Weiterentwicklung und Einsatz der Fluoreszenz-Clamp-Methode für Elektronenflußvergleiche in der Photosynthese

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1 Weiterentwicklung und Einsatz der Fluoreszenz-Clamp-Methode für Elektronenflußvergleiche in der Photosynthese Diplomarbeit der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Katrin Schinner März 1997

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3 Inhaltsverzeichnis Verzeichnis häufig verwendeter Abkürzungen und Begriffe VI 1 Einleitung 1 2 Der Photosyntheseapparat Die Licht- und Dunkelreaktion Ort der Photosynthese Die Photosysteme Die Elektronentransportkette Die Fluoreszenz als Meßgröße in der Photosynthese Fluoreszenzentstehung Unterschiede zwischen den beiden Photosystemen Quenchingmechanismen Das Topfmodell Fluoreszenzkinetik Yieldmessung Die Zeitkonstanten und ihre Bedeutung Motivation für die Entwicklung der Fluoreszenz-Clamp-Maschine Flußmessungen Beispielsystem Skalierungsfaktor Fluß-FC Vergleich von Sauerstoffentwicklung und Elektronenfluß Die Fluoreszenz-Clamp-Maschine Der Meßaufbau Die Meßkammer Der Photodetektor Der Leuchtdiodenkopf Das Hintergrundlicht Die Filter Die Datenaufnahme Die Pflanzen Technische Verwirklichung der FC-Maschine Grundversion nach Giannikos Die neue Version des Regelkreises Eigenschaften der neuen Hintergrundlicht-Regelung Untersuchung der Frequenzgänge des Fluoreszenz-Regelkreises III

4 INHALTSVERZEICHNIS IV 6 Vergleich der Standardmeßverfahren von PAM und FC-Maschine Messungen mit dem PAM Messungen mit der FC-Maschine Vorversuche für den meßtechnischen Einsatz Bestimmung der Hintergrundlicht-Intensität für sättigende Lichtblitze Bestimmung des Φ 0 /Φ M -Wertes Bestimmung der thermischen Deaktivierung Verfahren mit zwei Blitzen pro Messung Verfahren mit mehreren Lichtblitzen pro Messung Gegenüberstellung der beiden Meßverfahren Flußverzweigungen an PS I Motivation für FC-Messungen bei Pflanzen mit verschiedenen PS I-Akzeptoren Der lineare bzw. nichtzyklische Elektronentransport Der zyklische Elektronentransport Der pseudozyklische Elektronentransport (Mehler-Reaktion) Die Stickstoffassimilation Das Malat-Ventil Die Protonen-Elektronenbilanz Messungen mit zusätzlichem fernroten Licht Veränderungen an der FC-Maschine für das Zuschalten von FR-Licht Messungen Untersuchung der thermischen Deaktivierung Messungen im Sommer Die Kontrollmessungen Messungen mit Inhibitoren Einfluß des Steady-State-Wertes Einfluß auf den Φ 0 /Φ M -Wert Messungen im Herbst und Winter Messungen mit zusätzlichem blauen Licht Überprüfung der Lichtverteilungstheorie FR-Wirkung auf die Blaulichtmodulation Parallelmessungen von PAS- und FC-Maschine Die Photoakustik Änderungen an der FC-Maschine Messungen der O 2 - und FC-Flüsse Nachweis der Mehler-Reaktion Auswirkungen des CO 2 -Gehaltes Messungen mit zusätzlichem FR-Licht Diskussion der Ergebnisse Diskussion der Sommermessungen Diskussion der Wintermessungen Diskussion der Parallelmessungen von Sauerstoffentwicklung und Elektronenfluß

5 INHALTSVERZEICHNIS 13 Fazit Zusammenfassung 115 Anhang 119 Schaltpläne Literaturverzeichnis 123 Danksagung 129 Die eidesstattliche Erklärung 131 V

6 INHALTSVERZEICHNIS Verzeichnis häufig verwendeter Abkürzungen und Begriffe ADP Adenosindiphosphat ATP Adenosintriphosphat Chl Chlorophyll ETC lineare Elektronentransportkette F Grundfluoreszenz Fd Ferredoxin FET Feld-Effekt-Transistor F M Maximalfluoreszenz Φ maximaler Exzitonenfluß Φ M minimaler Exzitonenfluß I Lichtintensität k f ratenkonstante der Fluoreszenz k p Ratenkonstante der photochemischen Deaktivierung k t Ratenkonstante der thermischen Deaktivierung LHC Light Harvesting Complex NADP Nicotinadenindinucleotidphosphat P680,P Reaktionszentrumsmolekül von PS II bzw. PS I OAA Oxalacetat PC Plastocyanin PQ Plastoquinon PS I, PS II Photosystem I bzw. II Q A, Q B Akzeptoren von PS II q E Energy-Quenching q N nichtphotochemisches Quenching q I Photoinhibitions-Quenching q P photochemisches Quenching RZ Reaktionszentrum Vereinbarung Die Intensitätsangaben in W/m 2 beziehen sich auf die Mittelung über Hell- und Dunkelphasen der Lichtprogramme. VI

7 Kapitel 1 Einleitung Das Grundkonzept der Photosynthese wurde durch die chemiosmotische Hypothese von Mitchell (1961) verstanden. Die beiden Photosysteme II und I nutzen die Lichtenergie, um Elektronen vom Wasser zum NADP zu transportieren. Auf dem Weg dorthin bauen sie einen ph-gradienten über einer Membran auf. Dieser ph-gradient treibt eine ATPase und erzeugt ATP (Witt, 1979). ATP und NADPH/H + treiben zusammen den Calvin-Zyklus, der CO 2 in Zucker einbaut. Im Laufe der Jahre wurde dieses Bild jedoch komplexer. Der Elektronenfluß vom Wasser erreicht nicht in jedem Fall das NADP, sondern kann sich hinter PS I auf unterschiedliche Akzeptoren verteilen. Je nach Fragestellung interessieren sich Forschergruppen für verschiedene dieser Zusatzakzeptoren. Gegensätzliche Auffassungen über die Bedeutung der einzelnen Wege können bereits innerhalb einer Arbeitsgruppe bestehen. In Würzburg halten Heber et al. (1982) den sogenannten zyklischen Elektronentransport um PS I für den wichtigsten Prozeß, um die ATP-Bilanz im Blatt zu verbessern. Schreiber (Schreiber und Neubauer, 1990) hingegen schreibt diese Rolle der Mehler-Reaktion, d. h. der Übertragung von Elektronen auf molekularen Sauerstoff, zu. In Kiel steht die Bedeutung der Nitratassimilation als PS I-Elektronenakzeptor im Mittelpunkt. Es ist aus der Landwirtschaft bekannt (Magalhaes und Wilcox, 1983 ; Zornoza et al., 1989), daß nitraternährte Pflanzen resistenter gegen Lichtstreß sind als ammoniumernährte. In einem gemeinsamen DFG-Projekt der Kieler Arbeitsgruppe für Biophysik und des Instituts für Pflanzenernährung soll nachgewiesen werden, daß die Abnahme von Elektronen an PS I bei nitraternährten Pflanzen eine Entlastung und damit eine Schutzfunktion für die Pflanze bedeutet (Vanselow, 1993; Bendixen et al., 1997). In diesem Zusammenhang spielt auch die Mehler-Reaktion eine große Rolle (Zhu et al., 1997). Eine Schwierigkeit besteht darin, die Verzweigung des Elektronenflusses hinter PS I experimentell zu erfassen. Obwohl es verschiedene meßtechnische Zugänge zum photosynthetischen Apparat gibt, wird gerne auf die Chlorophyll-Fluoreszenz von PS II zurückgegriffen. Sie ist mit Abstand am leichtesten zu messen und birgt eine Fülle von Information. Allerdings ist die Information so reichhaltig, daß es teilweise schwer ist, sie zu decodieren. Es werden deshalb Meßverfahren gesucht, die eindeutige Antworten geben. Die Fluoreszenz ist ein Maß für die Konzentration von Exzitonen in den PS II-Antennen. Sie entspricht damit der Messung eines Potentials, vergleichbar mit einer Spannung in einem elektrischen Netzwerk. Die eigentlich interessierenden Exzitonenflüsse aus den Antennen in den photosynthetischen Apparat oder in die Energiedissipationsmechanismen werden indirekt aus Veränderungen dieser Potentialgröße geschlossen. Wie in Kapitel 4 gezeigt wird, hat es jedoch Vorteile, die Flüsse direkt zu messen. 1

8 EINLEITUNG Vor einer ähnlichen Anforderung stand früher die Nervenphysiologie. Es war verhältnismäßig einfach möglich, Spannungen an den Nervenzellen zu messen, es interessierten aber die Ströme. Dies änderte sich, als Marmont (1949) einen Voltage-Clamp-Kreis aufbaute: ein Regelkreis hielt die Spannung konstant und lieferte den dafür erforderlichen Strom nach. Dieses Konzept sollte in einer Vorgängerarbeit (Giannikos, 1995) auf die Chlorophyll-Fluoreszenz übertragen werden. Es entstand die FC-Maschine (Fluoreszenz-Clamp-Maschine), bei der das Licht so nachgeregelt wird, daß der Exzitonenfluß aus der Antenne kompensiert wird und die Intensität der Fluoreszenz konstant bleibt. Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit war es, das Konzept der ersten Version technisch zu vervollkommnen, den Nutzen zu verdeutlichen und damit Messungen zu den oben genannten Problemkreisen Nitratassimilation und Mehler-Reaktion durchzuführen. Insbesondere war der Nachweis der Mehler-Reaktion eine Motivation zur Entwicklung der FC-Maschine. Diese Reaktion ist zwar bei isolierten Chloroplasten nachgewiesen (Mehler, 1951a, 1951b), doch im intakten Blatt ist ihre Rolle nach wie vor unklar. Ein Zugang hierzu wurde von Parallelmessungen des Elektronenflusses mit der FC-Maschine und der Netto-Sauerstoffentwicklung erwartet. Die vorliegende Arbeit wird zeigen, daß dies mit simultanen, photoakustischen Messungen gemeinsam mit Tabrizi (1997) gelingt. 2

9 Kapitel 2 Der Photosyntheseapparat Die folgenden Abschnitte dienen dazu, eine kurze Einführung in die biologischen und physikalischen Hintergründe des photosynthetischen Systems zu geben, das hier untersucht wird. Da dieses System bereits in vielen Vorgängerdiplomarbeiten beschrieben wurde, erfolgt nur ein kurzer Überblick über die Grundlagen. Eine ausführlichere Beschreibung der Reaktionen an Photosystem I, die die vorliegende Arbeit direkt betreffen, liefern die Kapitel 4 und Die Licht- und Dunkelreaktion Der Gesamtprozeß der Photosynthese läßt sich in zwei Bereiche unterteilen: die Lichtreaktion, bei der hauptsächlich biophysikalische Vorgänge ablaufen, die Dunkelreaktion, bei der im wesentlichen biochemische Vorgänge eine Rolle spielen. Die Bezeichnung Dunkelreaktion bringt zum Ausdruck, daß die damit verbundenen Prozesse, zumindest für eine gewisse Zeit, ohne direkten Einfluß von Licht ablaufen können. Wie Abbildung 2.1 verdeutlicht, sind Licht- und Dunkelreaktion eng miteinander gekoppelt. Während der Lichtreaktion wird die Energie des absorbierten Lichtes genutzt, um die che- Abbildung 2.1: Zusammenwirken von Licht- und Dunkelreaktion in der Photosynthese (Buschmann und Grumbach, 1985). mischen Substanzen ATP und NADPH/H + herzustellen. Zusätzlich wird durch die Photolyse 3

10 DER PHOTOSYNTHESEAPPARAT des Wassers Sauerstoff freigesetzt. Während der Dunkelreaktion, dem sogenannten Calvin- Zyklus, werden mit Hilfe des ATP als Energieträger und des NADPH/H + als Reduktionsmittel durch die Reduktion von CO 2 Kohlenhydrate produziert. Da für diese Arbeit hauptsächlich die Lichtreaktion von Interesse ist, wird sie in den folgenden Abschnitten näher behandelt. 2.2 Ort der Photosynthese Die Photosynthese der grünen Pflanzen findet in den Chloroplasten der Pflanzenzelle statt. Jede Zelle enthält bis zu 400 Chloroplasten, die von ellipsoider Form sind und ein Volumen von ca. 40 µm 3 haben (Abb. 2.2). Im Inneren des Chloroplasten befindet sich eine 7 nm dicke Doppellipidschicht, die als Envelope Granastapel Stromathylakoid 4 Abbildung 2.2: Schematische Darstellung eines aufgeschnittenen Chloroplasten (Libbert, 1987). Thylakoidmembran bezeichnet wird. Sie kommt in gestapelter und ungestapelter Form vor. Die ungestapelten Schichten werden Stromathylakoide, die gestapelten Granathylakoide genannt. Die Thylakoidmembran teilt, da sie in sich geschlossen ist, den Innenraum des Chloroplasten in zwei Bereiche auf. Der äußere Bereich wird als Stroma, der innere als Lumen bezeichnet. Die Thylakoide enthalten die Komponenten des Photosyntheseapparates, die für die Energieumwandlung zuständig sind (Junge, 1975; Renger et al., 1987): die lichtsammelnden Proteine, die Photosysteme I und II, die Elektronentransportkette (ETC), das Elektroenzym ATPase. Das Stroma enthält die Komponenten, die für die Substanzumwandlung verantwortlich sind: Enzyme des Calvin-Zyklus, Enzyme weiterer Stoffwechselprozesse, wie Mehler-Reaktion und Stickstoffwechsel.

11 VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE Die Chloroplasten sind von einer Außenmembran, der Envelope, umgeben und beweglich im Cytosol eingelagert. Im Cytosol befinden sich u. a. die Mitochondrien, die für die Zellatmung verantwortlich sind und bei der Diskussion der Ergebnisse dieser Arbeit eine gewisse Rolle spielen (Kap. 12). 2.3 Die Photosysteme Das zur Photosynthese notwendige Licht wird in den Photo- bzw. Antennensystemen PS I und PS II absorbiert. Die Antennenpigmente werden aus Chlorophyll-Molekülen gebildet, die in der Lage sind, Photonen unterschiedlicher Frequenzen zu absorbieren. Ein Photosystem besteht aus ca. 300 Chlorophyllmolekülen a (Chl a), weiteren Photorezeptormolekülen (Chl b und Carotinoide) und einem Reaktionszentrum (RZ), in dem lichtgetriebene Ladungstrennungen stattfinden. Das Reaktionszentrumsmolekül ist ein spezielles Chl a, das im Falle von PS I bei 700 nm (P700 ), im Falle von PS II bei 680 nm (P680 ) sein Absorptionsmaximum hat. Zur Ladungstrennung wird die von den Antennenpigmenten absorbierte Energie benötigt. Der genaue Prozeß der Übertragung des Anregungszustands (Exziton = S 1 -Zustand des Chlorophyllmoleküls) aus der Antenne in das RZ ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen mit Hilfe der Picosekunden-Fluoreszenzmeßtechnik (Dau und Sauer, 1996). Beim shallow trap Modell wird davon ausgegangen, daß sich das Exziton frei im Antennenkomplex bewegt. Nach Messungen von Leibl et al. (1989) besucht es das RZ ca. 60 mal, bevor dort eine Ladungstrennung stattfindet. Voraussetzung dafür ist bei PS II ein offenes P680. Bei einem oxidierten P680 (P680 + ) ist eine Nutzung der Anregungsenergie nicht möglich. Entweder verschwindet das Exziton dann durch thermische Deaktivierung oder durch Fluoreszenzabstrahlung. Beim sogenannten connected-unit -Modell (Geacintov und Breton, 1987) kann der Anregungszustand auch auf einen anderen Antennenkomplex übertragen und dort von einem reduzierten RZ eingefangen werden. Auch bei offenen Reaktionszentren kann das Exziton über die bereits oben genannten alternativen Prozesse thermische Deaktivierung oder Abstrahlung von Fluoreszenz deaktiviert werden. Die Verteilung auf die einzelnen Prozesse wird im Zusammenhang mit dem Topfmodell in Kapitel 3 besprochen. Die Antennenfläche wird durch den light-harvesting -Komplex (LHC) vergrößert, der den größten Teil des Lichtes absorbiert und auf die beiden Photosysteme überträgt. Der bewegliche Anteil dieses Antennenkomplexes ermöglicht eine Veränderung der relativen Antennengröße von PS I und PS II. Dadurch kann die Pflanze in Abhängigkeit von den jeweiligen Rahmenbedingungen die Energieübertragung auf die beiden Photosysteme regeln und ausgleichen. 2.4 Die Elektronentransportkette An dem von der Energie des absorbierten Lichtes angetriebenen Prozeß der Abspaltung von Elektronen aus dem Wasser im wasserspaltenden Enzym (WSE = water splitting enzyme) und der Übertragung der Elektronen auf die Akzeptoren von PS I sind viele nacheinander ablaufende Reaktionen beteiligt. Sie reichen in einer Folge von Redoxreaktionen die Elektronen von einem Reaktionspartner an den nächsten weiter. Obwohl neben den Elektronen auch Protonen durch diese Kette verschoben werden, wird sie als Elektronentransportkette (ETC = electron transfer chain) bezeichnet. 5

12 ˆ ž ž ž f f % % f f DER PHOTOSYNTHESEAPPARAT In Abbildung 2.3 ist das sogenannte Z-Schema der ETC abgebildet. Die Ordinate stellt das Š ƒ }~ ƒ }~ Œ n / V % "! š š œ œ Ÿ Ÿ š š œ œ Ÿ Ÿ - œ œ Ÿ Ÿ WSE & # + &$ $ % & ' %)( $+*,- # 0 /&0,". %, F5G H)I5J KALMON G PDHQI5R)S T N RQMOJ S U)F5RQF5V N W5X YZ [+\ [e^5à^5\]a+bdc c νg νg ; B % $+: <>=?A@?DC 354 E $ ih ih j' mon mqp mor 12 9$+: w x y z { 9$+: w x y A{ KALMON G PDHQI5R)S T N RQMOJ S U)F5RQF5V N W5X 9lk YZ [+\][_^5À^ \ a+bdc νž νž # + 9Omts u&mtsv%) + Abbildung 2.3: Schematische Darstellung der ETC nach Richter (1988). Die Höhe der Komponenten entspricht dem Redoxpotential. Weitere Erläuterungen im Text. Redoxpotential dar. Die einzelnen Komponenten werden in der Reihenfolge der Kette besprochen: 1. Die ETC beginnt nach Absorption eines Photons mit der Anregung des Reaktionszentrums P680 von PS II. (a) Hier findet die Ladungstrennung statt. Nach 3 4 ps wird der Akzeptor Pheophytin (Pheo) von P680 reduziert. Es bildet sich das Radikalpaar [P680 +, Pheo ]. (b) Das WSE spaltet in vier Schritten zwei Moleküle H 2 O aus dem Lumen in ein Molekül Sauerstoff, vier Protonen und vier Elektronen. Die dazu notwendige Energie wird vom Reaktionszentrum P680 geliefert. 2. Das reduzierte Pheophytin reoxidiert durch die Weitergabe des Elektrons an den primären Chinonakzeptor, den Quencher Q A. 3. Q A wiederum gibt das aufgenommene Elektron an den sekundären Chinonakzeptor Q B ab. 4. Der Quencher Q B kann nur im zweifach negativ geladenen Zustand PS II verlassen. Nach Aufnahme zweier Protonen aus dem Stroma tritt er als Plastohydrochinon (PQH 2 ) in den Plastoquinonpool (PQ-Pool) ein. Die Größe des PQ-Pools relativ zur Anzahl der PS II-Einheiten liegt zwischen 7 und 40 (Crofts und Wright, 1983; Schreiber et al., 1988; Lawlor, 1990; Baake und Schlöder, 1992). Dadurch stellt er einen Zwischenspeicher zwischen PS II und den nachfolgenden Komponenten der ETC dar. 6

13 VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE 5. (a) Der PQ-Pool diffundiert durch die Thylakoidmembran zum Lumen, wo er die beiden Protonen abgibt. Die Erhöhung der Protonenkonzentration im Lumen es haben sich zusätzlich die vier Protonen aus der Wasserspaltung dort angereichert führt zum Aufbau eines ph-gradienten über der Thylakoidmembran. Die daraus resultierende freie Reaktionsenthalpie ermöglicht über eine inverse Protonenpumpe (ATPase) die Synthese des ATP aus ADP und Phosphat (Mitchell, 1977; Witt, 1979). (b) Die Reoxidation von PQ erfolgt über den Cytochrom b 6 /f-komplex: das vom Cytochrom b 6 aufgenommene Elektron gelangt über das Rieske Fe-S-Zentrum zum Cytochrom f und von dort in den Plastocyanin-Pool (PC-Pool). 6. Das Reaktionszentrum P700 von PS I übernimmt die Elektronen vom Plastocyanin und führt eine weitere Ladungstrennung durch. Über Zwischenschritte (A x ) wird schließlich Ferredoxin (Fd) reduziert. 7. Das Fd gibt seine Ladung an das Enzym Ferredoxin-NADP-Reduktase weiter. Es bildet das Ende der ETC und synthetisiert NADPH/H + aus NADP +. Allerdings gibt es für die Elektronen weitere Möglichkeiten, PS I zu verlassen. Diese Verzweigungen hängen stark mit den Untersuchungen dieser Arbeit zusammen und werden in den Kapiteln 4 und 8 näher besprochen. Ist z. B. die ATP-Synthese durch CO 2 -Mangel gehemmt, können die Elektronen vom Fd zurück an den Cytochrom b 6 /f-komplex gelangen. In diesem Fall wird von zyklischem Elektronentransport gesprochen (gestrichelte Linie in Abbildung 2.3). 7

14 DER PHOTOSYNTHESEAPPARAT 8

15 Kapitel 3 Die Fluoreszenz als Meßgröße in der Photosynthese Es gibt unterschiedliche Methoden, die Vorgänge während der Photosynthese zu untersuchen. Physiker bevorzugen im allgemeinen das Licht als Signalträger, welches gerade bei der Photosynthese besonders viel Information ergibt. Auf eine weitere physikalische Meßtechnik, die Photoakustik, mit deren Hilfe die Sauerstoffentwicklung und die CO 2 -Aufnahme bestimmt werden kann, wird in Kapitel 11 näher eingegangen. Abbildung 3.1: Darstellung der unterschiedlichen Prozesse, die von der eingestrahlten Lichtenergie im Blatt ausgelöst werden können (Buschmann und Grumbach, 1985). Abbildung 3.1 stellt die unterschiedlichen Prozesse dar, die von der eingestrahlten Lichtenergie im Blatt ausgelöst werden können. Alle Ausgänge tragen Information. Die Wärmeentwicklung kann photoakustisch gemessen werden und Aufschluß über die thermische Deaktivierung in der Antenne geben (Dau und Hansen, 1990). Die Reflexion beinhaltet das bei 535 nm zu messende Scattering-Signal, das mit dem ph-gradienten über der Thylakoidmembran zusammenhängt (Krause und Weis, 1984; Hansen et al., 1993). Die Transmission enthält zahlreiche Absorptionssignale. Die Absorption bei 505 nm (A505) hängt mit der Bildung des Zeaxanthins, eines Schutzcarotinoids in der PS II-Antenne, zusammen (Bilger 9

16 DIE FLUORESZENZ ALS MESSGRÖSSE IN DER PHOTOSYNTHESE und Björkmann, 1990; Gruszecki et al., 1994; Goss et al., 1995). Das 515 nm-signal (A515) hatte eine große Bedeutung bei der Übertragung der chemiosmotischen Hypothese (Mitchell, 1961, 1977) auf die Photosynthese (Witt, 1979; Junge, 1977; Gräber, 1987), denn es ermöglicht die Messung der elektrischen Thylakoidspannung über den Starkeffekt. Im Kieler Biophysik- Praktikum wird es benutzt, um die Rückwirkung der Thylakoidspannung auf die primäre Ladungstrennung in PS II (Abb. 2.3) zu bestimmen (Dau et al., 1991). Die Absorption bei 820 nm (A820) gibt Aufschluß über den Redoxzustand des Reaktionszentrums von PS I (Schreiber et al., 1988; Klughammer und Schreiber, 1994). Für die vorliegende Arbeit ist besonders das Fluoreszenzsignal von Interesse. Aus seinem zeitlichen Verlauf können Rückschlüsse auf Prozesse während der Photosynthese gezogen werden. 3.1 Fluoreszenzentstehung Die Beleuchtung von photosynthetisch aktivem Material (isolierte Chloroplasten, Algen, grüne Blätter und verschiedene Bakterien) führt zur Emission von Fluoreszenzlicht. Wie in Abschnitt 2.3 erwähnt, bestehen die Antennen der Photosysteme hauptsächlich aus Spektren des Chlorophyll a (Vorwiegend π π ) Ausschnitt aus dem Termschema nach Jablonski 3.0 E[eV] 400 λ[nm] 500 Anregung (1 fs) S4 S3 Interne Umwandlung (10 fs) S2 Tn Photochemie Photophysik (6 ps) S1 T1 Vibration (100 fs) Rotation (1 ps) Elektronisch (1 ns) Absorption Fluoreszenz Phosphoreszenz Fluoreszenz (1 ns) Phosphoreszenz (1 ms) S0 Abbildung 3.2: Darstellung des Absorptions- und Emissionsspektrums von Chl a (links). Auf der rechten Seite der Abbildung sind im Jablonski-Diagramm die entsprechenden Zustände im Termschema aufgetragen (Haken und Wolf, 1987). den Pigmentmolekülen Chl a und Chl b. Das Absorptionsspektrum von Chl a ist links in Ab- 10

17 VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE bildung 3.2 dargestellt. Es besitzt zwei ausgeprägte Maxima im blauen (450 nm) und roten (680 nm) Spektralbereich. Diese entstehen durch den Übergang vom Grundzustand S 0 zu höheren Singulettzuständen S x (Jablonski-Diagramm, rechts in Abbildung 3.2). Höhere Anregungszustände können strahlungslos in den S 1 -Zustand übergehen oder durch einen Energietransfer auf Nachbarmoleküle deaktivieren. Die Emission von Fluoreszenzlicht ist nur beim Übergang vom S 1 -Zustand in den Grundzustand S 0 möglich. Stellt sich die Emission nach einer Zeit von mehr als 2 ns ein, spricht man von Lumineszenz (delayed fluorescence). Das Intensitätsverhältnis von Fluoreszenz zu Lumineszenz liegt bei 100 bis Insgesamt gibt es folgende Möglichkeiten, wie aus dem S 1 -Zustand der Grundzustand S 0 erreicht werden kann: durch Fluoreszenz über die Abstrahlung eines einzelnen Lichtquants, über die sogenannte thermische Deaktivierung durch Abgabe der Energie als Wärme, durch die Übertragung der Anregungsenergie auf ein benachbartes Pigmentmolekül oder an das Reaktionszentrum des Photosystems, indirekt als Phosphoreszenz über einen Triplettzustand. Phosphoreszenz tritt sehr selten auf und ist unter normalen physiologischen Bedingungen kaum nachweisbar. Der Prozentsatz des über die Fluoreszenz abgegebenen Lichtes liegt zwischen 3 und 7 % bei intakten, photosynthetisch aktiven Blättern und 30 % bei isolierten Chlorophyllextrakten. Er hat eine hohe meßtechnische Bedeutung, weil er ein Maß für den physiologischen Zustand und die Photosytheseaktivität der jeweiligen Probe ist Unterschiede zwischen den beiden Photosystemen Die beiden Photosysteme I und II unterscheiden sich sowohl in ihrem Absorptions-, als auch in ihrem Fluoreszenzmaximum. Die Absorption von PS I ist maximal bei 700 nm, die von PS II bei 680 nm (Abb. 9.1). Diese Tatsache wird bei Messungen mit fernrotem Licht (λ > 700 nm) ausgenutzt. Da damit hauptsächlich PS I angeregt wird, kann dessen Einfluß auf den jeweiligen physiologischen Prozeß eingeschätzt werden. Das Intensitätsmaximum der Fluoreszenz liegt für PS I bei 735 nm, für PS II bei 683 nm. Bei Zimmertemperatur kann davon ausgegangen werden, daß die variable Fluoreszenz ausschließlich von PS II stammt (Baker und Webber, 1987). 3.2 Quenchingmechanismen Im vorherigen Abschnitt wurden die unterschiedlichen Möglichkeiten zur Deaktivierung der S 1 -Zustände behandelt. Alle Mechanismen, die zu einer Verringerung der S 1 -Zustände und der dazu proportionalen Fluoreszenz führen, werden Quenchingmechanismen genannt. Das Topfmodell veranschaulicht diesen Sachverhalt. 11

18 DIE FLUORESZENZ ALS MESSGRÖSSE IN DER PHOTOSYNTHESE Das Topfmodell Man stellt sich dabei einen Exzitonensee (Abb. 3.3) vor, dessen Höhe vom Gleichgewicht zwischen eingestrahlter Lichtenergie und Exzitonenflüssen aus der Antenne bestimmt wird. Die Höhe des Sees bekommt jedoch nur als statistisches Mittel einen Sinn. Bei einer Absorptionsrate von 10 bis 100 Photonen pro Sekunde und einer maximalen Lebensdauer der Exzitonen von 9 µs (Rogers und Bates, 1980) sind die Photosysteme meistens leer. Das Becken (Abb. 3.3) stellt die Gesamtheit der Photosysteme II dar. Der Abbau der Exzitonenenergie kann über thermische und photochemische Deaktivierung sowie über die Abstrahlung durch Fluoreszenz erfolgen. Diese Vorgänge werden durch die Ratenkonstanten k t, k p und k f repräsentiert (Abb. 3.3). Unter der Annahme, daß die Ratenkonstante k f der Fluoreszenz konstant ist, spiegelt die ai k f k p k t Q A ETC Abbildung 3.3: Das Topfmodell. Durch eingestrahltes Licht der Intensität I bildet sich in den PS II- Antennen ein Exzitonensee. Die Deaktivierung der Exzitonenenergie kann thermisch (k t ), photochemisch (k p ) und über die Abstrahlung von Fluoreszenz (k f ) erfolgen. Intensität der Fluoreszenz den Pegelstand im Exzitonensee wider. Für den Energietransfer zwischen den einzelnen Photosystemen gibt es verschiedene Modelle. Beim Matrix-Modell, das von einer sehr starken Kopplung der Photosysteme untereinander ausgeht, ergibt sich folgender Zusammenhang zwischen den im Topfmodell dargestellten Größen (Dau, 1989, 1994): E = a I k f + k t + k p [Q A ] (3.1) mit E : Höhe des Exzitonensees a : mittlerer Absorptionsquerschnitt der Photosysteme II I : Intensität des Anregungslichtes k f : Ratenkonstante der Fluoreszenz k t : Ratenkonstante der thermischen Deaktivierung k p : Ratenkonstante der photochemischen Deaktivierung [Q A ] : Konzentration an nichtreduziertem Quencher Q A Daraus ergibt sich die Fluoreszenz F zu: F = k f E = k f k f + k t + k p [Q A ] a I (3.2) 12

19 VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE An dieser Formel lassen sich die verschiedenen Quenchingmechanismen gut erläutern: eine Verringerung der Fluoreszenz F kann bei konstantem k f und konstanter Lichtintensität I durch eine Verminderung des Absorptionsquerschnittes a der Photosysteme II, ein Anwachsen der thermischen Deaktivierung k t, eine Erhöhung der photochemischen Aktivität k p auftreten. Die ersten beiden Punkte werden als nichtphotochemisches Quenching (q N ), die Erhöhung von k p als photochemisches Quenching (q P ), bezeichnet. Die nichtphotochemischen Quenchingprozesse sollen die Pflanze vor zu hohen Lichtintensitäten schützen. Es werden verschiedene Arten von nichtphotochemischen Quenchingmechanismen unterschieden: das Energy-Quenching (q E ) wird auch ph-abhängiges Quenching genannt, weil es zusammen mit dem Aufbau des ph-gradienten über der Thylakoidmembran auftritt. Es macht sich in einem Anstieg von k t im Zeitraum von 5 bis 20 Sekunden bemerkbar. Die genauen Prozesse, die zu dieser thermische Deaktivierung führen, sind noch nicht vollständig geklärt (Dau und Hansen, 1990; Schreiber und Neubauer, 1990; Schreiber et al., 1991; Ramm und Hansen, 1993). beim State-transition-Quenching (k T ) werden die beweglichen LHCs zwischen den Photosystemen II und I umverteilt, um eine bessere photochemische Ausnutzung der Anregungsenergie zu erreichen. Dies äußert sich in einer Verringerung des Absorptionsquerschnittes a und tritt nach 3 bis 10 Minuten auf (Dau und Hansen, 1988; Dau, 1989; Dau und Canaani, 1990). das Photoinhibitions-Quenching (q I ) wird durch sehr hohe Lichtintensitäten ausgelöst. Dabei werden Einheiten von PS II geschädigt und damit die Fluoreszenzausbeute vermindert. Dieser Prozeß läuft mit einer Zeitkonstanten von 30 Minuten relativ langsam ab und macht sich ebenfalls in einer Verringerung des Absorptionsquerschnittes a bemerkbar (Powles und Björkmann, 1982; Krause und Laasch, 1987). 3.3 Fluoreszenzkinetik Wird ein dunkeladaptiertes Blatt mit Licht mittlerer Intensität bestrahlt, zeigt das Fluoreszenzsignal einen charakteristischen Kurvenverlauf, der in Abbildung 3.4 dargestellt ist. Dieses zum ersten Mal von Kautsky und Hirsch (1931) entdeckte Phänomen wird häufig als Kautsky-Induktionskurve bezeichnet. Aus dem Kurvenverlauf kann auf einzelne Prozesse während der Photosynthese geschlossen werden. Eine ausführliche Erläuterung der Zeitbereiche [1] bis [6] erfolgt in Abschnitt Yieldmessung Die Fluoreszenzmessung ist eine sogenannte Yieldmessung. Hierbei wird zwischen zwei Lichtarten unterschieden: 13

20 DIE FLUORESZENZ ALS MESSGRÖSSE IN DER PHOTOSYNTHESE Veränderungen im Redoxzustand von QA Veränderungen des ph- Wertes im Lumen P LHC - Dephosphorilierung 3 4 5a Fluoreszenzyield M I 2 1 5b D 6 O s 10 s 100 s 1 ks 10 ks I B I B I I A Lichtintensität Zeit Abbildung 3.4: Charakteristische Fluoreszenzantwort auf einen Sprung in der Lichtintensität von I A auf I B mit den dazugehörigen Zeitbereichen (Hansen et al., 1993). das aktinische Licht (AL) stellt den Zustand des Blattes, d. h. die Größen k f, k t und k p aus Abbildung 3.3 über die Redoxzustände der ETC und die Quenchingmechanismen ein, das modulierte Meßlicht (ML) detektiert den vom aktinischen Licht eingestellten Zustand. Es wird zwischen dem integralen Fluoreszenzyield Y = F/I und dem differentiellen Fluoreszenzyield y = df/di unterschieden. Die Unterschiede sieht man z. B. an Gleichung 3.2: der differentielle Fluoreszenzyield ist y = df di = k f k f + k t + k p [Q A ] a. (3.3) Die Differentiation beim differentiellen Fluoreszenzyield wird durch das Meßlicht di bewirkt, und ist damit die Antwort df auf eine hochfrequente Änderung di des Meßlichtes. Hierbei werden Q A und k t am Arbeitspunkt genommen. Diesen Arbeitspunkt stellt das aktinische Licht ein, das aus dem Licht der Aktin-Lichtquelle und dem Mittelwert des Meßlichtes besteht. 14

21 VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE Der integrale Yield Y ist das Verhältnis zwischen der Fluoreszenzintensität F und der Intensität des eingestrahlten Lichtes I. Das Verhältnis F/I kann formal zwar auch durch den Quotienten aus Gleichung 3.3 beschrieben werden, er ist aber nicht unabhängig von I, da Q A und k t sich mit I ändern. Wird die Meßlichtfrequenz so hoch gewählt, daß sich die Parameter in Gleichung 3.3 während einer Meßlichtperiode nicht verändern, sind der mit diesem Meßlicht gemessene differentielle und der integrale Fluoreszenzyield identisch: y = F I = df di Die photosynthetischen Parameter werden, wie oben erwähnt, durch das niederfrequente aktinische Licht verändert, das Meßlicht besitzt aber ebenfalls eine aktinische Wirkung. Die Yieldmessung detektiert jedoch nur Prozesse, die langsamer als eine Meßlichtperiode ablaufen, so daß das Meßlicht wie ein Gleichlichtanteil des aktinischen Lichtes wirkt. Die Trennung von Meßlicht und aktinischem Licht hat folgende Vorteile: das aktinische Licht erzeugt zwei Signalanteile in der Chlorophyll-Fluoreszenz. Ein großer Teil ist direkt proportional zum eingestrahlten Licht. Er enthält keine Information. Was interessiert, ist die Abweichung von diesem proportionalen Anteil. Diese Abweichung entsteht dadurch, daß sich der Zustand des photosynthetischen Apparates geändert hat und damit die Quenching-Faktoren (k t und Q A in Gleichung 3.3). Diese Änderungen wirken auch auf die Antwort auf das Yieldlicht und modulieren dessen Amplitude. Ein Korrelator trennt die hochfrequente Yieldantwort von dem niederfrequenten Proportionalanteil der Antwort auf das aktinische Licht. Dadurch wird das informationsreiche Signal nicht mehr vom informationslosen Anteil verdeckt Die Zeitkonstanten und ihre Bedeutung Unter linearisierenden Meßbedingungen (Hansen et al., 1991) läßt sich die Fluoreszenz- Antwort (Abb. 3.4) durch eine Summe von Exponentialfunktionen nähern: f(t) = n i=1 a i e t τ i Jede Zeitkonstante τ i entspricht näherungsweise einem Prozeß während der Photosynthese. Die Amplitudenfaktoren a i spiegeln die Ausprägung der jeweiligen Prozesse wider. Folgende Prozesse liegen den in Abbildung 3.4 dargestellten Zeitkonstanten zugrunde: 15

22 DIE FLUORESZENZ ALS MESSGRÖSSE IN DER PHOTOSYNTHESE τ 1 < 1 s Das Anwachsen der Fluoreszenzausbeute wird hauptsächlich durch die zunehmende Reduktion des Quenchers Q A verursacht. 1 < τ 2 < 10 s Das leichte Absinken der Fluoreszenz spiegelt Redoxzustandsänderungen im PQ-Pool wider. In dieser Phase wird Q A verstärkt von PQ reoxidiert. Die damit verbundene Zunahme des Elektronenflusses äußert sich in einer Verringerung der Fluoreszenzausbeute. 2 < τ 3 < 20 s Die zunehmende Reduktion der Akzeptoren von PS I bewirkt eine Abnahme der Reoxidation von PQ. Die starke Verringerung oxidierter Plastoquinonmoleküle führt zu einem Mangel an Akzeptoren von PS II, was einen erneuten Anstieg der Fluoreszenz auf den Maximalwert P mit sich bringt (Vanselow, 1993). 3 < τ 4 < 30 s Der steile Abfall der Fluoreszenz ist zum einen auf verstärktes Energy- Quenching durch den Aufbau des ph-gradienten über der Thylakoidmembran zurückzuführen (Hansen et al., 1987, 1993; Dau und Hansen, 1989, 1990). Zusätzlich tritt durch das Anlaufen des Calvin-Zyklus und der damit verbundenen Sogwirkung auf die ETC erhöhtes photochemisches Quenching auf. 10 < τ 5a < 100 s Diese Zeitkonstante, die mit einer Zunahme der Fluoreszenz auf das Nebenmaximum M einhergeht, beschreibt die lichtinduzierte Ca 2+ -Aufnahme in die Chloroplasten (Plieth und Hansen, 1992; Vanselow und Hansen, 1989). 50 < τ 5b < 250 s Der genaue Ursprung dieses Prozesses ist zur Zeit noch nicht bekannt. Es wird ein Zusammenhang mit der verstärkten Umwandlung von ATP zu ADP vermutet (Dau, 1994). 200 < τ 6 < 1000 s Diese Phase verschwindet nach Zugabe von NaF, das den Austausch der beweglichen LHC zwischen den Photosystemen hemmt. Aus diesem Grund wird τ 6 dem Lichtverteilungsregler zugeordnet (Dau und Canaani, 1990, 1992). Die Sekundenangaben der Zeitkonstanten sind Orientierungswerte. Sie hängen stark von der Art der Pflanze, ihrem jeweiligen physiologischen Zustand sowie der eingestrahlten Lichtintensität ab. Die klassische Fluoreszenzmessung ist eine Potentialmessung. Es wird, wie in Abbildung 3.3 dargestellt, die Höhe des Exzitonensees gemessen und der Fluß aus der Antenne von PS II in den photochemischen Apparat über eine entsprechende Gleichung aus der Fluoreszenz bzw. der dazu proportionalen Höhe des Exzitonensees gewonnen. Damit ist der Fluß eine indirekt erschlossene Größe. Diesem Sachverhalt sollte mit der Entwicklung der Fluoreszenz-Clamp- Maschine abgeholfen werden. 16

23 Kapitel 4 Motivation für die Entwicklung der Fluoreszenz-Clamp-Maschine 4.1 Flußmessungen Das Prinzip der in dieser Arbeit weiterentwickelten Fluoreszenz-Clamp-Maschine (FC- Maschine) läßt sich ebenfalls gut anhand des Topfmodells und Formel 3.2 F = k f E = k f k f + k t + k p [Q A ] erläutern: F in Gleichung 3.2 ist, wie im vorherigen Kapitel bereits erwähnt, eine Potentialgröße. Obige Gleichung ergibt sich aus dem Flußgleichgewicht zwischen eingestrahlten und abfließenden Exzitonen (Dau, 1994): a I a I = Φ f + Φ t + Φ p = k f E + k t E + k p E, (4.1) wobei Φ f der Exzitonenfluß in die Fluoreszenz, Φ t der Exzitonenfluß in die thermische Deaktivierung und Φ p der Exzitonenfluß in den photosynthetischen Apparat ist. E, k f, k t und k p haben die bei Gleichung 3.1 erklärte Bedeutung. Wird mit Hilfe der eingestrahlten Intensität I über einem Regelkreis die Fluoreszenz und damit die Höhe des Exzitonensees konstant gehalten, so gibt die Änderung von I die zeitliche Veränderung der Ratenkonstanten k t und k p, also die Exzitonenflüsse aus PS II wider. Ist auch k t bekannt, so kann direkt auf k p geschlossen werden. Der Vorteil der FC-Maschine, den Exzitonensee von PS II konstant zu halten, kommt dann zum Tragen, wenn Flüsse direkt verglichen werden sollen. Beispiele, die diesen Vorteil zeigen, werden hier kurz genannt. 4.2 Beispielsystem Abbildung 4.1 zeigt die Elektronentransportkette wie sie aus Abbildung 2.3 bereits bekannt ist. Hier ist allerdings die Elektronenverzweigung an PS I etwas weiter ausgeführt. PS I kann 17

24 MOTIVATION FÜR DIE ENTWICKLUNG DER FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE E Fiha STROMA 4H N H 8e e 4H 4e 2 NADPH/H 3ADP 2O2 2e C 3ATP CO2 Fif Exzitonensee Fit Fip PS II P680 4e PQ Z 4e PS I P700 2e M 2O2m 2HO2 ATPase 2HO O2 4H 4H 2H 3*(3...4H) LUMEN Abbildung 4.1: Elektronentransportkette mit den verschiedenen Akzeptoren an PS I: dem Calvin- Zyklus (C), der Mehler-Reaktion (M), dem zyklischen Elektronentransport (Z), der Stickstoffassimilation (N) und dem Malatexport in das Cytosol (E). seine Elektronen an verschiedene Akzeptoren abgeben. Aus Kapitel 2 ist der lineare Elektronentransport zum Calvin-Zyklus (C in Abbildung 4.1) bekannt. Zusätzliche Wege sind: die Mehler-Reaktion (M in Abbildung 4.1). Hierbei gibt PS I ein Elektron direkt an molekularen Sauerstoff (Hormann et al., 1993; Polle, 1996). der zyklische Elektronentransport (Z in Abbildung 4.1). Das Elektron wird hierbei zuerst vom Ferredoxin aufgenommen, dann entweder direkt oder über ein Cytochrom des Cytochrom b 6 /f-komplexes an das Plastoquinon gegeben (Buschmann und Grumbach, 1985). Es findet also ein geschlossener Fluß um PS I statt (Heber et al., 1982; Katona et al., 1992). die Nitratassimilation (N in Abbildung 4.1). Elektronen von PS I werden auch zum Einbau von Stickstoff in Aminosäuren direkt vom PS I abgenommen. der Malat/Oxalat-Shuttle (E in Abbildung 4.1) kann Redoxäquivalente, also Elektronen von PS I über die Envelope an das Cytosol abgeben, wo sie von den Mitochondrien zur Bildung von ATP benutzt werden. Eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Prozesse folgt in Kapitel 8. Hier soll nur erklärt werden, warum die Untersuchung dieser Prozesse eine Motivation zur Entwicklung der FC- Maschine war. 18

25 VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE Veränderungen der physiologischen Rolle der oben genannten Akzeptoren führen zu Flußänderungen an PS I. Da die Fluoreszenz von PS I unabhängig von dessen Redoxzustand ist (Baker und Webber, 1987), können diese Änderungen nicht über die PS I-Fluoreszenz, sondern am besten über die PS II-Fluoreszenz beobachtet werden, da Flußänderungen an PS I im allgemeinen zu Flußänderungen an PS II führen. Der folgende Abschnitt zeigt, daß die FC-Maschine im Gegensatz zur klassischen Fluoreszenzmessung eine Meßgröße liefert, die mit diesen Flüssen über einen meistens konstanten Skalierungsfaktor zusammenhängt. 4.3 Skalierungsfaktor Fluß-FC Der oben genannte Vorteil gegenüber der klassischen Fluoreszenzmessung wird ersichtlich, wenn die jeweilige Meßgröße F bzw. I nach Φ p abgeleitet wird: Aus Gleichung 3.2 folgt: k f a I df = (k f + k t + k p ) 2 dk p k f = E dk p k f + k t + k p k f = dφ p, k f + k t + k p (4.2) aus Gleichung 4.1 folgt: di = 1 a dφ p (4.3) Somit ist der Skalierungsfaktor zwischen di und dφ p S I = 1 a, (4.4) während er zwischen df und dφ p k f S F = (4.5) k f + k t + k p lautet. Damit wird die Skalierung bei den klassischen Fluoreszenzmessungen S F, im Gegensatz zur FC-Messung S I, arbeitspunktabhängig und ändert sich mit der thermischen (k t ) und photochemischen (k p ) Deaktivierung. Von diesem Vorteil der FC-Messung wird in den Kapiteln 9, 10 und 11 Gebrauch gemacht. Es ist allerdings zu beachten, daß der Skalierungsfaktor S I den Absorptionsquerschnitt a der PS II-Antennen enthält. Er kann sich ändern, wenn der LHC-Regler (Dau und Canaani, 1990) die beweglichen LHC-Antennen verschiebt. 4.4 Vergleich von Sauerstoffentwicklung und Elektronenfluß Die Fähigkeit der FC-Maschine, den Elektronenfluß aus PS II direkt zu bestimmen, kann dazu genutzt werden, eine weitere meßtechnische Aufgabe einfacher zu gestalten: den 19

26 MOTIVATION FÜR DIE ENTWICKLUNG DER FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE Vergleich des Elektronenflusses aus PS II mit der Sauerstoffentwicklung. Abbildung 4.1 zeigt, daß an PS II Sauerstoffentwicklung und Elektronenfluß streng gekoppelt sind. An PS I kann der Sauerstoff bei der Mehler-Reaktion (Mehler, 1951 a, 1951 b) aber wieder eingefangen werden. Die Beteiligung dieser Reaktion am photosynthetischen Prozeß wurde postuliert (Schreiber und Neubauer, 1990), aber ein direkter experimenteller Beweis für die Existenz im intakten Blatt fehlte bisher. Werden nun Parallelmessungen von Elektronenfluß und Sauerstoffentwicklung durchgeführt, so könnte es die in Abbildung 4.2 dargestellten hypothetischen Kurvenverläufe geben: Fiel relative Einheiten C fio2 Zeit Abbildung 4.2: Hypothetische Verläufe der Sauerstoffentwicklung Φ O2 und des Elektronenflusses Φ el aus PS II. Ohne Mehler-Reaktion wäre ein streng proportionaler Verlauf zu erwarten, da vier Elektronen jeweils ein O 2 -Molekül freisetzen. Mit Mehler-Reaktion würde für den zur Mehler-Reaktion fließenden Elektronenteilstrom (schraffiert) keine O 2 -Entwicklung gemessen werden. Φ = 0: der Elektronenfluß und die Sauerstoffentwicklungskurve verlaufen streng proportional, d. h. alle im WSE erzeugten O 2 -Moleküle verlassen direkt das Blatt. Das würde bedeuten, daß es während der Lichtreaktion keinen Prozeß gibt, der Sauerstoff verbraucht. Bei diesem Ergebnis ist die Aktivität der Mehler-Reaktion gering. Φ 0: für diesen Fall gibt es zwei mögliche Erklärungen: Photorespiration. Bei der Photorespiration oder Lichtatmung wird ein Teil des Sauerstoffs, der durch die Photosynthese gebildet wird, im Blatt wieder verbraucht. CO 2, das hierbei entsteht, kann über den Calvin-Zyklus fixiert werden. Die physiologische Bedeutung der Photorespiration ist noch weitgehend ungeklärt. Da sie verstärkt bei hohen Lichtintensitäten auftritt, wird ihr eine Schutzfunktion zugeschrieben: sie verbraucht überschüssiges NADPH/H + und ATP aus 20

27 VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE der Lichtreaktion der Photosynthese und tritt in Konkurrenz zur Mehler-Reaktion, bei der hochreaktives und deshalb für die Pflanze schädliches Superoxid gebildet wird. Daß die Lichtatmung keine Auswirkungen auf die photoakustischen Messungen hat, wird in Kapitel 11 diskutiert. Die Mehler-Reaktion. Die Gesamt-O 2 -Bilanz der Mehler-Reaktion ist Null, da sie das an PS II erzeugte O 2 wieder einfängt. Das würde bedeuten, daß für den zur Mehler-Reaktion fließenden Elektronenteilstrom keine O 2 -Entwicklung gemessen werden könnte. 21

28 MOTIVATION FÜR DIE ENTWICKLUNG DER FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE 22

29 Kapitel 5 Die Fluoreszenz-Clamp-Maschine Mit der Entwicklung der FC-Maschine wurde die Möglichkeit geschaffen, die Exzitonenflüsse aus der PS II-Antenne direkt zu messen. Dieses Verfahren ist komplementär zum klassischen Verfahren mit dem PAM-Gerät der Firma Walz. Messungen der Fluoreszenz, die Aufschluß über den photosynthetischen Apparat geben sollen, werden weitverbreitet mit dem Puls-Amplituden-Modulierten Fluorometer (PAM) durchgeführt. Diese von Schreiber et al. (1986) entwickelte Anlage ist zum internationalen Standard geworden. Hierbei ist die detektierte Fluoreszenz bei konstant gehaltener Lichtstärke die gemessene und mit mathematischen Modellen auszuwertende Größe (Abschnitt 6.1). Im Gegensatz dazu wird bei der FC-Maschine mit Hilfe eines Regelkreises die Fluoreszenz konstant gehalten und die nachgeregelte Lichtintensität als neue Meßgröße eingeführt. Das Prinzip ist ähnlich dem in der Elektrophysiologie angewandten Voltage-Clamp (Marmont, 1949). Dort werden Ionenflüsse anstatt der Zustandsvariablen, der Membranspannung, gemessen. Wie bereits erwähnt, handelt es sich in der Photosynthese bei der Zustandsvariablen um die Fluoreszenz und bei den Flüssen um die Exzitonenflüsse in die Reaktionszentren, in die thermische Deaktivierung oder Strahlung (Fluoreszenz), wie im Topfmodell in Abbildung 3.3 dargestellt ist. 5.1 Der Meßaufbau Abbildung 5.1 zeigt das vereinfachte Meßprinzip, das in einer Vorläuferform bereits im Rahmen einer anderen Diplomarbeit (Giannikos, 1995) entwickelt wurde. Der Photodetektor setzt die Intensität der Fluoreszenz in eine dazu proportionale Spannung um. Diese wird mit einer Sollwert-Spannung verglichen und entsprechend angepaßt. Elektronisch erfolgt der Vergleich durch Addition der invertierten Sollwert-Spannung mit der Ausgangsspannung des Photodetektors an OP 2 (Abb. 5.1). Die Differenz dieser beiden Werte korrigiert die Intensität der auf die Blattoberfläche strahlenden Leuchtdiode (LED): ist die Fluoreszenz des Blattes gering, fällt also wenig Licht auf die Photodiode des Detektors, so wird sich der Strom durch die LED vergrößern, ist die Fluoreszenz des Blattes groß und fällt viel Licht auf die Photodiode, wird der Strom durch die LED sinken. 23

30 DIE FLUORESZENZ-CLAMP-MASCHINE

31 VERZEICHNIS HÄUFIG VERWENDETER ABKÜRZUNGEN UND BEGRIFFE 0.5 mv i P = = 500 pa. Dieser Mindeststrom ist also im Vergleich zum maximalen Biasstrom 1 MΩ des FET 500 mal größer. Der 5.6 pf-kondensator parallel zum Rückkopplungswiderstand dient zur Schwingungsunterdrückung. 5p6 1 M OPA OUT Abbildung 5.2: Der im Rahmen dieser Arbeit verwendete Photodetektor. Der Strom durch die Photodiode (Hamamatsu S 3590-) wird über den Rückkopplungswiderstand (R L = 1 MΩ) des Operationsverstärkers (OPA 602) in eine proportionale Spannung umgewandelt Der Leuchtdiodenkopf Für die Regelung wurde eine einzige LED (Oshino, OL-SUR T) mit einer Peakwellenlänge von λ max = 660 nm und einer Lichtstärke von 3000 mcd bei 20 ma verwendet. Wie in den Kapiteln 9 und 10 beschrieben, kamen zusätzlich bei einigen Messungen vier in Serie geschaltete LEDs (Oshino, OL-ESB44510) mit einem Emissionsmaximum im blauen (λ max = 450 nm) bzw. drei, ebenfalls in Serie geschaltete LEDs im fernroten (Walz, KL DDH, λ max = 735 nm) Wellenlängenbereich dazu. Damit die Fläche des Blattes, die über der Photodiode liegt, homogen von den verschiedenen LEDs ausgeleuchtet wird, wurden sie auf einen gemeinsamen Punkt ausgerichtet (Abb. 5.3). Zusätzlich wurde auf das Blatt eine Blende gelegt Das Hintergrundlicht Wie in Kapitel 6.2 dargestellt wird, werden zur Bestimmung der thermischen Flüsse aus PS II zusätzlich zum Licht der roten LED Lichtblitze von sehr hoher Intensität (ca W/m 2 ) benötigt. Dieses sogenannte sättigende aktinische Licht wurde durch eine Halogenlampe (Osram Xenophot 250 W) bereitgestellt, deren Intensität über ein elektronisch regelbares Gleichspannungsnetzteil variiert werden konnte. Da die Halogenlampe durch einen stark vibrierenden Ventilator vor Überhitzung geschützt wurde und sich deshalb außerhalb der Meßkammer befinden mußte, gelangte das Sättigungslicht über einen Lichtleiter in die Meßkammer auf das Blatt. 25