Pathogenese und Prävention der Typ IV Kollagenerkrankungen Alport Syndrom und Familiäre Benigne Hämaturie

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1 Auszug aus der Habilitationsschrift zur Erlangung der venia legendi für das Fach Innere Medizin an der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln Pathogenese und Prävention der Typ IV Kollagenerkrankungen Alport Syndrom und Familiäre Benigne Hämaturie vorgelegt von Dr. med. Oliver Wilhelm Alexander Gross aus Bad Homburg v. d. Höhe Köln 2005

2 1. Einleitung Die glomeruläre Basalmembran (GBM) dient in der Niere als Filtrationsbarriere zwischen dem Lumen der glomerulären Kapillaren und dem Bowman schen Raum [Weber 1992]. Sie entsteht durch Fusion von zwei Basalmembranen, die von Endothelzellen und viszeralen Epithelzellen (Podozyten) synthetisiert werden. Die GBM ist durch Fenestrationen in der endothelialen Zellschicht direkt Plasmaproteinen exponiert und befindet sich im engen Kontakt zur mesangialen Matrix (Abbildung 1). Abb. 1 Schemazeichnung eines Glomerulusausschnittes GBM = glomeruläre Basalmembran, KL = Kapillarlumen, MZ = Mesangiumzelle, MM = mesangiale Matrix, FF = Fußfortsätze der Podozyten, EPI = Podozyt (viszerale Epithelzelle), E = Endothelzelle. (modifiziert nach Weber et al. 1992) Die GBM ist fast unlöslich und mechanisch sehr stabil. Diese Eigenschaften beruhen auf einem supramolekularen Netzwerk von Typ IV Kollagen-Molekülen. Sechs verschiedene α-ketten des Typ IV Kollagens sind bekannt. Ein Typ IV Kollagen-Monomer besteht aus einer langen triple-helikalen Domäne mit mehr als 1000 Glycin-X-Y repeats und einer NC1-Domäne an ihrem C-terminalen Ende [Tryggvason et al. 1995; Hudson et al. 2003]. Die α1- und α2(iv)-ketten kommen ubiquitär vor, die α3-, α4-, α5-, α6(iv)-ketten zeigen eine eingeschränkte Verteilung (Lunge, Niere, Innenohr, Augenlinse). Im Gegensatz zu den Gewebs-Kollagenen Typ I, II, III und V haben die α-ketten des Typ IV Kollagens mehrere Unterbrechungen ihrer Glycin-XY repeats, die eine hohe Flexibilität erlauben. Typ IV Kollagen bindet an Laminin, Proteoglykan, Nidogen und auch an Zellen. Letzteres über Rezeptoren, die Aminosäuren aller drei α-ketten einschließen und eine intakte triple-helikale Struktur voraussetzen. Die terminalen NC1- und 7S-Domänen ermöglichen End-zu-End und Seit-zu-Seit Interaktionen der Kollagen-Monomere, die durch Disulfidbrücken zusätzlich stabilisiert werden [Weber et al. 1988] (Abbildung 2). Das Alport Syndrom (AS) ist eine erbliche progressive Nierenerkrankung einhergehend mit Hämaturie und Proteinurie, Innenohrschwerhörigkeit und typischen Augenver-

3 änderungen [Alport 1927; Flinter 1988] und charakteristischen Veränderungen der GBM. Elektronenmikroskopisch finden sich Aufsplitterungen und Lamellierungen der GBM. Abb.2 Aufbau und Organisation von Typ IV Kollagen in der glomerulären Basalmembran (GBM). (Darstellung modifiziert nach Hudson et al. 2003). Oben: Elektronenmikroskopische Darstellung der GBM zwischen Podozyten (Pod) und Endothelzelle (Endo). Mitte: Grundbaustein des Typ IV Kollagen Netzwerkes ist ein aus drei α-ketten bestehendes Kollagenmolekül (Monomer). Jeweils zwei Moleküle treten über die C-terminale NC1-Domäne zusammen (Dimer). Am N-terminalen Ende verbinden sich vier Moleküle (Tetramer). Diese Verbindungen und weitere Verdrillungen bilden ein komplexes Netzwerk. Die Seit-zu-Seit Verbindungen sind bei α3-/α4-ketten zusätzlich durch Disulfidbrücken stabilisiert. Die α1-/α2-und α3-/α4-netzwerke bestehen separat nebeneinander und sind durch Interaktionen von NC1 End-zu-End verbunden [Kleppel et al. 1992; Gunwar et al. 1998]. Dadurch entsteht ein Kollagen Netzwerk von erhöhter Stabilität. Unten: Jeweils drei der sechs α-ketten treten zu einem Typ IV Kollagen Molekül zusammen. Von den gezeigten Isoformen sind nur (α1) 2 (α2) und (α3) 2 (α4) experimentell belegt. Am C- terminalen Ende jeder α-kette befindet sich eine evolutionär hochkonservierte NC1 Domäne ("non-collagenous"). Die Klonierung der α3- und α4(iv)-ketten führte zur Entdeckung einer fünften Kette und des dazugehörigen Gens (COL4A5) auf dem X-Chromosom, wo zuvor das Gen für das AS lokalisiert worden war. Bislang sind im COL4A5-Gen über 300 Mutationen beschrieben [7]. Die Vererbung des Alport Syndroms erfolgt in über 80% der Fälle X-chromosomal [Antignac 1995], autosomal in 10-15% [Flinter et al. 1988]. Die Häufigkeit des X- chromosomalen AS wird auf 1:5000 geschätzt, die Prävalenz des autosomalen AS auf 1: Die Heterozygotenhäufigkeit liegt bei unter 1:120 [11]. Der Phänotyp des AS ist bei unterschiedlicher Penetranz der Symptome heterogen. Die einzelnen Schritte der Pathogenese vom defekten Aufbau der Basalmembran bis hin zur Vernarbung und zum Untergang der Nephrone sind noch ungeklärt [Tryggvason 1995; Kashtan et al. 1998; Sado et al. 1998]. Die terminale Niereninsuffizienz entwickelt sich innerhalb von Jahren, ohne dass primär bekannte Faktoren wie Entzündung, Hypertonie, Hyperfiltration oder eine verminderte Nephronenmasse hierfür verantwortlich wären. Bis vor kurzem war keine Therapie des AS bekannt, die das Auftreten der Symptome und der Niereninsuffizienz zu verhindern oder verzögern vermochte.

4 Die Vererbung des Merkmals Mikrohämaturie bei der familiären benignen Hämaturie (FBH, thin basement membrane disease) folgt einem autosomal dominanten Erbgang. Der Phänotyp der FBH ist nicht von dem heterozygoter AS-Carrier zu unterscheiden. COL4A3 -/- Mäuse dienen als Tiermodell für das humane Alport Syndrom. Sie erkranken am Vollbild des AS und versterben am Nierenversagen [Cosgrove et al. 1996; 10, 15, 16, 18, 19]. Histologisch und immunhistochemisch kommt es wie beim Menschen zum fehlenden Einbau von den α3-, α4- und α5(iv)-ketten und einem ersatzweisen Einbau von α1- und α2(iv)-ketten [Miner et Sanes 1996]. Tyrosinkinase-Rezeptoren (TKR) binden extrinsische Faktoren an der Zelloberfläche und leiten Signale durch die Plasmamembran. Sie regulieren Zellproliferation, -transformation, Zellaltern und Apoptose [Blume-Jensen et Hunter 2001]. Die Discoidin Domain Rezeptoren (DDR1 und DDR2) bilden eine neue Untergruppe der TKRs. Sie unterscheiden sich von anderen TKRs durch ihre extrazelluläre Discoidin-Domain. DDR1 und DDR2 binden als charakteristische Gemeinsamkeit beide Kollagene, DDR1 Kollagen Typ I, II, III und insbesondere Typ IV [Vogel et al. 1997]. DDR1 wird in Niere, Lunge, Gastrointestinaltrakt, Gehirn, Kornea und in dermalen Fibroblasten exprimiert [Alves et al. 1995]. DDR1 -/- Mäuse sind lebensfähig, wenn auch signifikant kleiner als ihre Artgenossen [Vogel at al. 2001]. Kultivierte Mesangiumzellen der Niere aus den DDR1 -/- Mäusen zeigen eine verringerte Proliferation, verringerte Kollagenbindung und Migration [Hou et al. 2001; Curat et Vogel 2002]. 2. Eigene Arbeiten Nach Klonierung des COL4A5 Gens wurde das Alport Syndrom (AS) und die Mutationssuche in Genen des Typ IV Kollagens Forschungsschwerpunkt [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 13, 20]. Ein deutsches Register von über 500 Alport Familien, Patienten und heterozygoten Überträgerinnen wurde erstellt. Dies ermöglichte einen maßgeblichen Beitrag zu einer von der Europäischen Gemeinschaft geförderten "Concerned Action for a new definition of Alport Syndrome based on molecular genetics, and towards the prevention of end-stage renal failure due to Alport syndrome" [4, 12]. Die Identifizierung von mehr als 25 Mutationen erlaubte wichtige Rückschlüsse über die Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp beim X-chromosomalen AS (Abbildung 3) [2, 6, 7, 13]. Die Untersuchungen trugen zur Aufklärung der Ätiologie des AS bei und wurden im Jahr 2000 von der European Renal Association ausgezeichnet.

5 Abb. 3 Genotyp- Phänotyp-Korrelation bei X-chromosomalen Alport Syndrom: Mutationen, die zu einem verkürzten Protein führen (large rearrangements, premature stop codon, frameshift) oder die NC1-Domäne bzw. die donor splice site betreffen führen im Mittel mit unter 20 Jahren und damit signifikant früher zum Nierenversagen als Mutationen, die nur die Proteinstruktur verändern (wie missence und in frame mutation). Glycin- Mutationen in den Exons 1-20 führen erst mit über 30 Jahren zum Nierenversagen. Bei einer großen Familie mit familiärer Hämaturie und autosomalem AS konnten die molekularen Defekte im COL4A4 Gen charakterisiert werden (Abbildung 4) [11]. Beide Eltern und zahlreiche Verwandte sind heterozygot für die gleiche Mutation. Ihre Kinder haben auf beiden Allelen eine pathogene Mutation und sind am AS erkrankt (D5 und D6, Abbildung 4). Damit fand sich ein erster kausaler Zusammenhang zwischen dem autosomalen AS und der familiären benignen Hämaturie auf molekulargenetischer Ebene [2, 3, 6, 11, 13]. Fast 1% der Bevölkerung sind Genträger für Mutationen in den COL4A3/ COL4A4 Genen und haben damit eine FBH. Die FBH gilt aufgrund der Forschungsergebnisse mittlerweile als Typ IV Kollagen Erkrankung. Die Untersuchungen wurden im Jahr 2002 von der Deutschen Gesellschaft für Pathologie ausgezeichnet. Abb. 4 Stammbaum der blutverwandten Familie mit familiärer benigner Hämaturie und autosomal rezessivem Alport Syndrom. Die Vorfahren der Familie wanderten um 1620 aus Südtirol in ein Dorf im Saarland ein. 10 Söhne und folgende Generationen blieben in der Umgebung, die zur der Zeit aus ein paar isolierten Dörfern bestand. Über Jahrhunderte hinweg wurden bei einzelnen Familienmitgliedern sporadische Episoden von Makrohämaturie dokumentiert. Somit waren die Vorfahren aus Südtirol vermutlich bereits Träger der Gründermutation.

6 Abb. 5 Überleben der heterozygoten COL4A3 +/- Mäuse im Vergleich zu Wildtyp- Kontrollen. Die heterozygoten COL4A3 +/- sterben signifikant früher als die gesunden Artgenossen (21,7 vs. 30,3 Monate; p<0.05). Abb. 6 Die COL4A3 +/- (rechts) weisen mehr EHS- Laminin (orange) und Fibronectin (grün) auf als gesunde Kontrollen (links). Einige Glomeruli sind als Hinweis auf die eingeschränkte Nierenfunktion bei den COL4A3 +/- bereits sklerosiert (unten rechts). Die Bedeutung der Typ IV Kollagen-Mutationen als Risikofaktor für das Auftreten anderer Nierenerkrankungen ist bisher unklar und wurde an heterozygoten COL4A3 +/- Mäusen als Tiermodell der familiären benigne Hämaturie untersucht [22]: Die COL4A3 +/- Mäuse leben kürzer als ihre gesunden Artgenossen und leiden an einer chronischen Niereninsuffizienz und Nierenfibrose (Abbildungen 5 und 6). Abb. 7 Überleben der unbehandelten COL4A3 -/- im Vergleich zu behandelten Mäusen. Die früh mit Ramipril behandelten Tiere leben mehr als doppelt so lange. Abb. 8 Proteinurie der Kontrolltiere, der unbehandelten COL4A3 -/- und der behandelten Tiere. Ramipril reduziert das Ausmaß der Proteinurie deutlich. Die weitere Forschungstätigkeit konzentrierte sich auf pharmakologische Interventionen [8, 9, 10, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 21] an COL4A3 -/- Mäusen als Tiermodell für das humane AS. So konnte erstmals eine Therapie für das Alport Syndrom gefunden werden: Die

7 präemptive Gabe des ACE-Hemmers Ramipril verlängerte das Überleben der Tiere um mehr als 100% und reduzierte die Proteinurie parallel zur glomerulären und tubulointerstitiellen Fibrose (Abbildungen 7 bis 10) [10]. Abb. 9 Die Alport-Maus (unten) zeigt elektronenmikroskopisch im Vergleich zum gesunden Tier (oben) eine Verbreiterung der glomerulären Basalmembran, die zur Nephrosklerose und tubulointerstitiellen Fibrose führt. Abb. 10 Gesunde Tiere zeigen eine dünne tubuläre und glomeruläre Basalmembran (links), die Alport- Mäuse weisen eine Vermehrung der extrazellulären Matrix tubulointerstitiell und periglomerulär auf (rechts) (EHS-Laminin). Die Arbeiten wurden aufgrund ihrer Bedeutung für Kinder mit AS von der Deutschen Gesellschaft für Nephrologie, der Deutschen Gesellschaft für Innere Medizin, der Europäischen Gesellschaft für Pädiatrische Nephrologie und mit dem Nils-Alwall-Preis der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Klinische Nephrologie ausgezeichnet. Abbate et Remuzzi kommentieren 2003 im Editorial die Arbeiten als entscheidend für die präemptive Therapie des AS und zur Klärung der renoprotektiven Wirkung der ACE-Hemmer. Abb. 11 Der Vergleich zwischen Ramiprilund Candesartan-behandelten COL4A3 -/- Mäusen zeigt einen Überlebensvorteil für den ACE-Hemmer. Abb. 12 Der ACE-Hemmer hemmt die profibrotischen Faktoren (TGFβ und connective tissue growth factor (CTGF), Western-Blot) stärker als der AT1-Antagonist.

8 Der ACE-Hemmer Ramipril zeigte im Vergleich zum AT1-Antagonist Candesartan ein höheres nephroprotektives Potential [9, 13, 14, 15, 16] (Abbildungen 11 und 12). Abb. 13 Im Vergleich zu unbehandelten Mäusen zeigen die AVE7688 therapierten Mäuse einen deutlichen Überlebensvorteil, auch bei später Therapie. Abb. 14 T-Lymphozyten (oben), Makrophagen (Mitte) und Fibroblasten (unten): Links gesunde Kontrollen, daneben unbehandelte COL4A3 -/-, und in den rechten zwei Reihen spät bzw. früh AVE7688 therapierte Alport-Mäuse. Der derzeit in Phase 3 Studien getestete Vasopeptidaseinhibitor AVE7688 wies zusätzlich zum vom ACE-Hemmer bekannten antifibrotischen Effekt auch eine ausgeprägte antiinflammatorische nephroprotektive Wirkung auf. Dies spiegelt sich in einem den ACE- Hemmer noch übertreffenden Überlebensvorteil selbst bei spätem Therapiebeginn wider [19] (Abbildungen 13 und 14). Abb. 15 Der Vergleich von unbehandelten COL4A3 -/- mit Cerivastatin behandelten Mäusen zeigt unabhängig vom Therapiebeginn einen Überlebensvorteil für therapierte Mäuse. Abb. 16 Der Vergleich von unbehandelten COL4A3 -/- mit CCR1-Antagonist behandelten Mäusen zeigt auch bei spätem Therapiebeginn einen Überlebensvorteil für therapierte Mäuse.

9 Unabhängig vom Therapiebeginn zeigte der HMG-CoA-Reduktase Inhibitor Cerivastatin eine nephroprotektive Wirkung [21] (Abbildung 15). Die Hemmung der Leukozytenadhäsion mit dem Chemokinrezeptorantagonisten BX471 bei den COL4A3 -/- Mäusen verzögerte signifikant das Fortschreiten der Nierenfibrose [18] (Abbildung 16) und belegt, dass diesen Therapieprinzip in naher Zukunft auch beim Menschen mit chronischen Nierenerkrankungen erfolgreich eingesetzt werden könnte. Abb. 19 Die DDR1 -/- Mäuse (rechts) zeigen im Vergleich zu gesunden Kontrollen (links) eine hochmolekulare Proteinurie als Hinweis auf eine geschädigte glomeruläre Basalmembran. Abb. 20 Die Verbreiterung der glomerulären Basalmembran von DDR1 -/- Mäusen (links) führt zum lokalen Verlust der Schlitzmembran (rote Kreise) und damit zur Proteinurie (rechts). Bei der Erforschung der Pathogenese des AS steht derzeit die (beim Alport Syndrom gestörte) Interaktion der extrazellulären Matrix mit den umliegenden Zellen über Typ IV Kollagen-Rezeptoren wie DDR1 im Mittelpunkt. Zunächst wurde der renale Phänotyp der DDR1-knockout Maus charakterisiert [17] (Abbildungen 19 und 20). Abb. 21 Die COL4A3-/- DDR1-/- leben 41% und die COL4A3-/- DDR1+/- 23% länger als die COL4A3-/- DDR1+/+ Mäuse. Abb. 22 Die Doppel-knockout Mäuse (unten) akkumulieren weniger Fibronectin (grün) und EHS-Laminin (orange) als Alport-Mäuse mit DDR1.

10 In der Folge wurden COL4A3/ DDR1 Doppelknockout-Mäuse generiert. Nach unserer Hypothese sollte das Fehlen des Typ IV Kollagenrezeptors DDR1 die Zell-Matrix-Interaktion beim AS so verändern, dass die Zelle das fehlerhafte Matrixsignal eingeschränkt wahrnimmt und vermindert mit Matrixakkumulation reagiert. Nach ersten Daten leben COL4A3/DDR1 Doppelknockouts länger und zeigen weniger Fibrose (Abbildungen 21 und 22), so dass derzeit die Idee der Blockade des DDR1-Rezeptors als neue Therapieoption bei chronischen Nierenerkrankungen bezüglich einer Patentanmeldung geprüft wird. Weitere Versuche mit den Doppel-knockout Tieren sollen das Verständnis verbessern, wie beim Alport Syndrom eine genetisch bedingte veränderte Zusammensetzung der Basalmembran über Zell-Matrix-Interaktion eine Nierenfibrose verursacht und ob sie durch Blockade der Kollagen-Rezeptoren verhindert werden kann. Ein verbessertes Wissen über diesen kritischen Zusammenhang wird helfen, neue Therapieansätze (wie DDR1-Blockade) und präventive Strategien für chronische Nierenerkrankungen mit erworbenen Matrixveränderungen (Diabetes mellitus, glomeruläre Entzündung etc.) zu entwickeln.