TESTBLÄTTCHEN FUR ANTIBIOGRAMME KARTUSCHE MIT 50 TESTBLATTCHEN Bestimmung der empfindlichkeit gegen antibiotika
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- Lieselotte Flater
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1 TESTBLÄTTCHEN FUR ANTIBIOGRAMME KARTUSCHE MIT 50 TESTBLATTCHEN Bestimmung der empfindlichkeit gegen antibiotika 2016/11 1- KLINISCHE BEDEUTUNG Die Testblättchen werden zur semiquantitativen Bestimmung der in-vitro-empfindlichkeit von schnell wachsenden Bakterien und mehrerer komplexer Spezies gegen Antibiotika im Agardiffusionstest verwendet. Diese Methode beruht auf einem standardisierten Verfahren, das von der WHO (1) veröffentlicht und als gemeinsamer Standard von CLSI (2, 3), CA-SFM (4) und EUCAST (5) angepasst wurde (er wird regelmäßig überprüft). Die Richtlinien zum Anlegen des Antibiogramms und der Interpretation der Ergebnisse entnehmen Sie den neuesten CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) Dokumenten. 2- TESTPRINZIP Die mit definierten Antibiotika-Konzentrationen imprägnierten Papierblättchen werden auf die Oberfläche eines entsprechenden Mediums (A) aufgebracht, das zuvor mit einem kalibriertem Inokulum (A) einer frischen Reinkultur des zu testenden Bakterienstammes beimpft wurde. Nach der Inkubation (A) werden die Petri-Schalen überprüft, die Hemmhöfe um die Testblättchen gemessen und für die Bestimmung der Empfindlichkeit (resistent,mäßig empfindlich,empfindlich...) mit den kritischen Werten (A) für die verschiedenen getesteten Antibiotika verglichen. Der Durchmesser der Hemmhöfe ist proportional zur Empfindlichkeit des getesteten Bakterienstammes. (A) gemäß den aktuellen Richtlinien CLSI (2, 3) CA-SFM (4) EUCAST (5). 3- INHALT DER TESTPACKUNG Die Testblättchen von Bio-Rad haben einen Durchmesser von 6,5 mm und sind aus hochwertigem Filterpapier. Sie sind jeweils exakt mit den definierten Konzentrationen an Antibiotika imprägniert. Die Testblättchen sind durch einen Code, der aus 1 bis 3 Buchstaben besteht und auf jede Seite des Blättchens aufgedruckt ist, deutlich gekennzeichnet (siehe Tabelle 1). Die Testblättchen von Bio-Rad werden in Kartuschen mit jeweils 50 Testblättchen in wasserdichten Packungen mit Trockenmittel verpackt geliefert. Tabelle 1 : Testblättchen von Bio-Rad für das Antibiogramm KONZENTRATION DER SYMBOL PACKUNGSGRÖSSE Art.-NR. TESTBLÄTTCHEN Amikacin AKN Amoxicillin 25 µg AMX Amoxicillin + Clavulanic Acid 2/1 µg 20/10 µg AUG3 AMC Ampicillin 2 µg 10 µg API2 AMP Ampicillin + Sulbactam 10/10 µg SAM Azithromycin 15 µg AZM Aztreonam ATM Bacitracin 10 IU (1) BCT Carbenicillin 100 µg CRB
2 KONZENTRATION DER SYMBOL PACKUNGSGRÖSSE Art.-NR. TESTBLÄTTCHEN Cefaclor CEC Cefalexin CXN Cefamandole FAM Cefazolin CZN Cefepime FEP Cefixime 5 µg 10 µg FIX5 CFM Cefoperazone 75 µg CFP75 CPZ Cefoperazone + Sulbactam 75/ SCF Cefotaxime 5 µg COX5 CTX Cefotetan CTT Cefoxitin FOX Cefpirome CPO Cefpodoxime 10 µg CPD Cefprozil CPR Cefsulodin CFS Ceftaroline 5 µg CPN Ceftazidime 10 µg CZD10 CAZ Ceftibuten CTB Ceftriaxone CRO Cefuroxime CXM Cephalothin CEF Chloramphenicol CHL Ciprofloxacin 5 µg CIP Clarithromycin 15 µg CLR Clindamycin 2 µg CMN Colistin 10 µg 50 µg COL10 CST Doripenem 10 µg DOR Doxycycline DOX Ertapenem 10 µg ETP Erythromycine 15 µg ERY Flumequine UBN Fosfomycin 50 µg 200 µg FSF50 FOS Fusidic Acid 10 µg FAD Gentamicin 10 µg 10 IU (15 µg) GMN10 GMI15 GME Gentamicin (high load) 120 µg 500 µg HLG120 GEN Imipenem 10 µg IPM Isepamicin ISP Kanamycin KMN Kanamycin (high load) 1 mg KAN Levofloxacin 5 µg LVX Lincomycin 15 µg LCN Linezolid 10 µg LIN Linezolid LZD Mecillinam 10 µg MEC Meropenem 10 µg MEM Metronidazole 4 µg MTR Mezlocillin 75 µg MZN Minocycline MNO Moxalactam MOX Moxifloxacin 5 µg MXF Mupirocin 5 µg MUP µg PUM Nalidixic Acid NAL Neomycin 30 IU NEO Netilmicin 10 µg NTM10 NET
3 KONZENTRATION DER SYMBOL PACKUNGSGRÖSSE Art.-NR. TESTBLÄTTCHEN Nitrofurantoin 100 µg NFE Nitrofurantoin 300 µg FTN Nitroxolin 20 µg NIT Norfloxacin 10 µg 5 µg NXN10 NOR Ofloxacin 5 µg OFX Oleandomycin 15 µg OLE Oxacillin 1 µg 5 µg OXC1 OXA Oxolinic Acid 10 µg OAD Pefloxacin 5 µg PEF Penicillin 1 IU 6 µg (10 IU) PNG1 PEN Pipemidic Acid 20 µg PIM Piperacillin 75 µg 100 µg PIL30 PIP75 PIR Piperacillin + Tazobactam 30/6 µg 75/10 µg 100/10 µg PTZ36 PPT85 TZP Polymixin 300 IU (50 µg) PXB Pristinamycin 15 µg PTN Quinupristin-Dalfopristin 15 µg QDF Rifampicin 5 µg RIF5 RAM Sparfloxacin 5 µg SPX Spectinomycin 100 µg SPT Spiramycin 100 µg SPN Streptomycin 10 µg SMN Streptomycin (high load) 300 µg 500 µg HLS300 STR Sulphonamides 300 µg 200 µg SSS300 SUL Teicoplanin TEC Telithromycin 15 µg TEL Temocillin TEM Tetracycline TET Ticarcillin 75 µg TIC Ticarcillin + Clavulanic Acid 75/10 µg TCC Tigecycline 15 µg TGC Tobramycin 10 µg TMN10 TOB Trimethoprim + Sulfamethoxazole 1.25/23.75 µg SXT Trimethoprim 5 µg TMP Vancomycin 5 µg VNC5 VAN LAGERUNG Das Verfalldatum gilt ausschließlich für TestBlättchen aus intakten Kartuschen, die gemäß den Anweisungen des Herstellers aufbewahrt werden. Das Verfallsdatum und die Seriennummer sind auf jeder Verpackung (Kartusche und Packung) angegeben. Die Kartuschen müssen in ihren Verpackungen an einem trockenen Ort bei einer Temperatur zwischen +2 C und +8 C aufbewahrt werden. Die Packung muss vor dem Öffnen Raumtemperatur (18-30 C) erreicht haben. Nach Anwendung der TestBlättchen müssen die nicht verwendeten Kartuschen wieder zwischen +2 C und +8 C aufbewahrt werden. Die TestBlättchen nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. Verwenden Sie Kartuschen, die länger als 8 Stunden bei Raumtemperatur (18-30 C) aufbewahrt wurden erst, nachdem Sie überprüft haben, ob die Werte noch innerhalb des akzeptablen Bereiches liegen (6). Entsprechen die mit den TestBlättchen und Kontroll-Bakterienstämmen erzielten Hemmhöfe nicht den Spezifikationen, muss das Verfahren überprüft werden; dieser Fehler kann auf das TestBlättchen, das Inokulum, die Beimpfung des Mediums oder auf andere Faktoren zurückzuführen sein. Verbleibt die Kartusche nach der Auslieferung im Lager, muss sie bei +2-8 C an einem trockenen Ort mit Trockenmittel aufbewahrt werden. Die Haltbarkeit von TestBlättchen,die in den Kartuschen in einem Dispenser gelagert werden (gemäss Empfehlung mit einem 3
4 Trockenmittel) wurde unter Routinebedingungen mit sechs Wochen ermittelt, mit Ausnahme der mit dem Zeichen markierten Antibiotika-Teststreifen, deren Stabilität unter der Woche im Inneren dieses Zeichens angegeben ist. 5- BENÖTIGTE, JEDOCH NICHT MITGELIEFERTE MATERIALIEN Blättchendispenser: 6-7 Blättchen Art.-Nr Blättchen Art.-Nr Kulturmedium (gemäß den aktuellen Richtlinien (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) )) Reagenzien Bakterienstämme für die Qualitätskontrolle Trübungsstandard,entsprechend einem Mac Farland 0,5-Standard Laborausstattung zum Anlegen eines Antibiogramms im Agardiffusionstest 6- VORSICHTSMASSNAHMEN Beachten Sie die aktuellen Richtlinien (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ). Beachten Sie stets die aktuellen Methoden und Vorsichtsmaßnahmen zum Schutz vor mikrobiologischen Gefahren. Nach der Verwendung die Kulturen und alle kontaminierten Materialien sterilisieren. 7- TESTDURCHFÜHRUNG Proben: Für direkt mit biologischen Proben durchgeführten Tests dürfen keine TestBlättchen verwendet werden. Beachten Sie die aktuellen Richtlinien (CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) ) hinsichtlich der Vorbereitung des Inokulums aus einer frischen Reinkultur. Beachten Sie die von CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) empfohlene Anleitung bei der Ausführung aller Schritte des Antibiogramms und der Interpretation ebnisse: CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) Cempfehlen standardisierte Verfahren zur Vorbereitung des Inokulums, der Beimpfung der Petri-Schalen, der Auswahl und der Anordnung der TestBlättchen sowie der Inkubationstemperatur und -zeit. Darüber hinaus sollten stets die GLP-Richtlinien beachtet werden. 8- INTERPRETATION DER ERGEBNISSE Die Durchmesser der Hemmhöfe exakt ausmessen und mit den kritischen Durchmessern der aktuellen Richtlinien CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) vergleichen. Jedem Mikroorganismus ist eine Kategorie (mäßig resistent, empfindlich oder nicht empfindlich...) in Funktion des erzielten Durchmessers und des kritischen Durchmessers für das getestete Antibiotikum zugeordnet. Diese Kriterien der klinischen Kategorisierung gemäß kritischer Durchmesser werden regelmäßg von CLSI (2,3), CA-SFM (4), EUCAST (5) überprüft. 9- TESTEIGENSCHAFTEN / QUALITÄTSKONTROLLE Die Testeigenschaften der Antibiotika -TestBlättchen werden mittels folgender Teststämme systematisch kontrolliert: - Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC Neisseria gonorrhoeae ATCC Haemophilus influenzae ATCC Enterococcus faecalis ATCC Clostridium perfringens ATCC Enterococcus faecalis ATCC Clostridium sporogenes ATCC In Tabelle 2 sind die Akzeptanzgrenzen für die im Agardiffusionstest für die Referenzstämme erzielten Durchmesser der Hemmhöfe angegeben: Konzentration der TestBlättchen Standard E. coli ATCC Akzeptabler Durchmesser (mm) Qualitätskontrollgrenzen S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC Amikacin CLSI Amoxicillin 25 µg Intern Amoxicillin + Clavulanic Acid 20/10 µg CLSI Ampicillin 10 µg CLSI Ampicillin + Sulbactam 10/10 µg CLSI Azithromycin 15 µg CLSI Aztreonam CLSI Bacitracin 10 UI Intern Carbenicilin 100 µg CLSI Cefaclor CLSI Cefalexin Intern Cefamandole CLSI S. pneumoniae ATCC H. influenzae ATCC
5 Konzentration der TestBlättchen Standard E. coli ATCC Akzeptabler Durchmesser (mm) Qualitätskontrollgrenzen S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC Cefazolin CLSI Cefepime CLSI Cefixime 10 µg Intern Cefixime 5 µg CLSI Cefoperazone Intern Cefoperazone 75 µg CLSI Cefoperazone + Sulbactam 75/ Intern Cefotaxime CLSI Cefotetan CLSI Cefpirome Intern Cefpodoxime 10 µg CLSI Cefprozil CLSI Cefsulodin Intern Ceftazidime CLSI Ceftibuten CLSI Ceftriaxone CLSI Cefuroxime CLSI Cephalothin CLSI Chloramphenicol CLSI Ciprofloxacin 5 µg CLSI Clarithromycin 15 µg CLSI Clindamycin 2 µg CLSI Colistin 10 µg CLSI Colistin 50 µg CA-SFM Doxycycline CLSI Ertapenem 10 µg CLSI Erythromycine 15 µg CLSI Flumequine Intern Fosfomycin 50 µg CA-SFM Fosfomycin 200 µg CLSI Fusidic acid 10 µg CA-SFM Gentamicin 10 µg CLSI Gentamicin 10 UI CA-SFM Imipenem 10 µg CLSI Isepamicin Intern Kanamycin CLSI Levofloxacin 5 µg CLSI Lincomycin 15 µg CA-SFM Linezolid CLSI Mecillinam 10 µg CLSI Meropenem 10 µg CLSI Mezlocillin 75 µg CLSI Minocycline CLSI Moxalactam CLSI Moxifloxacin 5 µg CLSI Mupirocin 5 µg Intern Mupirocin 200 µg CLSI Nalidixic Acid CLSI Neomycin 30 UI Intern Netilmicin CLSI Nitrofurantoin 300 µg CLSI Nitroxolin 20 µg Intern Norfloxacin 5 µg Intern Norfloxacin 10 µg CLSI S. pneumoniae ATCC H. influenzae ATCC
6 Konzentration der TestBlättchen Standard E. coli ATCC Akzeptabler Durchmesser (mm) Qualitätskontrollgrenzen S. aureus ATCC P. aeruginosa ATCC S. pneumoniae ATCC H. influenzae ATCC Ofloxacin 5 µg Intern Oleandomycin 15 µg Intern Oxacillin 5 µg CA-SFM Oxacillin 1 µg CLSI Oxolinic Acid 10 µg Intern Pefloxacin 5 µg CA-SFM Penicillin 6 µg CLSI Pipemidic Acid 20 µg Intern Piperacillin 100 µg CLSI Piperacillin 75 µg Intern Piperacillin + Tazobactam 75/10 µg Intern Piperacillin + Tazobactam 100/10 µg CLSI Polymixin 300 UI CLSI Pristinamycin 15 µg CA-SFM Quinupristin-Dalfopristin 15 µg CLSI Rifampicin 5 µg CLSI Rifampicin CA-SFM Sparfloxacin 5 µg CLSI Spectinomycin 100 µg Intern Spiramycin 100 µg Intern Streptomycin 10 µg CLSI Sulfonamides 300 µg CLSI Sulfonamides 200 µg Intern Teicoplanin CLSI Telithromycin 15 µg CLSI Temocillin Intern Tetracycline CLSI Ticarcillin 75 µg CLSI Ticarcillin + Clavulanic Acid 75/10 µg CLSI Tigecycline 15 µg CLSI Tobramycin 10 µg CLSI Trimethoprim 5 µg CLSI Trimethoprim + Sulfamethoxazole 1,25/23,75 µg CLSI Vancomycin CLSI Für die Kontrollgrenzen (internes Standards oder CLSI) : Gentamicin 120 µg : E. faecalis ATCC (16-23 mm) Streptomycin 300 µg : E. faecalis ATCC (14-20 mm) Gentamicin 500 µg : S. aureus ATCC (30-34 mm) ; E. faecalis ATCC (18-28 mm) Kanamycin 1 mg : S. aureus ATCC ( 14 mm) ; E. faecalis ATCC (> 14 mm). Streptomycin 500 µg : S. aureus ATCC (24-28 mm) ; E. faecalis ATCC (14-25 mm). Metronidazole 4 µg : Clostridium perfringens ATCC 13124, Clostridium sporogenes ATCC mm Cefoperazone + Sulbactam 75 / : E. coli ATCC (24-30 mm) Mupirocin 200 µg : S. aureus ATCC BAA-1708 (6 mm) Temocillin : E. coli ATCC (22-28 mm) Haemophilus influenzae ATCC kann bei der Bestimmung der wachstums-fördernden Eigenschaften von HTM als zusätzlicher Kontrollstamm hilfreich sein. Trotz fehlender,verlässlicher Interpretationskriterien für die Ergebnisse im Agardiffuiosntest für S. pneumoniae gegenüber versch. Beta-Laktamen kann Streptococcus pneumonia ATCC als der Kontrollstamm angesehen werden, der für die Qualitätskontrolle für alle Streptococcus spp gleichermassen geeignet ist. Neisseria gonorrhoeae ATCC wird für den Test des Spectinomycin-TestBlättchens mit akzeptablen Durchmessern von 23 bis 29 mm empfohlen (CLSI). Ein evtl. Abbau der 1 µg Oxacillin Konzentration eines TestBlättchens wird am besten mit dem Kontrollstamm Staphylococcus aureus ATCC mit einem akzeptablen Durchmesser von 18 bis 24 mm ermittelt. 6
7 Gemäss den aktuellen EUCAST Richtlinien (Version V3.1, 2013), ist die Funktionsfähigkeit von AntibiotikatestBlättchen regelmässig mit Hilfe der nachfolgend aufgeführten Referenzstämme zu überprüfen : - Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Streptococcus pneumoniae ATCC Enterococcus faecalis ATCC Haemophilus influenzae NCTC 8468 Tab. 3 enthält die jeweiligen Grenzwerte für Hemmhofdurchmesser im Agardiffusionstest mit den genannten Referenzstämmen.. Konzentration der TestBlättchen E. coli ATCC Akzeptable Durchmesser (mm) bei der Qualitätskontrolle H. S. aureus P. aeruginosa S. pneumoniae influenzae ATCC ATCC ATCC NCTC 8468 E. faecalis ATCC Amoxicillin + Clavulanic Acid 2/1 µg Ampicillin 2 µg Cefotaxime 5 µg Cefoxitin Ceftaroline 5 µg Ceftazidime 10 µg Doripenem 10 µg Gentamicin Linezolid 10 µg Netilmicin 10 µg Nitrofurantoin 100 µg Penicillin 1 IU Piperacillin Piperacillin + Tazobactam 30/6 µg Tobramycin Vancomycin 5 µg QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS Alle hergestellten oder im Handel erhältlichen Reagenzien unterliegen einem umfassenden Qualitätssystem vom Empfang der Rohmaterialien bis zur Vermarktung des Produktes. Jede Charge unterliegt einer Qualitätskontrolle und wird nur für den Markt freigegeben, wenn die Akzeptanzkriterien erfüllt sind.die Produkt- und Kontrolldokumentation zu jeder einzelnen Charge wird in der Firma aufbewahrt. 11- GRENZEN DES VERFAHRENS Die klinische Einteilung der Bakterien (in resistent, mäßig resistent, empfindlich...) hängt manchmal von einem einzigen Millimeter ab. Dies entspricht einem üblichen Fehlerbereich in einem Labor. Es können andere Antibiotika als die in Tabelle 2 angegebenen verwendet werden. Antibiogramme, bei denen diese Antibiotika verwendet werden, sollten auf der Grundlage von Vorhandensein oder Abwesenheit eines definierten Hemmhofes interpretiert werden und sollten lediglich als qualitativ betrachtet werden, bis Interpretationszonen festgelegt wurden. Alle Zonendurchmesser sollten erfasst werden. Die Leistung des Tests hängt nicht nur von der Aktivität der TestBlättchen ab, sondern auch von Faktoren wie der Verwendung eines geeigneten Inokulums und geeigneter Kontrollstämme, von geeigneten und zuvor validierten Kulturmedien sowie von einer adäquaten Lagerung. Die endgültige Interpretation kann, wie bei allen Laborinterpretationen, nicht nur auf Basis der Ergebnisse eines einzelnen Tests erfolgen, sondern muss ggf. auch klinische Daten sowie biochemische, zytologische und immunologische Ergebnisse mit berücksichtigen. 7
8 12- LITERATUR 1. World Heath Organization Expert Committee on Biological Standardization Technical report series 822. W.H.O., Geneva. 2. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute Approved standard M2-A11. Performance standards for antimicrobial susceptibility tests, 10th ed. CLSI, Wayne, Pa. 3. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI document M100-S23. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, 21th informational supplement, Wayne, Pa. 4. CA-SFM: Comité de l antibiogramme French Society of Microbiology. 5. EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST QC Tables V V. Loncle-Provot, E. Keller, M.O. Gourdin, M.L. Garrigues. Etude de la stabilité des Blättchen antibiotiques dans les conditions d'utilisation en routine, 18th inter disciplinary meeting on anti-infectious chemotherapy, Paris, Dec.3/ Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) Fax : +33 (0) /11 8
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