraktion IRKD IRKD- Y1316/22F IRKD- 960/1316/22F IRKD- Y1316/22T Phosphateinbau [mol/mol]: 4,5 2,9 2,1 0,9 Fraktion Phosphorylierungsstelle Phosphatgehalt [%] a Ser b Tyr 1316 und Tyr c Tyr 1146 oder Tyr oder Tyr 1151 d Tyr 1146/50 oder Tyr 1146/51 e Tyr 1150, f Ser g Tyr 1146, 1150, Abb. 5.6: Vergleich der Phosphopeptidkartierung der IRKD, IRKD-Y1316/22F, IRKD-Y960/1316/22F und IRKD-Y1316/22T. Nach 30minütigen Autophosphorylierungsreaktionen der jeweiligen Enzyme wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und der Phosphateinbau durch Messung der Radioaktivität im β-counter ermittelt. Anschließend erfolgte die tryptische Elution der Gelbanden und die Auftrennung der Phosphopeptide durch HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie. Nach Tabelle 5.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten zu den Phosphopeptiden. A: Repräsentative Chromatogramme der autophosphorylierten Enzyme. B: Prozentuale Verteilung der Phosphate in die einzelnen Phosphorylierungsstellen der Enzyme. In der IRKD findet sich der Hauptanteil der inkorporierten Radioaktivität in den beiden Tyrosinphosphorylierungsstellen des C-Terminus und den drei Tyrosinresten der katalytische Domäne wieder (Fraktion b: 12,5 %, Fraktion g: 17 %). Daneben werden aber auch partiell phosphorylierte Formen der katalytischen Domäne gefunden (Fraktion c: 10 %, d: 10 %, e: 5 %). Das Serinpeptid 1309 enthält etwa 5 % (Fraktion a), das Serinpeptid 1275 etwa 5 % der Phosphate (Fraktion f). In der Summe ergibt sich damit ein Anteil von 10 %. Im Gegensatz dazu beträgt der Anteil der Serinphosphorylierung 52

59 Ergebnisse im Hydrolysat des Gesamtproteins etwa 25 % (Abb. 5.5 A). Der Austausch der beiden C-terminalen Tyrosinreste gegen Phenylalanin in der IRKD-Y1316/22F spiegelt sich in dem Verlust des bisphosphorylierten Tyrosinpeptids der Fraktion b wider. Ferner ergeben sich Unterschiede in dem Phosphorylierungsgrad der katalytischen Domäne. So finden sich erhöhte Phosphatinkorporationen in den partiell oder vollständig phosphorylierten Peptiden, aber nur ein geringer Anteil an monophosphorylierten Peptiden. Der Anteil an Serinphosphorylierung beträgt in der Summe 15 %. Die Kinase IRKD-Y960/1316/22F zeigt die nahezu identische Besetzung der Phosphorylierungsstellen wie die IRKD-Y1316/22F. Allerdings ist der prozentuale Anteil an Serinresten deutlich erhöht (18 %). In Übereinstimmung mit der Phosphoaminosäureanalyse des Hydrolysates des Gesamtproteins wird in der Phosphopeptidkartierung der IRKD-Y1316/22T kein Signal für die beiden Serinpeptide erhalten. Die Radioaktivität wird nahezu vollständig in die Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne inkorporiert. Im Vergleich zu den anderen Enzymen ergeben sich hier Unterschiede. Der Anteil an partiell phosphorylierten Peptiden ist deutlich erhöht, ein großer Anteil der Phosphate wird in den mono- und bis-phosphorylierten Formen erhalten Einfluß der Poly(Lysin)-Stimulierung auf die Verteilung der Phosphate in der IRKD Die Stimulierung der IRKD und der IRKD-Y1316/22F durch Poly(Lysin) führt zu einer 6-10fachen Steigerung der Initialgeschwindigkeit und einer ca. 2fachen Erhöhung des spezifischen Phosphateinbaus in der Autophosphorylierung (Abb. 3.5, Abb. 5.3, Tab. 5.1). Die Serinphosphorylierung scheint dabei um denselben Faktor stimuliert zu werden wie die Tyrosinphosphorylierung. Im folgenden Experiment wurde daher der Einfluß der Poly(Lysin)-Stimulierung auf die Verteilung der Phosphate nach der Autophosphorylierung der IRKD und der IRKD-Y1316/22F untersucht. Die Reaktionsansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Enzym, 1 µm bzw. kein Poly(Lysin). Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS- Probenpuffer beendet. Nach Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE erfolgte die Bestimmung des Phosphateinbaus und eine tryptische Elution der Phosphopeptide aus den Gelbanden. Die erhaltenen Peptide wurden anschließend durch HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie aufgetrennt (Abb. 5.7). Die Profile aller Chromatogramme unterscheiden sich nur in den relativen Peakhöhen, die Retentionszeiten der einzelnen Peptide ist nahezu identisch. Es muß daher davon ausgegangen werden, daß Poly(Lysin) keinen Einfluß auf die Zugänglichkeit der einzelnen Phosphorylierungstellen zu haben scheint. Deutlich sind aber Unterschiede in der relativen Verteilung der Phosphate in die einzelnen Phosphorylierungsstellen zu erkennen. In der nicht Poly(Lysin) stimulierten Reaktion inkorporiert die IRKD hauptsächlich Phosphate in mono-formen der katalytischen Domäne (Fraktion c) und den C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen Tyr 1316 und Tyr 1322 (Fraktion b). Höhere Phosphorylierungsformen der katalytischen Domäne (Fraktion d, e, g) sind dagegen kaum vorhanden. In Anwesenheit von 1 µm Poly(Lysin) kommt es zu einer drastischen Erhöhung der Phosphorylierung in der katalytischen Domäne, welche auf Kosten der phosphorylierten Peptide aus der C-terminalen Region zu gehen scheint. Die Abwesenheit von Poly(Lysin) in der Reaktion der IRKD-Y1316/22F bewirkt ebenfalls eine Verschiebung der Phosphatverteilung zu Gunsten der mono-phosphorylierten Peptide der katalytischen Domäne. Die Stimulierung durch Poly(Lysin) beeinflußt auch direkt die Serinphosphorylierung der Kinase. Während in der nicht stimulierten Reaktion die beiden Serinpeptide Ser 1275 und Ser 1309 in der IRKD und der IRKD-Y1316/22F (vgl Abb. 5.6) nur sehr schwach zu detektieren sind, führt die Anwesenheit von Poly(Lysin) zu einer deutlichen Zunahme des radioaktiven Signals (Fraktion a und f). 53

60 Ergebnisse A Radioaktivität a b c d e f g IRKD + Poly(Lysin) IRKD - Poly(Lysin) IRKD-Y1316/22F - Poly(Lysin) B Fraktion IRKD + Poly(Lysin) IRKD - Poly(Lysin) IRKD- Y1316/22F - Poly(Lysin) Phosphateinbau [mol/mol]: 4,1 2,1 0,9 Fraktion Phosphorylierungsstelle Phosphatgehalt [%] a Ser ,2 0,1 b Tyr 1316 und Tyr ,7 5 c Tyr 1146 oder Tyr oder Tyr 1151 d Tyr 1146/50 oder Tyr 1146/51 e Tyr 1150, f Ser g Tyr 1146, 1150, ,5 5,5 4 Abb. 5.7: Anionenaustausch-Chromatographie tryptischer Peptide der phosphorylierten IRKD und IRKD-Y1316/22F unter dem Einfluß der Poly(Lysin)-Stimulation. Die Reaktionsansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Enzym und 1 µm bzw. kein Poly(Lysin). Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Die Proteine wurden durch SDS- PAGE aufgetrennt und der Phosphateinbau ermittelt. Anschließend wurde die kinase aus dem gel tryptisch eluiert. Von einem Teil des Peptidgemisches die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung, der Rest durch HPLC- Anionenaustausch-chromatographie aufgetrennt. Die nicht stimulierte IRKD enthielt 2,1 mol/mol (P-Ser 0,05 mol/mol), die nicht stimulierte IRKD-Y1316/22F 0,9 mol/mol (P-Ser 0,1 mol/mol) und die Poly(Lysin) stimulierte IRKD 4,1 mol/mol (P-Ser: 0,9 mol/mol). Nach Tabelle 5.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten der Phosphopeptide. 54

61 Ergebnisse Identifizierung der Serinphosphorylierungsstellen des humanen Insulinrezeptors in situ Um zu prüfen, ob die Phosphorylierung der Serinreste Ser 1275 und Ser 1309 der löslichen Kinasen und des Insulinrezeptors in vitro auch nach Autophosphorylierung des Rezeptors in situ nachgewiesen werden kann, wurden in Zusammenarbeit mit Darryl Telting im Labor von Dr. Maasen in Leiden (NL) in situ-labeling Experimente durchgeführt. Dazu wurde eine humane Zell-Linie (Bezeichnung: A14, abgeleitet aus der Adipozyten-Zell-Linie NIH3T3) und eine Nager-Zell-Linie (Bezeichnung: CHO800, abgeleitet aus der Zell-Linie CHO9) verwendet, die den Rezeptor stabil mit 1 bzw. 1,6 Millionen Molekülen pro Zelle überexprimieren. Insgesamt wurden jeweils Zellzahlen eingesetzt, die bei optimaler Reinigung ca. 50 pmol bzw. 80 pmol Rezeptor liefern sollten. Die Zellen wurden über Nacht in Phosphat-freien Medium gehalten und anschließend mit radioaktiv markiertem Phosphat- Medium für 3 Stunden inkubiert (1 mci/ Zellen). Nach Stimulation der in situ Autophosphorylierung des Rezeptors mit Insulin für 30 Minuten (Insulinkonzentration 10-7 M), wurden die Zellen in einem Lysispuffer aufgeschlossen und enthaltenen Rezeptoren durch Immunpräzipitation isoliert. Für die Reinigung des Rezeptors aus den A14-Zellen ein polyklonaler α-phosphotyrosinantikörper (α-py) verwendet. Die Reinigung der Rezeptoren aus dem Zell-Lysat der CHO800 Zellen erfolgte sowohl durch Immunpräzipitation mit dem α-phosphotyrosin-antikörper (α-py), als auch mit einem polyklonalen α-insulinrezeptor-antikörper (α-ir). Als Kontrolle dienten jeweils Präzipitate aus nicht Insulin stimulierten Zellen. Die Präzipitate wurden in einer reduzierenden SDS-PAGE aufgetrennt und die phosphorylierte β-untereinheit durch Autoradiographie der getrockneten Gele lokalisiert. Durch eine zusätzliche Western-Blot-Analyse von Aliquots der Immunpräzipitate mit α-insulinrezeptor-antikörper erfolgte eine qualitative Bestimmung der präzipitierten Rezeptormoleküle (Abb. 5.8 A). Nach der Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität durch Messung der Cerenkov- Strahlung wurden die Rezeptorproteine durch tryptischen Verdau aus den Gelbanden eluiert. Von einem Teil des tryptischen Eluats wurde nach Partialhydrolyse die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung durch zweidimensionale Elektrophorese bestimmt (Abb. 5.8 B), der übrige Teil wurde für eine Phosphopeptidkartierung verwendet. Abbildung 5.8 A zeigt eine repräsentative Autoradiographie und Western-Blot-Analyse der Immunpräzipitation des IR aus CHO800 Zellen. Nach Immunpräzipitation des IR aus den Zell-Lysaten nicht Insulin-stimulierter Zellen mit dem α-phosphotyrosin- oder α-insulinrezeptor-antikörper werden im Mittel 2949 ± 837 cpm bzw ± 1931 cpm inkorporierte Radioaktivität in der β-untereinheit des IR erhalten. Der Serinphosphatanteil beträgt 68 % bzw. 83 % der Gesamtphosphorylierung. Die 30minütige Insulinstimulation führt zu einem Anstieg der Phosphatinkorporation in die β-untereinheit um den Faktor Die Western-Blot-Analyse mit α-insulinrezeptor-antikörper zeigt, daß der zusätzliche Phosphateinbau in Tyrosinreste zu einer qualitativ höheren Ausbeute von Rezeptorprotein unter Verwendung des α-phosphotyrosin-antikörpers führt. Im Gegensatz dazu werden nahezu gleiche Mengen an Rezeptorprotein aus nicht oder Insulin stimulierten Zellen mit dem α-insulinrezeptor-antikörper immunpräzipitiert (Abb. 5.8, Bahn 7 und 8). Außerdem kann hier auch der nicht prozessierte Prorezeptor ( 207 kda) detektiert werden. In der Präzipitation mit α-phosphotyrosin-antikörper wird ein Phosphateinbau von ± 680 cpm in der β-untereinheit des Rezeptors erhalten, der durch α-insulinrezeptor-antikörper präzipitierte IR enthält ± 2010 cpm Radioaktivität. Die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung ergibt im ersten Fall einen relativen Serinphosphatanteil von 27 %, im zweiten Fall einen Anteil von 38 % an der Gesamtphosphorylierung. Damit ergeben sich für die Verwendung der beiden Antikörper Unterschiede in den Ausbeuten und in der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der beiden Protein- Präzipitationen, welche in der unterschiedlichen Spezifität der verwendeten Antikörper begründet sind (D. Telting, persönliche Mitteilung). Trotz dieser Differenzen wird aber deutlich, daß die β- Untereinheit vor der Insulinstimulation zu einem hohen Grad an Serinresten vorphosphoryliert vorliegt. Nach Insulinstimulation ergibt sich unter Berücksichtigung des erhöhten Phosphorylierungsgrades der β-untereinheiten der Rezeptoren eine absolute Zunahme der Phosphatinkorporation in Tyrosin- und Serinresten. Weder in den Präzipitaten des IR aus nicht Insulin noch aus Insulin stimulierten Zellen konnte eine Threoninphosphorylierung nachgewiesen werden. 55

62 Ergebnisse A MW [kda] ,5 B ps ps py py C - Insulin + Insulin ps py py ps - Insulin + Insulin Abb. 5.8: In situ Autophosphorylierung des Insulinrezeptors in der CHO800 Zell-Linie CHO800 Zellen, welche 1, Rezeptoren pro Zelle exprimieren, wurden über Nacht in Phosphat-freiem Medium gehalten und anschließend nach Zugabe von radioaktiv markiertem [γ- 32 P]-Orthophosphat für 3 Stunden inkubiert. Die Stimulation der IR-Autophosphorylierung (30 min) erfolgte durch Zugabe von M Insulin zum Kulturmedium. Als Kontrolle dienten nicht mit Insulin stimulierte Zellen. Nach Immunpräzipitation des Rezeptors durch einen polyklonalen α-phosphotyrosin- (α-py) oder α-insulinrezeptor-antikörper (α-ir) wurden die Präzipitate durch SDS-PAGE aufgetrennt und die β-untereinheit durch Autoradiographie bzw. Western-Blot- Analyse lokalisiert. Die inkorporierte Radioaktivität wurde durch Messung der Cerenkov-Strahlung ermittelt und die Rezeptorproteine durch tryptische Spaltung aus den Gelbanden eluiert. Von einem Teil des Peptidgemisches wurde die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung durch zweidimensionale Elektrophorese analysiert. A: Autoradiographie und Western-Blot-Analyse von Immunpräzipitaten des IR. links: Autoradiographie eines 7 %igen SDS-PAA-Geles. rechts: Immunologischer Nachweis des Insulinrezeptors in den jeweiligen Präzipitaten durch α- IR-Antikörper. Molekulargewichtsmarker (Broad Range), Bahn 1, 2, 5, 6: Immunpräzipitation des IR mit dem α-py-antikörper nach 30minütiger Stimulation in Ab- (1, 5) oder Anwesenheit (2, 6) von Insulin. Bahn 3, 4, 7, 8: Immunpräzipitation des IR mit dem α-ir-antikörper nach 30minütiger Stimulation in Ab- (3, 7) oder Anwesenheit (4, 8) von Insulin. B: Phosphoaminosäureanalyse des in situ -gelabelten IR nach Immunpräzipitation mit dem α-py-antikörper. Autoradiographie nach zweidimensionaler Elektrophorese. C: Phosphoaminosäureanalyse der in situ -gelabelten IR nach Immunpräzipitation mit α-ir-antikörper. Autoradiographie nach zweidimensionaler Elektrophorese. 56

63 Ergebnisse Abbildung 5.9 faßt die erhaltenen Ergebnisse für die Immunpräzipitation des Insulinrezeptors aus CHO800-Zellen grafisch zusammen Phosphateinbau P-Tyr P-Ser Phosphateinbau P-Tyr P-Ser Phosphateinbau [cpm] Phosphateinbau [cpm] Insulin+ Insulin anti-py CHO Insulin+ Insulin anti-ir CHO800 Abb. 5. 9: Grafische Darstellung des Phosphateinbaus in die β-untereinheit des Insulinrezeptors und Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der in situ -Autophosphorylierung des Insulinrezeptors aus der CHO800-Zell-Linie. Die Analyse der Immunpräzipitate des IR aus der humanen Zell-Linie A14 zeigen vergleichbare Ergebnisse. Auch hier kann in den unstimulierten Zellen ein hoher Anteil an Phosphoserin in der β-untereinheit detektiert werden. Die Insulin-Stimulation führt ebenfalls zu einer Erhöhung der Tyrosin- und Serinphosphorylierung (Daten nicht gezeigt), dabei ergeben sich vergleichbare Stimulationsraten in der Autophosphorylierung und der Phosphatinkorporation in Serinreste. Ob die beobachtete erhöhte Serinphosphorylierung auf die Besetzung der in vitro identifizierten Phosphorylierungsstellen Ser 1275 und Ser 1309 zurückzuführen ist, sollte durch den Vergleich der Phosphopeptidkartierungen der in situ autophosphorylierten Rezeptoren aus den CHO800 und A14 Zellen mit den Elutionsprofilen des Insulinrezeptors bzw. der IRKD nach in vitro Autophosphorylierung analysiert werden (Abb. 5.10). Dazu wurden die erhaltenen tryptischen Eluate durch HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie aufgetrennt. In der Gegenüberstellung der einzelnen Elutiosprofile können zunächst Unterschiede in der Besetzung einzelner Tyrosin-Phosphorylierungstellen beobachtet werden. Während im Profil des in vitro phosphorylierten IR und der löslichen Kinase IRKD die C-terminalen Phosphorylierungsstellen und die drei Tyrosine der katalytischen Domäne die stärksten radioaktiven Signale liefern (Fraktion b und g), sind im Vergleich dazu in den in situ phosphorylierten Rezeptoren diese Autophosphorylierungsstellen nur mäßig phosphoryliert. Hier liefert das stärkste Signal ein Peptid aus der katalytischen Domäne, in welchem die beiden Tyrosinreste 1150 und 1151 besetzt sind (Fraktion e). Dessenungeachtet führt die Autophosphorylierung in situ aber auch zu der Besetzung der beiden Serinphosphorylierungsstellen. Das Serinpeptid Ser 1309 (Fraktion a) kann sowohl in der phosphorylierten β-untereinheit des IR aus den CHO800 als auch aus den A14 Zellen durch den direkten Vergleich der Retentionszeiten identifiziert werden. Eine nachfolgende Phosphoaminosäureanalyse dieser Fraktion zeigt, das in diesem Peak zu 98 % Phosphoserin enthalten ist. (Abb B). Im Gegensatz dazu ist das Serinpeptid Ser 1275 nicht direkt zu lokalisieren, da das bisphosphorylierte Tyrosinpeptid der katalytischen Domäne eine vergleichbare Retentionszeit besitzt. Werden aber die Fraktionen aufgrund der erwarteten Retentioszeit vereinigt und eine Phosphoaminosäureanalyse durchgeführt, zeigt sich ein hoher Anteil an Phosphoserin ( 40 %). Dieser Sachverhalt scheint daher für die Anwesenheit auch dieses Phosphopeptids zu sprechen (Abb B). 57

64 Ergebnisse A a b c d e f g IRKD Radioaktivität IR in vitro IR in situ CHO800 IR in situ A14 B Fraktion Fraktion ptyr pser Auftrag Abb. 5.10: Vergleich der Phosphopeptidkartierungen des autophosphorylierten Insulinrezeptors, der löslichen Kinase IRKD und der in situ gelabelten β-untereinheiten des Insulinrezeptors aus CHO800 und A14-Zellen. A: HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie der tryptischen Peptide. IR und IRKD (je 1 µg Protein) wurden für 30 Minuten autophosphoryliert und durch SDS-PAGE getrennt. Nach tryptischer Elution wurden die erhaltenen Phosphopeptide durch HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie getrennt. Das Elutionsprofil des autophosphorylierten Insulinrezeptors wurde freundlicherweise von Frau C. Magg zur Verfügung gestellt. Zur Phosphopeptidkartierung der in situ radioaktiv markierten Rezeptoren wurden die tryptischen Eluate der Gelbanden verwendet. Nach Tabelle 5.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten zu den Phosphopeptiden. B: Dünnschichtchromatographische Phosphoaminosäureanalyse der Peptide aus den Fraktionen und aus dem Elutionsprofil des IR aus CHO800 Zellen. Die Fraktionen wurden vereinigt und mit Chromabond-C8-Säulen rechromatographiert (Die Ausbeute in diesem Schritt betrug 70 % der eingesetzten Radioaktivität). Im Anschluß erfolgte die saure Partialhydrolyse und dünnschichtchromatographische Auftrennung der Phosphoaminosäuren. Die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Fraktionen aus dem Elutionsprofil des IR aus A14-Zellen zeigten identische Ergebnisse (Daten nicht gezeigt). 58

65 Ergebnisse Die Serinphosphorylierung der IRKD-K1018A Bei der Möglichkeit, die beiden Serinreste Ser 1275 und Ser 1309 in der Autophosphorylierungsreaktion zu besetzen, ergibt sich die Frage, ob diese Reaktion einem trans- oder cis-mechanismus unterliegt. Ein Ansatz zur Untersuchung dieses Problems ist die Kombination der kinaseaktiven IRKD-HIS und der kinaseinaktiven IRKD-K1018A, welche sich aufgrund ihrer unterschiedlichen N-terminalen Struktur in ihrem apparenten Molekulargewicht in der denaturierenden SDS-PAGE unterscheiden. Durch diese Eigenschaft ist es möglich, beide Moleküle gemeinsam in einer Reaktion zu kombinieren, sie anschließend zu separieren, um sie dann getrennt hinsichtlich ihrer Phosphoaminosäure-Zusammensetzung und der Verteilung der einzelnen Phosphate der einzelnen Phosphate in die verschiedenen Phosphorylierungsstellen zu analysieren. Zunächst wurde die kinaseinaktive Variante IRKD-K1018A hinsichtlich ihrer kinetischen Konstanten untersucht. Dazu wurde sie in variierenden Substratkonzentrationen mit der IRKD-HIS kombiniert und die Initialgeschwindigkeit der Substratphosphorylierung ermittelt. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm der für 5 Minuten vorphosphorylierten IRKD-HIS. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet, nach 0,5 bzw. 1 Minuten mittels Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und durch SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Lokalisation der phosphorylierten Proteine durch Autoradiographie wurde die inkorporierte Radioaktivität in der IRKD-K1018A ermittelt (Abb. 5.11). Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit untersuchten Substraten (Kap. 6.2, Tab. 6.1) ergibt sich aus der Auftragung der Initialgeschwindigkeiten gegen die Substratkonzentration keine hyperbolische Funktion der Michaelis-Menten-Kinetik; vielmehr wird ein sigmoidaler Verlauf beschrieben, der auf einen allosterischen Prozeß der Phosphorylierung hindeutet. Daher lassen sich K m und V max für dieses Substrat nicht direkt bestimmen. Um dennoch einen Anhaltspunkt für die Größenordnung der kinetische Konstanten zu erhalten, wurde der V max bzw. der K m Wert durch Extrapolation der maximal erzielten Geschwindigkeit und der halbmaximalen Geschwindigkeit der Reaktion bestimmt. Demnach ergibt sich für V max ein Wert von etwa 146 nmol min -1 mg -1, für den K m ein Wert von 2,5 µm. Daraus errechnet sich K cat zu 6,6 min -1 und k cat /K m zu 2, M -1 min -1. Die kinaseinaktive IRKD-K1018A weist damit die höchste katalytische Effizienz aller untersuchten Substrate auf. A Phosphattransfer [pmol/min] IRKD-K1018A [µm] B 1/V [min/pmol] 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1/S [1/µM] Abb. 5.11: Die Substratphosphorylierung der IRKD-K1018A. Die Ansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin). Die Reaktionen wurden durch Zugabe der für fünf Minuten vorphosphorylierten IRKD-HIS (1 µm) gestartet und nach 0,5 bzw. 1 min durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE erfolgte die Bestimmung des Phosphateinbaus durch Messung der Cerenkov-Strahlung. A: Initialgeschwindigkeiten des Phosphotransfers. B: Doppelt reziproke Lineweaver-Burk-Auftragung. 59

66 Ergebnisse A B pt ps pt ps py py IRKD-HIS IRKD-K1018A C Phosphateinbau [mol/mol] IRKD P-Tyr P-Ser Phosphattransfer [pmol] IRKD-K1018A P-Tyr P-Ser 0 9 2,5 0,25 IRKD-K1018A [µm] 0 9 2,5 0,25 IRKD-K1018A [µm] Abb. 5.12: Substratphosphorylierung der IRKD-K1018A durch die IRKD-HIS in Abhängigkeit von der Substratkonzentration. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, IRKD- K1018A (9, 2,5, 0,25 µm) und 1 µm IRKD-HIS. Die Kontrolle enthielt 1 µm IRKD oder 1 µm IRKD-HIS ohne Substrat. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten erfolgte nach SDS-PAGE die Bestimmung des Phosphateinbaus und die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung. A: Autoradiographie nach SDS-PAGE. 1: IRKD-HIS, 2: 9 µm IRKD-K1018A, 1 µm IRKD-HIS, 3: 2,5 µm IRKD-K1018A, 1 µm IRKD-HIS, 4: 0,25 µm IRKD-K1018A, 1 µm IRKD-HIS, 5: IRKD. B: Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der IRKD-HIS (1 µm) und IRKD-K1018A (2,5 µm). Autoradiographie nach zweidimensionaler Elektrophorese der Proben aus Bahn 4. C: Auswertung der Phosphatinkorporation und Phosphoaminosäure-Zusammensetzung. Im folgenden wurden konzentrationsabhängige Substratphosphorylierungsreaktionen mit der kinaseinaktiven IRKD-K1018A und der IRKD-HIS durchgeführt. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP, 9, 2,5 bzw. 0,25 µm IRKD-K1018A und 1 µm IRKD-HIS. Als Kontrolle wurde die IRKD und die IRKD-HIS ohne Substrat in einer Autophosphorylierungsreaktion eingesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe der IRKD-HIS gestartet und nach 20 Minuten durch SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE, Lokalisierung der Kinasebanden im Gel durch Autoradiographie und Messung der inkorporierten Radioaktivität wurden die Proteine tryptisch eluiert und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung untersucht. In Anwesenheit von 9 µm IRKD-K1018A ist in der Autoradiographie (Abb A, Bahn 2) eine distinkte Substratbande zu erkennen. Die hohe 60

67 Ergebnisse Substratkonzentration führt zu einer starken Inhibition der Autophosphorylierung der IRKD-HIS; das Enzym inkorporiert 0,6 mol/mol. Allerdings scheint diese Inhibition den Phosphotransfer nicht zu beeinträchtigen, der Phosphateinbau beträgt in der IRKD-K1018A 180,3 pmol. In Anwesenheit von 2,5 µm Substrat (1 K m ), inkorporiert die aktive Kinase 3,9 mol/mol, die Phosphatinkorporation der IRKD-K1018A beträgt 90 pmol (Bahn 3). In Gegenwart von 0,25 µm Substrat zeigt die IRKD-HIS eine im Vergleich zur Kontrollreaktion leicht erhöhte Phosphatinkorporation (5,7 mol/mol), im Substrat werden 16 pmol Phosphat inkorporiert. Die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung beider Proteine ergibt eine detektierbare Serinphosphorylierung (Abb B). Dabei nimmt mit steigender Substratkonzentration der prozentuale Anteil der Serinphosphatinkorporation im Vergleich zur der Gesamtphosphorylierung in der Kinase und dem Substrat kontinuierlich ab. Demnach scheint sich hier eine Abhängigkeit der Serinphosphorylierung von der Substratkonzentration zu ergeben (5.12 C). A B Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser 5 + Poly(Lysin) IRKD Phosphattransfer [pmol] Gesamt P-Ser Poly(Lysin) IRKD-K1018A C Zeit [min] D Zeit [min] Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 - Poly(Lysin) IRKD 0, Phosphattransfer [pmol] Gesamt P-Ser Poly(Lysin) IRKD-K1018A Zeit [min] Zeit [min] Abb. 5.13: Zeitverlauf der IRKD-K1018A-Substratphosphorylierung durch die IRKD-HIS in An- oder Abwesenheit von Poly(Lysin). Die Reaktionsansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 2,5 µm IRKD-K1018A und 1 µm IRKD-HIS. Nach der Reaktion wurden die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung ermittelt. A/C: Phosphateinbau in die IRKD in An- bzw. Abwesenheit von Poly(Lysin). B/D: Phosphatinkorporation in die IRKD-K1018A in An- bzw. Abwesenheit von Poly(Lysin). Im folgenden Experiment wurde unter Berücksichtigung des apparenten K m -Wertes eine zeitabhängige Substratphosphorylierung der IRKD-K1018A mit der IRKD-HIS in einem Verhältnis von 2,5 : 1 durchgeführt. Dabei sollte auch der Einfluß der Poly(Lysin)-Stimulation auf diese Reaktion 61

68 Ergebnisse analysiert werden. Die Reaktion wurde durch Zugabe der aktiven Kinase gestartet. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und die Reaktion durch Zufügen von SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE und Lokalisation der Kinasebanden durch Autoradiographie wurde der jeweilige Phosphateinbau in die Moleküle durch Messung der Cerenkov-Strahlung ermittelt (Abb. 5.13). In der Poly(Lysin) stimulierten Reaktion beschreibt der Phosphateinbau in die IRKD-HIS einen Sättigungsverlauf (Abb A). Allerdings ist die Sättigung nach 20 Minuten noch nicht erreicht, der Phosphateinbau beträgt 4 mol/mol Enzym. Die Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierungsreaktion im Vergleich zu einer Autophosphorylierungsreaktion ohne Substrat deutlich verlangsamt (Kap. 4.3) und beträgt 23 nmol min -1 mg -1. Im Gegensatz dazu ist der Phosphotransfer auf das kinaseinaktive Molekül um den Faktor 3 schneller, die Initialgeschwindigkeit beträgt 65 nmol min -1 mg -1 (Abb B). Andere Verhältnisse ergeben sich bei der nicht Poly(Lysin) stimulierten Reaktion. Hier ist die Autophosphorylierung der aktive Kinase dem Phosphotransfer auf das Substrat bevorzugt. Die Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierungsreaktion beträgt 9,3 nmol min -1 mg -1, der spezifische Phosphateinbau nach der Reaktionszeit von 20 Minuten 1,77 mol/mol Kinase (Abb C). Auf die IRKD-K1018A werden nach 20 Minuten Reaktionszeit 2 pmol Phosphat übertragen, die Initialgeschwindigkeit der Reaktion beträgt 1,2 nmol min -1 mg -1 (Abb D). Zur Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung wurden die isolierten Gelbanden einer tryptischen Gelelution unterworfen, die erhaltenen tryptische Phosphopeptide sauer hydrolysiert und eine dünnschichtchromatische Auftrennung der lyophilisierten Hydrolysate vorgenommen. Sowohl in der IRKD-HIS als auch im Substrat ist die Phosphorylierung von Serinresten nachweisbar. Der prozentuale Anteil der Serinphosphorylierung an der Gesamtphosphorylierung der IRKD-HIS nach Poly(Lysin)-Stimulation beträgt in diesem Versuch 26 % (1,04 mol/mol), die Initialgeschwindigkeit 4 nmol min -1 mg -1 und ist damit in den kinetischen Konstanten der Serinautophosphorylierung ohne Substrat identisch (Kap. 4.3). Im Gegensatz dazu sind die ermittelten Werte für die Serinphosphorylierung im Substrat verdoppelt. Der Anteil an phosphorylierten Serinresten an der Gesamtphosphorylierung beträgt 24 %, die Initialgeschwindigkeit kann mit 8,2 nmol min -1 mg -1 angegeben werden. In der nicht Poly(Lysin) stimulierten Reaktion kann zu den frühen Zeitpunkten der Reaktion keine signifikante Serinphosphorylierung oberhalb der Nachweisgrenze der Dünnschichtchromatographie beschrieben werden, nach 20 Minuten Reaktionszeit lassen sich im Substrat und in der IRKD-HIS etwa 5 % Phosphoserin detektieren. Die vorherigen Experimente zeigten, daß die IRKD-HIS in der Lage ist eine Serinphosphorylierung in der IRKD-K1018A zu katalysieren. Ob dieser Serinphosphorylierung die Besetzung der Serinphosphorylierungsstellen Ser 1275 und Ser 1309 zu Grunde liegt, wurde durch die Methode der Phosphopeptidkartierung analysiert. Desweiterem wurde der Phosphorylierungstatus der IRKD-K1018A in Abwesenheit von Poly(Lysin) untersucht. Dazu wurde das inaktive Protein (2,5 µm) für 20 Minuten durch die IRKD-HIS (1 µm) in An- oder Abwesenheit von 1 µm Poly(Lysin) phosphoryliert, die Reaktion mittels Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt. Nach tryptischer Elution der erhaltenen Gelbanden wurden die Phosphopeptide durch Anionenaustausch-Chromatographie aufgetrennt (Abb A). Die korrespondierenden Elutionsprofile zeigen, daß es in der relativen Verteilung der Phosphate in die einzelnen Tyrosinphosphorylierungsstellen nach der Substratphosphorylierungsreaktion kaum Unterschiede zu dem Phosphorylierungsmuster der autophosphorylierten IRKD gibt (Kap , Abb. 4.6). Die Phosphorylierung führt sowohl in der aktiven Kinase als auch in der IRKD-K1018A zur Besetzung der beiden C-terminalen Tyrosinreste Tyr 1316 und Tyr 1322 und der Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne. Desweiteren wird in beiden Proteinen die Phosphorylierung der Serinphosphorylierungsstellen Ser 1275 und Ser 1309 detektiert. Allerdings ergeben sich hier leichte Unterschiede in der Besetzung (Abb B). Während sich die Phosphate in der IRKD-HIS gleichmäßig auf beide Positionen zu verteilen scheinen, wird in der IRKD-K1018A bevorzugt das Ser 1309 phosphoryliert. Die Summe der Anteile ist aber in beiden Fällen identisch und beträgt etwa 10 %. Zusammengefaßt zeigt der Versuch, daß alle durch die Phosphopeptidkartierung analysierbaren Autophosphorylierungsstellen der IRKD-K1018A für die aktive Kinase zugänglich sind. Damit scheint ein trans-phosphorylierungsmechanismus der Serinphosphorylierung möglich. In der Phosphorylierungsreaktion in Abwesenheit von Poly(Lysin) zeigt die IRKD-HIS ein ähnliches Phosphorylierungsmuster wie die IRKD. Die meisten Phosphate finden sich in den C-terminalen Phosphorylierungsstellen (Fraktion b) und in den mono-formen der katalytischen Domäne (Fraktion c; vgl. Abb. 4.7). Die 62

69 Ergebnisse Phosphorylierung der beiden Serinphosphorylierungsstellen ist dagegen nur schwach ausgeprägt. In der IRKD-K1018A finden sich die meisten Phosphate in den C-terminalen Phosphorylierungsstellen; die Phosphorylierung der Tyrosinreste in der katalytischen Domäne ist gering (Fraktion c, d, e, g). Dieser Umstand drückt sich auch in der sehr niedrigen Phosphateinbaurate des Substrates aus. A a b c d e f g IRKD-HIS + Poly(Lysin) Radioaktivität IRKD-K1018A + Poly(Lysin) IRKD-HIS - Poly(Lysin) IRKD-K1018A - Poly(Lysin) B Fraktion + Poly(Lysin) - Poly(Lysin) IRKD-HIS IRKD- K1018A IRKD-HIS IRKD- K1018A Phosphateinbau [pmol]: Fraktion Phosphorylierungsstelle Phosphatgehalt [%] a Ser b Tyr1316/ c Tyr1146 oder Tyr oder Tyr1151 d Tyr1146/50 oder Tyr1146/51 e Tyr 1150 und Tyr f Ser g Tyr 1146, 1150, Abb. 5.14: A: Anionenaustausch-Chromatographie tryptischer Peptide von IRKD-HIS und IRKD- K1018A. Der Reaktionsansatz enthielt 1 µm oder kein Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, 2,5 µm IRKD-K1018A und 1 µm IRKD. Die Reaktion wurde durch Zugabe der aktiven Kinase gestartet, nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt. Im Anschluß erfolgte die tryptische Elution der Gelbanden und die Auftrennung der erhaltenen Peptide durch Anionenaustauschchromatographie. B: Relative Verteilung der Phosphate in den Phosphorylierungsstellen der IRKD-HIS und IRKD-K1018A. Eine Aussage über die Verteilung der Phosphate in die bis-phosphorylierten Formen der katalytischen Domäne in der IRKD-HIS ist nicht möglich, da in diesem Bereich phosphorylierte Peptide aus dem heterologen N-terminalen Fusionsanteil eluieren (Al-Hasani 1995). 63

70 Ergebnisse 6 Die Duale Kinaseaktivität der IRKD in der Substratphosphorylierung 6.1 Konstruktion, Expression und Reinigung von GST-Fusionsproteinen Das Gluthation-S-Transferase-Expressionssystem in E. coli Die Glutathion-S-Transferase (GST), ein 28 kda Protein aus Schistosoma japonicum, bindet das Tripeptid Glutathion (GSH) mit sehr hoher Affinität. Dieser Umstand erlaubt es, das Protein an einer Säule mit immobilisiertem Glutathion zu binden und es anschließend mit freiem GSH zu eluieren. Damit ist es möglich, andere Proteine oder Proteindomänen, die als Fusionsproteine N- oder C-terminal mit GST exprimiert werden, durch Affinitätschromatographie zu reinigen. Für die Klonierung und Expression der GST-Fusionsproteine wurde in dieser Arbeit der Expressionsvektor pgex-3x verwendet. In diesem Vektor steht das Gen für die GST unter der Kontrolle des induzierbaren tac-promotors. Zusätzlich enthält der Vektor das laci q -Gen, welches für den Repressor des Lac- Operons kodiert. In Abwesenheit von Lactose wird die Expression des GST-Proteins reprimiert. Durch die Zugabe des nicht hydrolysierbaren Lactose-Analogons IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zum Kulturmedium kann der Repressor in seine inaktive Form überführt und somit die Expression des GST-Fusionproteins induziert werden. Eine Klonierungsstelle am 3 -Ende der GSTcDNA-Sequenz erlaubt es, Proteine in das Leseraster der GST zu klonieren. Zusätzlich befindet sich zwischen der kodierenden Sequenz der GST und der MCS eine Region, die für die Erkennungssequenz einer Serinprotease (Blutgerinnungsfaktor Xa) kodiert, die eine spätere Abspaltung des GST- Anteils erlaubt Konstruktion, Expression und Reinigung der GST-Fusionsproteine GST-JM, GST-Ex20, GST-CT, GST-CTphe und GST-CTthr Für die Untersuchung der Substratphosphorylierungsreaktion der IRKD wurden die Fusionsproteine GST-JM, GST-Ex20, GST-CT, GST-CTphe und GST-CTthr verwendet. Die Substrate enthalten die Proteinsequenzen, welche sich aus den jeweiligen funktionellen Domänen des Rezeptors ableiten und beinhalten ein oder mehrere Autophosphorylierungsstellen. Interessanterweise korrelieren diese Domänen direkt mit der Exon-Struktur des Gens (Seino et al. 1990). Das GST-JM Fusionsprotein enthält die Sequenz aus dem Juxtamembran-Bereich des IR (Gly Val 1020, Exon 16) und wurde von Al-Hasani (1995) konstruiert. Das Peptid enthält die Tyrosinphosphorylierungsstelle Tyr 960 des IR. Das GST-Ex20 Fusionsprotein wurde im Rahmen der Diplomarbeit von Lehr konstruiert (Lehr 1995) und entspricht der Aminosäuresequenz Phe Asp Es enthält die katalytische Domäne der Rezeptorkinase mit den drei Tyrosinautophosphorylierungsstellen Tyr 1146, Tyr 1150 und Tyr Der Expressionsvektor pgex-ct kodiert für ein C-terminales Fusionsprotein des humanen IR und wurde im Rahmen der Diplomarbeit von Goder 1995 dargestellt. Das resultierende Protein umfaßt die Aminosäuren Asp Ser 1343, enthält aber, im Gegensatz zur humanen IR-Sequenz, zusätzlich die Punktmutation Cys 1296 gegen Serin, die eine bessere Löslichkeit des Proteins bewirkt (Goder 1995). Neben den beiden Tyrosinphosphorylierungsstellen Tyr 1316 und Tyr 1322 beinhaltet das Protein auch die beiden Serinautophosphorylierungsstellen Ser 1275 und Ser Für eine spezifische Charakterisierung der Serinphosphorylierung in Substratphosphorylierungsreaktionen wurden, ausgehend von dem pgex-ct-expressionsvektor, zwei weitere Vektoren konstruiert, in denen die beiden Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Phenylalanin bzw. Threonin substituiert wurden (Bezeichnung in dieser Arbeit: GST-CTphe und GST-CTthr). Die Mutationen wurden in Analogie zu den Mutationen in den löslichen Insulinrezeptorkinasen (IRKD-Y1316/33F und IRKD-Y1316/22T) unter Verwendung der entsprechenden Mutagenese-Primer nach dem Verfahren von Deng und Nickoloff eingeführt und durch Restriktionskartierung und Sequenzierung verifiziert. Abbildung 6.1 zeigt die resultierende Aminosäuresequenzen aller verwendeten Peptide nach Abspalten des GST-Anteils. 64

71 Ergebnisse JM-Peptid Gly 947 gipglpgply ASSNPEYLSA SDVFPCSVYV PDEWEVSREK ITLLRELGQS SFGMVYEGNA RDIIKGEAET RVAVKTVgns s Val 1020 Ex20-Peptid Phe 1139 gilfgmtrdi YETDYYRKGG KGLLPVRWMA PESLKDGVFT TSS Dmnss Asp 1179 CT-Peptid Asn 1249 gipnllkddl HPSFPEVSFF HSEENKAPES EELEMEFEDM ENVPLDRSSH SQREEAGGRD GGSSLGFKRS YEEHIPYTHM NGGKKNGRIL TLPRSNPS Ser 1343 CTphe-Peptid Asn 1249 gipnllkddl HPSFPEVSFF HSEENKAPES EELEMEFEDM ENVPLDRSSH SQREEAGGRD GGSSLGFKRS FEEHIPFTHM NGGKKNGRIL TLPRSNPS Ser 1343 Abb. 6.1: Aminosäuresequenz der rekombinanten IR-Peptide nach proteolytischer Spaltung der Fusionsproteine. Die Doppelpfeile geben die korrespondierenden Aminosäurepositionen im IR an (Sequenz nach Ullrich et al. 1985). Das JM-Peptid enthält 81 Aminosäuren (8,7 kda), das Ex20-Peptid 48 Aminosäuren (5,3 kda) und die C-terminalen Proteine 101 Aminosäuren (11,1 kda). Heterologe Aminosäuren, die vom Expressionsvektor kodiert werden, sind durch Kleinbuchstaben und Kursivdruck hervorgehoben. Tyrosin- und Serinphosphorylierungstellen sind jeweils durch Fettdruck, eingeführte Mutationen sind durch einen einfachen Pfeil gekennzeichnet Expression und Reinigung der Fusionsproteine Für die Expression der Fusionsproteine wurde der E. coli Bakterienstamm DH5α verwendet. Vier Stunden nach der Induktion der Proteinexpression durch Zugabe von IPTG in das Kulturmedium wurden die Bakterien abzentrifugiert, das Pellet in Lysispuffer resuspendiert und die Zellen durch Sonifikation aufgeschlossen. Mit dem erhaltenen cytosolischen Überständen wurden Affinitätschromatographien mit Glutathion-Sepharose durchgeführt. Nach Elution mit Glutathion waren die jeweiligen Proteinpräparationen bereits nahezu homogen, so daß eine weitere Reinigung erspart blieb (Abb. 6.2). Allerdings zeigten sich in den Eluaten einiger Expressionsprodukte weitere Proteinbanden, die durch Western-Blot-Analyse als Abruchfragmente identifiziert werden konnten (Daten nicht gezeigt). Die durchschnittliche Ausbeute an den jeweiligen Fusionsproteinen betrug zwischen 8 und 12 mg/l Bakterienkultur. Für die Bestimmung der kinetischen Konstanten der Substratphosphorylierung wurden die IR-Peptide vom GST-Anteil durch die Protease Faktor Xa gespalten und jeweils über eine C8-Reversed-Phase-HPLC gereinigt (Lehr 1995, Goder 1995, Al-Hasani 1995, Müller 1997). 65

72 Ergebnisse MW [kda] ,7 75,2 43,6 33,5 M Abb. 6.2: Reinigungsgel der Insulinrezeptorfusionsproteine. Aufgetragen wurden jeweils 2 µg Fusionsprotein. M: Molekulargewichtsmarker (Broad Range), 1: GST-JM, 2: GST-Ex20, 3: GST-CTphe, 4: GST-CT. SDS-PAGE, Peptidfärbung nach Blakesley und Boezi (1977). 6.2 Kinetische Konstanten der Substratphosphorylierung Zur Charakterisierung der Kinaseaktivität der Insulinrezeptorkinase bezüglich exogener Substrate werden im allgemeinen natürlich vorkommende Proteine, wie z.b. Histon 2b und Myelin Basic Protein oder natürliche Substrate verwendet. Zur letzteren Gruppe zählen die vom Rezeptor abgeleiteten Proteine, d.h. Domänen oder Peptide, die Autophosphorylierungsstellen enthalten, oder Substrate, die von der Kinase in der Zelle erkannt und phosphoryliert werden. In dieser Arbeit wurden für die Untersuchung der kinetischen Konstanten der Substratphosphorylierungsreaktion Proteine aus allen genannten Klassen verwendet. Dazu wurden für diese Arbeit im Rahmen von Diplomarbeiten die initialen Reaktionsgeschwindigkeiten in Gegenwart der betreffenden Substrate untersucht (Lehr 1995, Müller 1997). Die Reaktionsansätze enthielten das entsprechende Substrat in variierenden Konzentrationen, 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin). Die Reaktionen wurden durch Zugabe der zuvor für 5 Minuten autophosphorylierten Kinase gestartet und nach einer Reaktionszeit von 0,5 bzw. 1 Minute mittels SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennen der Proteine durch SDS-PAGE wurde die inkorporierte Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung ermittelt. Die aus diesen Analysen abgeleiteten kinetischen Konstanten sind in Tabelle 6.1 zusammengefaßt. Die ermittelten apparenten Konstante für K m und V max sind für die untersuchten Substrate stark verschieden. Der Vergleich zeigt, daß die vom Insulinrezeptor abgeleiteten Substrate deutlich den künstlichen Substraten vorgezogen werden. Als ein sehr gutes Substrat erweist sich ferner ein rekombinantes Fragment, welches vom humanen IRS-1 abgeleitetet ist. Das 30 kda große Fragment hirs-1 p30 enthält die zentrale Phosphorylierungsdomäne dieses Insulinrezeptor-Signalproteins (Asp Pro 777 ) mit neun potentiellen Tyrosin- und neun potentiellen Serin-/ Threoninphosphorylierungsstellen. Das Protein wird durch Überexpression in E. coli und sequentielle Kationen- und Anionenaustausch-Chromatographie erhalten und wurde für diese Arbeit freundlicherweise von der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Müller-Wieland zur Verfügung gestellt (Siemeister et al. 1995). Als Maß für die katalytische Effizienz eines Enzyms gilt der Ausdruck k cat /K m, in den die Substratbindung und die Geschwindigkeit der Reaktion eingehen. Die katalytischen Effizienzen der natürlichen Substrate weisen eine, um bis zu zwei Zehnerpotenzen höhere, katalytische Effizienz auf, als die künstlichen Substrate Histon 2b und Myelin Basic Protein. 66

73 Ergebnisse Substrat app. K m [µm] app. V max [nmol min -1 mg -1 ] k cat [min -1 ] k cat /K m [M -1 min -1 ] Histon 2b 89 ± ± 12 3,9 4, MBP 322 ± ± 11 2,3 7, GST-JM 10,5 ± 0,5 2,3 ± 0,1 0,1 9, GST-Ex20 28 ± 6 53,9 ± 2,1 2,4 8, GST-CT 6,1 ± 0,5 117,0 ± 3,6 5,2 8, JM-Peptid 4,2 ± 0,2 81,7 ± 7,6 3,7 8, Ex20-Peptid 5,5 ± 0,6 17,4 ± 1,5 0,8 1, CT-Peptid 4,8 ± 0,5 13,2 ± 1,3 0,6 1, hirs-1 p30 11,9 ± 0,8 114,9 ± 18,6 5,2 4, Tab. 6.1: Apparente kinetische Konstanten der Substrate der IRKD. Unter den natürlichen Substraten heben das C-terminale Fusionsprotein und das aus der katalytischen Domäne des Rezeptors abgeleitete Substrat GST-Ex20 deutlich von den übrigen Proteinen hervor. Die GST-Fusionsproteine und die daraus durch Spaltung mit der Protease Faktor Xa erhaltenen Peptide zeigen Unterschiede in den einzelnen K m - als auch in den V max -Werten. Es ist bemerkenswert, daß die Abspaltung der GST-Fusionsproteinanteils bei allen Fusionsproteinen zu einer Erniedrigung des K m -Wertes führt. Im Gegensatz dazu erniedrigen sich die V max -Werte für das CT- und Ex20-Peptid, für das JM-Peptid wird eine Steigerung des V max -Wertes beobachtet. Insgesamt liegen aber alle erhaltenen K m -Werte für die vom Rezeptor abgeleiteten und natürlichen Substrate im niederen mikromolaren Bereich. Diese niedrigen Werte sind insofern interessant, da sich für kurze synthetische Peptide, die die entsprechenden Phosphorylierungsstellen beinhalten, K m -Werte ergeben, die millimolaren Konzentrationen entsprechen (Stadtmauer und Rosen 1986, Shoelson et al. 1992). Demnach ist für die Substraterkennung nicht nur die direkte Umgebung der Phosphorylierungsstelle entscheidend, vielmehr müssen auch Strukturen in weiter entfernten Regionen eine Rolle spielen. Ein Unterschied zu Serinkinasen sind die hier erhaltenen Wechselzahlen, die für alle Substrate sehr niedrige Werte ergeben; jedoch stimmen sie in den Größenordnungen mit gefundenen Werten für andere Tyrosinkinasen überein (Affüpper 1997, Al-Hasani 1995, Walker et al. 1987, Pike et al. 1984, Richert et al. 1982, Graziani et al. 1983). Demnach ist für die Signalweiterleitung der Rezeptorkinase nicht alleine die Quantität der Phosphorylierung und damit die Multiplikation des Signales entscheidend, vielmehr deutet dieser Befund auf eine hohe Qualität und Spezifität des Signals hin. Im folgenden wurde der Einfluß der Substitution der C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Phenylalanin untersucht. Dazu wurden die IRKD-Y1316/22F und die IRKD in Bezug auf die Substratphosphorylierung der GST-Fusionsproteine GST-CT und GST-Ex20 analysiert. Die Versuche wurden in Anwesenheit von 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP unter Verwendung des für fünf Minuten vorphosphorylierten Enzyms durchgeführt. (Abb. 6.3). Die Substitution der beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen in der IRKD-Y1316/22F führt zu einer Erniedrigung der jeweiligen V max -Werte für die Substrate, aber zu vergleichbaren apparenten K m -Werten. Im Vergleich zur IRKD (V max : 117,0 ± 3,6 nmol min -1 mg -1 ) ist der ermittelte apparente V max -Wert für das GST-CT-Fusionsprotein (V max : 26,3 ± 1,9 nmol min -1 mg -1 ) um den Faktor vier niedriger. Für den K m -Wert ergibt sich 7,4 ± 2,3 µm (IRKD: 6,06 ± 0,47 µm). Der apparenten V max -Wert des GST-Ex20 Fusionsproteins beträgt 37,7 ± 7,95 nmol min -1 mg - 1 (IRKD: 53,91 ± 2,1 nmol min -1 mg -1 ) und ist im Vergleich zur IRKD um den Faktor 1,5 niedriger. Für den apparenten K m -Wert wurden 4,75 ± 0,9 µm (IRKD: 2,78 ± 0,6 µm) ermittelt. Die Erniedrigung der V max -Werte deutet auf eine Kompetition der Substratphosphorylierung durch den C-Terminus hin, der durch eine Phosphorylierung der beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen aufgehoben zu werden scheint. 67

74 Ergebnisse A 3,0 2,5 IRKD -Y1316/22F B 10 8 IRKD -Y1316/22F 1/ V [min/pmol] 2,0 1,5 1,0 0,5 IRKD 1/ V [min/pmol] IRKD 0,0-0,2-0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 GST-CTmut [1/µM] 0-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 GST-Ex20 [1/µM] Abb. 6.3: Vergleich der Substratphosphorylierung von GST-CT und GST-Ex20 durch die IRKD und IRKD-Y1316/22F. Die Versuche wurden in Anwesenheit von 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und für 5 Minuten vorphosphorylierter IRKD-Y1316/22F durchgeführt. A: Lineweaver-Burk Diagramm der Phosphorylierung des GST-CT-Fusionsproteins B: Lineweaver-Burk-Diagramm der Phosphorylierung des GST-Ex20- Fusionsproteins 6.3 Einfluß von Substraten auf die Autophosphorylierung der IRKD Die Autophosphorylierung des Insulinrezeptors und der löslichen Kinase gilt als der eigentliche Schritt für die Aktivierung der enzymatische Aktivität. Dieser Vorgang führt beim Rezeptor zu einer Steigerung der Kinaseaktivität um den Faktor durch Erhöhung des V max -Wertes in der Phosphotransferasereaktion bezüglich exogener Substrate (White et al. 1984, Kwok et. al. 1886). Für die lösliche Kinase wurden Steigerungen um einen Faktor von berichtet (Cobb et. al 1989, Al- Hasani 1995, Lehr 1995, Goder 1995). Die Anwesenheit exogener Substrate führt dagegen zur Inhibition der Autophosphorylierung sowohl des Insulinrezeptors als auch seiner löslichen Kinase, wenn eine vorherige Phosphorylierung unterbleibt (Cobb et. al. 1989, White et al. 1988, Al-Hasani 1995, Goder 1995, Kohanski und Lane 1986, Flores-Riveros et al. 1989). Im folgenden wurde untersucht, welchen Einfluß die Anwesenheit exogener Substrate auf die Autophosphorylierungsreaktion des Enzyms hat. Im Versuch wurden Phosphorylierungen mit variierenden Substratkonzentrationen für 20 Minuten durchgeführt. Als Substrate dienten das C-terminale GST-Fusionsprotein (GST-CT), das rekombinante Fragment des humanen IRS-1 (hirs-1 p30), Histon 2b und Myelin Basic Protein. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP. Die Reaktionen wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten die Reaktion mittels Zugabe von SDS- Probenpuffer beendet. Durch SDS-PAGE wurden Substrat und Kinase voneinander getrennt, die radioaktiv markierten Banden nach Autoradiographie des getrockneten Gels lokalisiert und der Phophateinbau durch Messung der Cerenkov-Strahlung bestimmt. Anschließend wurde nach tryptischer Elution der erhaltenen Gelbanden eine Phosphoaminosäureanalyse durchgeführt (Abb. 6.4). In Anwesenheit der Substrate wird eine deutliche Inhibition der Autophosphorylierung der Kinase mit zunehmender Substratkonzentration erkennbar. Obwohl sich die verwendeten Substrate deutlich in ihren kinetischen Konstanten unterscheiden lassen (Tab. 6.1), wird die halbmaximale Inhibition dieser Reaktion (EC 50 ) in allen Fällen bei Konzentrationen erreicht, die in etwa dem K m -Wert des jeweiligen Substrates entspricht. Diese Inhibition bewirkt gleichzeitigt eine deutliche Abnahme auch der Serinautophosphorylierung der Kinase. Die Hemmung der Serinphosphorylierung setzt, im Gegensatz zu der Hemmung der Gesamtphosphorylierung, schon bei wesentlich geringeren Substratkonzentrationen ein. Die Anwesenheit hoher Substratkonzentrationen wirkt sich aber nicht auf die Phosphotransferaseaktivität des Enzyms aus. 68

75 A Phosphateinbau [mol/mol] B Phosphateinbau [mol/mol] C Phosphateinbau [mol/mol] D Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt GST-CT [µm] 5 Gesamt hirs-1 p30 [µm] 5 Gesamt H2b [µm] 5 Gesamt MBP [µm] Phosphateinbau [mol/mol] Phosphateinbau [mol/mol] Phosphateinbau [mol/mol] Phosphateinbau [mol/mol] 1,2 Phosphoserin 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, ,0 0,8 0,6 0,4 0,2 GST-CT [µm] 1,2 Phosphoserin 0, hirs-1 p30 [µm] 1,2 Phosphoserin 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, H2b [µm] 1,2 Phosphoserin 1,0 0,8 0,6 0,4 0, MBP [µm] Phosphattransfer [pmol] Phosphattransfer [pmol] Phosphattransfer [pmol] Phosphattransfer [pmol] 200 GST-CT GST-CT [µm] 300 hirs-1 p hirs-1 p30 [µm] 800 H2b H2b [µm] 250 MBP MBP [µm] Ergebnisse Abb. 6.4: Einfluß der Substratkonzentration auf die Autophosphorylierungsreaktion der IRKD. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und variierende Konzentrationen der jeweiligen Substrate. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der IRKD gestartet und nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE und Bestimmung des Phosphateinbaus in das Enzym und das Substrat erfolgte die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung. Anordnung der Diagramme: Links: Gesamtphosphateinbau in die IRKD, Mitte: Serinphosphatgehalt der IRKD, Rechts: Phosphatinkorporation in das Substrat. Konzentrationsabhängigkeit in Anwesenheit von: A: GST-CT, B: hirs-p30, C: Histon 2b, D: Myelin Basic Protein. 69

76 Ergebnisse Mit steigenden Substratkonzentrationen wird gleichzeitig eine Zunahme der inkorporierten Radioaktivität in die Substrate beobachtet. Demnach deutet die Substrathemmung der Autophosphorylierungsreaktion nicht auf eine Hemmung der Kinaseaktivität per se, sondern auf eine Kompetition der Autophosphorylierung und Substratphosphorylierung. Diese scheint sich spezifisch auf die Serinphosphorylierung im C-Terminus aber auch aufgrund der erniedrigten Phosphatinkorporation in das Enzym auf Tyrosinphosphorylierungsstellen auszuwirken (Abb. 6.4). Im folgenden Experiment wurde untersucht, welche Unterschiede in der Besetzung der einzelnen Phosphorylierungsstellen im Enzym im Vergleich zur nicht gehemmten Reaktion zu beobachten sind. Dazu wurden Phosphorylierungsreaktionen in Anwesenheit hoher Substratkonzentrationen durchgeführt, Kinase und Substrat durch SDS-PAGE getrennt und das Enzym anschließend durch Phosphopeptidkartierung analysiert. Abbildung 6.5 zeigt die repräsentativen Chromatogramme der IRKD in Ab- bzw. Anwesenheit von 50 µm GST-CT. Deutlich ist zu erkennen, daß die Reduktion des Phosphateinbaus in das Enzym auf die Inhibition der Phosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne zurückzuführen ist. Während in der ungehemmten Kinase mono- (c), bis- (d, e) und tris- (g) phosphorylierte Peptide der katalytischen Domäne nachweisbar sind, wird bei Anwesenheit des Substrates hauptsächlich Phosphatinkorporation in mono-phosphorylierten Peptiden detektierbar. Die Inhibition wirkt sich ebenfalls auf die Besetzung der Serinphosphorylierungsstellen aus, die im gehemmten Enzym nicht mehr nachweisbar sind (Fraktion a und f). Die Anwesenheit des C-terminalen Peptids führt aber nicht zu einer Inhibition der C-terminalen Phosphorylierungsstellen im Enzym (Fraktion b), wodurch eine kompetitive Hemmung speziell dieser Phosphatakzeptorstellen ausgeschlossen werden muß. Die Hemmung der Autophosphorylierungsreaktion der IRKD durch andere Substrate führt immer zu einer vergleichbaren Besetzung der Autophosphorylierungsstellen im Enzym (Daten nicht gezeigt). In jedem Fall sind die katalytische Domäne und die Serinphosphorylierungsstellen von der Inhibition betroffen, die C-terminalen Phosphatakzeptorstellen und die phosphorylierten mono-formen der katalytischen Domäne sind die prominenten Peaks in den jeweiligen Chromatogrammen. Daher kann bei Anwesenheit exogener Substrate immer von einer gleichartigen Hemmung des Enzyms ausgegangen werden. Da die Phosphotransferaseaktivität auf die exogenen Substrate allerdings unbeeinflußt bleibt, ergibt sich, daß für diese Reaktion die volle Besetzung der Tyrosinphosphorylierungsstellen in der katalytischen Domäne keine notwendige Voraussetzung für die Substratphosphorylierung ist. A B Radioaktivität a b c d f e g Radioaktivität b c Fraktion Fraktion Abb. 6.5: Einfluß hoher Substratkonzentrationen auf die Besetzung der Autophosphorylierungsstellen der IRKD. Jeweils 1 µm IRKD wurden in Ab- bzw. Anwesenheit von 50 µm GST-CT in Gegenwart von 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP für 20 Minuten phosphoryliert, die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und die erhaltenen Gelbanden tryptisch eluiert. Im Anschluß erfolgte die Auftrennung der tryptischen Peptide durch Anionenaustausch-Chromatographie. A: In Abwesenheit von Substrat. B: In Anwesenheit von 50 µm GST-CT. 70

77 Ergebnisse 6.4 Die Serinphosphorylierung exogener Substrate Die Fähigkeit zur Phosphotransferasereaktion der IRKD wird durch die Anwesenheit exogener Substrate nicht beeinflußt, während die Phosphatinkorporation in der Autophosphorylierungsreaktion stark gehemmt zu werden scheint. Aufgrund der Beobachtung, daß eine Vorphosphorylierung des Enzyms zu einer gesteigerten Phosphotransferaseaktivität gegenüber Substraten führt (White et al. 1984, Kwok et al. 1986, Al-Hasani 1995), scheint die beobachtete Hemmung auf eine generelle Kompetition der Kinaseautophosphorylierung hinzudeuten. Dabei ergeben sich Unterschiede in der Besetzung einzelner Autophosphorylierungsstellen im Enzym. Vor allem ist die Phosphorylierung der katalytischen Domäne und der Serinphosphorylierungsstellen betroffen. Die halbmaximale Hemmung dieser Reaktion wird bei Substratkonzentrationen erreicht, die in etwa den jeweiligen K m -Werten entsprechen. Diese Beobachtungen führten zu der Fragestellung, ob sich in Abhängigkeit ihrer Konzentration auch Unterschiede in den Phosphorylierungsmustern der Substrate erkennen lassen. Im folgenden wurde zunächst die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Modellsubstrate Histon 2b und Myelin Basic Protein aus dem Experiment aus Kapitel 6.3 untersucht. Dazu wurden die hier erhaltenen Proteinbanden tryptisch eluiert und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Substrate analysiert. In beiden Fällen kommt es bei der Phosphorylierung dieser Substrate unabhängig von der Substratkonzentration ausschließlich zur Tyrosinphosphorylierung (Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu kann in dem C-terminalen Fusionsprotein und überraschenderweise auch in hirs-1 p30 eine Serinphosphorylierung in Abhängigkeit von der eingesetzten Substratkonzentration detektiert werden. Die Beobachtung einer Serinphosphorylierung in einem Substrat durch die IRKD ist bislang ein nicht beschriebenes Ereignis und wird in den folgenden Abschnitten näher charakterisiert Die Serinphosphorylierung des C-terminalen Fusionsproteins GST-CT Das GST-CT-Fusionsprotein umfaßt die Aminosäuren Asn Ser 1343 aus der IR-Sequenz und enthält somit die vier C-terminalen Autophosphorylierungsstellen des Rezeptors Tyr 1316, Tyr 1322, Ser 1275 und Ser Abbildung 6.6 zeigt eine repräsentative Autoradiographie auf Grundlage der im Kapitel 6.3 beschriebenen Versuche. Die Zunahme der Substratkonzentrationen führt, wie erwartet, zu einer erhöhten Phosphatinkorporation in das Substrat. Die Inhibition der Autophosphorylierung des Enzyms wirkt sich in der Abnahme des apparenten Molekulargewichts aus. Die Auswertung der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung des Substrates zeigt, daß bei Verwendung einer hohen Substratkonzentration ( 10facher K m ) nur ein geringer Phosphoserinanteil detektiert wird (< 5 %), während bei einer niedrigen Konzentration ein Serinphosphatanteil von 30 % erhalten wird. Dieses Ergebnis wurde durch die Auswertung der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung des GST-CT-Fusionsproteins in Abhängigkeit von seiner Konzentration aus dem Versuch 6.3 bestätigt (Abb. 6.7). Mit zunehmender Substratkonzentration wird eine Abnahme in der prozentualen Verteilung der Serinphosphorylierung im Substrat beobachtet. Allerdings kehren sich die Verhältnisse um, wenn dieses auf den Phosphotransfer bezogen wird. Mit steigenden Substratkonzentrationen werden mehr Phosphate auf Serinreste des Substrates als der Kinase übertragen. Während in Anwesenheit von 50 µm GST-CT nur etwa 1-2 pmol der Serinphosphate in der Kinase wiedergefunden werden (Kap. 6.3), sind im Substrat etwa 12 pmol enthalten. Dieses könnte auf eine Kompetition der Kinaseeigenen und der Serinphosphorylierungsstellen des Substrates hinweisen. Wird die Serintransferaseaktivität auf den molaren Einbau bezogen, ergibt sich, daß nur ca. 0,02 mol Serin pro mol Substrat erhalten werden, während die Kinase etwa 5 mal mehr phosphorylierte Serinreste enthält. Bei einer Substratkonzentrationen von 5 µm, bei der es zu einer Inhibition der Autophosphorylierung der Kinase von etwa 50 % kommt, werden dagegen etwa 0,8 mol/mol Phosphoserin in der Kinase und 0,2 mol/mol im Substrat erhalten. Der unterschiedliche spezifische Einbau von Phosphaten in Serinresten des Substrates kann demzufolge nur durch Unterschiede in der Besetzung der einzelnen Phosphorylierungstellen erklärt werden. Zur Analyse dieser Zusammenhänge wurde das bei 5 und 50 µm phosphorylierte Substrat hinsichtlich der Identität seiner Phosphorylierungsstellen durch Phosphopeptidkartierung analysiert (Abb. 6.8). 71

78 Ergebnisse A IRKD GST-CT B ps ps py py GST-CT (50 µm) GST-CT (5 µm) Abb. 6.6: Substratphosphorylierung des GST-CT-Fusionsproteins durch die IRKD. Der Versuch wurde in Analogie zu den Experimenten aus Kap. 6.3 durchgeführt. A: Autoradiographie nach SDS-PAGE. 1: IRKD nach 20minütiger Autophosphorylierung in Abwesenheit eines Substrates. 2: IRKD + 5 µm GST-CT-Fusionsprotein 3: IRKD + 50 µm GST-CT-Fusionsprotein B: Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der GST-CT-Fusionsproteine aus Abb. 6.6 A. Autoradiographie nach zweidimensionaler Phosphoaminosäureanalyse P-Ser [%] Phosphattransfer [pmol] P-Ser GST-CT [µm] Abb. 6.7: Einfluß der Substratkonzentration auf den Phosphoseringehalt des GST-CT-Fusionsproteins. Die Auswertung der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung des GST-CT-Fusionsproteins bezieht sich auf die Analyse der in Kap. 6.3 durchgeführten Versuche. 72

79 Ergebnisse b a Radioaktivität f GST-CT 5 µm GST-CT 50 µm Fraktion Abb. 6.8: Phosphopeptidkartierung des GST-CT-Fusionsproteins. 5 µm und 50 µm GST-CT wurden für 20 Minuten durch die IRKD phosphoryliert, die Proteine anschließend durch SDS-PAGE getrennt und die erhaltenen Gelbanden tryptisch eluiert. Im Anschluß erfolgte die Trennung der Phosphopeptide durch Anionenaustausch-Chromatographie. Nach Tabelle 4.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten zu den jeweiligen Phosphopeptiden. Die Auswertung der Elutionsprofile zeigt, daß die Phosphopeptide vom GST-CT-Fusionsprotein in gleicher Weise wie die entsprechenden Phosphopeptide der IRKD von der Säule eluieren (Kap , Abb. 4.6). In dem korrespondierenden Elutionsprofil des Substrates, welches in einer Konzentration von 50 µm in die Reaktion eingesetzt wurde, werden zwei prominente Peaks erhalten, die der Sequenz SYEEHIPYTHMNGGK zugeordnet werden können. Dabei handelt es sich bei dem Peak der Fraktion um eine Form dieses Peptids, in welchem der Tyrosinrest 1316 oder 1322 phosphoryliert vorliegen kann. Diese mono-form kann im allgemeinen in der Phosphopeptidkartierung der IRKD nicht beobachtet werden. Der zweite Peak enthält die bis-phosphorylierte Form dieses Peptids (Fraktion b). Beide Formen liegen ungefähr in einem 1 : 2-Verhältnis vor. Eine geringe Menge an Radioaktivität enthält das Serinpeptid Ser 1309 (Fraktion a), während das Serinpeptid Ser 1275 (Fraktion b) nicht detektiert werden kann. Im Gegensatz dazu wird im Substrat, welches in einer Konzentration von 5 µm in die Phosphorylierungsreaktion eingesetzt wurde, nur die bis-phosphorylierte Form des Peptids gefunden (Fraktion b), welches die beiden Tyrosinphosphorylierungsstellen enthält. Weiterhin können die beiden Serinpeptide entsprechend ihrer Retentionszeiten identifiziert werden (Fraktion a und f). Relativ zur eluierten Gesamtradioaktivität finden sich etwa 13 % und 11 % der inkorporierten Phosphate in den Phosphopeptiden mit den Serinphosphorylierungsstellen Ser 1275 und Ser Damit ergibt sich wie schon in der Analyse der Phosphoaminosäurezusammensetzung des Gesamtproteins ein ähnliches Ergebnis. Weiterhin zeigt das Experiment, daß tatsächlich qualitative Unterschiede in der Besetzung der einzelnen Phosphorylierungsstellen bestehen, wenn das Substrat unter niedrigen oder hohen Konzentrationen in die Phosphorylierungsreaktion eingesetzt wird. Eine niedrige Substratkonzentration führt zu der Besetzung aller Phosphorylierungsstellen, während bei der hohen Substratkonzentration die Besetzung der Tyrosinphosphorylierungsstellen bevorzugt werden. Die Möglichkeit, spezifisch die beiden Serinreste Ser 1275 und Ser 1309 in dem C-terminalen Fusionsprotein phosphorylieren zu können, sollte im folgenden hinsichtlich ihrer Kinetik untersucht werden. Dazu wurden zeitabhängige Substratphosphorylierungsreaktionen durchgeführt. Die Ansätze 73

80 Ergebnisse enthielten 5 bzw. 50 µm GST-CT-Fusionsprotein, 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 µm Kinase gestartet, nach den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen und die Reaktionen mittels Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Autoradiographie und Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität durch Messung der Cerenkov- Strahlung im β-counter wurden die Gelbanden durch tryptischen Verdau eluiert und die Phosphoaminosäurezusammensetzung der Kinase und des Substrates analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Abbildung 6.9 dargestellt. A 5 IRKD B 80 5 µm GST-CT Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser Phosphattransfer [pmol] Gesamt P-Ser Zeit [min] Zeit [min] C 2,0 IRKD D µm GST-CT Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser 1,5 1,0 0,5 Phosphattransfer [pmol] Gesamt P-Ser , Zeit [min] Zeit [min] Abb. 6.9: Zeitabhängigkeit der Substratphosphorylierung des GST-CT-Fusionsproteins durch die IRKD. Die Reaktionsansätze enthielten 5 bzw. 50 µm Fusionsprotein, 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS- PAGE aufgetrennt. Im Anschluß wurde der spezifische Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Kinase und des Substrates bestimmt. Phosphateinbau und Phosphoaminosäure-Zusammensetzung: A: der IRKD in Anwesenheit von 5 µm GST-CT, B: des GST-CT (5 µm), C: der IRKD in Anwesenheit von 50 µm GST-CT, D: des GST-CT (50 µm). 74

81 Ergebnisse Sowohl die Autophosphorylierung der Kinase als auch der Phosphotransfer auf 5 µm GST-CT beschreiben einen Sättigungsverlauf (Abb. 6.9 A, B). Die Kinase inkorporiert nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten 3,4 mol Phosphat pro mol Molekül. Die Initialgeschwindigkeit der Reaktion beträgt in diesem Versuch 104 nmol min -1 mg -1 und ist damit niedriger als in einer Autophosphorylierungsreaktion ohne Substrat (Kap. 4.3). Die Anwesenheit des Substrates führt zu einer Reduktion der maximalen Phosphatinkorporation in Serinreste um 50 %, beeinträchtigt aber die Initialgeschwindigkeit dieser Phosphorylierung nur unwesentlich. Der maximale Phosphateinbau in Serinreste beträgt 0,5 mol/mol, aus dem linearen Anteil der Kurve ergibt sich die Initialgeschwindigkeit mit 4 nmol min -1 mg -1. Auf das Substrat werden nach 20 Minuten Reaktionszeit 60 pmol Phosphate übertragen, wovon 12 pmol in Serinresten enthalten sind. Für die Initialgeschwindigkeit des Phosphotransfers auf das Substrat (5 µm) ergeben sich 42 nmol min -1 mg -1, die Initialgeschwindigkeit der Serinphosphorylierung kann mit 3,5 nmol min -1 mg -1 angegeben werden. In Anwesenheit von 50 µm Substrat ist die Autophosphorylierung der Kinase stark gehemmt (Abb. 6.9 C). Die Autophosphorylierungsreaktion des Enzyms wird durch eine Sättigungskurve beschrieben, jedoch ist im Vergleich zur Reaktion ohne bzw. mit 5 µm Substrat die Reaktion auch nach 20 Minuten noch nicht abgeschlossen, der Phosphateinbau nach dieser Reaktionszeit beträgt 1,4 mol/mol. Die Initialgeschwindigkeit der Reaktion ergibt sich zu 6 nmol min -1 mg -1 und ist damit um den Faktor 25 niedriger als die einer Autophosphorylierungsreaktion in Abwesenheit von Substrat. Im Enzym ist in der initialen Phase der Reaktion keine Serinphosphorylierung zu detektieren, nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten beträgt der prozentuale Anteil etwa 5 % und damit 0,1 mol/mol. Der Phosphateinbau in das Substrat wird durch einen biphasischen Verlauf beschrieben, die Initialgeschwindigkeit der Reaktion beträgt 4,8 nmol min -1 mg -1 (Abb. 6.9 D). Nach etwa 2,5 Minuten kommt es aber zu einem deutlichen Anstieg der Phosphotransferaseaktivität, nach 20 Minuten Reaktionszeit werden 168 pmol Phosphat auf das Substrat übertragen. Wie schon für die Kinase beschrieben, sind in den ersten Minuten der Reaktion keine phosphorylierten Serinreste nachweisbar, nach Beendigung der Reaktion ergibt sich ein Phosphoseringehalt von 14 pmol Die Serinphosphorylierung des C-terminalen Fusionsproteins GST-CTphe Um zu überprüfen, ob die Tyrosinphosphorylierung eine Voraussetzung für die Besetzung der beiden Serinphosphorylierungsstellen im Substrat GST-CT ist, wurde das GST-Fusionprotein GST-CTphe konstruiert. Das Protein umfaßt die identischen Aminosäuresequenz wie GST-CT, allerdings sind die beiden Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Phenylalanin substituiert (Kap ). Das Substrat wurde in Analogie zu Kap in den Konzentrationen 5 und 50 µm in einer Substratphosphorylierungsreaktion für 20 Minuten eingesetzt. Die Ansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der IRKD gestartet und nach 20 Minuten mittels Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE wurden der Phosphateinbau in den Kinasen und den Substraten bestimmt (Abb. 6.10). GST-CTphe wird wie GST-CT von der Kinase erkannt und phosphoryliert (Abb A). Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten werden bei einer Substratkonzentration von 5 µm 22 pmol, bei einer Konzentration von 50 µm 10 pmol Phosphat auf das Substrat übertragen. Dieser Befund ist insofern erstaunlich, da hier eine höhere Substratkonzentration nicht unweigerlich zu einer erhöhten Phosphatinkorporation im Substrat führt, wie es bei anderen Substraten gezeigt werden konnte (Kap. 6.3 und 6.4.1). Die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung durch zweidimensionale Elektrophorese zeigt für beide Substratkonzentrationen einen hohen Phosphoseringehalt (Abb B). Das Auftreten von Phosphotyrosin ist insofern verwunderlich, da in der Sequenz des Fusionproteins keine Tyrosinphosphorylierungsstelle mehr existiert. Wahrscheinlich handelt es sich deshalb bei der beobachteten Tyrosinphosphorylierung um eine unspezifische Phophorylierung eines Tyrosinrestes im GST-Fusionsanteil. 75

82 Ergebnisse A IRKD GST-CTphe B ps ps py py 5 µm GST-CTphe 50 µm GST-CTphe Abb. 6.10: Substratphosphorylierung des GST-CTphe-Fusionsproteins durch die IRKD. Die Ansätze enthielten 5 und 50 µm GST-CTphe, 1 µm Poly(Lysin), 250 µm ATP und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet. Nach Abstoppen der Reaktion nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS- Probenpuffer und Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE erfolgte zur Lokalisation der Proteinbanden eine Autoradiographie und die Bestimmung des Phosphateinbaus in die Proteine. Nach tryptischer Elution der erhaltenen Gelbanden wurde eine Analyse der Phosphoaminosäure- Zusammensetzung durch zweidimensionale Elektrophorese durchgeführt. A: Autoradiographie nach SDS-PAGE. 1: IRKD nach 20minütiger Autophosphorylierung in Abwesenheit eines Substrates. 2: IRKD + 5 µm GST-CTphe-Fusionsprotein. 3: IRKD + 50 µm GST-CTphe-Fusionsprotein. Das vermeintlich stärkere visuelle Signal in Bahn 3 ist aufgrund einer längeren Expositionszeit des Films bedingt. B: Phosphoaminosäureanalyse des GST-CTphe-Fusionsproteins. Autoradiographie nach zweidimensionaler Elektrophorese. Radioaktivität a f 5 µm GST-CTphe 50 µm GST-CTphe Fraktion Abb. 6.11: Phosphopeptidkartierung des GST-CTphe-Fusionsproteins. Ein Teil der tryptischen Eluate der Fusionsproteine aus Abb wurde durch Phosphopeptidkartierung analysiert. Nach Tabelle 5.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten zu den Phosphopeptiden. 76

83 Ergebnisse Im folgenden wurde die Besetzung der Phosphorylierungsstellen im Substrat durch die Methode der Phosphopeptidkartierung untersucht (Abb. 6.11). Die Analyse zeigt eindeutig, daß die beobachtete Serinphosphorylierung im GST-CTphe-Fusionsprotein auf die Phosphorylierung der beiden C-terminalen Serinphosphorylierungsstellen zurückzuführen ist. Allerdings ergeben sich Unterschiede in der relativen Verteilung der Phosphate in die einzelnen Positionen. Bei der niedrígen Substratkonzentration werden beide Serinreste gleichermaßen phosphoryliert, bei der hohen Substratkonzentration scheint die Phosphorylierung des Serinrestes Ser 1309 bevorzugt zu sein (Fraktion a), eine Auffälligkeit, die auch schon für das GST-CT Protein beobachtet werden konnte. In Analogie zum GST-CT-Fusionsprotein wurde eine detaillierte Analyse der Zeitabhängigkeit einer Substratphosphorylierungsreaktion des GST-CTphe-Fusionsproteins durch die IRKD durchgeführt. Dabei wurde der Einfluß des Substrates sowohl auf die Autophosphorylierung und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der IRKD, als auch der Phosphotransfer auf das Substrat untersucht (Abb. 6.12). A 5 IRKD B 30 5 µm GST-CTphe Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser C Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser ,0 1,5 1,0 0,5 Zeit [min] IRKD 0, Zeit [min] D Phosphattransfer [pmol] Gesamt P-Ser Phosphattransfer [pmol] Gesamt P-Ser Zeit [min] 50 µm GST-CTphe Zeit [min] Abb. 6.12: Zeitabhängigkeit der Substratphosphorylierung von GST-CTphe. Die Reaktionsansätze enthielten 5 bzw. 50 µm Fusionsprotein, 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt. Im Anschluß wurde der spezifische Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Kinase und des Substrates bestimmt. Phosphateinbau und Phosphoaminosäure-Zusammensetzung A: der IRKD in Anwesenheit von 5 µm GST-CTphe, B: des GST-CTphe (5 µm), C: der IRKD in Anwesenheit von 50 µm GST-CTphe, D: des GST-CTphe (50 µm). 77

84 Ergebnisse Bei einer Substratkonzentration von 5 µm werden die Autophosphorylierung der Kinase und der Phosphotransfer auf das Substrat durch eine Sättigungskurve beschrieben (Abb A, B). Die Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierungsreaktion beträgt 117 nmol min -1 mg -1, die des Phosphotransfers auf GST-CTphe 10 nmol min -1 mg -1. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten werden in der Kinase 3,5 mol/mol in der Kinase und 22 pmol Phosphat im Substrat erhalten. Der spezifische Serinphosphatanteil in der IRKD ergibt sich zu 0,6 mol/mol, die Initialgeschwindigkeit dieser Reaktion beträgt 1,7 nmol min -1 mg -1. Unter Berücksichtigung der unspezifischen Tyrosinphosphorylierung werden nach 20 Minuten Reaktionszeit im Substrat 16 pmol Phosphoserin detektiert, für die Initialgeschwindigkeit der Reaktion ergeben sich 4 nmol min -1 mg -1. Im Vergleich dazu ist die Autophosphorylierungsreaktion der Kinase in Anwesenheit von 50 µm Substrat stark inhibiert (Abb C). Nach 20 Minuten wird eine spezifische Phosphatinkorporation von 1,4 mol/mol erhalten, die Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierung beträgt 4,5 nmol min -1 mg -1. In der initialen Phase der Reaktion ist keine Serinphosphorylierung des Enzyms zu detektieren, nach 20 Minuten beträgt der Serinphosphatanteil 0,1 mol/mol. Wie schon für das GST-CT-Fusionsprotein beobachtet, beschreibt der Phosphotransfer auf das Substrat einen biphasischen Verlauf (Abb D). Die Initialgeschwindigkeit der Reaktion beträgt 13 nmol min -1 mg -1, die Phosphatinkorporation nach 20 Minuten Reaktionszeit 10 pmol. Für die Serinphosphorylierung ergibt sich eine Initialgeschwindigkeit von 0,4 nmol min -1 mg -1 und eine maximale Phosphatinkoporation von 8 pmol. Der Versuch zeigt, daß das Vorhandensein der Tyrosinphosphorylierungsstellen keine Voraussetzung für die Kinase katalysierte Phosphorylierung der Serinphosphorylierungsstellen im Substrat ist. Im Vergleich zum GST-CT-Fusionsprotein werden nahezu dieselben kinetische Konstanten für die Serinphosphorylierung erhalten. Interessanterweise findet sich auch dieselbe Beeinflussung der IRKD- Autophosphorylierung, welches zeigt, daß nicht alleine ein erhöhter Phosphotransfer auf die Tyrosinphosphorylierungsstellen des Substrates Ursache für die gefundene Hemmung der Phosphatinkorporation in die Kinase sein kann. Vielmehr scheint das Fusionsprotein eine Art Pseudosubstrat für die IRKD darzustellen. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit der gefundenen Michaelis-Konstante für dieses Substrat. In Analogie zu den Experimenten aus Kap. 6.2 wurde die initiale Geschwindigkeit des Phosphotransfers in Gegenwart variierender GST-CTphe Konzentrationen untersucht. Die Reaktionsansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin) und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der zuvor für 5 Minuten autophosphorylierten Kinase gestartet und nach einer Reaktionszeit von 0,5 bzw. 1 Minute durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennen der Proteine durch SDS-PAGE wurde die inkorporierte Radioaktivität durch Messung der Cerenkov- Strahlung ermittelt (Abb. 6.13). 20 0,3 Phosphateinbau [pmol/min] Phosphateinbau [min/pmol] 0,2 0, GST-CTphe [µm] 0,0-0,8-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 GST-CTphe [1/µM] Abb. 6.13: Substratphosphorylierung von GST-CTphe durch die IRKD. Die Ansätze enthielten 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin) und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe des für fünf Minuten vorphosphorylierten Enzyms gestartet und nach 0,5 min durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE erfolgte die Bestimmung des Phosphateinbaus durch Messung der Cerenkov-Strahlung. A: Initialgeschwindigkeiten des Phosphotransfers. B: Doppelt reziproke Lineweaver-Burk-Auftragung. 78

85 Ergebnisse Die Analyse der Initialgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration ergibt einen apparenten K m -Wert von 2 µm. Aus den niedrigen Initialgeschwindigkeiten, die für die Serinphosphorylierung charakteristisch sind, resultiert eine größere Fehlerbreite, in der Größenordnung scheint er aber dem gefundenen apparenten K m -Wert für das GST-CT-Fusionsprotein zu entsprechen (Kap 6.2). Demnach ergibt sich eine vergleichbare Affinität dieses Substrates zur Kinase. Im Vergleich zu dem ermittelten V max -Wert für das GST-CT-Fusionsprotein ist der apparente V max Wert erwartungsgemäß sehr gering, er beträgt 25 nmol min -1 mg -1. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres C-terminales Fusionsprotein konstruiert, in welchem die beiden Tyrosinphosphorylierungsstellen gegen Threonin substituiert wurden (Kap. 6.1). Dieses Fusionsprotein wird wie das GST- CTphe ausschließlich an den beiden Serinresten Ser 1275 und Ser 1309 phosphoryliert und besitzt vergleichbare kinetischen Konstanten in der Substratphosphorylierung (Daten nicht gezeigt) Die Serinphosphorylierung des hirs-1 p30 Eines der wichtigsten Zielproteine für die Signalweiterleitung des Insulinrezeptors ist das Insulinrezeptorsubstrat-1 (IRS-1). Das Protein wird durch die Insulinrezeptorkinase an mehreren Tyrosinphosphorylierungsstellen phosphoryliert. Daneben ist für dieses Protein auch die Phosphorylierung an Serinresten beschrieben. Als Folge dieser Phosphorylierungen ergibt sich eine Desensitivierung des Insulinsignales (s. Einleitung). Einige der Serinphosphorylierungsstellen konnten durch Mothe et al. identifiziert werden (1996). Es zeigte sich, daß diese Phosphorylierungsstellen alle im zentralen Bereich des Moleküls in direkter Nachbarschaft zu dem Insulinrezeptor zugänglichen Tyrosinphosphorylierungsstellen lokalisiert sind. Das rekombinante Fragment hirs-1 p30 umfaßt 262 Aminosäuren (Asp Pro 777, MW: 30,3 kda) und enthält diese potentiellen Tyrosin- und Serinphosphorylierungsstellen. Bisher war für dieses Protein nur eine signifikante Tyrosinphosphorylierung durch die lösliche Insulinrezeptorkinase beschrieben (Siemeister et al. 1995). Das Substrat wurde mit dem 10fachen des K m -Wertes für diese Untersuchung eingesetzt. Die aus der Untersuchung der Inhibition der IRKD-Autophosphorylierung gewonnene Erkenntnis, daß bei niedrigen Konzentrationen eine Serinphosphorylierung auch in einem Substrat erhalten werden kann, konnte von Parvaresch (persönliche Mitteilung) auf das hirs-1 p30 übertragen werden. Die Konzentrationsabhängigkeit wurde im folgenden näher analysiert. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm IRKD und variierende Substratkonzentrationen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet, nach 20 Minuten durch SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS-PAGE getrennt (Abb A). Im Anschluß daran wurde der Phosphateinbau bestimmt und eine Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung durchgeführt (Abb B). In Anwesenheit von 25 µm IRS-1 p30 ist die Autophosphorylierung der Kinase deutlich inhibiert. Die Abnahme der Substratkonzentration im Reaktionsansatz führt zu einer verminderten elektrophoretischen Mobilität des Enzyms und des Substrates. Die beobachteten veränderten elektrophoretischen Mobilitäten sind wahrscheinlich auf eine Abnahme der spezifischen SDS-Bindung zurückzuführen und belegen damit indirekt eine zunehmende Besetzung von Phosphorylierungsstellen in den Proteinen. Die zweidimensionale Phosphoaminosäureanalyse des Proteins bei einer Substratkonzentration von 25 µm zeigt einen prozentualen Anteil von 5 % Phosphoserin an der Gesamtphosphorylierung (Abb B). Bei einer Substratkonzentrationen von 5 µm ist eine starke Zunahme des Phosphoserinanteils zu erkennen (25 % der Gesamtphosphorylierung). Interessanterweise ist auch die Phosphorylierung an Threoninresten zu beobachten (10 % der Gesamtphosphorylierung). Die Möglichkeit der Kinase, auch Threoninreste als Phosphorylakzeptor zu tolerieren, konnte bisher nur für die Autophosphorylierung der IRKD-HIS beschrieben werden, die einen Threoninrest aus dem N- terminalen Histidin-Fusionsproteinanteil als Phosphorylierungsstelle erkennt (Al-Hasani 1995). Dieser Versuch bestätigt, daß eine effiziente Serinphosphorylierung in einem Substrat durch die lösliche Rezeptorkinase katalysiert werden kann, wenn geringe Substratkonzentrationen vorliegen. Weitaus wichtiger ist aber die Tatsache, daß diese Serinphosphorylierung in einem natürlichen Signalprotein der Kinase erhalten wird, wodurch sich möglicherweise neue Erkenntnisse in der Signalweiterleitung des Insulinrezeptors gewinnen lassen können. 79

86 Ergebnisse A IRKD - hirs1-p30 - B py p H 3. ph [µm hirs1-p30] ps pt py hirs1-p30 (25 µm) hirs1-p30 (5 µm) Abb. 6.14: Substratphosphorylierung von hirs-1 p30 durch IRKD in Abhängigkeit von der Substratkonzentration. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP (spez. Radioaktivität 1145 cpm/pmol ATP), 1 µm IRKD und variierende Substratkonzentrationen hirs-1 p30. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten durch SDS-Probenpuffer beendet. Die Proteine wurden durch SDS-PAGE getrennt und der spezifische Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. A: Autoradiographie nach SDS-PAGE B: Phosphoaminosäure-Analyse. 5 µm hirs-1 p30 Phosphotyrosin: 65 %, Phosphoserin: 25 %, Phosphothreonin 10 %. 25 µm hirs-1 p30 Phosphotyrosin: 95 %, Phosphoserin: 5 %, Phosphothreonin 0 %. Autoradiographie nach zweidimensionaler Elektrophorese. Probe Phosphateinbau [cpm] Phosphateinbau [pmol] P-Ser/P-Thr [%] IRKD ,8 24 IRKD + 1 µm hirs-1 p30 n.b n.b 23 IRKD + 5 µm hirs-1 p ,9 19 IRKD + 10 µm hirs-1 p ,7 10 IRKD + 25 µm hirs-1 p ,9 6 1 µm hirs-1 p30 n.b n.b n.b. 5 µm hirs-1 p , µm hirs-1 p , µm hirs-1 p ,9 11 spezifische Radioaktivität: 954 cpm/pmol ATP Tab. 6.4: Zusammenfassung des Phosphateinbaus und der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Proteine aus Abb Die Gelbanden aus Abb wurden ausgeschnitten der Phosphateinbau durch Messung der Cerenkov-Strahlung und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung nach Auftrennung der Phosphoaminosäuren durch Dünnschichtchromatographie quantifiziert (n.b.: nicht bestimmt). Um einen Einblick in den Zeitverlauf der Substratphosphorylierung zu erhalten, wurde der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure Zusammensetzung der Kinase und des Substrates analysiert. Der Ansatz enthielt 5 µm IRS-1 p30, 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet, zu den entsprechenden Zeitpunkten Aliquots entnommen, die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt. Nach Bestimmung des Phosphateinbaus durch Zählung der Cerenkov-Strahlung wurden die 80

87 Ergebnisse erhaltenen Gelbanden tryptisch eluiert und nach saurer Partialhydrolyse die Phosphoaminosäure- Zusammensetzung durch Dünnschichtchromatographie und Phosphoimager-Analyse quantifiziert (Abb. 6.15). Die Anwesenheit des Substrates führt zu einer leicht reduzierten Gesamtphosphatinkorporation im Enzym. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten beträgt der spezifische Phosphateinbau 4 mol/mol, die Initialgeschwindigkeit der Autophosphorylierungsreaktion ergibt sich zu 86 nmol min -1 mg -1. Im Vergleich zu einer Autophosphorylierung ohne Substrat erreicht die Kinase nur etwa 50 % der möglichen Serinphosphorylierung (vgl. Abb. 4.3). Der spezifische Phosphateinbau in Serinreste beträgt in dieser Reaktion 0,4 mol/mol, die Initialgeschwindigkeit 2,9 nmol min -1 mg -1. Auf das Substrat werden 40 pmol Phosphat übertragen. Die Initialgeschwindigkeit der Reaktion ergibt sich zu 64 nmol min -1 mg -1. Nach 20 Minuten Reaktionszeit werden 13,9 pmol Phosphoserin/-threonin detektiert. Die Initialgeschwindigkeit dieser Reaktion ist mit 3,3 nmol min -1 mg -1 den Initialgeschwindigkeiten der Serinphosphorylierung der GST-CT-Fusionsproteine vergleichbar. A 5 B 50 Phosphateinbau [mol/mol] Gesamt P-Ser Phosphattransfer [pmol] Gesamt P-Ser Zeit [min] Zeit [min] Abb. 6.15: Zeitverlauf der Substratphosphorylierung von hirs-1 p30 durch die IRKD. Der Reaktionsansatz enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, 5 µm hirs-1 p30 und 1 µm IRKD. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Kinase gestartet. Zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennen der Proteine durch SDS-PAGE erfolgte die Bestimmung des Phosphateinbaus und die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung. A: IRKD B: hirs-1 p Die Serinphosphorylierung von Gab-1. In Zusammenarbeit mit Herrn S. Lehr aus der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Müller-Wieland (Klinik II und Poliklinik für Innere Medizin, Universität zu Köln) und Frau Dr. Affüpper wurden die kinetischen Konstanten für Teilbereiche und für das Gesamtprotein des 1996 entdeckten Gab1 (Grb2- associated binder-1, Holgado-Madruga et al. 1996) bezüglich der Phosphorylierung durch die EGF- Rezeptorkinase und der IRKD untersucht (Tab. 6.2). Das 77 kda große Protein gilt als Adapterprotein in der Insulinrezeptor- und EGF-Rezeptor-Signalweiterleitung. Gab1 zeigt große Homologien in der Aminosäuresequenz und seinen strukturellen Motiven zu dem Signalprotein IRS-1. Das Gesamtprotein enthält 47 potentielle Serin- und Threoninphosphorylierungsstellen und 16 potentielle Tyrosinphosphorylierungsstellen. Die Untersuchung der Teilbereiche und des Gesamtproteins in der Substratphosphorylierung durch die lösliche EGF-Rezeptorkinase und die IRKD zeigte, daß sich deutliche Unterschiede in den apparenten K m -Werten für die Proteine ergeben. In neueren Untersuchungen konnte Herr Lehr zeigen, daß diese Unterschiede in einem differenzierten Phosphorylierungsmuster der beiden Kinasen begründet sind, welche damit auch zu unterschiedlichen Signalweiterleitungen in der Zelle führen (Lehr et al. eingereicht zur Publikation). 81

88 Ergebnisse Substrat EGFRK IRKD GST-Gab-NT 4,0 ± 0,4 µm 3,0 ± 1,1 µm GST-Gab-MT 4,9 ± 1,5 µm 6,3 ± 1,5 µm GST-Gab-CT 2,4 ± 0,5 µm 12,8 ± 2,2 µm Gab1 2,7 ± 0,5 µm 21,3 ± 5,6 µm Tab. 6.2: Vergleich der apparenten K m -Werte für Teilbereiche und für das Gesamtprotein des Signalproteins Gab1. In den folgenden Untersuchungen wurden die rekombinanten Fragmente des humanen Gab-1 Proteins qualitativ hinsichtlich einer möglichen Serin- oder Threoninphosphorylierung durch die IRKD analysiert. Dabei sollte auch der Einfluß der Substrate auf die Serinautophosphorylierung der Kinase untersucht werden. Für den N-terminalen Anteil konnte von Herrn Lehr bereits gezeigt werden, daß das Substrat ausschließlich antyrosinresten phosphoryliert wird. Im folgenden wurde daher das mittlere und C-terminale Fragment in einer Substratphosphorylierungsreaktion eingesetzt. Die Reaktionsansätze enthielten die jeweiligen Substratkonzentrationen, 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten Reaktionszeit durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE und Lokalisation der Proteinbanden durch Autoradiographie wurde die spezifische Phosphatinkorporation der Proteine ermittelt und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung durch zweidimensionale Elektrophorese analysiert (Abb. 6.16, Tab. 6.4). Beide Proteine werden durch das Enzym phosphoryliert (Abb A). Die Anwesenheit von 1 µm GAB-CT oder GAB-MT führt zu keiner Beeinträchtigung der molaren Einbauraten in die IRKD, sie erreicht in beiden Fällen etwa 4,5 mol/mol (Tab. 6.4). Der Serinphosphatanteil in der Kinase beträgt in beiden Fällen ca. 24 %. Der Phosphotransfer auf die beiden Substrate ist bei dieser Konzentration ungefähr gleich (GAB-CT: 43,3 pmol; GAB-MT: 36,1 pmol). Die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung zeigt, daß in beiden Proteinen Serin- und Threoninphosphorylierung erhalten wird. In GAB-CT werden 26,9 % Phosphoserin und 1,6 % Phosphothreonin detektiert, während in GAB-MT der Anteil der Serin- bzw. Threoninphosphorylierung 15,7 % und 12,5 % beträgt. Die Anwesenheit der hohen Substratkonzentration führt in beiden Fällen zu einer Veränderung der elektrophoretischen Mobilität der Proteine, die mit einer Hemmung der Kinaseautophosphorylierung einhergeht. spez. Radioaktivität Probe Phosphateinbau Phosphateinbau P-Ser P-Thr [cpm/pmol ATP] [cpm] [pmol] [%] [%] 435 IRKD ,56 25,2-1 µm GAB-CT ,31 26,9 1, IRKD ,35 10,1-25 µm Gab-CT ,38 2,77 0, IRKD ,19 23,4-1 µm Gab-MT ,10 15,73 12, IRKD ,24 15,8-15 µm GAB-MT ,22 2,88 2,54 Tab. 6.4: Quantifizierung des Phosphateinbaus und der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Proteine aus Abb Allerdings ist der Einfluß auf die Kinase verschieden. Während GAB-CT zu einer Reduktion der Kinase-Autophosphorylierung von etwa 40 % führt, ist der Phosphateinbau bei Anwesenheit von 15 µm GAB-MT nur um etwa 20 % vermindert. Der Serinphosphatanteil in der Kinase beträgt im Fall von GAB-CT 0,3 mol/mol, im Fall von GAB-MT 0,6 mol/mol. Die höhere Substratkonzentration führt in beiden Fällen zu einem erhöhten Phosphateinbau in die Proteine (GAB-CT: 270 pmol; GAB- MT: 163 pmol). Dabei vermindert sich in beiden Fällen der prozentuale Anteil der Serin- und Threoninphosphorylierung. 82

89 Ergebnisse A MW [kda] 84,7 75,2 55,3 IRKD 43,6 B pt ps pt py ps py 1 µm GAB-CT 25 µm GAB-CT pt py pt ps py py 1 µm GAB-MT 15 µm GAB-MT Abb. 6.16: Substratphosphorylierungen der rekombinanten Fragmente aus Gab-1 (GAB-CT und GAB-MT) durch die IRKD. Die Ansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 bzw. 25 µm Substrat. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. A: Autoradiographie nach SDS-PAGE. Molekulargewichtsmarker Broad Range 1: IRKD + 1 µm Gab-CT, 2: IRKD + 25 µm Gab-CT, 3: IRKD + 1 µm Gab-MT, 4: IRKD + 15 µm Gab-MT. B: Phosphoaminosäure-Analysen der phosphorylierten Substrate. Die Proteine wurden aus den Gelbanden tryptisch eluiert, partiell hydrolysiert und durch zweidimensionale Elektrophorese aufgetrennt. Autoradiographie nach zweidimensionaler Elektrophorese. 83

90 Ergebnisse Die Substratphosphorylierung synthetischer Peptide Eine weitere Möglichkeit die Phosphotransferaseaktivität der IRKD zu charakterisieren ist die Verwendung von synthetischen Peptiden, die die Autophosphorylierungsstellen des Enzyms beinhalten. In allen bisherigen Untersuchungen mit diesen Substraten wurden ausschließlich kurze Peptide gewählt (10-15 Aminosäuren), die die Tyrosinphosphorylierungsstellen der katalytischen Domäne und des C-Terminus des Insulinrezeptors beinhalten. Dabei zeigten sich immer K m -Werte im millimolaren Bereich. Im Gegensatz dazu werden für die rekombinanten Fusionsproteine K m -Werte im mikromolaren Bereich erhalten. Dies deutet darauf hin, daß für eine effektive Substraterkennung nicht nur die direkte Nachbarschaft der Phosphorylierungsstellen eine Rolle spielt, sondern auch weiter entfernte Bereiche im Substrat. Im folgenden sollte daher die Frage untersucht werden, ob es in einem synthetischen Peptid, welches die Serinphosphorylierungsstelle 1309 und die Tyrsoinphosphorylierungsstelle 1316 enthält auch eine Serinphosphorylierung durch die IRKD katalysiert werden kann. Das Peptid umfaßt die Aminosäuren des humanen Insulinrezeptors (Aminosäuresequenz: DGGSSLGFKRSYEEH). Das Substrat wurde in einem Konzentrationsbereich von µm zusammen mit der IRKD in einer Substratphosphorylierungsreaktion eingesetzt. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm Enzym. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 1 Minute zur Bestimmung der kinetischen Konstanten der Phosphorylierung und nach 20 Minuten für die Bestimmung des maximalen Phosphateinbaus durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennen der Proteine in einer Tricine-SDS-PAGE wurde der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung von Substrat und Kinase bestimmt (Abb. 6.17). Das Peptid erweist sich für die Kinase als ineffizentes Substrat. Unter Berücksichtigung der Werte für die Phosphatinkorporation nach einer Reaktionszeit von einer Minute kann ein apparenter K m -Wert von 192 µm und ein V max -Wert von 12 nmol min -1 mg -1 angegeben werden. Die Analyse nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten zeigt mit steigender Substratkonzentration eine lineare Zunahme der Phosphatinkorporation in das Peptid. Im untersuchten Konzentrationsbereich kommt es aber dabei nicht zu einer signifikanten Beeinträchtigung der Kinase-Autophosphorylierung. Die Untersuchung der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung des Peptids zeigt eine ausschließliche Tyrosinphosphorylierung des Substrates (Daten nicht gezeigt). Demzufolge scheint die Kinase Serinphosphorylierung in diesem Peptid nicht katalysieren zu können. A Phosphattransfer [min/pmol] B Phosphateinbau [pmol] IRKD Peptid ,010-0,005 0,000 0,005 0,010 0,015 Peptid Ser1309 [1/µM] Peptid Ser1309 [µm] Abb. 6.17: Substratphosphorylierung des synthetischen Peptids Ser1309 durch die IRKD. Die Ansätze enthielten jeweils 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, variierende Substratkonzentrationen und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 1 und 20 Minuten durch Zugabe von SDS- Probenpuffer beendet. Im Anschluß erfolgte die Bestimmung des Phosphateinbaus und die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung. A: Lineweaver-Burk-Plot B: Phosphateinbau nach 20 Minuten Reaktionszeit. 84

91 Ergebnisse In einem weiteren Experiment wurde ein synthetisches Peptid untersucht, für welches eine Serinphosphorylierung am Serinrest Ser 1078 durch eine exogene Serinkinase beschrieben werden konnte (Carter et al. 1995). Das Peptid umfaßt die Aminosäuren (Aminosäuresequenz: AHDGLKSYLRSLR) des Insulinrezeptors. In Analogie zum obigen Experiment wurde dieses Substrat in einer Substratphosphorylierungsreaktion eingesetzt und die kinetischen Konstanten der Phosphorylierung und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung analysiert (Abb. 6.18). Interessanterweise wird dieses Peptid durch die Kinase erkannt und phosphoryliert. Die Untersuchung der kinetischen Konstanten ergab einen apparenten K m -Wert von 209 µm und einen V max -Wert von 3 nmol min -1 mg -1. Die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung zeigt jedoch, daß dieses Peptid ausschließlich an dem enthaltenen Tyrosinrest Tyr 1075 phosphoryliert zu werden scheint. A B Phosphattransfer [min/pmol] ,000 0,005 0,010 0,015 Peptid Ser1078 [1/µM] Phosphateinbau [pmol] IRKD Peptid Peptid Ser1078 [µm] Abb. 6.18: Substratphosphorylierung des synthetischen Peptids Ser1078 durch die IRKD. Die Ansätze enthielten jeweils 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, variierende Substratkonzentrationen und 1 µm IRKD. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 1 und 20 Minuten durch Zugabe von SDS- Probenpuffer beendet. Im Anschluß erfolgte die Bestimmung des Phosphateinbaus und die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung. A: Lineweaver-Burk-Plot B: Phosphateinbau nach 20 Minuten Reaktionszeit. 85

92 Ergebnisse 7 Die Transiente Phosphorylierung der IRKD 7.1 Untersuchungen zum ATP-Umsatz der Phosphotransferasereaktion Die Phosphotransferasereaktion der IRKD folgt formal der Gleichung: IRKD + Me 2+ ATP IRKD-P + Me 2+ ADP. Als Akzeptor der Phosphorylgruppe kommt dabei das Enzym selbst oder ein Substrat in Frage. Gemäß dieser Gleichung sollte demnach für jedes übertragene Mol Phosphat ein Mol ADP entstehen. Für die lösliche Insulinrezeptorkinase IRKD-HIS und den Insulinrezeptor konnte aber gezeigt werden, daß während der Reaktion anorganisches Phosphat freigesetzt wird (Al-Hasani et al. 1994). Für eine detaillierte Analyse dieses Befundes wurde von Herrn Dr. Al-Hasani ein Doppelmarkierungsexperiment entwickelt. In diesem Experiment wird die Kinasereaktion in Gegenwart einer definierten Mischung aus [α- 32 P]ATP und [γ- 32 P]ATP durchgeführt. Die Kinase wird durch das [γ- 32 P]ATP markiert (Gl. I) und nach Abtrennen des freien ATP kann die Phosphatinkorporation in das Molekül ermittelt werden. Der ATP-Verbrauch während der Reaktion wird nach dünnschichtchromatographischer Auftrennung der Nukleotide durch Quantifizierung des des entstandenen [α- 32 P]ADP verfolgt (Gl. II). I. IRKD + Me 2+ [γ- 32 P*]ATP IRKD-P* + Me 2+ ADP II. IRKD + Me 2+ [α- 32 P]ATP IRKD-P +Me 2+ [α- 32 P]ADP Die Differenz von inkorporiertem Phosphat in das Enzym und verbrauchtem ATP entspricht dann der freigesetzten Phosphatmenge. Zur Untersuchung des ATP-Umsatzes der IRKD-Phosphotransferase- Reaktion in An- oder Abwesenheit von Poly(Lysin) wurden im Rahmen einer Diplomarbeit (Koch 1998) zeitabhängige Autophosphorylierungen durchgeführt. Die Ansätze enthielten 250 µm ATP, die radioaktive Markierung bestand aus 45 % [α- 32 P]ATP und 55 % [γ- 32 P]ATP. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 1 µm Enzym gestartet und zu definierten Zeitpunkten zwei Aliquots entnommen. Zur Bestimmung des Phosphateinbaus wurde die Reaktion in dem einen Aliquot durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Kinase durch SDS-PAGE getrennt. Das andere Aliquot wurde zur Bestimmung des ATP/ADP-Verhältnisses in 300 µm EDTA überführt und nach einer Dünnschichtchromatographie der jeweilige Anteil durch Phosphoimageranalyse quantifiziert. Die Kinetiken der beiden Reaktionen sind in der Abbildung 7.1 dargestellt. In der Poly(Lysin) stimulierten Reaktion werden in 60 Minuten 4-4,5 mol Phosphat pro mol Enzym inkorporiert (Abb. 7.1 A). Die Halbwertszeit dieser Reaktion beträgt 0,5-1 Minute. Während die Phosphatinkorporation im Verlauf der Zeit in die Sättigung geht, hält die ADP-Bildung weiter an. Nur in der initialen Phase der Reaktion ist die ADP-Bildung der Phosphatinkorporation äquimolar, nach 10 Minuten Reaktionszeit beträgt das Verhältnis von inkorporierter Radioaktivität und entstandenem ADP bereits 1:50. Nach bereits 30 Minuten ist die Hälfte des eingesetzten ATP zu ADP umgesetzt, nach 60 Minuten sind etwa 70 % zu ADP hydrolysiert. Im Vergleich dazu sind in der nicht Poly(Lysin) stimulierten Reaktion Phosphateinbau und ATP-Umsatz deutlich geringer (Abb. 7.1 B). Der maximale Phosphateinbau nach 60 Minuten beträgt 2,2 mol Phosphat pro mol Enzym, die Halbwertszeit dieser Reaktion ist 10 Minuten. In der initialen Phase der Reaktion ist der Phosphateinbau von einer Bildung äquimolarer Mengen ADP begleitet, nach 10 Minuten beträgt das Verhältnis 1:4. Nach 60 Minuten werden etwa 60 pmol ADP erhalten (2,5 % des eingesetzten ATP), im Vergleich zur stimulierten Reaktion ist dieser Endwert jedoch um den Faktor 15 niedriger. Der gesteigerte ATP- Umsatz könnte auf eine Fremdaktivität im Reaktionsansatz zurückzuführen sein. Bei dieser Fremdaktivität könnte es sich zum einen um eine Phosphatase oder eine ATPase handeln. Eine Phosphatase im Reaktionsansatz würde die Kinase permanent dephosphorylieren und dadurch eine Rephosphorylierung des Enzyms unter ATP-Verbrauch bewirken. Dagegen würde eine ATPase, parallel zur Autophosphorylierungsreaktion, ATP hydrolysieren und somit den erhöhten ATP-Umsatz hervorrufen. 86

93 Ergebnisse A Phosphateinbau [pmol] Poly(Lysin) - Poly(Lysin) pmol ADP pmol ATP B Phosphateinbau [pmol] pmol ADP pmol ATP Zeit [min] Zeit [min] 0 Abb. 7.1: Zeitverlauf des Phosphateinbaus und der Bildung von ADP während der IRKD-Autophosphorylierung in Abhängigkeit der Poly(Lysin)-Stimulation. Die Ansätze enthielten 250 µm [α- 32 P]ATP und [γ- 32 P]ATP und 1 µm Kinase. Die Reaktionen wurden in An- oder Abwesenheit von 1 µm Poly(Lysin) durch Zugabe des Enzyms gestartet. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und der Phosphateinbau des Proteins nach SDS-PAGE und die Menge an ATP und ADP durch dünnschichtchromatographische Auftrennung der Nukleotide bestimmt. A: Zeitverlauf in Anwesenheit von 1 µm Poly(Lysin). B: Zeitverlauf in Abwesenheit von 1 µm Poly(Lysin). Das der gesteigerte ATP-Umsatz eine intrinsische Eigenschaft der Rezeptorkinase ist, konnte durch mehrere Befunde gestützt werden. Die Zugabe von Inhibitoren der Kinaseaktivität (AMP-PNP oder Staurosporin) führt nach Vorphosphorylierung des Enzyms zu keinem Verlust der inkorporierten Radioaktivität (Al-Hasani 1995, Koch 1998). Somit ist keine Phosphataseaktivität im Reaktionsansatz vorhanden. Desweiteren zeigten die kinaseinaktiven Varianten der IRKD (IRKD-K1018A und IRKD- D1120A) keinerlei ATP-Umsatz während einer Reaktionszeit von 60 Minuten (Nölle 1998). Demnach ist der erhöhte ATP-Umsatz direkt an die enzymatische Aktivität des Enzyms gekoppelt. Die Aktivierung der Kinaseaktivität durch Poly(Lysin), die mit einer Erhöhung des ATP-Umsatzes einhergeht, spricht ebenfalls für diesen Befund. 7.2 Die transiente Phosphorylierung der IRKD Die Chase-Reaktion mit der IRKD Der erhöhte ATP-Umsatz in der Phosphotransferase-Reaktion der IRKD ist eine intrinsische Eigenschaft des Enzyms. Daher ergibt sich die Frage, ob es sich bei dieser intrinsischen Aktivität um eine ATPase- oder eine Phosphatase-Aktivität handelt. Bei einer intrinsischen ATPase-Aktivität würde ATP gespalten und die γ-phosphorylgruppe auf das Enzym selbst, ein Substrat oder auf Wasser übertragen. In der initialen Phase der Reaktion würde demnach bei einer konstanten Wechselzahl des Enzyms nur die Übertragung auf Phosphorylierungsstellen des Enzyms oder des Substrates stattfinden, danach überwiegt die Übertragung auf Wasser, wobei anorganisches Phosphat entsteht. Eine intrinsische Phosphataseaktivität würde nach Phosphorylierung des Enzyms zu einer Dephosphorylierung führen, wobei anorganisches Phosphat entsteht. Anschließend käme es zu einer Rephosphorylierung der Kinase unter ATP-Verbrauch. Demnach müßten in der Kinase transiente Phosphorylierungsstellen nachweisbar sein. Denkbar wäre auch, daß das Phosphoenzym und das gebildete ADP zur Rückreaktion zu ATP und Dephosphoenzym führen könnte. Allerdings spricht gegen diese Annahme, daß in der Messung des ATP-Umsatzes keine Gleichgewichtseinstellung zwischen Phosphoenzym und ADP-Bildung beobachtet wird. 87

94 Ergebnisse Um diese Aktivitäten der Kinase zu unterscheiden, eignen sich Pulse-Chase Experimente, die mit radioaktiv und nicht radioaktiv markiertem ATP durchgeführt werden. In der Pulse-Reaktion wird die γ-phosphorylgruppe des ATP auf das Enzym übertragen. Dabei wird radioaktiv markiertes [γ- 32 P]ATP (ATP*) verwendet. Pulse: I IRKD + ATP* IRKD-P* + ADP Der Pulse-Reaktion folgt eine Chase-Reaktion durch Zugabe eines 10-20fachen Überschusses an nicht radioaktiv markiertem ATP: Chase: IIa IRKD-P* + ATP IRKD-P + ADP + Pi* (Phosphatase-Aktivität) IIb IRKD-P* + ATP IRKD-P* + ADP + Pi (ATPase-Aktivität) Danach sollten sich ATPase-Aktivität oder Phosphatase-Aktivität des Enzyms unterscheiden lassen. In der Chase-Reaktion steht mehr nicht radioaktiv markiertes ATP als markiertes ATP zur Verfügung. Besitzt das Enzym eine intrinsische Phosphatase-Aktivität (Gleichung IIa), sollte dieses zur Dephosphorylierung des Enzyms führen. Eine erneute Rephosphorylierung würde dann aufgrund der Erniedrigung der spezifischen Aktivität mit unmarkiertem ATP stattfinden. Im Gegensatz dazu sollte eine ATPase-Aktivität nicht zu einem Verlust der inkorporierten Radioaktivität führen (Gleichung IIb). Im Versuch wurde die Poly(Lysin) stimulierte Kinase in Gegenwart von radioaktiv markiertem ATP für 20 Minuten phosphoryliert und anschließend der Ansatz in vier Teile aufgetrennt. Ein Aliquot wurde für weitere 20 Minuten inkubiert, zum zweiten Aliquot wurde ein 10facher Überschuß an nicht radioaktiv markiertem ATP zugefügt und für weitere 20 Minuten inkubiert (Chase-Reaktion). Dem dritten bzw. vierten Aliquot wurden 2,5 mm ADP bzw. AMP-PNP hinzugesetzt und die Ansätze ebenfalls für weitere 20 Minuten inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die erhaltenen Proben geteilt. Die Proteine des einen Teils wurden durch SDS-PAGE getrennt und der Phosphateinbau der IRKD durch Messung der Radioaktivität der entsprechenden Gelbanden bestimmt (Abb. 7.2 A). Die Proteine der anderen Probe wurden ebenfalls durch SDS-PAGE getrennt und anschließend eine Western-Blot-Analyse mit α-phosphotyrosin-antikörper zur Bestimmung des Phosphorylierungsstatus durchgeführt (Abb. 7.2B). Die Kinase inkorporiert nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten 4 mol/mol, dabei blieb der Phosphateinbau bis zu 40 Minuten konstant. In der Chase-Reaktion verliert das Enzym nahezu 50 % der inkorporierten Radioaktivität, dagegen ist in der Reaktion mit ADP oder AMP-PNP ein 10 %iger bzw. gar kein Verlust an inkorporierter Radioaktivität erkennbar (Tab. 7.1). In der Western-Blot- Analyse des Versuches zeigt sich, daß, obwohl es zu einem Verlust der Phosphate in der Chase- Reaktion kommt, dieses nicht auf einen Verlust des Phosphorylierungssgrades bzw. Proteinverlust zurückgeführt werden kann. Das Antikörpersignal scheint in allen Fällen identisch. Dieser Befund deutet auf eine intrinsische Phosphatase-Aktivität des Enzyms. Die Anwesenheit einer exogenen Phosphatase-Aktivität im Reaktionsansatz muß ausgeschlossen werden, da die Inkubation mit AMP- PNP nicht zu einem Verlust an Radioaktivität im Enzym zu führen scheint. In Anwesenheit einer exogenen Phosphatase sollte es zu einer Dephosphorylierung des inhibierten Enzyms kommen. Im Gegensatz dazu führt die Anwesenheit von Vanadat, einem potenten Inhibitor von PTPasen, in der Chase-Reaktion ebenfalls zu einem Verlust der inkorporierten Radioaktivität (Daten nicht gezeigt). Die Möglichkeit einer Rückreaktion von ADP und Phosphoenzym zu ATP und Dephosphoenzym kann nicht mit endgültiger Sicherheit verneint werden, da ein, wenn auch geringer, Verlust an inkorporierter Radioaktivität beobachtet wird. Allerdings ist das Ausmaß dieser Rückreaktion unter diesen Bedingungen sehr gering. 88

95 Ergebnisse + ATP*-Pulse 20 min + 10x ATP-Chase 20 min + 10x ADP-Chase 20 min + 10x AMP-PNP-Chase 20 min + ATP*-Pulse 40 min A Autoradiographie B Autoradiography Western-Blot (α-py) Abb. 7.2: Die Autophosphorylierung der IRKD unter Pulse-Chase-Bedingungen. Der Ansatz enthielt 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm Poly(Lysin) und 1 µm Kinase. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten geteilt. Zwei Teile des Ausgangsansatzes wurden durch Zugabe von SDS-Probenpuffer nach 20 und 40 Minuten beendet. Zu weiteren jeweils gleich großen Teilen wurden ADP, ATP und AMP-PNP zu einer Endkonzentration von 2,5 mm gegeben und die Reaktion für weitere 20 Minuten fortgesetzt. Nach 20 Minuten wurden diese Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS- PAGE getrennt. Im Anschluß erfolgte der immunologische Nachweis der Tyrosinphosphorylierung durch Western-Blot-Analyse mit α-phosphotyrosin-antikörper und die Bestimmung des Phosphateinbaus in die Kinase. A: Autoradiographie nach SDS-PAGE. B: Immunologischer Nachweis durch α Phosphotyrosin-Antikörper. Phosphateinbau [cpm] Phosphateinbau [pmol] Phosphateinbau [mol/mol] 20 Minuten Pulse 20 Minuten Chase 2,5 mm ATP + 2,5 mm ADP + 2,5 mm AMP-PNP Pulse 40 Minuten ,75 22,97 36,47 40,18 40,31 3,97 2,29 3,65 4,02 4,03 spez. Radioaktivität: 2548 cpm/pmol ATP Tab Zusammenfassung der Autophosphorylierung der IRKD unter Pulse-Chase-Bedingungen. Quantitative Analyse nach Bestimmung der Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung der Proteinbanden aus Abb Das folgende Experiment zeigt, daß die transiente Phosphorylierung des Enzyms unmittelbar an seine katalytische Aktivität gekoppelt ist (Abb. 7.3). Das Enzym wurde für 20 Minuten in Gegenwart von 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP inkubiert und der Reaktionsansatz anschließend geteilt. Die Reaktion in einem Teil wurde durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Den anderen Teilen wurde 2,5 mm nichtradioaktiv markiertes ATP, 2,5 mm ATP und 100 mm EDTA und 2,5 mm ATP und 1 mm AMP-PNP zugefügt. Die Reaktionen wurden nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS- Probenpuffer beendet und anschließend die Proteine durch SDS-PAGE getrennt. 89

96 Ergebnisse In Anwesenheit der Inhibitoren wird das Ausmaß der transienten Phosphorylierung deutlich reduziert. Während in der nicht inhibierten Reaktion ein Austausch von 50 % der inkorporierten Radioaktivität beobachtet wird, zeigt die durch EDTA inhibierte Kinase keinen Verlust. Die Anwesenheit von AMP- PNP führt dagegen zu einer geringeren Abnahme der inkorporierten Radioaktivität, die in einer Kompetition von ATP und AMP-PNP begründet ist (EC 50 : 0,5 mm bei 100 µm ATP) Abb. 7.3: Autophosphorylierung unter Pulse-Chase-Bedingungen in Abhängigkeit von der Kinaseaktivität. Der Reaktionsansatz enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm IRKD. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten geteilt. Zwei Teile des Ansatzes wurden nach 20 und 40 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Zu den weiteren Teilen wurde ATP, ATP/EDTA und ATP/AMP-PNP in den angegeben Konzentrationen zugefügt und diese für weitere 20 Minuten inkubiert. Nach dieser Reaktionszeit wurden die Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und der spezifische Phosphateinbau bestimmt. 1: Pulse, 2: Chase ATP + EDTA, 3: Chase, 4: Chase ATP + AMP-PNP. Autoradiographie nach SDS-PAGE. Phosphateinbau [cpm] Phosphateinbau [pmol] Phosphateinbau [mol/mol] 20 Minuten Pulse 20 Minuten Chase 1 mm ATP Chase 1 mm ATP 100 mm EDTA Chase 1 mm ATP 1 mm AMP-PNP ,87 20,08 42,42 26,57 4,29 2,01 4,24 2,66 spez. Radioaktivität: 1743 cpm/pmol ATP Tab. 7.2: Autophosphorylierung unter Pulse-Chase-Bedingungen in Abhängigkeit von der Kinaseaktivität. Quantitative Analyse nach Bestimmung der Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung der Proteinbanden aus Abb Im folgenden wurde die Chase-Reaktion der Kinase in Abhängigkeit von der ATP- und ADP-Konzentration untersucht. Das Enzym wurde für 20 Minuten in Gegenwart von 250 µm [γ- 32 P]ATP vorphosphoryliert und anschließend der Reaktionsansatz in gleiche Aliquots aufgeteilt, denen jeweils variierende Konzentrationen an ATP und ADP zugefügt wurden. Die Reaktionen wurden für weitere 20 Minuten fortgesetzt, nach diesem Zeitpunkt durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt. Die Zugabe an ADP in verschiedenen Konzentrationen führt in dem Konzentrationsbereich von µm zu einer linearen Abnahme der inkorporierter Radioaktivität im Enzym. Die Zugabe von 10 mm ADP zum Reaktionsansatz vermindern den Phosphateinbau um 33 %. Im Gegensatz dazu führen schon geringe ATP-Konzentrationen zu einer starken Reduktion der inkorporierten Radioaktivität. Dieser Verlust ist in einem Konzentrationsbereich von µm kontinuierlich, höhere Konzentrationen bewirken aber keine weitere Verminderung. Der Verlust an inkorporierter Radioaktivität beträgt dabei 50 %. 90

97 Ergebnisse 5 Phosphateinbau [mol/mol] ATP ADP [µm] Abb. 7.4: Pulse-Chase-Reaktion der IRKD in Abhängigkeit der ATP und ADP-Konzentration. Der Reaktionsansatz enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm IRKD. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten geteilt. Die Reaktion in zwei Teilen des Ausgangsansatzes wurden nach 20 und 40 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Zu den weiteren Teilen wurde ADP und ATP zu den angegebenen Endkonzentrationen zugefügt und die Reaktion für weitere 20 Minuten fortgesetzt. Nach dieser Zeit wurden die Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und nach Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE der Phosphateinbau ermittelt Zeitverlauf der transienten Phosphorylierung der IRKD Um einen Einblick in den Zeitverlauf der transienten Phosphorylierung der Kinase zu erhalten, wurde eine zeitabhängige Chase-Reaktion mit der Kinase durchgeführt. Das Enzym wurde in Anwesenheit von 1 µm Poly(Lysin) und 250 µm [γ- 32 P]ATP für 20 Minuten zur Sättigung phosphoryliert und anschließend für weitere 20 Minuten nach Zugabe von 2,5 mm nicht radioaktiv markiertem ATP inkubiert. Zu den jeweiligen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen, die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet, die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und der Phosphateinbau bestimmt (Abb. 7.5 A). Die Zugabe des nicht radioaktiv markierten ATP führt zu einem apparenten Verlust der inkorporierten Radioaktivität. Nach 5 Minuten Reaktionszeit inkubiert das Enzym in diesem Versuch 4,3 mol/mol. Die Initialgeschwindigkeit der Abnahme der radioaktiven Phosphatinkorporation beträgt 13,6 nmol min -1 mg -1. Nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten wird ein spezifischer Phosphateinbau von 2,1 mol/mol Enzym erhalten, in der Kontrollreaktion ergibt sich ein Phosphateinbau von 3,95 mol/mol. In Analogie zu einer Chase-Reaktion wurde die transiente Phosphorylierung unter Hot-Chase-Bedingungen untersucht (Abb. 7.5 B). In diesem Ansatz wird das Enzym in der Pulse-Reaktion mit nicht radioaktiv markiertem ATP bis zur Sättigung phosphoryliert und im Anschluß daran radioaktiv markiertes ATP zugefügt. Die intrinsische Phosphatase-Aktivität sollte in der Nettoreaktion demnach zu einem Austausch der nichtradioaktiv markierten Phosphorylgruppen im Enzym gegen radioaktiv markierte Phosphatreste führen. Hot-Chase IRKD-P + ATP* IRKD-P* + ADP + Pi (Phosphatase-Aktivität) Im Versuch wurde die Poly(Lysin) stimulierte Kinase für 5 Minuten in Gegenwart von nicht radioaktiv markiertem ATP zur Sättigung phosphoryliert (Pulse). Als Kontrolle diente ein Ansatz, der 250 µm [γ- 32 P]ATP enthielt. Der Phosphateinbau betrug nach 5 Minuten 4,4 mol Phosphat pro Molekül Enzym. Nach 5 Minuten wurde dem Reaktionsansatz radioaktiv markiertes [γ- 32 P]ATP zugesetzt und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen. Nach Abstoppen der Reaktion in 91

98 Ergebnisse SDS-Probenpuffer und SDS-PAGE wurde der Phosphateinbau in das Enzym bestimmt. Der Versuch zeigt, daß die bereits zur Sättigung phosphorylierte Kinase noch zusätzlich radioaktives Phosphat inkorporiert. Die Inkorporation radioaktiv markierter Phosphate erreicht nach 5 Minuten eine Sättigung, nach 25 Minuten Reaktionszeit ergeben sich 2,3 mol Phosphat pro mol Enzym. Die Initialgeschwindigkeit der Reaktion ergibt sich aus dem linearen Anteil der Kurve mit 16,6 nmol min -1 mg -1 und ist im Vergleich zur Autophosphorylierungsreaktion um den Faktor 10 geringer (153 nmol min -1 mg -1 ). Der Vergleich der kinetischen Konstanten der Pulse-Chase und Pulse-Hot-Chase-Reaktion zeigt, daß die Initialgeschwindigkeiten der Reaktion, die zur De- und Rephosphorylierung der Kinase führen, sich um ca. 20 % unterscheiden. Der Anteil der transienten Phosphorylierung ergibt sich zu etwa 50 %. Die höhere Initialgeschwindigkeit der Hot-Chase-Reaktion führt aber zu einem schnelleren Erreichen der Sättigungsphase. Die Zugabe einer hohen ATP-Konzentration in der Chase- Reaktion kann zu ungünstigen Verhältnissen der Ionenkonzentrationen führen, die damit die Katalysegeschwindigkeit dieser Reaktion beeinträchtigen. A 5 Chase-Reaktion B 5 Hot-Chase-Reaktion Phosphateinbau [mol/mol] Phosphateinbau [mol/mol] Pulse Chase Zeit [min] 1 Pulse Hot Chase Zeit [min] Abb. 7.5: Zeitverlauf der transienten Phosphorylierung der IRKD. A: Zeitverlauf unter Pulse-Chase- Bedingungen. Der Reaktionsansatz enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm IRKD. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms gestartet und der Ansatz nach 20 Minuten geteilt. Zwei Teile des Ausgangsansatzes wurden durch Zugabe von SDS-Probenpuffer nach 20 und 40 Minuten beendet. Einem weiteren Teil wurde nicht radioaktiv markiertes ATP zu einer Endkonzentration von 2,5 mm zugefügt und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen und die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach SDS-PAGE erfolgte die Bestimmung des Phosphateinbaus. B: Zeitverlauf unter Pulse-Hot Chase- Bedingungen. Der Reaktionsansatz enthielt 250 µm nicht radioaktiv markiertes ATP, 1 µm Poly(Lysin) und 1 µm IRKD. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 5 Minuten dem Reaktionsansatz radioaktiv markiertes ATP zugefügt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und der Phosphateinbau bestimmt. Als Kontrolle diente ein Ansatz, der radioaktiv markiertes ATP enthielt. Während der Autophosphorylierungsreaktion kommt es zur Bildung von ADP. Daher wäre es denkbar, daß ADP und Phosphoenzym in der Rückreaktion zu ATP und Dephosphoenzym führen können. Allerdings sprechen die beobachteten kinetischen Daten in der Untersuchung des ATP-Umsatzes dagegen, die belegen, daß es zu keiner Gleichgewichtseinstellung zwischen ADP und Phosphoenzym zu kommen scheint. Der Phosphateinbau in die Kinase bleibt über den gesamten Reaktionsablauf konstant, die Formation von ADP und der Abbau des ATP erfolgen kontinuierlich. Gegen diese Hypothese spricht auch die Beobachtung, daß in einer Chase-Reaktion mit 2,5 mm ADP nur ein geringer Phosphatverlust in der Kinase erhalten wird. Dennoch besteht die Möglichkeit, daß geringe Mengen an ADP ausreichend sind, um diese Rückreaktion zu katalysieren. In Gegenwart eines ATPregenerierenden Systems wird deutlich, daß die transiente Phosphorylierung der Kinase in der Tat ein ATP-getriebenes Ereignis ist. Hierbei wird das entstandene ADP kontinuierlich mit Hilfe von Phosphoenolpyruvat und Pyruvatkinase wieder zu ATP regeneriert. Die Pyruvatkinase, ein Stoffwechselenzym aus der Glykolyse, katalysiert spezifisch den Umsatz von Phosphoenolpyruvat und 92

99 Ergebnisse ADP zu Pyruvat und ATP. Da kein radioaktiv markiertes Phosphoenolpyruvat für die Neusynthese des ATP verwendet wird, sollte diese konstitutive Regenerierungsaktivität in einer permanenten Verdünnung der spezifischen Radioaktivität des eingesetzten [γ- 32 P]ATP-Pools resultieren. Ein weiterer Vorteil dieses Systems ist, daß die Kinase-Reaktion, ähnlich den Hot-Chase-Bedingungen, unter optimalen Bedingungen verläuft, da die Ionen- und die ATP-Konzentration erhalten bleiben. Unter diesen Voraussetzungen wurden zeitabhängige Autophosphorylierungsreaktionen in An- oder Abwesenheit des ATP-regenerierenden Systems durchgeführt (in der Kontrollreaktion war kein Phosphoenolpyruvat enthalten). Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen. Nach Abstoppen der Reaktionen in SDS-Probenpuffer wurden die Proteine in der SDS-PAGE aufgetrennt und der Phosphateinbau in die Kinase bestimmt (Abb. 7.6). Phosphateinbau [mol/mol] + reg. System - reg. System P-Ser - reg. System P-Ser + reg. System Zeit [min] Abb. 7.6: Zeitverlauf der IRKD-Autophosphorylierung in Anwesenheit eines ATP-regenerierenden Systems. Die Ansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, 10 µg/µl Pyruvatkinase (10 U/µg), 4 mm Phosphoenolpyruvat und 1 µm IRKD. Der Kontrollreaktion wurde kein Phosphoenolpyruvat zugefügt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen, in denen die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer die Reaktion beendet wurde. Nach Auftrennen der Proteine durch SDS-PAGE wurde der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. In Abwesenheit des ATP-regenerierenden Systems erreicht die Kinase nach 5 Minuten einen Phosphateinbau von ca. 4,3 mol/mol, der über den weiteren Zeitraum von 55 Minuten konstant bleibt. In Gegenwart des ATP-regenerierenden Systems ist die Initialgeschwindigkeit und der Phosphateinbau nach 5 Minuten in etwa der Kontrollreaktion vergleichbar, danach wird eine kontinuierliche Abnahme der inkorporierten Radioaktivität beobachtbar. Als Ursache hierfür muß die Neusynthese von nicht radioaktiv markiertem ATP verantwortlich gemacht werden, welche zu einer Verdünnung der spezifischen Radioaktivität und damit zu einer Chase-Reaktion während des Reaktionsverlaufes führt. Im Vergleich zur Kontrollreaktion ergeben sich nach 30 Minuten Reaktionszeit eine Abnahme der inkorporierten Radioaktivität um ca. 20 %, nach 60 Minuten um 55 %. Die Inkorporation in Serinreste wird in beiden Reaktionen durch einen Sättigungsverlauf beschrieben, die Initialgeschwindigkeiten sind identisch. In der Kontrollreaktion erreicht sie ihr Maximum nach 10 Minuten und bleibt über den weiteren Reaktionsverlauf konstant. In Anwesenheit des ATP-regenerierenden Systems ist das Maximum der Serinphosphorylierung bereits nach 5 Minuten erreicht. Die Tatsache, daß in der folgenden Reaktionszeit keine weitere Zunahme der Phosphatinkorporation in Serinreste beobachtbar wird, ist in der Verdünnung des ATP-Pools durch nicht radioaktives ATP begründet. Während der Reaktion steht weniger [γ- 32 P]ATP zur Verfügung, welches für die Inkorporation in Serinreste ver- 93

100 Ergebnisse wendet werden kann. Weiterhin zeigt das Experiment, daß die Phosphatinkorporation in Serinreste stabil ist, d.h. eine Hydrolyse der Serinphosphoesterbindung scheint nicht möglich. Dieser Umstand zeigt sich auch in der herkömmlichen Chase-Reaktionen, in der keine relative Abnahme der Serinphosphorylierung erhalten wird (Kap ) Identifizierung der transienten Phosphorylierungsstellen in der IRKD Die Inkubation der radioaktiv markierten Kinase mit nicht radioaktiv markiertem ATP führt zu einem apparenten Verlust der inkorporierten Radioaktivität in dem Enzym (Chase-Reaktion). Im Umkehrexperiment werden im zur Sättigung phosphorylierten Enzyms weiterhin Phosphorylgruppen auf das Enzym übertragen, wenn nachträglich [γ- 32 P]ATP dem Reaktionsansatz zugefügt wird (Hot-Chase- Reaktion). Dieser beobachtete Austausch verläuft in beiden Fällen mit nahezu der gleichen Geschwindigkeit, der Anteil beträgt in etwa 50 % der maximal erreichbaren Gesamtphosphorylierung. Aus diesen Beobachtungen ergibt sich die Frage, ob Unterschiede zwischen den einzelnen Phosphorylierungsstellen existieren oder alle Phosphorylierungsstellen gleichermaßen von der transienten Phosphorylierung betroffen sind. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden mit der IRKD Pulse-Chase und Pulse-Hot-Chase-Experimente durchgeführt und im Anschluß die jeweiligen Phosphorylierungsmuster der Kinase durch die Methode der Phosphopeptidkartierung analysiert. Im Fall der Chase- Reaktion sollte der Verlust der Radioaktivität einzelnen Phosphorylierungsstellen in einem Verlust bestimmter Peaks in dem korrespondierenden Chromatogramm resultieren, während in der Hot- Chase-Reaktion diese Peaks verstärkt auftreten müßten. Im Fall einer gleichartigen Beeinflussung aller Phosphorylierungsstellen sollten sich nur Unterschiede in den relativen Peakhöhen ergeben, nicht aber in der relativen Verteilung der Phosphate in die einzelnen Phosphorylierungsstellen. Im Versuch wurden jeweils 1 µm Kinase in Gegenwart von radioaktiv markiertem oder nicht radioaktiv markiertem ATP für 10 Minuten zur Sättigung phosphoryliert (Pulse-Reaktion). Im Anschluß daran erfolgte im Fall der radioaktiv vorphosphorylierten Kinase eine 20minütige Chase-Reaktion mit 2,5 mm ATP, im Fall der nicht radioaktiv markierten Kinase eine 20minütige Hot-Chase-Reaktion. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet, die Proteine im SDS-PAGE aufgetrennt und der Phosphateinbau in das Enzym bestimmt. Im Anschluß daran erfolgte eine tryptische Elution der Proteine aus dem Gel. Von einem Teil der tryptischen Eluate wurde eine Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung durchgeführt, der andere Teil wurde für die Anionenaustausch-Chromatographie verwendet. Die Kinase inkorporierte in der Pulse-Reaktion nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten 4,1 mol Phosphat pro Molekül, davon entfallen etwa 24 % auf Serinreste (0,9 mol/mol, Abb. 7.7 A). Nach der Chase-Reaktion enthält das Enzym nur noch 50 % der zuvor inkorporierten Radioaktivität (2,2 mol/mol). Der relative Anteil der Serinphosphorylierung nimmt dagegen auf 35 % zu, daraus errechnet sich ein absoluter Wert von 0,7 mol Phosphoserin pro mol Enzym (Abb. 7.7 B). In der Hot- Chase-Reaktion werden noch etwa 15 % Phosphoserin detektiert. Mit einer Phosphatinkorporation von 2,1 mol/mol wird damit ein spezifischer Phosphateinbau in Serinreste von 0,3 mol/mol erhalten (Abb. 7.7 C). Demnach ergibt sich, daß der Verlust an radioaktiven Phosphaten maßgeblich Tyrosinphosphorylierungsstellen betrifft. 94

101 Ergebnisse A B C Pulse Chase Hot Chase Abb. 7.7: Phosphoaminosäure-Analyse der IRKD nach Autophosphorylierung unter Pulse-Chase und Pulse-Hot-Chase-Bedingungen. Die Ansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm ATP (radioaktiv oder nicht radioaktiv markiert) und 1 µm IRKD. A: Pulse-Hot-Chase: Das mit nicht radioaktiv markiertem ATP vorphosphorylierte Enzym (5 Minuten) wurde nach Zugabe von [γ- 32 P]ATP für weitere 15 Minuten inkubiert. B: Pulse- Reaktion mit radioaktiv markiertem ATP. C: Chase-Reaktion mit 2,5 mm nicht radioaktiv markiertem ATP. Der Vergleich des Elutionsprofil der Kinase aus der Chase-Reaktion mit dem Chromatogramm aus der Pulse-Reaktion zeigt, daß das Enzym hauptsächlich Phosphate in dem Peptid verliert, welches die beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen enthält (Fraktion b, Abb. 7.8). Dagegen sind alle übrigen Phosphorylierungsstellen präsent. Der Verlust des radioaktiven Signals des C-terminalen Peptids wird auch in dem korrespondierenden Elutionsprofil der Kinase beobachtet, wenn sie in Anwesenheit des ATP-regenerierenden Systems phosphoryliert wird (Daten nicht gezeigt). Im Profil der Hot-Chase-Reaktion ist dieses Peptid dagegen sehr stark vertreten, alle weiteren Phosphorylierungsstellen treten nur schwach hervor. Der Versuch zeigt, daß die beobachtete transiente Phosphorylierung der IRKD zum größten Teil auf eine permanente De- und Rephosphorylierung der C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen zurückzuführen ist. Die Beobachtung, daß es in Gegenwart von 2,5 mm ADP auch zu einem Verlust an inkorporierter Radioaktivität kommt, deutet auf eine Rückreaktion von Phosphenzym zu Dephosphoenzym. Diese Dephosphorylierung sollte sich demnach auch in der Phosphopeptidkartierung bemerkbar machen. Die Reaktion erfolgte in Analogie zu den Experimenten aus Kapitel Nach Auftrennung der Kinase durch SDS-PAGE wurde die erhaltene Gelbande tryptisch eluiert und das Phosphopeptidgemisch durch HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie aufgetrennt. Im Gegensatz zu dem schon beschriebenen apparenten Verlust des Signals für das C-terminale Peptid in der ATP-Chase-Reaktion, wird im korrespondierenden Elutionsprofil nach Inkubation mit ADP nur eine geringfügige Abnahme dieses radioaktiven Signals beobachtet. Vielmehr scheinen sich unter diesen Reaktionsbedingungen die Signalstärke des tris-phosphorylierten Peptids der katalytischen Domäne zu reduzieren (Fraktion g), während gleichzeitig eine Erhöhung der bisphosphorylierten Peptide (Fraktion e) beobachtet wird. Demzufolge handelt es sich bei dem beobachteten Phosphatverlust durch Inkubation mit ADP um eine qualitativ andere Reaktion als bei dem beobachteten Austausch der Phosphate im C-Terminus der Kinase und basiert wahrscheinlich auf einer Rückreaktion von Phosphoenzym und ADP zu Dephosphoenzym. 95

102 Ergebnisse a b c d e f g IRKD Pulse Radioaktivität IRKD Chase ATP IRKD Hot Chase IRKD Chase ADP Zeit [min] Abb. 7.8: HPLC-Anionenaustauschchromatographie tryptischer IRKD-Peptide nach Autophosphorylierung unter Pulse-Chase-Bedingungen. Nach Tabelle 5.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten zu den Phosphopeptiden Die transiente Phosphorylierung der IRKD-Y1316/22F und IRKD-Y1316/22T Die Autophosphorylierungsreaktionen der IRKD unter Pulse-Chase bzw. Pulse-Hot-Chase- Bedingungen sind in Einklang mit einer intrinsische Phosphataseaktivität des Enzyms, die spezifisch auf die C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen einwirkt. Allerdings ergibt sich eine Diskrepanz zwischen dem Verlust an Radioaktivität im Gesamtprotein verglichen mit der im C-Terminus inkorporierten Radioaktivität im Enzym. Demzufolge werden in den jeweiligen Reaktionen bis zu 50 % der inkorporierten Radioaktivität verloren, der Anteil der Phosphatinkorporation in die C-terminalen Tyrosinstellen beträgt aber nur %. Zwar sollte die ermittelte Verteilung der Phosphate in der IRKD nur als eine apparente Größe betrachtet werden, da die einzelnen Peptide unterschiedliche Wiederfindungsraten besitzen, es ist jedoch nicht auszuschließen, daß auch andere Phosphorylierungsstellen in der Kinase einer, wenn auch geringeren transienten Phosphorylierung unterliegen. In der IRKD-Y1316/22F und IRKD-Y1316/22T sind die beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen substituiert, eine Analyse ihrer Autophosphorylierungsreaktionen unter Pulse-Chase oder Pulse-Hot-Chase-Bedingungen sollte daher zur Beantwortung der Frage nach der Spezifität der transienten Phosphorylierung führen. Mit den beiden Kinasekonstrukten wurden, in Analogie zu den Experimenten aus Kap und 7.2.2, zeitabhängige Autophosphorylierungsreaktionen unter Pulse-Chase- und Pulse-Hot-Chase-Bedingungen durchgeführt. Die Ausgangsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm der jeweiligen Kinase. Die Chase-Reaktionen wurden durch Zugabe der Enzyme gestartet und zu den angegebenen Zeitpunkten geteilt. Die Reaktionen des einen Teiles wurden durch Zugabe von SDS- Probenpuffer beendet. Den anderen Teilen wurde nicht radioaktiv markiertes ATP zu einer Endkonzentration von 2,5 mm zugefügt und für weitere 20 Minuten inkubiert. Für die Hot-Chase- Reaktionen wurden die beiden Enzyme für 20 Minuten mit nicht radioaktiv markiertem ATP zur Sättigung phosphoryliert, im Anschluß [γ- 32 P]ATP zugefügt und die Reaktion zeitabhängig verfolgt. Als Kontrolle diente ein Reaktionsansatz, der radioaktiv markiertes ATP enthielt. 96

103 Ergebnisse Die Reaktionen wurden durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet, die Proteine durch SDS-PAGE aufgetrennt und der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt (Abb. 7.9). In der Chase-Reaktion der Kinase IRKD-Y1316/22T wird unabhängig vom Vorphosphorylierungsgrad des Enzyms ein etwa %iger Verlust der Phosphatinkorporation beobachtet. Nach 20 Minuten ergibt sich im Vergleich zur Pulse-Reaktion ein apparenter Verlust an inkorporierter Radioaktivität von etwa 0,5-0,6 mol Phosphat pro mol Kinase. Nach 20minütiger Pulse-Reaktion und anschließender Hot-Chase-Reaktion inkorporiert das Enzym ebenfalls 0,5 mol Phosphat pro Molekül. In beiden Reaktionen wurde keine Serinphosphorylierung der Kinase detektiert. A Phosphateinbau [mol/mol] 2,0 1,5 1,0 0,5 IRKD-Y1316/22T Pulse Chase 20 min B Phosphateinbau [mol/mol] 2,0 1,5 1,0 0,5 IRKD-Y1316/22T Pulse Hot Chase 20 min C 0,0 1 2, Zeit [min] D 0, Zeit [min] Phosphateinbau [mol/mol] IRKD-Y1316/22F P-Tyr P-Ser P10 C20 P20 C20 Zeit [min] Phosphateinbau [mol/mol] IRKD-Y1316/22F 4 Pulse Hot Chase 20 min Hot Chase Ser-P Zeit [min] Abb. 7.9: Zeitverlauf der Autophosphorylierung der IRKD-Y1316/22T und IRKD-Y1316/22Funter Pulse- Chase und Pulse-Hotchase Bedingungen. A, B: Zeitverlauf der Autophosphorylierung der IRKD-Y1316/22T unter Pulse-Chase-Bedingungen (A) und Pulse-Hot-Chase-Bedingungen (B). Die Ausgangsansätze enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm IRKD-Y1316/22T. Die Reaktionen wurden durch Zugabe des Enzyms gestartet und der Ansatz zu den angegebenen Zeitpunkten geteilt. Ein Teil wurde durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Dem anderen Teil wurde nicht radioaktiv markiertes ATP zu einer Endkonzentration von 2,5 mm zugefügt und nach 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Der Reaktionsansatz der Pulse-Hot-Chase-Reaktion enthielt 250 µm nicht radioaktiv markiertes ATP, 1 µm Poly(Lysin) und 1 µm Enzym. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten der Reaktionsansatz durch radioaktiv markiertes ATP ergänzt. Als Kontrolle diente ein Ansatz, der radioaktiv markiertes ATP enthielt. C, D: Zeitverlauf der Autophosphorylierung der IRKD-Y1316/22F unter Pulse-Chase-Bedingungen (C) und Pulse- Hot-Chase-Bedingungen (D). Die Reaktionen wurden wie unter A und B beschrieben durchgeführt. 97

104 Ergebnisse In der Chase-Reaktion der IRKD-Y1316/22F wird ähnliches beobachtet. Nach 10 bzw. 20minütiger Vorphosphorylierungsdauer und anschließender Inkubation mit nicht radioaktiv markiertem ATP kommt es zu einer Reduktion der inkorporierten Radioaktivität um etwa 30 %. Der Phosphateinbau beträgt 2 mol/mol Kinase. Unter Berücksichtigung der Serinphosphorylierung in diesem Enzym, welche von der Chase-Reaktion nicht beeinflußt zu werden scheint, verbleiben damit etwa 1 mol/mol radioaktiv markierter Tyrosinreste im Molekül, während ca. 0,7 mol der Tyrosinphosphate durch nicht radioaktiv markiertes ATP ersetzt werden. In der Hot-Chase-Reaktion nach 20minütiger Vorphosphorylierung werden 0,65 mol Tyrosinphosphorylierungsstellen markiert, gleichzeitig findet noch Phosphorylierung der Serinphosphorylierungsstellen statt. Dieser Anteil nach 30 Minuten Reaktionszeit beträgt ca. 10 %. Im folgenden wurden die beiden Kinasen nach 20 Minuten der Hot-Chase-Reaktionen durch die Methode der Phosphopeptidkartierung analysiert (Abb. 7.10). Bei beiden Enzymen zeigt sich, daß die weitere Phosphatinkorporation in den Peptiden der katalytischen Domäne erfolgt, wobei monophosphorylierte Peptide einen Vorrang einnehmen (Fraktion c). Entsprechend könnte daher argumentiert werden, daß die beobachtete transiente Phosphorylierung in der Hot-Chase-Reaktion eher als eine Besetzung noch unphosphorylierter Tyrosinphosphorylierungsstellen angesehen werden kann. Allerdings spricht dagegen der beobachtete Phosphatverlust in der Chase-Reaktion der Kinasen und der Umstand, daß die Enzyme bereits nach einer Reaktionszeit von etwa 5 Minuten zu Sättigung phosphoryliert vorliegen. Daher muß von einer De- und Rephosphorylierung in dieser Domäne ausgegangen werden. Radioaktivität a c d e f g IRKD- Y1316/22F IRKD- Y1316/22T Fraktion Abb. 7.10: HPLC-Anionenaustauschchromatographie tryptischer Phosphopeptide der IRKD-Y1316/22T und IRKD-Y1316/22F. Nach Tabelle 4.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten zu den Phosphopeptiden Die transiente Phosphorylierung der IRKD-K1018A Bei der Möglichkeit einer transienten Phosphorylierung, die vor allem die C-terminalen Tyrosine der Kinase betrifft, ergibt sich die Frage, ob diese einem intermolekularem Mechanismus, d.h. zwischen zwei Kinasemolekülen, oder einem intramolekularen Mechanismus unterliegt. Zur Analyse dieser Fragestellung wurden Pulse-Chase und Pulse-Hot-Chase-Reaktionen der IRKD-HIS und der IRKD-K1018A untersucht. Die Analyse des Phosphorylierungsmusters der IRKD-K1018A zeigte, daß dieses Molekül effizient an allen Tyrosinphosphorylierungsstellen durch die aktive Kinase phosphoryliert werden kann (Abb. 5.13). Für die Chase-Reaktion wurden die aktive Kinase und die kinaseinaktive Variante in Gegenwart von 250 µm [γ- 32 P]ATP für 10 Minuten phosphoryliert (Verhältnis 98

105 Ergebnisse 1:2,5) und nach Entnahme eines Aliquots anschließend der Ansatz getrennt. Ein Aliquot wurde für weitere 10 Minuten inkubiert, dem anderen wurde 2,5 mm nicht radioaktiv markiertes ATP zu gefügt und die Reaktion ebenfalls für 10 Minuten fortgesetzt. Für die Hot-Chase-Reaktion wurden die beiden Proteine in Gegenwart von nicht radioaktiv markiertem ATP für 20 Minuten vorphosphoryliert und anschließend [γ- 32 P]ATP zugefügt und die Reaktion für weitere 20 Minuten fortgesetzt. Nach Abstoppen der Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer wurden die Proteine durch SDS- PAGE getrennt, der Phosphateinbau bestimmt und die jeweiligen Gelbanden durch tryptischen Verdau eluiert. Danach wurde von einem Teil der erhaltenen Peptide die Phosphoaminosäure- Zusammensetzung nach saurer Hydrolyse und zweidimensionaler Elektrophorese ermittelt, der andere Anteil wurde für eine Phosphopeptidkartierung verwendet. A B IRKD-HIS IRKD- K1018A ps ps py py IRKD-K1018A Pulse IRKD-K1018A Chase Abb. 7.11: Substratphosphorylierung der IRKD-K1018A durch die IRKD-HIS unter Pulse-Chase- Bedingungen. Der Reaktionsansatz enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP 1 µm IRKD-HIS und 2,5 µm IRKD-K1018A. Die Reaktion wurde durch Zugabe der aktiven Kinase gestartet und nach 10 Minuten geteilt. Zwei Teile des Ansatzes wurden nach 10 und 20 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet, einem weiteren Teil wurde nicht radioaktiv markiertes ATP zu einer Endkonzentration von 2,5 mm zugefügt und die Reaktion für 10 Minuten fortgesetzt. Nach Abstoppen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. A: Autoradiographie nach SDS-PAGE. 1: 1 µm IRKD nach Autophosphorylierung ohne Substrat. 2: Pulse-Reaktion 10 Minuten. 3: Chase-Reaktion 10 Minuten. 4: Pulse-Reaktion 20 Minuten. 5: 1 µm IRKD-HIS nach Autophosphorylierung ohne Substrat. B: Phosphoaminosäure-Analyse der IRKD-K1018A nach Pulse- bzw. Chase-Reaktion. Autoradiographie nach zweidimensionaler Elektrophorese. Nach 10minütiger Autophosphorylierung inkorporiert die aktive Kinase etwa 3 mol Phosphat pro mol Enzym, auf das Substrat werden 70 pmol übertragen, entsprechend einem molaren Einbau von 3 mol/mol. Nach der Chase-Reaktion beträgt der radioaktive Phosphatgehalt der aktiven Kinase nur noch 2 mol/mol, der der kinaseinaktive Variante 34 pmol [γ- 32 P]-Phosphat. Damit ist der apparente Verlust an inkorporierter Radioaktivität im Enzym etwa 30 %, im Substrat ca. 50 %. 99

106 Ergebnisse Zeit [min] Phosphateinbau [cpm] Einbau [pmol] Einbau [mol/mol] Ser-P [%] Thr-P [%] Ser-P [pmol] Thr-P [pmol] IRKD-HIS P ,8 3,1 16,9 2,3 5,2 0,7 C ,3 2,0 23,2 2,96 4,7 0,6 P ,9 3,4 20,4 3,2 6,9 1,1 IRKD-K1018A P ,2-14,99-10,5 - C ,1-25,0-8,5 - P ,0-21,4-16,5 - spez. Radioaktivität: 943 cpm/pmol ATP Tab Zusammenfassung des Phosphateinbaus und der Phosphoaminosäure-Analyse der Proteine aus Abb Die Analyse des Phosphoserinanteils in den jeweiligen Proteinen zeigt, daß die molaren Verhältnisse Phosphotyrosin zu Phosphoserin bzw. Phosphothreonin in den korrespondierenden Pulse-Chase- Reaktionen in etwa konstant bleiben. In der Pulse-Reaktion der IRKD-HIS entfallen 0,5 mol/mol auf Phosphoserin bzw. 0,07 mol/mol auf Phosphothreonin, in der Chase-Reaktion werden 0,47 mol/mol und 0,06 mol/mol erhalten. Im Substrat ergeben sich 11 pmol Phosphoserin, in der Chase-Reaktion entfallen 8,5 pmol auf phosphorylierte Serinreste. Demnach scheint, wie schon in der transienten Phosphorylierung der IRKD beobachtet, der Austausch im Substrat ausschließlich Phosphotyrosine zu betreffen. Die Auswertung der Hot-Chase-Reaktion zeigt, daß trotz Vorphosphorylierung beider Moleküle noch Radioaktivität inkorporiert wird (Abb. 7.12). A Phosphateinbau [mol/mol] IRKD-HIS Gesamt P-Ser/ -Thr B Phosphateinbau [pmol] IRKD-K1018A Gesamt P-Ser Zeit [min] Zeit [min] Abb. 7.12: Zeitverlauf der Substratphosphorylierung der IRKD-K1018A durch die IRKD-HIS unter Pulse-Hot-Chase-Bedingungen. Der Reaktionsansatz enthielt 250 µm nicht radioaktiv markiertes ATP, 1 µm Poly(Lysin), 1 µm IRKD-HIS und 2,5 µm IRKD-K1018A. Die Reaktion wurde durch Zugabe der aktiven Kinase gestartet und nach 5 Minuten der Reaktionsansatz durch radioaktiv markiertes ATP ergänzt. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und nach Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. A: IRKD-HIS B: IRKD-K1018A 100

107 Ergebnisse Der spezifische Phosphateinbau in die IRKD-HIS erreicht nach 20 Minuten Reaktionszeit etwa 1,5 mol/mol Enzym, im Substrat werden 45 pmol inkorporiert. Demnach ergeben sich ähnliche Verhältnisse wie in der Chase-Reaktion beider Moleküle, wonach ca. 30 % bzw. 50 % der inkorporierten Phosphate in der Kinase bzw. in der IRKD-K1018A ausgetauscht werden können. Die Initialgeschwindigkeit der Hot-Chase-Reaktion für die aktive Kinase errechnet sich aus dem linearen Anteil der Kurve zu 7 nmol min -1 mg -1. Im Vergleich zu der Initialgeschwindigkeit einer Hot-Chase-Reaktion der IRKD-HIS ohne Substrat, welche 11 nmol min -1 mg -1 beträgt (Al-Hasani 1995), ist diese damit erniedrigt. Für die IRKD-K1018A kann eine Initialgeschwindigkeit angegeben werden, welche mit 19 nmol min -1 mg -1 der Initialgeschwindigkeit der IRKD in der Hot-Chase-Reaktion entspricht (Kap ). Demnach scheint die Reaktion ein gerichteter Prozeß zu sein, die Initialgeschwindigkeit und der maximale Phosphateinbau sind im Vergleich zum Katalysator für das kinaseinaktive Protein deutlich erhöht. Durch die Methode der Phosphopeptidkartierung können die Phosphatreste, die einer permanten De- und Rephosphorylierung unterliegen, lokalisiert werden. Für die IRKD wurde bereits gezeigt, daß hiervon hauptsächlich die C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen 1316 und 1322 betroffen sind. Von den Endwerten der Pulse-Chase- und Pulse-Hot-Chase-Reaktionen wurde daher in Analogie zu diesen Experimenten eine Phosphopeptidkartierung der kinaseinaktiven Mutante durchgeführt (Abb. 7.13). Die Auswertung der entsprechenden Chromatogramme zeigt, daß auch im Substrat diese Tyrosinphosphorylierungsstellen durch die Katalyse der aktiven Kinase der transienten Phosphorylierung unterliegen (Fraktion b). Demnach kann von einem gerichteten trans-phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsprozeß ausgegangen werden. Die korrespondierenden Chromatogramme der IRKD-HIS sind ähnlich, allerdings ergeben sich aufgrund des nur 30%igen Ausmaß der transienten Phosphorylierung in der Substratreaktion gegenüber den Reaktionen in Abwesenheit der IRKD-K1018A andere relative Verteilungen der Phosphopeptide, d.h. die De- und Rephosphorylierung der C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen ist nicht so stark ausgeprägt (Daten nicht gezeigt). a b c d e f g Pulse 20 min Radioaktivität Chase 20 min Hot Chase 20 min Fraktion Abb. 7.13: HPLC-Anionenaustauschchromatographie tryptischer IRKD-K1018A-Peptide nach Autophosphorylierung unter Pulse-Chase-Bedingungen. Nach Tabelle 5.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten zu den Phosphopeptiden. 101

108 Ergebnisse 7.3 Substratphosphorylierungen unter Pulse-Chase-Bedingungen Phosphorylierung der GST-Fusionproteine GST-CT, GST-Ex20 und GST-JM unter Pulse-Chase-Bedingungen Die Möglichkeit einer transienten Phosphorylierung in der IRKD-K1018A führte zu der Frage, inwieweit die Kinase auch in der Lage ist, den Austausch von phosphorylierten Aminosäureresten in anderen Substraten zu katalysieren. Im folgenden Versuch wurden Phosphorylierungen unter Pulse- Chase-Bedingungen in Anwesenheit der GST-Fusionsproteine des C-Terminus (GST-CT und GST-CTphe), der katalytischen Domäne (GST-Ex20) und des Juxtamembranbereiches (GST-JM) durchgeführt. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP und Substratkonzentrationen, die in etwa den jeweiligen einfachen und 5fachen K m -Werten entsprachen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet. Nach zwanzig Minuten wurden jeweils ein Drittel der Ansätze mit SDS-Probenpuffer beendet, einem weiteren Drittel 2,5 mm nicht radioaktiv markiertes ATP zugefügt und mit dem dritten Anteil für weitere 20 Minuten inkubiert. Nach SDS- PAGE und Autoradiographie der getrockneten Gele wurden die Proteinbanden ausgeschnitten und die Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung bestimmt. Im Anschluß daran erfolgte die tryptische Elution der Gelstücke und die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Proteine (Abb. 7.14, Abb. 7.15). A Phosphateinbau [pmol] Phosphateinbau IRKD GST-CT B Radioaktivität a b f Pulse Chase 0 P10 C10 P20 P10 C10 P20 5 µm GST-CT 25 µm GST-CT Fraktion Abb. 7.14: Substratphosphorylierung des GST-CT-Fusionsproteins durch die IRKD unter Pulse-Chase- Bedingungen. A: Konzentrationsabhängigkeit der Substratphosphorylierung unter Pulse-Chase-Bedingungen. Der Reaktionsansatz enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP 1 µm IRKD und die angegebenen Konzentrationen des GST-Fusionsproteins. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten geteilt. Zwei Teile des Ansatzes wurden nach 20 und 40 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet, einem weiteren Teil wurde nicht radioaktiv markiertes ATP zu einer Endkonzentration von 2,5 mm zugefügt und die Reaktion für 20 Minuten fortgesetzt. Nach Abstoppen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. B: HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie tryptischer GST-CT-Peptide nach 20minütiger Pulseund Chase-Reaktion. Ein Teil der tryptischen Phosphopeptide aus Versuch A (5 µm GST-CT) wurde durch HPLC-Anionenaustausch-Chromatographie getrennt. Nach Tabelle 5.2 ergibt sich die Zuordnung der Retentionszeiten zu den Phosphopeptiden. 102

109 Ergebnisse In der Pulse-Reaktion in Gegenwart des GST-CT-Fusionsproteins wird bei der Substrat-Konzentration von 5 µm eine Inhibition der Autophosphorylierung von etwa 50 % beobachtet (vgl. Kap. 5.3). Die Anwesenheit des Substrates beeinträchtigt auch das Ausmaß der transienten Phosphorylierung, die Kinase verliert etwa 30 % ihrer inkorporierten Radioaktivität (1,3 mol/mol). Im Gegensatz dazu ist sowohl die Autophosphorylierung als auch die Chase-Reaktion in Anwesenheit von 25 µm Substrat gehemmt. Der Phosphateinbau beträgt nach 20 Minuten etwa 1,4 mol/mol, der Anteil der transienten Phosphorylierung in der Chase-Reaktion sinkt auf 23 % (0,4 mol/mol). Allerdings scheint die Phosphorylierungsreaktion der Kinase nach diesem Zeitraum nicht abgeschlossen. Sowohl im Enzym als auch im Substrat wird der weitere Einbau von radioaktiv markiertem Phosphat beobachtet. Der molare Einbau in das Enzym beträgt nach 40 Minuten Reaktionszeit 2,2 mol/mol, im Substrat werden 131 pmol Phosphat erhalten. In der Chase-Reaktion wird im Substrat ein apparenter Verlust der inkorporierten Radioaktivität beobachtet. Der Anteil beträgt in der Reaktion mit 5 µm Substrat 34 %, mit 25 µm 1 % gegenüber der Phosphatinkorporation in der Pulse-Reaktion (Abb A). Die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung ergibt, daß sowohl in der Kinase als auch im Substrat der Anteil der Serinphosphorylierung in der Chase-Reaktion gegenüber der Pulsereaktion bei einer Substratkonzentration von 5 µm und 25 µm konstant bleibt (s. Tabelle Anhang). Demnach scheint der Phosphatverlust im Substrat auf eine transiente Phosphorylierung von Tyrosinresten zurückzugehen. Durch Pulse-Chase Experimente mit dem Fusionsprotein GST-Ctphe konnte diese Beobachtung bestätigt werden. Der Anteil phosphorylierter Serinreste war sowohl in der Pulse als auch in der Chase-Reaktion vergleichbar (Daten nicht gezeigt). Zur Identifizierung der transienten Phosphate im Substrat wurden das Substrat durch Phosphopeptidkartierung nach der Pulse-Reaktion und der Chase-Reaktion hinsichtlich seiner Verteilung der einzelnen Phosphate in die Phosphorylierungsstellen untersucht (Abb B). Das Chromatogramm zeigt, daß nach der Chase-Reaktion ein relativer Verlust der inkorporierten Radioaktivität in dem Peptid beobachtet wird, welches die beiden C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen enthält. Allerdings erfolgt der Austausch im Vergleich zu der De- und Rephosphorylierung einer intakten Kinase nicht vollständig. Die Beobachtung, daß keine mono-phosphorylierte Form dieses Peptids im Chromatogramm erhalten wird, deutet darauf hin, daß einer Dephosphorylierung direkt eine Rephosphorylierung folgt. In Anwesenheit von 5 µm GST-Ex20 Fusionsprotein inkorporiert die Kinase nach einer Reaktionszeit von 20 Minuten 4,5 mol Phosphat pro mol Enzym (Abb A). Sowohl der spezifische Einbau als auch der Phosphoserinanteil bleiben über den Zeitraum von 40 Minuten relativ konstant. In der Chase-Reaktion verliert das Enzym etwa 25 % seiner inkorporierten Radioaktivität. Der Phosphotransfer auf das GST-Fusionsprotein beträgt im Mittel 25 pmol, während der Chase-Reaktion ist keine Abnahme der inkorporierten Radioaktivität ersichtlich. Bei einer Substratkonzentration von 25 µm GST-Ex20 werden in die Kinase nach 20 Minuten 1,7 mol Phosphat pro mol Enzym inkorporiert. Im Gegensatz zu der weiteren Zunahme der Phosphatinkorporation in Anwesenheit von 25 µm GST-CT Fusionprotein scheint aber die Reaktion abgeschlossen, sowohl der Phosphateinbau in das Enzym als auch der Phosphotransfer auf das Substrat (108 pmol) erreichen nach dieser Zeit konstante Werte. In der Chase-Reaktion kann weder im Enzym noch im Substrat eine Abnahme der inkorporierten Radioaktivität festgestellt werden. Der Einfluß des GST-JM Fusionsprotein in der Chase-Reaktion zeigt ähnliche Charakteristika wie das C-terminale Fusionsprotein (Abb B). In Anwesenheit von 5 µm Substrat inkorporiert die Kinase in diesem Versuch über den Reaktionszeitraum im Mittel 4,7 mol/mol. In der Chase-Reaktion kommt es zu einem apparenten Verlust von ca. 17 % der inkorporierten Radioaktivität, der spezifische Einbau in Serinphosphat bleibt aber unverändert. Im Gegensatz dazu zeigt das Substrat in der Pulse- und der Chase-Reaktion keine meßbare Änderung seiner spezifischen Phosphatinkorporation. Sie beträgt im Mittel 43 pmol. Bei einer Substratkonzentration von 25 µm GST-JM beträgt der spezifische Phosphateinbau in das Enzym 1,44 mol/mol. Allerdings scheint die Reaktion, wie schon beim GST-CT-Fusionsprotein beobachtet, noch nicht abgeschlossen, nach 40 Minuten erreicht der molare Einbau 2,2 mol/mol. Auf das Substrat werden nach 20 Minuten 26 pmol Phosphat, nach 40 Minuten 171 pmol übertragen. In der Chase-Reaktion kommt es weder im Enzym, noch im Substrat zu einem signifikanten Verlust der zuvor inkorporierten Radioaktivität. 103

110 Ergebnisse A B Phosphateinbau [pmol] Phosphateinbau IRKD GST-Ex20 Phosphateinbau [pmol] Phosphateinbau IRKD GST-JM 0 P20 C20 P40 P20 C20 P40 5 µm 25 µm 0 P20 C20 P40 P20 C20 P40 5 µm 25 µm Abb. 7.15: Substratphosphorylierung der GST-Ex20 und GST-JM Fusionsproteine durch die IRKD unter Pulse-Chase-Bedingungen. Der Ansatz enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP 1 µm IRKD und die angegebenen Konzentrationen der GST-Fusionsproteine. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten geteilt. Zwei Teile des Reaktionsansatzes wurden nach 20 und 40 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet, einem weiteren Teil wurde nicht radioaktiv markiertes ATP zu einer Endkonzentration von 2,5 mm zugefügt und die Reaktion für 20 Minuten fortgesetzt. Nach Abstoppen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. A: Pulse-Chase-Reaktion mit GST-Ex20 B: Pulse-Chase- Reaktion mit GST-JM Phosphorylierung des hirs-1 p30 unter Pulse-Chase-Bedingungen Die Analyse der Pulse-Chase-Reaktionen der GST-Fusionsproteine zeigte, daß ihre Anwesenheit unterschiedlichen Einfluß auf die Kinase ausüben. Während bei niedrigen Konzentrationen noch ein Phosphataustausch im Enzym detektierbar ist, unterliegt er in Gegenwart hoher Konzentrationen einer Inhibition. Das Prinzip der transienten Phosphorylierung kann auch auf das C-terminalen Fusionsprotein und die IRKD-K1018A übertragen werden, während in den übrigen Substraten der Austausch radioaktiv markierter Tyrosinreste nicht nachweisbar ist. Im folgenden sollte die Fragestellung untersucht werden, ob eine De- und Rephosphorylierung auch in dem Substrat hirs-1 p30 beobachtet werden kann. Zur Klärung dieser Fragestellung wurden Pulse-Chase-Experimente in Anwesenheit variierender hirs-1 p30 Konzentrationen durchgeführt. Die Reaktionen wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und für 20 Minuten mit 250 µm [γ- 32 P]ATP inkubiert. Nach dieser Zeit wurde ein Drittel des Ansatzes durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet, ein Drittel mit 2,5 mm nicht radioaktiv markiertem ATP versetzt für weitere 20 Minuten inkubiert. Nach Auftrennen der Proteine im SDS-PAGE und Lokalisation der Proteinbanden durch Autoradiographie wurde der spezifische Phosphateinbau in die Kinase und das Substrat bestimmt. Anschließend erfolgte eine tryptische Elution der Gelbanden und die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung von Kinase und Substrat (Abb. 7.16). Die Autophosphorylierung der Kinase wird mit steigender Substratkonzentration gehemmt (vergl. Kap 5.3). Während in Gegenwart von 5 µm IRS-1 p30 3,9 mol/mol Phosphat in der Pulse-Reaktion inkorporiert werden, beträgt die spezifische Phosphatinkorporation der Kinase in Anwesenheit von 50 µm nur noch 1,5 mol/mol. Das Ausmaß der transienten Phosphorylierung im Enzym wird ebenfalls beeinflußt. Bei geringen Substratkonzentrationen ergibt sich in der nachfolgenden Chase-Reaktion ein apparenter Verlust der Phosphatinkorporation von 15 %, bei hohen Substratkonzentrationen ist keine signifikante Reduktion der inkorporierten Radioaktivität mehr feststellbar. Steigende Substratkonzentrationen führen zu einem gesteigerten Phosphotransfer in das IRS-1 p30 Fragment, der bei hohen Konzentrationen sein Maximum erreicht. Auch in dem Substrat wird ein apparenter Verlust der inkorporierten Radioaktivität meßbar, welcher bis zu 50 % beträgt. 104

111 Ergebnisse A 5 µm 10 µm 25 µm 50 µm IRKD hirs-1 p30 P10 C10 P20 P10 C10 P20 P10 C10 P20 P10 C10 P20 B Probe Zeit [min] Phosphateinbau [cpm] Einbau [pmol] Einbau [mol/mol] Ser-P [%] Ser-P [pmol] 5 µm hirs-1 p30 P ,34 3,93 23,2 9,11 IRKD C ,39 3,44 26,7 9,18 P ,49 4,35 21,1 9,18 P ,14-30,6 9,83 IRS-1p30 C ,30-64,8 9,26 P ,84-31,1 9,28 10 µm hirs-1 p30 P ,06 2,81 19,3 5,42 IRKD C ,63 2,26 22,1 4,9 P ,79 2,68 19,9 5,3 P ,67-31,2 14,5 IRS-1p30 C ,24-53,4 14,0 P ,16-27,8 11,9 25 µm hirs-1 p30 P ,16 2,22 1,9 0,42 IRKD C ,47 2,25 2,6 0,58 P ,32 2,23 1,6 0,36 P ,47-14,3 23,7 IRS-1p30 C ,48-22,1 23,3 P ,66-13,8 22,4 50 µm hirs-1 p30 P ,56 1,46 5,1 0,74 IRKD C ,71 1,47 5,5 0,81 P ,51 1,55 5,9 0,92 P ,28-9,1 23,2 IRS-1p30 C ,24-11,5 24,9 P ,51-10,8 33,2 spezifische Radioaktivität: 660 cpm/pmol ATP Abb. 7.16: Substratphosphorylierung von hirs-1 p30 durch die IRKD unter Pulse-Chase-Bedingungen. Die Ausgangsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP 1 µm IRKD und die angegebenen Konzentrationen an hirs-1 p30. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 20 Minuten geteilt. Zwei Teile des Ausgangsansatzes wurden nach 20 und 40 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet, einem weiteren Teil wurde nicht radioaktiv markiertes ATP zu einer Endkonzentration von 2,5 mm zugefügt und die Reaktion für 20 Minuten fortgesetzt. Nach Abstoppen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer wurden die Proteine durch SDS-PAGE getrennt und der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure- Zusammensetzung bestimmt. A: Autoradiographie nach SDS-PAGE. B: Phosphateinbau und Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der IRKD und des hirs1 p30 aus Abb A. Der prozentuale Serinphosphatanteil der Kinase und des Substrates nimmt mit steigenden Konzentrationen in den Pulse-Reaktionen ab, in den jeweiligen Chase-Reaktionen wird dabei keine Zunahme der Serinphosphorylierung meßbar. Demnach müssen maßgeblich Tyrosinreste einer De- und Rephosphorylierung unterliegen. Der Austausch radioaktiv markierter Phosphate in der Chase- Reaktion ist dabei unbedingt abhängig von der Kinaseaktivität. Das gleichzeitige Zufügen von EDTA und nicht radioaktiv markiertem ATP in der Chase-Reaktion führt weder im Substrat noch in der 105

112 Ergebnisse Kinase zu einem apparenter Phosphatverlust (Nölle 1998). Auch eine mögliche Dephosphorylierung des Substrates nach der Chase-Reaktion kann ausgeschlossen werden, da eine Western-Blot-Analyse mit α-phosphotyrosin-antikörper keine Abnahme des Phosphorylierungsstatus des hirs-1 p30 zeigt (Daten nicht gezeigt). Im folgenden Experiment wurde eine zeitabhängige Substratphosphorylierung in Anwesenheit von 5 µm GST-IRS-1 p30 in Gegenwart des ATP-regenerierenden Systems durchgeführt. GST-IRS-1 p30 ist ein rekombinantes Protein, welches die identische Aminosäure-Sequenz wie IRS-1 p30 besitzt, zusätzlich aber noch über einen GST-Fusionsproteinanteil verfügt, der eine einfache und effiziente Reinigung des Proteins durch Gluthathionsepharose-Affinitätschromatographie ermöglicht. Durch den GST-Anteil erhöht sich das apparente Molekulargewicht des Proteins auf 52,4 kda, welches eine bessere Trennung von der Kinase in der SDS-PAGE ermöglicht. Das Protein wird in der Substratphosphorylierung durch die IRKD an Serin und Threoninresten phosphoryliert und unterliegt ebenfalls der transienten Phosphorylierung in der Pulse-Chase-Reaktion (S. Parvaresch, persönliche Mitteilung). Das Substrat wurde freundlicherweise von Frau S. Parvaresch zur Verfügung gestellt. Die Reaktionsansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, 5 µm GST-hIRS-1 p30 und die Komponenten des regenerierenden Systems (Kap ), in der Kontrollreaktion wurde kein Phosphoenolpyruvat zugefügt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen, die nach Abstoppen der Reaktion in SDS-Probenpuffer durch SDS-PAGE aufgetrennt wurden. Nach Bestimmung des spezifischen Phosphateinbaus in die Kinase und das Substrat wurden die Gelbanden tryptisch eluiert und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung analysiert. A 50 Phosphateinbau IRKD GST-IRS-1 p30 P-Ser P-Ser B 50 Phosphateinbau IRKD Ser-P GST-IRS-1 p30 Ser-P µm ADP IRKD GST-IRS-1 p30 Phosphateinbau [pmol] Phosphateinbau [pmol] Zeit [min] Zeit [min] Abb. 7.17: Zeitverlauf der Substratphosphorylierung des GST-hIRS-1 p30 durch die IRKD in Anwesenheit eines ATP-regenerierenden Systems. Die Ansätze enthielten 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, 10 µg/µl Pyruvatkinase (10 U/µg), 4 mm Phosphoenolpyruvat, 5 µm GST-hIRS-1 p30 und 1 µm IRKD. Der Kontrollreaktion wurde kein Phosphoenolpyruvat zugefügt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu den jeweiligen Zeitpunkten Aliquots entnommen, in denen die Reaktion durch Zugabe von SDS- Probenpuffer die Reaktion beendet wurde. Nach Auftrennen der Proteine durch SDS-PAGE wurde der Phosphateinbau und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. A: Substratphosphorylierung in Abwesenheit des regenerierenden Systems. B: Substratphosphorylierung in Anwesenheit des regenerierenden Systems. 106

113 Ergebnisse Der Phosphateinbau in die IRKD gleicht in Abwesenheit des regenerierenden Systems einer Sättigungskurve. Die Initialgeschwindigkeit der Reaktion beträgt 68 nmol min -1 mg -1, der maximale Phosphateinbau im Mittel 3,6 mol/mol. Die Serinphosphorylierung erreicht nach etwa 10 Minuten ihr Maximum, die Initialgeschwindigkeit der Reaktion beträgt 1,7 nmol min -1 mg -1. Der Phosphotransfer auf das Substrat wird ebenfalls durch einen Sättigungverlauf beschrieben, der maximale Einbau beträgt im Mittel 26 pmol Phosphat, die Initialgeschwindigkeit der Reaktion 33 nmol min -1 mg -1. Die Phosphatinkorporation in Serinreste ergibt nahezu identische Werte wie für die Autophosphorylierungsreaktion. Nach 60 Minuten werden 7,3 pmol Serinphosphat gefunden, die Initialgeschwindigkeit der Reaktion ist allerdings mit 0,13 nmol min -1 mg -1 deutlich langsamer. Im Vergleich zu einer Substratphosphorylierungsreaktion mit dem IRS-1-Fragment ohne GST-Fusionsproteinanteil wird deutlich, daß GST-IRS-1 p30 ein wesentlich schlechteres Substrat für die Kinase darstellt. Dies drückt sich zum einen in der geringeren Beeinflussung der Autophosphorylierungsreaktion der Kinase aus, zum anderen in den spezifischen Konstanten der Substratphosphorylierung, die alle weitaus geringer ausfallen als in der vergleichbaren Reaktion mit IRS-1 p30 ohne GST-Fusionsproteinanteil (Kap ). In Anwesenheit des regenerierenden Systems ist in der initialen Phase der Reaktion nahezu kein Unterschied zur Kontrollreaktion festzustellen, die Initialgeschwindigkeiten der Autophosphorylierung, der Phosphatinkorporation in das Substrat und der Serinphosphorylierung ergeben vergleichbare kinetischen Konstanten. Nach 5 Minuten Reaktionszeit wird die permanente Abnahme der inkorporierten Radioaktivität im Substrat und der Kinase beobachtet. Nach 60 Minuten verlieren sowohl Kinase als auch Substrat etwa 70 % der inkorporierten Radioaktivität. Im Vergleich dazu bleibt der Serinanteil in Substrat und Enzym unverändert. Der mittlere Phosphateinbau in Serinbzw. Serin-/Threoninreste beträgt jeweils etwa 2 pmol. Die Tatsache, daß es während der Reaktion nicht zu einem Anstieg der Phosphatinkorporation in Serinreste kommt, belegt wiederum, daß die zunehmende Verdünnung des radioaktiven ATP-Pools und der daraus resultierende Verlust der inkorporierten Radioaktivität allein auf die transiente Phosphorylierung von Tyrosinphosphorylierungsstellen zurückzuführen ist. In einem Kontrollexperiment wurde nach 5 Minuten Reaktionszeit in Anwesenheit des regenerierenden Systems zusätzlich 100 µm ADP dem Ansatz zugefügt. Die schnellere Abnahme der inkorporierten Radioaktivität sowohl in Kinase als auch Substrat belegen die Wirksamkeit des ATP-regenerierenden Systems, durch die Zugabe wird eine schnellere Verdünnung des radioaktiven ATP-Pools erreicht, welche zu einer schnelleren Abnahme der spezifischen Phosphatinkorporation in den Molekülen führt. Das Ausmaß der transienten Phosphorylierung bleibt aber konstant Die transiente Phosphorylierung in Gegenwart des vorphosphorylierten hirs-1 p30 Sowohl die Autophosphorylierung der IRKD als auch die durch sie vermittelte Katalyse der Substratphosphorylierung unter Pulse-Chase-Bedingungen zeigt das Vorhandensein einer transienten Phosphorylierung, welche ein Ausdruck einer intrinsischen Phosphatase-Aktivität zu sein scheint. Dabei kommt es im Enzym selber zu einem Austausch von radioaktiven Phosphaten an den C-terminalen Tyrosinphosphorylierungsstellen und zu einem geringen Teil auch an Tyrosinresten der katalytischen Domäne. Desweiteren ist die Fähigkeit einer De- und Rephosphorylierung phosphorylierter Tyrosinreste auch während der Substratphosphorylierung zu beobachten. Dabei ergibt sich die Frage, ob die Phosphorylierungsreaktion der IRKD über ein Phospho-Enzymintermediat verläuft und damit einem Ping-Pong-Mechanismus unterliegt. Demnach sollte dem Enzym ein vorphosphoryliertes Substrat als Phosphatdonor dienen können. Im folgenden Experiment wurde das rekombinante Fragment des humanen IRS-1 (15 µm) durch die IRKD (1 µm) in Gegenwart von 250 µm [γ- 32 P]ATP und 1 µm Poly(Lysin) für 30 Minuten vorphosphoryliert und im Anschluß der Reaktionsansatz durch Zentrifugation über Superdex-G25-Säulen vom [γ- 32 P]ATP befreit. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt darin, daß das auf die Säulen aufgegebene Volumen des Reaktionsansatzes nach der Gelfiltration weitestgehend erhalten bleibt. Allerdings kommt es durch unspezifische Wechselwirkung der Proteine mit der Gelfiltrationsmatrix immer zu einem Verlust an Protein. 107

114 Ergebnisse Ansatz Eluat GI GII Probe Radioaktivität [cpm/10 µl] Ausbeute [%] Protein Phosphateinbau [cpm] Anteil [%] Ansatz ± 0, IRKD ± IRS-1 p ± ,4 G I ± ,73 IRKD ± 3794 IRS-1 p ± ,8 G II ± 140 0,57 IRKD 6950 ± 233 IRS-1 p ± ,5 Abb. 7.18: Übersichts des Reinigungsverlaufes der Gelfiltration. Der Ausgangsreaktionsansatz enthielt 1 µm Poly(Lysin), 250 µm [γ- 32 P]ATP, 1 µm IRKD und 15 µm hirs-1 p30. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Kinase gestartet und nach 30 Minuten ein Aliquot entnommen, in welchem die Reaktion durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet wurde. Der übrige Teil (70 µl) wurde auf eine mit Gelfiltrationspuffer (0,1 M NaCl, 1 mg/ml BSA, 50 mm Tris/HCl ph 7,5) äquilibrierte Superdex G25 Gelfiltrationsäule geladen und die Säule durch Zentrifugation eluiert (G I). Dem Eluat wurde ein weiteres Aliquot entnommen und der Rest erneut einer Gelfiltration zugeführt (G II). Nach Entnahme eine Aliquots wurde das erhaltenen Eluat direkt für nachfolgende Versuche weiter verwendet. Die Ausbeute gibt die erhaltene Radioaktivität nach der Gelfiltration in 10 µl an, der Anteil der darin enthaltenen radioaktiv markierten Proteine. Um den Reinigungsverlauf zu dokumentieren, wurden jeweils gleich große Aliquots des Reaktionsansatzes und der einzelnen Reinigungsschritte in einer SDS-PAGE aufgetrennt und der spezifische Phosphateinbau in die Proteine gemessen. Desweiteren wurde die vorhandene Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung und der prozentuale Anteil des [γ- 32 P]ATP nach der Gelfiltration durch den Vergleich mit dem Ausgangsansatz dünnschichtchromatographisch bestimmt. Die Übersicht für einen typischen Reinigungsverlauf ist in Abbildung 7.18 zusammengefaßt. Die Auswertung der Reinigung zeigt, daß das Verfahren zur Abtrennung des radioaktiv markierten ATP durch Gelfiltration zu hohen Verlusten an Protein führt. Gemessen an eingesetztem radioaktiv markiertem Protein ( cpm) können demnach nur ca. 7 % ( cpm) wiedergewonnen werden. Unter Berücksichtigung der Ausbeute an Gesamtradioaktivität und dem Anteil der wiedererhaltenen radioaktiv markierten Proteine ergibt sich, daß das erhaltene Eluat nur noch ca. 1 µm [γ- 32 P]ATP enthält. Das erhaltene IRKD-Substrat-Gemisch wurde in einem neuen Phosphorylierungsansatz mit 1 µm IRKD in Gegenwart von 1 µm Poly(Lysin) und variierenden Konzentrationen an nicht radioaktiv markiertem ATP zeitabhängig inkubiert und im Anschluß daran die Reaktionen durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Als Kontrolle diente ein Ansatz, der kein ATP enthielt. Nach Auftrennen der Proteine durch SDS-PAGE wurden die Gelbanden durch Autoradiographie lokalisiert und der Phosphatgehalt und die Phosphoaminosäure-Zusammensetzung bestimmt. Abb zeigt die erhaltene Autoradiographie nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten, Abb den Zeitverlauf der Reaktionen. Deutlich ist zu erkennen, daß es mit Zunahme der ATP-Konzentration zu einem Verlust der inkorporierten Radioaktivität im hirs-1 p30 kommt. In der Enzymbande wird in Anwesenheit geringer ATP-Konzentrationen (1 µm und 10 µm) eine Zunahme der Phosphatinkorporation beobachtet, welche direkt mit dem erhaltenen Verlust der Radioaktivität im Substrat zu korrelieren scheint. Demnach muß sich ein Teil der hinzugefügten Kinase phosphoryliert haben. Dieser Umstand ist insofern bemerkenswert, als daß nicht von einer Autophosphorylierung aufgrund des noch vorhandenen Rest-ATP im Reaktionsansatz ausgegangen werden kann. Ohne Zusatz nicht radioaktiv markierten ATP wird keine zusätzliche Phosphatinkorporation beobachtet. Bei den höheren ATP- Konzentrationen wird dieser Effekt nicht mehr detektiert, der apparente Verlust der Radioaktivität im Substrat ist aber unverändert und verläuft hier mit einer noch höheren Geschwindigkeit. 108

115 Ergebnisse IRKD hirs-1 p Abb. 7.19: Zeitverlauf der transienten Phosphorylierung des vorphosphorylierten hirs-1 p30. Die Reaktionsansätze enthielten 2,5 µl des vorphosphorylierten Enzym-Substrat Gemisches, 1 µm Poly(Lysin), 1 µm IRKD und variierende ATP-Konzentrationen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu definierten Zeitpunkten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Im Anschluß daran erfolgte die Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE und die Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität. Aufgetragen sind die erhaltenen Proben nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten. 1: 0 µm ATP, 2: 1 µm ATP, 3: 10 µm ATP, 4: 100 µm ATP, 5: 1000 µm ATP. Autoradiographie nach SDS-PAGE. IRKD hirs-1 p30 ATP [µm] Gelbande [cpm] P-Tyr [%] P-Ser [%] P-Tyr [cpm] P-Ser [cpm] Gelbande [cpm] P-Tyr [%] P-Ser/-Thr [%] P-Tyr [cpm] P-Ser/-Thr [cpm] ,7 9, ,2 3, ,3 10, ,4 4, ,9 14, ,6 14, ,8 19, ,4 27, ,3 15, ,8 27, Tab. 7.3: Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der IRKD und dem vorphosphorylierten hirs-1 p30. Die Proteinbanden (Abb. 7.18) wurden aus dem Gel tryptisch eluiert, partiell hydrolysiert und die Phosphoaminosäuren dünnschichtchromatographisch aufgetrennt. Die Analyse der Phosphoaminosäure-Zusammensetzung der Proteine nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten zeigt, daß es in allen Fällen zu einer leicht erhöhten Zunahme der Serinphosphorylierung in der Kinase kommt (Tab. 7.3). In Anwesenheit von 10 µm ATP ist die Zunahme des Serinphosphatgehaltes in der Kinasebande am höchsten, er beträgt im Vergleich zur Kontrollreaktion in Abwesenheit von ATP 1006 cpm gegenüber 211 cpm. Der Serin-/Threoninphosphatgehalt im Substrat bleibt dagegen in etwa konstant, bei allen Konzentrationen werden ca cpm Phosphoserin erhalten. Demzufolge betrifft die Dephosphorylierung des Substrates ausschließlich Phosphotyrosine. Weiterhin zeigt daß Experiment, daß einige dieser radioaktiv markierten Phosphate als Phosphatdonor für die Serinphosphorylierung der IRKD dienen können. Allerdings ist die Effizienz dieser Phosphatübernahme, im Vergleich zum Gesamtphosphatverlust der Tyrosinphosphorylierung im hirs-1 p30, nur äußerst gering. Die beobachtete apparente Dephosphorylierung des Substrates scheint weiterhin unbedingt von der Anwesenheit von ATP und damit von der Kinaseaktivität abhängig zu sein. Diese Beobachtung wurde durch weitere Experimente bestätigt. 109

116 Ergebnisse A B Phosphateinbau [cpm] IRKD hirs-1 p µm ATP Phosphateinbau [cpm] IRKD hirs-1 p µm ATP Zeit [min] Zeit [min] C Phosphateinbau [cpm] IRKD hirs-1 p µm ATP D Phosphateinbau [cpm] IRKD hirs-1 p µm ATP Zeit [min] Zeit [min] E Phosphateinbau [cpm] IRKD hirs-1 p µm ATP Phosphatinkorporation IRKD hirs-1 p Zeit [min] Abb. 7.20: Zeitverlauf der transienten Phosphorylierung des vorphosphorylierten hirs-1 p30. Die Reaktionsansätze enthielten 2,5 µl des vorphosphorylierten Enzym-Substrat Gemisches, 1 µm Poly(Lysin), 1 µm IRKD und variierende ATP-Konzentrationen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe der Kinase gestartet und zu den angegebenen Zeitpunkten mittels SDS-Probenpuffer beendet. Im Anschluß daran erfolgte die Auftrennung der Proteine durch SDS-PAGE und die Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität. A: 0 µm ATP, B: 1 µm ATP, C: 10 µm ATP, D: 100 µm ATP, E: 1000 µm ATP. In Analogie zum obigen Experiment wurden das vorphosphorylierte Substrat mit 1 µm IRKD, 1 µm IRKD-K1018A oder 1 µm IRKD-Y960/1316/22F in An- oder Abwesenheit von 250 µm nicht radioaktiv markiertem ATP inkubiert. In einem weiteren Experiment wurde 1 µm IRKD und 250 µm ATP, 110

117 Ergebnisse 2,5 mm AMP-PNP und vorphosphoryliertes Substrat zugefügt. Die Reaktionen wurden nach 10minütiger Inkubation durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet und die Proteine durch SDS- PAGE getrennt. Nach Lokalisation der Gelbanden im getrockneten Gel durch Autoradiographie wurden die erhaltenen Gelbanden ausgeschnitten und die Radioaktivität durch Messung der Cerenkov-Strahlung bestimmt (Abb. 7.21, Tab. 7.4). IRKD hirs-1 p Abb. 7.21: Abhängigkeit der transienten Phosphorylierung des hirs-1 p30 von der Kinaseaktivität. Das radioaktiv markierte Substrat (Ausgang: 2447 cpm in IRKD; cpm in hirs-1 p30) wurde zusammen mit der IRKD, IRKD-K1018A und der IRKD-Y960/1316/22F in An- oder Abwesenheit von 250 µm nicht radioaktiv markierten ATP inkubiert. In einem weiteren Experiment wurde 1 µm IRKD und 250 µm ATP, 2,5 mm AMP- PNP und vorphosphoryliertes Substrat eingesetzt. Die Reaktionen wurde durch Zugabe der Kinase und ihrer Varianten gestartet und nach einer Reaktionszeit von 10 Minuten durch Zugabe von SDS-Probenpuffer beendet. Nach Auftrennen der Proteine durch SDS-PAGE erfolgte die Bestimmung des Phosphateinbaus durch Messung der Cerenkov-Strahlung. 1: IRKD µm ATP, 2: IRKD µm ATP und 2,5 mm AMP-PNP, 3: IRKD - ATP, 4: IRKD-K1018A µm ATP, 5: IRKD-K1018A - ATP, 6: IRKD-Y960/1316/22F µm ATP, 7: IRKD-Y960/1316/22F - ATP. Autoradiographie nach SDS-PAGE. Die Anwesenheit von ATP im die IRKD enthaltenden Ansatz führt zur apparenten Dephosphorylierung des Substrates. Diese Beobachtung wird auch für die IRKD-Y960/1316/22F erhalten. In Abwesenheit von ATP kann kein signifikanter Verlust an der inkorporierter Radioaktivität des Substrates beobachtet werden, allerdings wird im Vergleich zu den Ansätzen mit dem inaktiven Enzym eine Zunahme der Radioaktivität in der Kinasebande detektiert. Diese zusätzliche Inkorporation kann durch noch im Ansatz enthaltendes Rest-[γ- 32 P]ATP erklärt werden. Ein nicht zu beobachtender Phosphatverlust im Substrat in Anwesenheit des kinaseinaktiven Proteins zeigt, daß die Möglichkeit zur Dephosphorylierung des Substrates unbedingt abhängig von der Kinaseaktivität ist. Die Zugabe von 2,5 mm AMP-PNP zum Reaktionsansatz führt ebenfalls nicht zu einem apparenten Phosphatverlust im Substrat und bestätigt damit die obige Aussage. Bahn Enzym ATP [µm] Zusatz Gelbande (IRKD) [cpm] Gelbande (hirs-1 p30) [cpm] 1 IRKD IRKD 250 2,5 mm AMP-PNP IRKD IRKD K1018A 5 IRKD K1018A 6 IRKD Y960/1316/22F 7 IRKD- Y960/1316/22F Tab. 7.4: Zusammenfassung des Phosphateinbaus der Proteine aus Abb

118 Ergebnisse Zur Klärung der Frage ob es sich bei dem beobachtetem apparenten Phosphatverlust um eine tatsächliche Dephosphorylierung handelt, wurden ein Teil der die IRKD enthaltenen Ansätze in einer weiteren SDS-PAGE getrennt, die Proteine auf eine PVDF-Membran transferiert und der Phosphorylierungsstatus durch α-phosphotyrosin-antikörper analysiert (Abb. 7.22). Deutlich ist zu erkennen, daß es nur in Anwesenheit von 250 µm ATP zu einem verstärkten Signal mit dem Antikörper kommt. Damit zeigt sich, daß der apparenten Dephosphorylierung des Substrates eine Rephosphorylierung folgt. MW [kda] ,7 75,2 55,3 43,6 35, Abb. 7.22: Analyse des Phosphorylierungsstatus der Proteine aus Abb durch Western-Blot-Analyse mit α-phosphotyrosin-antikörper. Ein Teil der die IRKD enthaltenen Ansätze aus Abb wurden durch SDS-PAGE getrennt und die Proteine durch Western Blotting auf eine PVDF-Membran transferriert. Im Anschluß daran erfolgte der immunologische Nachweis des Phosphorylierungsstatus der Proteine durch α-phosphotyrosin-antikörper. 1: IRKD µm ATP, 2: IRKD - ATP, 3: IRKD µm ATP und 2,5 mm AMP-PNP, 4: Ausgangsansatz. Western-Blot, immunologischer Nachweis mit α-phosphotyrosin-antikörper. 112