Aus der Universitäts-Frauenklinik. der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau

Transkript

1 Aus der Universitäts-Frauenklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Untersuchung der Regulation angiogener Prozesse im Corpus luteum in vitro unter Berücksichtigung der Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Granulosazellen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt 2006 von Andrea Ursula Walz geboren in Stuttgart-Bad Cannstatt

2 Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters 1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Gerald Gitsch 2. Gutachter: Prof. Dr. Georg Bauer Jahr der Promotion: 2007

3 Vorveröffentlichungen der Dissertation Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden in folgenden Beiträgen vorab veröffentlicht: Publikationen: Walz A., Keck C., Weber H., Kissel C., Pietrowski D. Effects of luteinizing hormone and chorionic gonadotropin on corpus luteum cells in a spheroid cell culture system. Mol Reprod Dev Sep; 72(1): Becker J, Walz A, Daube S, Keck C, Pietrowski D. Distinct responses of human granulosa lutein cells after hcg or LH stimulation in a spheroidal cell culture system. Mol Reprod Dev Feb; Epub ahead of print Tagungsbeitrag: Walz A., Pietrowski D., Korff T., Keck C. Einfluss von humanem Choriongonadotropin auf die Expression von Wachstumsfaktoren in einem computergestützten Angiogenese-Assay. 4. Symposium Junge forschende Reproduktionsmediziner, Münster (2003)

4 Meinen Eltern

5 Inhaltsverzeichnis 1 1 Einleitung Die Follikelphase Die Lutealphase Humanes Choriongonadotropin und luteinisierendes Hormon Angiogenese Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Angiopoietine Matrix-Metalloproteinasen und ihre Inhibitoren Angiogenese im weiblichen Reproduktionstrakt Dreidimensionale Angiogenese-Assays Boyden-Kammer Fibrin Gel in vitro Angiogenese-Assay Sphäroidales Angiogenese-Assay Fragestellung Material und Methoden Zellkultur Granulosazellen Endothelzellen Immortalisierte Granulosazellline hgl Induktion der Granulosazellen in Kultur: Stimulation der EC sowie Isolierung der messenger Ribonukleinsäure (mrna): Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR): TaqMan-Polymerasen-Kettenreaktion (TaqMan-PCR) Sequenzierung des Tie-1 Amplifikates Extraktion der Tie-1 DNA aus Agarosegelen Klonierung des Tie-1 DNA-Fragmentes in den Vektor pcr 2.1 TOPO (Methode der TA Klonierung) Selektion der Klone ohne Galaktosidaseaktivität (Blau Weiss Selektion) Isolierung der Plasmid-DNA aus den transfizierten E. coli Plasmid-DNA Mini-Präparation Strukturanalyse der zu untersuchenden DNA Sequenz Sphäroidales Angiogenese-Assay Reagenzien Sphäroidherstellung Statistik Stimulanzien Ergebnisse Sphäroidales Angiogenese-Assay HUVEC-Sphäroide Untersuchung des Einflusses von Granulosazell-konditioniertem Medium auf das Expressionsprofil von HUVEC Untersuchung eines Tie-1 Fragmentes Teilsequenz Das klonierte kürzere Fragment Granulosazell-Sphäroide hgl-5 Sphäroide EC-GC-Kokultur-Sphäroide Diskussion Sphäroidales Angiogenese-Assay Stimulation der HUVEC-Sphäroide Genexpression in HUVEC Ausbildung von GC-Sphäroiden Entwicklung eines sphäroidalen Modellsystems für das Corpus luteum Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Anhang Abkürzungsverzeichnis Material Auswertung der PCR-Daten Auswertung der Sphäroiddaten Sphäroiddaten Lebenslauf...187

6 Einführung 2 1 Einleitung Die menschliche Reproduktion stellt einen komplexen Prozess dar, für dessen Gelingen das abgestimmte Zusammenspiel verschiedener Faktoren ausschlaggebend ist. Bereits vor Eintritt einer Schwangerschaft müssen verschiedene Grundbedingungen erfüllt sein, damit es zur Konzeption kommen kann. Neben den organischen Voraussetzungen, wie Uterus und Ovarien bzw. Testes, spielt der Hormonhaushalt sowohl beim Mann als auch bei der Frau eine entscheidende Rolle. Bei der Frau führt die hormonelle Regulation physiologischerweise zu zyklischen Veränderungen des Reproduktionstraktes. Wesentlich ist dabei die Heranreifung einer Eizelle, die anschließende Ovulation und die darauf folgende Bildung des Corpus luteums. Im Folgenden soll dieser Regelkreis kurz beleuchtet werden. 1.1 Die Follikelphase Während eines physiologischen Zykluses, der ca. 28 Tage andauert, wird zwischen einer Follikel- und einer Lutealphase unterschieden. Die erste Zyklushälfte wird mit dem Beginn der Menstruation eingeleitet und steht hauptsächlich unter dem Einfluss des follikelstimulierenden Hormons (FSH). In diesem als Follikelphase bezeichneten Zeitabschnitt kommt es zur Reifung des für die Konzeption notwendigen Follikels. Die Ausschüttung von FSH aus der Hypophyse wird durch die pulsatile Ausschüttung von Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) des Hypothalamus stimuliert. Unter dem Einfluss von FSH fangen mehrere Follikel im Ovar an, sich zu Sekundärfollikeln zu entwickeln. In diesem Follikelstadium liegt der Oozyt, der von der azellulären Zona pellucida umgeben ist, in einem mehrschichtigen Follikelepithel. Dieses ist nicht vaskularisiert und besteht aus Granulosazellen (GC), die den Oozyten über Gap junctions versorgen. Granulosazellen und Oozyt sind wiederum durch eine Basalmembran von der gut vaskularisierten Thekazellschicht (Theka interna) getrennt. FSH induziert in der Follikelphase die Synthese der Rezeptoren für luteinisierendes Hormon (LH) in den Zellen der Theka interna, wobei die Produktion von Androgenen in dieser Zellschicht durch LH stimuliert wird. Die Androgene gelangen daraufhin durch Diffusion in die Granulosazellschicht, die die Wand des heranreifenden Follikels auskleiden und werden dort durch die unter Kontrolle von FSH stehende Aromatase zu Östradiol metabolisiert (Zwei-Zell Theorie der ovariellen Steroidsynthese und Follikelreifung) (Short, 1962). Parallel bilden

7 Einführung 3 Granulosazellen Inhibin, das im Sinne einer negativen Rückkopplung auf die Bildung von hypophysärem FSH wirkt. Durch den Abfall des FSH überlebt nur der am weitesten entwickelte Follikel und bildet sich weiter zum Graaf-Follikel (Baird, 1987). Simultan zur Follikelreifung beginnt unter dem Einfluss der Östrogene, insbesondere des 17-β-Östradiols, die Proliferation des Endometriums. 17-β-Östradiol induziert die Synthese seines eigenen Rezeptors und die des Progesteronrezeptors. Kurz vor der Ovulation erreicht der Östrogenspiegel einen Wert von ca. 200 pg/ml (Pollow, 1990) und führt über einen positiven Feedback-Mechanismus zu einem sprunghaften Anstieg von LH. Gemeinsam mit dem bereits ansteigenden Progesteron löst dieser die Ovulation aus (zusammengefasst in Karck und Keck, 2002). Sekundärfollikel Granulosa- Eizelle zellen Rinde Primärfollikel Corpus albicans Primordialfollikel Mesovar und Blutgefäße Graafscher Follikel Antrum Eizelle Lig. ovarii proprium Zona pellucida Theka folliculi Mark Corpus luteum Corpus luteum in Entwicklung Gesprungene Eizelle Corona radiata Primärfollikel Abb. 1.1: Entwicklung eines Follikels im weiblichen Ovar. Aus Pearson, Die Lutealphase Mit der Ovulation beginnt die zweite Zyklusphase. Durch Proteolyse findet die Eröffnung des Graaf-Follikels, und damit die Ovulation, statt. Daraufhin differenzieren sich aus den im Ovar verbliebenen Zellen des Follikelrandwalls, d.h. den GC und den Theka interna Zellen, die Granulosaluteinzellen und die Thekaluteinzellen (Channing et al., 1970). Diese Zellen bilden

8 Einführung 4 den Ausgangspunkt für das Corpus luteum (CL), den sogenannten Gelbkörper, eine zeitlich begrenzt endokrin und parakrin aktive Drüse. Wichtigstes Produkt dieser Drüse ist das Progesteron, das eine Reihe von Wirkungen auf verschiedene Organe aufweist. An der Hypophyse hemmt es die Bildung von FSH und LH; am Uterus wird die Schleimhaut auf die Nidation vorbereitet; an der Zervix führt es zur Verengung des Muttermundes und verändert den Zervixschleim; an der Vagina kommt es zu Epithelveränderungen. Des Weiteren fördert es an der Mamma die Proliferations- und Sekretionsbereitschaft der Alveolen (gemeinsam mit Östrogen). Nach vollständiger Entwicklung des CL weist Progesteron periphere Blutkonzentrationen von ng/ml (Pollow, 1990) auf. Da das CL während seiner 8- bis 10-tägigen Entwicklungsphase sowohl seine Größe als auch seine Zellzahl alle 60 bis 70 Stunden verdoppelt (Reynolds et al., 1994), und somit sehr schnell nicht mehr durch Diffusion versorgt werden kann, sind ausgeprägte angiogene Prozesse Voraussetzung für die Entwicklung eines voll funktionsfähigen CL. Vor der Ovulation sind Granulosazellschicht und Theka interna durch eine Basalmembran voneinander getrennt, womit die Gefäßeinsprossung aus der bereits vaskularisierten Theka interna in die Granulosazellschicht verhindert wird. Mit der Ovulation erhalten diese Gefäße durch den Zusammenfall des Follikels und dem gleichzeitig einsetzenden Integritätsverlust der Basalmembran direkten Kontakt zu dem GC-Kompartiment (McClure et al., 1994). Während der nächsten Tage finden angiogene Vorgänge enormen Ausmaßes statt, was durch die Bildung vieler kleiner Kapillaren, die das Gewebe durchziehen, sichtbar wird. Endothelzellen machen im reifen CL mehr als fünfzig Prozent der Gesamtzellzahl aus (O`Shea, et al., 1989). Dabei ist die Proliferationsrate des CL in der frühen Lutealphase am höchsten und nimmt in der mittleren und späten Lutealphase ab (Rodger, 1997; Gaytan 1998). Durch die rasche Einsprossung von Blutgefäßen können Nährstoffe und die zur Progesteronsynthese notwendigen Stoffe schnell in das CL gelangen. Wichtigstes Ausgangsprodukt für die Biosynthese des Progesterons ist das Cholesterin. Entsprechend gelangen im CL synthetisierte Hormone auch rasch zu den Zielorganen wie etwa dem Endometrium. Die molekularen Prozesse, die im menschlichen CL angiogene Prozesse regulieren, sind bislang noch nicht vollständig geklärt. Allerdings ist bekannt, dass angiogene Regulatoren wie Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und Angiopoietine von größter Bedeutung sind (Wulff et al., 2000). Während in den ersten Follikelstadien keine VEGF-Synthese nachweisbar ist, beginnen die Thekazellen nach dem Primärfollikelstadium mit der VEGF- Synthese, was die Endothelzellen des ovariellen Stromas zur Proliferation anregt. Diese

9 Einführung 5 bilden daraufhin das oben beschriebene dichte Kapillarnetz um den Follikel (Yamamoto et al., 1997). Auch in den Granulosazellen steigt die VEGF-Expression an. Es konnte zudem gezeigt werden, dass die Menge an messenger Ribonukleinsäure (mrna) des VEGF im menschlichen CL nach Behandlung mit humanem Choriongonadotropin (hcg) ansteigt (Keck et al., 1998; Wulff et al., 2000; Pietrowski et al., 2004). Dabei spielt im CL VEGF-A die wichtigste Rolle. Jedoch scheinen auch andere Faktoren aus der VEGF-Familie spezielle Aufgaben zu erfüllen (Ferrara and Davis-Smyth, 1997; Laitinen et al., 1997). Die oben beschriebene Situation der Stimulation des CL mit hcg entspricht der Lage im Corpus luteum graviditatis: Während die Lebenszeit des CL und seiner Gefäße im normalen Menstruationszyklus auf zwei Wochen begrenzt ist, und es anschließend zum Corpus albicans abgebaut wird, wird das CL bei Eintritt einer Schwangerschaft durch endogenes hcg erhalten. Dabei folgt auf den hcg-stimulus hin ein zweiter Angiogeneseschub bei gleichzeitiger Stabilisierung der Gefäße (Wulff et al., 2001). Abb. 1.2: Blutspiegel hypophysärer Gonadotropine und ovarieller Steroide im Verlauf eines Zyklus sowie nach Eintritt einer Schwangerschaft. Aus Dr. Hagemann,

10 Einführung Humanes Choriongonadotropin und luteinisierendes Hormon Bei den Hormonen luteinisierendes Hormon (LH) und humanes Choriongonadotropin (hcg) handelt es sich um Glykoproteine, die ebenso wie das follikelstimulierende Hormon (FSH) und das thyroideastimulierende Hormon (TSH) aus zwei nicht-kovalent gebundenen Ketten bestehen. Dabei sind die alpha-einheiten der genannten Hormone identisch und werden durch ein einziges Gen kodiert. Für die jeweils hormonspezifische beta-kette konnten verschiedene auf Chromosom 19 gelegene Gene identifiziert werden (Policastro et al., 1986). LH (Molekulargewicht 32 kda) wird auf Stimulation von GnRH hin pulsatil aus dem Hypophysenvorderlappen ausgeschüttet. HCG, dessen Molekulargewicht bei 38 kda liegt, wird schon vor der Implantation der menschlichen Blastozyste, wenn auch nur in geringen Mengen, gebildet. Sobald die Implantation abgeschlossen ist, wird das vom Trophoblasten gebildete hcg zu 95 % in den mütterlichen Kreislauf abgegeben, wo es zu einer Welle der Gefäßproliferation und vaskulärer Stabilisierung im CL führt (Wulff et al., 2001). Die beiden Hormone LH und hcg binden an denselben LH/hCG-Rezeptor und führen dort zu einer vergleichbaren Aktivierung von cyklischem Adenosinmonophosphat (camp) (Jia, X.C, et al., 1991). Interessanterweise kann nur die Bindung von hcg an diesen Rezeptor die Lebenszeit des CL verlängern (Zeleznik, 1998). In Gegenwart von LH wird das CL regressiv. Für dieses Phänomen wurden verschiedene Hypothesen aufgestellt, die im Folgenden kurz dargestellt werden: Eine Hypothese sieht den Grund für das unterschiedliche Verhalten des CL auf LH respektive hcg in der unterschiedlichen Plasmakonzentration. Die Serumwerte für LH fallen in vivo auf Grund der pulsatilen Sekretion zeitweise auf sehr niedrige Werte ab; dies lässt sich für hcg sowohl durch die längere Halbwertszeit als auch auf Grund der kontinuierlichen Sekretion nicht beobachten. Möglicherweise übt also die konstante Gegenwart von hcg einen intensiveren gonadotropen Stimulus auf das CL als LH aus (Stouffer et al., 1987; Monfort et al., 1989). Allerdings konnte mittlerweile gezeigt werden, dass LH auch bei kontinuierlicher Verabreichung die Regression des CL nicht verhindern kann (Zeleznik, 1998). Eine zweite Hypothese geht davon aus, dass sowohl die Unterschiede in der beta-kette als auch die verschiedenen Glykosylierungs- und Sulfatierungsgrade in unterschiedlichen biologischen Aktivitäten resultieren könnten (Strickland et al., 1985). Inzwischen wurde nachgewiesen, dass Makaken (Macaca fascicularis) weder auf kontinuierliche LH- noch auf kontinuierliche hcg-infusion mit einem Progesteron-Sekretionsmuster reagieren, wie es während einer spontan eingetretenen Schwangerschaft beobachtet werden kann. Allerdings fielen die absoluten Serum-Progesteronspiegel sowohl nach kontinuierlichen als auch nach

11 Einführung 7 exponentiell ansteigenden LH- bzw. hcg-infusionen (bei vergleichbaren bioaktiven Plasmakonzentrationen) nach LH-Gabe um etwa 40 % geringer aus (Zeleznik, 1998). Eine dritte Hypothese hält es für möglich, dass das alternde CL zunehmend weniger stark auf Gonadotropine reagiert. Entsprechend wäre der LH-Spiegel nicht mehr in der Lage, die Funktion des CL zu erhalten (Zeleznik, 1990; Zeleznik, 1998) und die verringerte Reaktion des CL auf altersbezogene Veränderungen zellulärer Signalwege, wie der Steroidogenese, zurückzuführen. Bislang ist die genaue Ursache für das unterschiedliche Verhalten nicht abschließend geklärt. Möglicherweise bewirkt jedoch die Stimulation des CL mit LH bzw. hcg trotz Bindung an denselben Rezeptor verschiedene Antworten nach Aktivierung von camp im Protein Kinase (PK)-A und -C Signalweg (Becker, 2005). 1.4 Angiogenese Unter Angiogenese versteht man die Bildung von Kapillaren aus bereits bestehenden Gefäßen. Auf einen angiogenen Stimulus hin werden ruhende Endothelzellen dazu angeregt, die sie umgebende extrazelluläre Matrix proteolytisch zu degradieren. Daraufhin migrieren sie in Richtung Stimulus und proliferieren stark, um dann röhrenförmige Strukturen auszubilden, die sich anschließend zu einem dreidimensionalen Kapillarnetz zusammenfügen (Augustin, 1998; Risau, 1997). Der streng regulierte Angiogenese-Prozess wird von einer Vielzahl angiogener und antiangiogener Faktoren beeinflusst. Der bekannteste unter ihnen ist VEGF. Die Bildung von mrna dieses Faktors wird von etlichen Zellarten bei Sauerstoffmangel schnell und reversibel induziert (Minchenko et al., 1994; Shima et al., 1995) und wird teilweise über Hypoxia- Induced Factor-1α und -3α (Hif-1α und -3α) reguliert (Heidbreder et al., 2003). Weitere Faktoren sind der Fibroblast Growth Factor a und b (FGF-a, saurer FGF; FGF-b, basischer FGF), Placenta Growth Factor (PGF), Platelet Derived Growth Factor (PDGF-A und -B), der Transforming Growth Factor-α und-β (TGF-α, TGF-β), der Hepatocyte Growth Factor (HGF), der Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) sowie Interleukin-6 und -8 (IL-6 und -8) (Motro et al., 1990; Folkman und Shing, 1992; Risau 1997). Die Rolle der Liganden des Tie-2-Rezeptors, der Angiopoietine-1 (Ang-1) und -2 (Ang-2), ist abhängig von der Umgebungssituation (Suri et al., 1996; Maisonpierre et al., 1997). Während des aktiven Angiogenese-Prozesses und bei Vorhandensein von ausreichend VEGF-A fördert

12 Einführung 8 Ang-2 den Vorgang, wohingegen Ang-1 einen für die Ausreifung und Stabilisierung der Gefäße wichtigen Faktor darstellt (Yancopoulos et al., 1998). Paradoxerweise führt Ang-2 bei vermindertem VEGF-Angebot zu einer Destabilisierung der Blutgefäße und induziert den Gefäßabbau, indem es dann einen kompetitiven Inhibitor von Ang-1 darstellt (Maisonpierre PC et al., 1997). Unter den potentiell antiangiogen wirkenden Faktoren sind Thrombospondin (God et al., 1991; DiPietro et al, 1997), das N-terminale 16 kda große Fragment des Prolaktins (Ferrara et al., 1991) sowie Ang-2 (in Abhängigkeit der Umgebungssituation) bekannt. Zudem wirken lösliche Rezeptoren angiogener Faktoren, wie z. B. der lösliche VEGF-Rezeptor-1 (VEGFR-1) sowie der lösliche FGF-Rezeptor (FGF-R) der Gefäßbildung entgegen. Endothelzellen (EC) PDGF-B Recruitment von Perizyten Kapillabildung EC Proliferation EC Migration EC Proteasesynthese VEGF TGF-β Angiopoietin 1 Differnzierung Stabilisierung Perizyten + Angiopoietin 2 + VEGF Sprossung + Angiopoietin 1 Stabilisierung -Angiopoietin 1 Destabilisierung + Angiopoietin 2 -VEGF Regression Abb. 3: Vorgänge im Rahmen der Angiogenese. Aus Dr. Maria Grant; Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Dieser Wachstumsfaktor spielt schon im Laufe der Embryonalentwicklung eine wichtige Rolle während angiogener Vorgänge. Er stellt den wichtigsten spezifischen Stimulator der Endothelzellproliferation dar. Der erste entdeckte VEGF wird heute als VEGF-A bezeichnet. VEGF-A vermag die Gefäßproliferation zu induzieren und die Permeabilität vaskulärer Endothelzellen zu steigern (Senger et al., 1986). Die Rezeptoren, an die VEGF-A mit hoher

13 Einführung 9 Affinität bindet, werden fast ausschließlich von Endothelzellen exprimiert (Ferrara et al., 1991). Die kodierende Gensequenz von VEGF-A besteht aus acht Exons; durch alternatives Spleißen des Primärtranskriptes kann VEGF-A in fünf verschiedenen Isoformen vorliegen. Entsprechend der resultierenden Aminosäureanzahl des nativen Proteins werden die Spleißvarianten als VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF189 und VEGF206 bezeichnet (Tischer et al., 1991; Ferrara et al., 1991; Charnock-Jones et al., 1993). Es wurden zudem vier weitere Wachstumsfaktoren entdeckt, die zur VEGF Familie gehören (VEGF-B bis -E). Ebenfalls als Mitglied der VEGF-Familie eingestuft wird aufgrund seiner Homologie (Aminosäure- Homologie bis zu 53% (Cao et al., 1997)) der Placenta Growth Factor (PGF/PIGF). Sauerstoffmangel im Gewebe stellt den stärksten Stimulus der VEGF-A-Expression dar (Shweiki et al., 1992). Beispielsweise kommt es in Tumorgeweben bei raschem Wachstum schnell zur Hypoxie, wodurch die VEGF-A Expression induziert und damit die Angiogenese gefördert wird (Folkman et al., 1971; Talks et al., 2000). Um seine angiogene Wirkung übermitteln zu können, muss VEGF an einen seiner Rezeptoren binden. Die miteinander verwandten Rezeptoren vom Tyrosinkinase-Typ bestehen aus einem Bereich, der sieben Immunglobulin(Ig)-ähnliche Domänen umfasst, einem extrazellulären Bereich, einer transmembranären Region, sowie einer katalytischen Region. Die Rezeptoren werden als VEGF-Rezeptor-1 (VEGFR-1; Flt-1) (Shibuya et al., 1991), VEGF-Rezeptor-2 (VEGFR-2, KDR) (German et al., 1991) und VEGF-Rezeptor-3 (VEGFR-3; Flt-4) (Pajusola et al., 1992) bezeichnet. VEGFR-1 wird vor allem auf Endothelzellen exprimiert, wobei seine Transkription durch Hypoxie verstärkt wird (Gerber et al., 1997). Der VEGFR-1 wurde zudem auf Mesangiumzellen (Takahashi et al, 1995) und Monozyten (Barleon et al., 1996) nachgewiesen. Auch VEGFR-2 wird vor allem auf Endothelzellen exprimiert. Seine Transkription ist jedoch nicht vom Sauerstoffgehalt der Umgebung abhängig. Der VEGFR-2 konnte außerdem auf hämatopoetischen Stammzellen, Megakaryozyten und retinalen Vorläuferzellen detektiert werden (Katoh et al, 1995; Yang et al, 1996). Ebenfalls eine VEGF-bindende Funktion haben die Neuropiline (Neuropilin-1, NP-1; und Neuropilin-2, NP- 2), die Co-Rezeptoren der Tyrosinkinasen sind (Soker et al., 1998). Die Neuropiline sind transmembranäre Nicht-Tyrosinkinasen und werden auf verschiedenen Zellarten exprimiert (Chen et al., 1997; Kawakami et al., 1996; Herzog et al. 2001; Soker et al., 1998). Der VEGFR-1 bindet VEGF121, VEGF165, VEGF-B sowie PIGF-1 und PIGF-2, während der VEGFR-2 die Faktoren VEGF121, VEGF145, VEGF165 sowie VEGF-C, -D und -E bindet (Achen et al., 1998; Joukov et al., 1997). Der Rezeptor VEGFR-3 bindet VEGF-C, -D und -E (Achen et al., 1998; Joukov et al., 1997), wohingegen NP-1 nur VEGF165 und PIGF-2 und

14 Einführung 10 NP-2 ausschließlich VEGF165 bindet. Alternatives Splicen der mrna von VEGFR-1 generiert einen löslichen Rezeptor, der VEGF antagonisiert (Kendall und Thomas, 1993). Die für Angiogenese und Mitogenese wichtigsten Signale werden hauptsächlich über VEGFR-2 (KDR) übertragen (Gille et al., 2001). 1.6 Angiopoietine Eine weitere wichtige Aktivatorgruppe im Bereich der Angiogenese sind die Angiopoietine. Bislang sind die Angiopoietine-1 bis -4 bekannt, die an den Tyrosinkinase-Rezeptor Tie-2/TEK binden (Davis et al., 1997; Maisonpierre et al., 1997). Das Angiopoietin-3 aus der Maus und das Angiopoietin-4 des Menschen stellen Orthologe dar. Die Angiopoietine spielen eine wichtige Rolle im Aufbau und Erhalt der Blutgefäße (s. o.). Tie-1 (für den bislang noch kein Ligand identifiziert werden konnte) und Tie-2 besitzen beide eine große extrazelluläre Domäne und werden ausschließlich von Endothelzellen exprimiert (Lyons et al., 1998). 1.7 Matrix-Metalloproteinasen und ihre Inhibitoren Viele verschiedene physiologische und pathologische Vorgänge, wie beispielsweise Ovulation und Schwangerschaft, Embryogenese, Wundheilungsvorgänge, Tumorinvasion und Metastasierung, involvieren sowohl Abbau als auch Remodellierung von extrazellulärer Matrix. An diesen Degradationsprozessen ist die Familie der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) maßgeblich beteiligt. Mittlerweile wurde eine Reihe von verschiedenen MMPs identifiziert, die eine hohe strukturelle Ähnlichkeit aufweisen und als Kollagenasen, Stromolysine oder Gelatinasen kategorisiert werden können. Um eine ungewollte Matrixdegradation zu vermeiden, wird die Transkription der mrna dieser Enzyme ebenso wie die Proteolyse der Pro-MMPs zu MMPs streng reguliert (Murphy et al., 1993). Des Weiteren können spezifische Inhibitoren, die Tissue Inhibitors of Matrix-Metalloproteinases (TIMPs), an aktive MMPs binden und somit inaktive Komplexe bilden. Wie bei den MMPs wird auch bei den TIMPs ein hoher Homologiegrad beobachtet (Apte et al., 1996). Im Corpus luteum werden die TIMPs zu verschiedenen Zeiten unterschiedlich stark exprimiert. TIMP-1 scheint während der Bildungs- und Entwicklungsphase des CL eine wichtige Rolle zu spielen, während TIMP-2 für dessen Erhalt wichtig zu sein scheint (Zhang et al., 2003). MMPs

15 Einführung 11 können sowohl eine proangiogene Rolle als auch eine antiangiogene Rolle einnehmen, wobei der Einfluss von MMPs und TIMPs auf angiogene Prozesse teilweise auf deren Wirkung auf proangiogene Moleküle (z.b. VEGF, Angiopoietine) und auf antiangiogene Moleküle (Angiostatin) beruht (Bergers et al., 2000; Pozzi et al., 2000). TIMP-1 wurde mittlerweile als potentieller Marker für die Progression eines Prostatakarzinoms vorgeschlagen (Jung et al., 1997; Lein et al., 1999). 1.8 Angiogenese im weiblichen Reproduktionstrakt In den meisten Geweben des Körpers finden angiogene Prozesse nur sehr limitiert und in der Regel im Rahmen der Wundheilung oder während pathologischer Entwicklungen, wie bei Tumorwachstum oder Retinopathien, statt (Ferrara und Davis-Smyth, 1997). Der weibliche Reproduktionstrakt bildet dabei eine Ausnahme. Hier finden sich periodische Änderungen der Gefäßverhältnisse beim Aufbau von Endometrium, der Follikelreifung, der Bildung des Corpus luteums und der Implantation eines Embryos. Dabei kann die volle Funktionsfähigkeit dieses Kompartiments erst durch die zyklischen Angiogenese-Prozesse geschaffen und erhalten werden (ten Dijke und Iwata, 1989; Philips et al., 1990). So wird in jedem Zyklus das Corpus luteum gebildet, das im Fall einer Konzeption während des ersten Trimesters die Hauptbildungsstätte des für den Erhalt der Schwangerschaft unentbehrlichen Progesterons, dem Gelbkörperhormon, darstellt (Niswender et al., 1995). Dementsprechend ist die volle Funktionsfähigkeit des CL Voraussetzung für den normalen Ablauf einer Schwangerschaft. Es wird deshalb bei eingetretener Schwangerschaft nicht wie ansonsten im Verlauf des Menstruationszykluses abgebaut, sondern durch das vom Trophoblasten gebildete Choriongonadotropin (hcg) zu weiterem Wachstum stimuliert und erhalten. Dabei besteht das reife CL zu 40 bis 70 % aus mikrovaskulären Perizyten und Endothelzellen (Davis et al., 2003). Interessanterweise exprimieren die in Ausbildung befindlichen Lutealgefäße keinen LH/hCG- Rezeptor. In den Gefäßen des CL graviditatis wurde zwar Immunoreaktivität für den zytoplasmatischen LH/hCG-Rezeptor nachgewiesen, jedoch war eine Oberflächenanfärbung nicht möglich (Bukovsky et al., 2003). Im CL sind jedoch nicht nur die Endothelzellen in der Lage, gefäßähnliche Strukturen auszubilden. Mittlerweile konnte gezeigt werden, dass auch humane Granulosazellen in Monolayer-Kulturen in vitro gefäßähnliche Strukturen auszubilden vermögen (Antczak und

16 Einführung 12 Van Blerkom, 2000). Interessanterweise wurden jeweils die Mehrzahl der untersuchten menschlichen und murinen Granulosazellen für die spezifischen Endothelzellmarker Tie-1, Tie-2, ckit, Flt-1, CD-31, von Willebrand-Faktor (vwf) und die schnelle Aufnahme von AcLDL positiv getestet. Diese Beobachtungen führten zu der Hypothese, dass Granulosazellen möglicherweise nicht wie bisher angenommen epithelialem, sondern endothelialem, Ursprung sind (Antczak, 2001). Durch diese Forschungsergebnisse erscheint der Gedankengang plausibel, dass möglicherweise nicht nur Endothelzellen, sondern auch Granulosazellen, direkt an der Gefäßausbildung im CL beteiligt sind. 1.9 Dreidimensionale Angiogenese-Assays Auf Grund des parallel zur Gefäßentstehung raschen, wenn auch streng regulierten, Gewebewachstums wurde verschiedentlich postuliert, dass das Gewebe des weiblichen Reproduktionstraktes als Modellsystem dienen können, um nicht nur auf dem Gebiet der Reproduktion, sondern auch in den Bereichen Gewebewachstum und Angiogenese intensivere Forschungen betreiben zu können (Augustin, 2000; Plendl, 2000; Reynolds et al., 2000; Reynolds und Redmer, 2001). Hierfür eingesetzte dreidimensionale Assays bieten gegenüber zweidimensionalen Assays den Vorteil, dass die erleichterte Ausbildung von Zell-Zell- Kontakten die Lebensdauer der Zellen im Vergleich zu Zellsuspensionen verlängert. Um die im Rahmen dieser Arbeit zu untersuchenden Aspekte darzustellen, standen prinzipiell verschiedene Modellsysteme zur Auswahl: Boyden-Kammer Als Boyden-Kammer (Bignold, 1989) bezeichnet man eine einfache Kammer, die zur Untersuchung von Chemotaxis genutzt wird. Sie besteht aus zwei übereinander gelagerten Kompartimenten, die durch einen Milliporefilter, der z. B. aus einer Polycarbonat-Membran besteht, voneinander getrennt sind. Der chemotaktisch wirksame Faktor wird in das untere Kompartiment gegeben, wodurch sich anschließend ein Gradient entlang des Filters entwickelt; in das obere Kompartiment werden anschließend beispielsweise Endothelzellen gegeben. Zelluläre Bewegungen in den Filter hinein können nach einer gewissen Inkubationszeit gemessen werden, deren Ende allerdings zeitlich vor dem Zerfall des Gradienten liegen muss.

17 Einführung 13 Ein Problem der Boyden-Kammer bildet die Schwierigkeit der exakten Quantifizierung der Ergebnisse, die nur dann gewährleistet ist, wenn die Zellmigration sehr einheitlich von Feld zu Feld stattgefunden hat. War dies nicht der Fall, so enthalten die ausgezählten Felder eine Vielzahl an unterschiedlichen Zellzahlen, was im Endeffekt zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen zwischen einzelnen Kammern und Experimenten führt Fibrin Gel in vitro Angiogenese-Assay Hierbei werden in oder auf ein Fibringel einzelne Endothelzellen gegeben, die sich innerhalb weniger Tage zusammenlagern und ein zelluläres Netzwerk bilden. Auf dieses Gel kann ein Agens gegeben werden; anschließend wird der Effekt auf die Endothelzellen mikroskopisch beurteilt. Ein Nachteil des Angiogenese-Assays im Fibringel ist folgender: Es spielt sich Angiogenese im Bereich von Wundheilung und Tumorwachstum in einer fibrinreichen Matrix ab (Dvorak, 1986). Die physiologische Angiogenese, wie sie embryonal oder zyklisch im weiblichen Reproduktionstrakt vorkommt, findet jedoch hauptsächlich in einer kollagenreichen extrazellulären Matrix statt und führt zu einem wohlgeordneten kapillären Netzwerk. Ein weiterer Nachteil des Fibrin-Assays besteht im Einsetzen von Einzelzellen, da diese schneller apoptotisch werden als Zellen, die sich in einem Zellverbund befinden (Pollamn et al., 1999, Satake et al., 1998). Zudem muss eine große Anzahl an Zellen in das Gel eingebettet werden, was dementsprechend eher zu Studienzwecken der kapillären Anordnung und des Remodellings genutzt werden kann, allerdings nicht tatsächlich die Situation einer Gefäßaussprossung widerspiegelt Sphäroidales Angiogenese-Assay Korff und Augustin führten 1998 das sphäroidale Angiogenese-Assay ein. In diesem Assay werden zunächst Endothelzell-Konglomerate definierter Zellzahl, sogenannte Sphäroide, generiert, die anschließend in ein Kollagengel eingebettet und stimuliert werden. Bei diesen Sphäroiden handelt es sich um Zellverbände, deren äußere Schicht Zell-Zell-Kontakte ausgebildet hat (tight junctions), wodurch sie vor Apoptose geschützt und für Wachstumsfaktoren empfänglich werden (Korff und Augustin, 1998). Diejenigen Zellen, die nicht über Zell-Zell-Kontakte in den Zellverbund aufgenommen wurden, gehen nach kurzer Zeit zu Grunde. Auf einen angiogenen Stimulus hin bilden die Sphäroide durch Migration, Elongation und Proliferation Sprossen aus, wobei diese Sprossen ein kapillarähnliches Aussehen zeigen und

18 Einführung 14 im Querschnitt ein Lumen aufweisen (Korff und Augustin, 1999). Das Ausmaß, in dem die Sphäroide mit Kapillarbildung und Wachstum der einzelnen Sprossen reagieren, kann als Maß für das Ausmaß an Stimulation durch das Agens gewertet werden. Anhand der beschriebenen Eigenschaften dieser relativ sensiblen Versuchsanordnung wird deutlich, dass sich das sphäroidale Angiogenese-Assay besonders gut zum Testen von verschiedenen Substanzen auf deren proliferationsfördernde und angiogene Potenz eignet. Durch die Bildung eines Zellverbundes können auch die Zell-Zell-vermittelten Reaktionen dargestellt werden. Dabei kommt die Einbettung in ein Kollagengel der in vivo Situation während physiologischer Angiogenesevorgänge besonders nahe. Aus den genannten Gründen erschien die Auswahl des sphäroidalen Angiogenese-Assays für die Untersuchungen im Rahmen der vorliegenden Arbeit am zweckmäßigsten. Aggregation Organisation Differenzierung Abb. 4: Schematische Darstellung der Ausbildung von Sphäroiden;

19 Fragestellung 15 2 Fragestellung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte das Zusammenspiel der verschiedenen Zellarten des Corpus luteums beleuchtet werden. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die direkte und indirekte Interaktion zwischen Granulosazellen und Endothelzellen gelegt. Folgende Fragen sollten untersucht werden: 1. Führen von Granulosazellen sezernierte Faktoren im Endothelzell-Sphäroid zu einer Änderung der Sprossenlänge sowie zu einer Zunahme der Anzahl an Sprossen? Welche Faktoren bewirken eine Änderung? 2. Lässt sich durch die Stimulation von Endothelzellen mit Granulosazellkonditioniertem Medium eine Expressionsänderung ausgewählter, im Zusammenhang mit Angiogenese-Prozessen stehender, Faktoren im Expressionsprofil der Endothelzellen feststellen? 3. Bilden auch Granulosazellen Sphäroide aus? Wie reagieren diese auf Gonadotropine? 4. Können Endothelzellen und Granulosazellen einen gemeinsamen Zellverbund ausbilden? 6. In wieweit kann ein Endothelzell-Granulosazell-Kosphäroid als funktionsfähiges Modellsystem für das Corpus luteum dienen? 7. Welche Schlussfolgerungen lassen sich aus dem Vergleich der verschiedenen Sphäroide ableiten?

20 Material und Methoden 16 3 Material und Methoden 3.1 Zellkultur In der vorliegenden Arbeit wurden Versuche mit den im folgenden beschriebenen Primärkulturen und Zelllinien durchgeführt: Granulosazellen Die in unserer Arbeitsgruppe verwendeten Granulosazellen (GC) wurden im Rahmen der an der Universitäts-Frauenklinik Freiburg im Breisgau durchgeführten in vitro Fertilisations (IVF) -Therapie gewonnen. Die Patientinnen wurden über die Verwendung der Zellen aufgeklärt und haben diesbezüglich eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben. Die Durchführung der Versuche wurde von der Ethikkommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau genehmigt. Nachdem die Eizellen vom Follikelpunktat der IVF-Patientin abgetrennt worden waren, wurde die verbliebene Follikelflüssigkeit samt Granulosazellen für 5 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Daraufhin wurde das entstandene Zellpellet mit 50 ml Phosphate Buffer Saline (PBS) gewaschen und nochmals für 5 Minuten bei 1000g zentrifugiert. Die entstandenen Zellpellets wurden nun vorsichtig auf je 2 ml Percoll-Lösung (Percoll : PBS wie 1 : 3) gegeben und bei 4000g 10 Minuten lang zenrifugiert. Der Einsatz der Percoll-Lösung diente der Auftrennung zellulärer Bestandteile verschiedener Dichte, so dass die Granulosazellen nach der Zentrifugation als gesonderte Fraktion abgenommen werden konnten. Danach wurden alle Granulosazellen gepoolt und nochmals für 5 Minuten bei 1500g in 50 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Granulosazellen in Medium-199 mit 10 % Hitze-inaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) und 1 % Penicillin/Streptomycin gleichmäßig auf 25 cm 2 Zellkulturflaschen verteilt. Das Medium wurde erstmals nach 24 Stunden gewechselt, danach alle 48 Stunden. Die Zellen wurden regelmäßig morphologisch beurteilt. Die GC wurden erst nach 3-tägiger Kultivierung in Medium-199 verwendet.

21 Material und Methoden Endothelzellen Bei den im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Endothelzellen (EC) handelt es sich um makrovaskuläre humane Zellen aus der Nabelschnurvene (HUVEC), die von PromoCell bezogen wurden. Die Zellen wurden in 25 cm² Zellkulturflaschen mit Endothelial Cell Growth Medium (ECGM)* kultiviert. Nach dem Ausplattieren wurden die Zellen erstmals nach 24 Stunden, anschließend alle 48 Stunden gewaschen und mit frischem Medium versorgt. Die Zellen wurden in den Passagen 3 bis 8 verwendet. Höhere Passagen wurden nicht eingesetzt, um das Auftreten morphologischer Unterschiede zu vermeiden. * (ECGM = Endothelial Cell Basal Medium (ECBM) mit Supplement** sowie 10 % Hitze-inaktiviertem FCS) ** (12,3 ml Supplement auf 500 ml ECGM enthalten 10 ml FCS, 2 ml ECGS/H, 0,1 ng/ml Endothelial Growth Factor, 1,0 ng/ml β-fibroblast Growth Factor, 1,0 µg/ml Hydrocortison und Gentamycin/Amphothericin B) Immortalisierte Granulosazellline hgl-5 Diese immortalisierte Granulosazelllinie wurde uns freundlicherweise von Herrn Prof. W. H. Rainey, University of Texas, USA überlassen. Nachdem die Zellen ausplattiert worden waren, fand der erste Mediumwechsel nach 24 Stunden statt, im weiteren Verlauf alle 48 Stunden. Das Wachstumsmedium dieser Zellen bestand aus DMEM-12-Medium mit 10 % Hitzeinaktiviertem FCS, 1 % Penicillin/Streptomycin und 2 % Ultroser G. 3.2 Induktion der Granulosazellen in Kultur: Um den Effekt von humanem Choriongonadotropin (hcg) auf die Expression verschiedener Wachstumsfaktoren in EC zu untersuchen, wurde jeweils die Hälfte einer GC-Präparation nach 72 Stunden in Kultur mit 10 IU/ml hcg stimuliert. Die mit hcg stimulierten Proben wurden als P-Proben (Probe), die nicht mit hcg stimulierten als K-Probe (Kontrolle) bezeichnet. Nach 48 Stunden wurde die Stimulation beendet Stimulation der EC sowie Isolierung der messenger Ribonukleinsäure (mrna): Sobald die EC im Monolayer weitestgehend konfluent waren, wurden sie mit 3 ml GCkonditioniertem Medium pro 25cm 2 Flask für 24 Stunden stimuliert. Die mrna wurde anschließend nach der One-Step Methode von Chomczynski und Sacchi (1987) isoliert.

22 Material und Methoden 18 Zunächst wurden die Zellen einmal in PBS gewaschen. Daraufhin wurden die Zellen mit 1 ml TriZol pro 25 cm 2 Zellkulturflasche vom Untergrund abgelöst und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugen-Reaktionsgefäß (RG) überführt. Hierauf wurden 200 µl Chloroform:Isoamylalkohol-Lösung (24 : 1) gegeben und der Ansatz bei 14000g 15 Minuten lang bei 4 C zentrifugiert. Nach der Zentrifugation befanden sich die mrna-moleküle in der oberen, wässrigen Phase, diese wurde abpipettiert und in ein zweites RG überführt. Es wurden daraufhin 500 µl Isopropanol zugegeben und der Ansatz nach kurzem kräftigem Schütteln für 30 Minuten auf 4 C gestellt. Anschließend wurde bei 12000g für 20 Minuten bei 4 C zentrifugiert. Nach dem Abnehmen des Überstands wurde das mrna-pellet zunächst für 5 Minuten in 100 %-igem, dann fünf Minuten lang in 75 %-igem Ethanol bei 7500g und 10 C gewaschen. Das Trocknen erfolgte über eine Vakuumtrocknung. Die getrocknete mrna wurde in 40 µl RNA Secure Reagent (RS-Lösung-Ambition) aufgenommen, noch vorhandene Desoxyribonukleinsäure (DNA) wurde durch den Zusatz von 3 µl DNase (DNase-I) und Inkubation bei 37 C für 30 Minuten zerstört (Anpassung der Inkubationsbedingungen an das Thermocycler GeneAmp-PCR System 2400, Perkin Elmer). Die Konzentration der isolierten RNA wurde mit Hilfe eines DU 640 Spectrometers bei 260 nm bestimmt. Der Grad der Reinheit wurde durch den Quotienten 260 nm : 280 nm bestimmt. Als Zielwert wurde 2,0 + 0,2 bestimmt Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR): Reverse Transkriptase-Reaktion Für die Herstellung der copy-desoxyribonukleinsäure (cdna) wurde das Kit RevertAid H Minus-First Strand cdna Synthesis Kit eingesetzt. Es wurden jeweils 1,5 µg mrna und ein Primergemisch aus 6 Basenpaar (bp)-langen Oligonukleotiden unterschiedlicher Sequenzen (Random Hexamer) verwendet. Die Reaktion lief in zwei Schritten ab: Im ersten Schritt wurden die mrna-moleküle zunä hst für 5 Minuten bei 70 C denaturiert, anschließend sofort für 5 bis 10 Minuten auf Eis gekühlt. Im zweiten Schritt fand die Synthese der cdna- Moleküle durch die Aktivität der M-MuLV reversen Transkriptase bei 42 C für 60 Minuten statt (Annealing- und Elongationsphase). Die entstandene cdna-lösung wurde im Verhältnis 1:10 mit H 2 O verdünnt und als Vorlage (Template) in der PCR eingesetzt Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaktion, PCR) (RT-PCR) Unter PCR versteht man eine sehr schnelle und sensitive molekularbiologische Methode der DNA-Vermehrung. Das Prinzip beruht auf der enzymatischen Vermehrung eines

23 Material und Methoden 19 gewünschten DNA-Abschnittes: Hierbei wird die Doppelstrang-DNA in zwei Einzelstränge getrennt, an beide bindet eine als Primer bezeichnete Startersequenz, die zur jeweiligen Sequenz am 5`-Ende komplementär ist. Anschließend findet durch die DNA-Polymerase die Komplettierung der Einzelstränge zu Doppelsträngen statt. Diese können nun erneut getrennt werden und Primer binden. Auf diese Weise kommt es zu einer exponentiellen Vermehrung des gewünschten DNA-Abschnittes. Das Ergebnis der Reaktion kann anschließend mit Hilfe der Gelelektrophorese sichtbar gemacht werden. Die PCR wurde mit Hilfe des Eppendorf Mastercycler Gradient Thermocyclers und benötigten Reagenzien (Taq-Polymerase Unit) durchgeführt. Standardbedingungen eines 25 µl PCR-Ansatzes: Komponente Menge Konzentration 1. dntp (Desoxyribonukleosid Triphosphat) 2,5 µl 2 mm 2. PCR 10-fach Puffer 2,5 µl 15 mm Mg mm Mg(OA) 2 3. Magnesium 3,5 µl 25 mm 4. Taq- Polymerase 0,2 µl 5 U/µl 5. Primer (Sense und Antisense) je 2,5 µl 100 µm 6. Template 2,0 µl 7. Wasser auf 25 µl Tabelle 3-1: Standardkomponenten einer PCR mit dem Taq-Polymerase Unit Kit von Qiagen; als Template wurden 2,0 µl der 1:10 verdünnten cdna eingesetzt Die Primer zu den verschiedenen Sequenzen wurden mittels der beim National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA) gespeicherten Sequenzen und mit Hilfe der Computerprogramme Virtual Genome Center ( und Web Primer: DNA and Purpose Entry ( ausgewählt.

24 Material und Methoden 20 Cyclerprogramm der PCR (Mastercycler Gradient): primäre Denaturierungsphase 94 C 5 Minuten Zyklen (im linearen Bereich) Denaturierung 94 C 30 Sekunden Annealing 60 C 30 Sekunden Elongation 72 C 45 Sekunden endgültige Elongation 72 C 5 Minuten Raumtemperatur 1 Minute Tabelle 3-2: Amplifikationsbedingungen der PCR Um eine quantitativ vergleichende Aussage zwischen PCR-Produkten machen zu können, müssen diese in der noch exponentiell ansteigenden Phase miteinander verglichen werden Zyklen 30 Zyklen 35 Zyklen 40 Zyklen Abb. 3-1: Darstellung der GAP-DH-Amplifikationsprodukte nach verschiedenen Zyklen der PCR, wobei die jeweils ersten, zweiten und dritten PCR-Produkte vom gleichen Template stammen. Anhand dieser Darstellung wird ersichtlich, dass auch nach 35 Zyklen weiterhin ein exponentieller Anstieg für GAPDH stattfindet Primer-Sequenzen Zur Untersuchung des Expressionsprofils von HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) wurden folgende Primer-Sequenzen benutzt: VEGF-A 5 -GTG AAG TTC ATG GAT GTC TAT CAG -3` 5 GCA TTC ACA TTT GTT GTG CTG TAG-3` VEGF-B VEGF-C 5 -ATA GAT GTG TAT ACT CGC GCT AC-3` 5 -GAG GAA GCT GCG GCG TC-3` 5 -AAA AAG CTA CAC CGA CGC-3` 5 -GAA GGT GTT TGT CGC GAC-3`

25 Material und Methoden 21 VEGF-D sflt1 FLT1-R 5 -ACT AGA ACC TGC GGC ATA C-3` 5 -TGC ACC AGC TGG ACG TAC 3` 5 -GAC AAA TCC TGA CTT GTA CCG-3` 5 -TTT AAT GTT TTA CAT TAC TTT GTG TGG-3` 5 -GGA AAG GAA AAT CGC GT-3` 5 -GCT TAA AGT GCT TAA TAT GCG C-3` KDR 5 -TCA TCA TCC TAC GGA CCG -3` 5 -GTG GAT ACA CTT TCG CGA T-3` PDGF-A PDGF-B PGF Ang-1 Ang-2 Ang-3 Ang-4 Tie-1 TEK/Tie-2 Hif-1α Hif-3α EPAS 5 -CTC CTC GGC TGC GGA TA-3` 5 -GTG TCC TCT TCC CGA TAA TC-3` 5 -CGC TCG ATC TAC GCG TT-3` 5 -GAC TCG CAC CGT CCG AA-3` 5 -CCG GTC ATG AGG CTG TTC-3` 5 -CTC TGG GGC CTA GCT TGC-3` 5 -CAG CAA TCA GCG CCG AA-3` 5 -CTG GAT TAT ATA TGT TTG ACG AGT AA-3` 5 -ACA GCT GAG CAA ACG CG-3` 5 -TGT GGC CTT GAG CGA AT-3` 5 -CAA AAC AGC GCG CTC GA-3` 5 -ATG TCC AAA GGC CGT ATC-3` 5 -AAA ACA GCG CGC TCG AG-3` 5 -GAG CCG CTG TAC CCG AC-3` 5 -ACG ACC ATG ACG GCG AAT-3` 5 -GGA TCT GGG GGA TCC GGT-3` 5 -CCT GGC CAT TGA GTA CGC-3` 5 -GGG CAG CTT CTC GTA GAG T-3` 5 -CAA GAC TTT CCT CAG TCG ACA-3` 5 -GGG AGA AAA TCA AGT CGT G-3` 5 -TGC GCA TGA AGA GTA CGC-3` 5 -CGC GTG GAT GTA CTC GTA-3` 5 -TGC TCT GAA AAC GAG TCC G-3`

26 Material und Methoden TGA GGT TGA CAG TAC GGC-3` FGF-a FGF-b TIMP-1 hil-6 hil6-r OSM OSMR gp-130 hlif LIF-R IL-8 IL-11 IL11-R NF-1 NF-2 5 -CAA ACT CCT CTA CTG TAG CAA CG-3` 5 -ATG TCC CAC TAA GCC GAC -3` 5 -GTT TCT TTT TTG AAC GAT TGG-3` 5 -GAG ACA CAG CGG TTC GA-3` 5 -GCC TTC TGC AAT TCC GAC-3` 5 -TGG AGG AGC TGG TCC GTC-3` 5 -ATG AAC TCC TTC TCC ACA AGC GC-3` 5 -GAA GAG CCC TCA GGC TGG ACT G-3` 5 -CAT TGC CAT TGG TCT GAG GTT C-3` 5 -AGT AGT CTG TAT TGC TGA TCT C-3` 5 -GCG AGC ATG GCG GCT AT-3` 5 -GGC GCT GCT CTA AGT CG-3` 5 -TTT CCA CCA ATT CTA CGC G-3` 5 -TCT TTA GGG AAA ACG AAC AAT-3` 5 -TAT ATA AAG TGA AGC CCA ATC CG-3` 5 -TGT GTA TGC TGC CAT TCG-3` 5 -CCA GGG CAT CGC TAA AC-3` 5 -TCC ACT TGT AAC ATT GTC GAC T-3` 5 -GCA CAA AGC AGA GAT ACG AC-3` 5 -CCA CCA TCT GTA TAG GCT CG-3` 5 -GGC CAA GAG AAT ATC CGA-3` 5 -TTT TAA TAG TTC TAA CTC ATT ATT CCG-3` 5 -CAT GAA CTG TGT TTG CCG-3` 5 -GAT CAC CTG GCT GTT TCG-3` 5 -TGC CAA GCA GCC GAC TA-3` 5 -CCT GTG ATC AAG TAG CCG A-3` 5 -TCA ATC CAG TCT TTA GTC GC-3` 5 -CCA AAC TGC TGC TTT ACG-3` 5 -CTG GCT TCT TAC GCC GT-3` 5 -CTC CTC CGT GCG AAT CG -3`

27 Material und Methoden 23 p53 APC VHL RB-1 CTGF BAX BCLX LH-hCG-R FSH-R GAPDH 5 -CAG TCA GAT CCT AGC GTC G-3 5 -CAC CAC CAC ACT ATG TCG A-3` 5 -CGA AAA GGA CAT ACT TCG TAT ACG-3` 5 -TTT CAC AGT AAG CGC GTA TC-3` 5 -TGG CTC AAC TTC GAC GG-3` 5 -GTC ACC AAC CGC TAC GG-3` 5 -AAC CCA GCA GTT CGA TAT CT-3` 5 -TTT TAA GAT AAA TTT CTT CGT ATC G-3` 5 -CAT CTT CGG TGG TAC GGT-3` 5 -ACA GAA TTT AGC TCG GTA TGT-3` 5 -GTG TCT CAA GCG CAT CG-3` 5 -GTA GGA GAG GAG GCC GTC-3` 5 -ATG TCT CAG AGC AAC CGG-3` 5 -TGT CTG GTC ATT TCC GAC T-3` 5 -CAC TTG CCT ACC TCC CTG TCA-3` 5 -TGC TCC GGG CTC AAT GTA TCT-3` 5 -AGG ATG TCA TCA TCG GAT C-3` 5 -CAG CTT TTT TAA GTT GTA AGT CGA-3` 5 -CTG GCG CTG AGT ACG TCG-3` 5 -TTG ACA AAG TGG TCG TTG A-3` Tabelle 3-3: Primer-Sequenzen der RT-PCR Um die während der Klonierung integrierte Sequenz zu überprüfen, wurden die beiden folgenden Primer einzeln eingesetzt: M13rev M13for CAG GAA ACA GCT ATG AC-3 5 -GTA AAA CGA CGG CCA G-3 Tabelle 3-4: Klonierungs-Sequenzen

28 Material und Methoden Darstellung der PCR-Amplifikationsprodukte Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte mittels Elektrophorese in einem 1 %-igen Agarosegel, wobei die DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe wanderten. Die Spannung betrug während der Bandenauftrennung zwischen 100 und 120 Volt. Mit Hilfe eines gleichzeitig laufenden DNA-Standards (Gene Ruler DNAQ Ladder Mix) konnte die Anzahl an Basenpaaren der PCR-Produkte ermittelt werden Densitometrische Auswertung der PCR-Amplifikate (Semiquantifizierung) Die Agarosegele wurden zunächst für 30 Minuten in einer Ethidiumbromidlösung inkubiert, damit diese mit der im Gel befindlichen cdna interkalieren konnte. Durch Bestrahlung mit Ultraviolettem (UV) Licht wurde es möglich, die Banden sichtbar zu machen und diese mit Hilfe der Software DIANA II Chemieluminescense Detection System (Raytest Isotopenmessgeräte GmbH) zu photographieren. Die densitometrische Auswertung erfolgte unter Zuhilfenahme des Computerprogramms Advanced Image Data Analyzer TaqMan-Polymerasen-Kettenreaktion (TaqMan-PCR) Unter TaqMan-PCR versteht man eine Real-Time-PCR, bei der im Gegensatz zur RT-PCR eine quantitative Aussage zur Ausgangsmenge an DNA gemacht werden kann. Dadurch wird es möglich festzustellen, in welchem Maß die Expression eines Gens durch eine bestimmte Substanz stimuliert wird. Das Prinzip der Real-Time-PCR ist folgendes: Ergänzend zur oben beschriebenen PCR arbeitet die TaqMan-PCR als Real-Time-PCR mit einer zusätzlichen TaqMan-Sonde. Dieses Oligonukleotid ist am 5 -Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Reporter-Farbstoff, Fluorescein-Derivat) markiert, dessen Fluoreszenz von einem am 3 - Ende befindlichen Quencher ( Unterdrücker-Molekül ) (Rhodamin-Derivat ) (Livac et al., 1995) auf Grund der räumlichen Nähe unterdrückt wird, und bindet innerhalb der zu amplifizierenden Sequenz. Erreicht die Polymerase beim Synthetisieren des komplementären Strangs die TaqMan-Sonde, wird der Reporter-Farbstoff abgespalten. Dabei wird ein Fluoreszenzsignal freigesetzt, welches durch eine automatische Laserdetektion gemessen wird. Die Intensität der Strahlung ist direkt proportional zur Anzahl der neu gebildeten DNA- Stränge. Die PCR-Quantifizierung findet auf der Grundlage eines Fluoreszenz- Schwellenwertes statt. Dieser wird dann überschritten, wenn die Reporterfluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt.

29 Material und Methoden 25 Die Real-Time-PCR wurde mit dem ABI Prism Sequenznachweissystem der Core Facility Freiburg i. Br. quantitativ und in Echtzeit mit einer VEGF-A-Sonde durchgeführt. 3.3 Sequenzierung des Tie-1 Amplifikates Extraktion der Tie-1 DNA aus Agarosegelen Hierfür wurde das Gel Extraktion Kit QIAGEN II verwendet. Es wurde den Herstellerangaben entsprechend vorgegangen und mit Puffern des Kits gearbeitet. Das Prinzip der DNA-Extraktion aus dem Agarosegel beruht auf der Verflüssigung des Gels und der - in Anwesenheit hoher Salzkonzentrationen - quantitativen Adsorption von DNA an die QIAEX II Silikagel-Partikel. Die folgende DNA-Elution fand in niedrigerer Salzkonzentration in Wasser statt. Das zu sequenzierende Tie-1-DNA-Fragment (hier das kleinere Fragment der Doppelbande) wurde zunächst durch Interkalierung von Ethidiumbromid und anschließender UV- Bestrahlung sichtbar gemacht. Daraufhin wurde es aus dem Agarosegel herausgeschnitten und in ein mit QX1-Puffer gefülltes Reaktionsgefäß (RG) gegeben. Darauf wurde eine der Masse des Agarosegels angepasste Menge der suspensierten Lösung QIAEX II gegeben, die die Silikagel-Partikel enthielt. Dieser Ansatz wurde gevortext und 10 Minuten lang bei 50 C inkubiert, wodurch es zu einer Verflüssigung der Agarosegels kam. Während der Inkubation wurden die DNA-Moleküle von den Silikagel-Partikeln adsorbiert und befanden sich nach einem Zentrifugatiationsschritt im Pellet. Das Pellet wurde mit QX1-Puffer und PE-Puffer gewaschen und anschließend getrocknet. Im Folgenden wurde die DNA in 10 mm Tris-Cl (ph 8,5) gelöst und mittels Zentrifugation von der Silikamatrix getrennt. Die QX1-, QIAEX II- und PE-Puffer waren im Gel Extraktion Kit QIAGEN II enthalten Klonierung des Tie-1 DNA-Fragmentes in den Vektor pcr 2.1 TOPO (Methode der TA Klonierung) Das zu untersuchende Tie-1 DNA-Fragment wurde zunächst in den Plasmid Vektor pcr 2.1 TOPO ligiert und danach in Escherichia coli DH5α (One Shot Chemically Competent E. coli) transformiert. Dieser Arbeitschritt wurde mit dem Kit und nach dem Protokoll TOPO Cloning Reaktion and Transformation ausgeführt.

30 Material und Methoden 26 Prinzip der TA-Klonierung: Durch die Taq-Polymerase kommt es am 3`-Ende des Amplifikationsproduktes fast immer zu einem unspezifischen Überhang von einer Base Adenosin. Entsprechend ist der pcr 2.1 TOPO Vektor so konstruiert, dass eine Base des komplementären Thymidins überhängt. Mit Hilfe der Ligaseaktivität des Enzyms Topoisomerase I (aus Vaccinia Virus) wurden Adenosinüberhang und Thymidinüberhang, und somit DNA-Amplifikationsprodukt und Vektor, ligiert. Zunächst wurden 4 µl gereinigte DNA, 1 µl Salzlösung und 1 µl des pcr 2.1 Vektors bei Raumtemperatur für fünf Minuten inkubiert und dann auf Eis gestellt. 2 µl dieses Ansatzes wurden zu den im RG befindlichen E. coli DH5α gegeben und für 10 Minuten auf Eis gestellt. Das Wärmeschocken der Bakterien fand bei 42 C für 30 Sekunden statt, anschließend wurden die Zellen sofort wieder auf Eis gestellt. Daraufhin wurde der Ansatz in 500 µl LB-Medium* bei 37 C eine Stunde lang geschüttelt, auf einer LB-Kulturplatte, die mit 5 mm X-Gal (5-Bromo-4-Chlor-Indigo-Galaktosid) beschichtet war, ausplattiert und über Nacht bei 37 C kultiviert. Da das Plasmid als Resistenzgen das β-laktamasegen trägt wurde zum LB-Medium 100 µg/ml Ampicillin gegeben, um nur plasmidtragende Bakterien anzuzüchten. *LB-Medium (in Pulverform): Zutaten für 1 Liter: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl. Die Zutaten wurden in 800 ml Wasser gelöst und der ph-wert mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellt und mit destilliertem Wasser ad 1000 ml aufgefüllt. Anschließend wurde für 21 Minuten bei 121 C autoklaviert. Sowohl flüssiges LB-Medium als auch der Agar für Kulturplatten wurden aus LB-Medium in Pulverform hergestellt Selektion der Klone ohne Galaktosidaseaktivität (Blau-Weiss-Selektion) Zur Auswahl geeigneter Klone wird die Tatsache genutzt, dass die Insertionsstelle des zu klonierenden DNA-Fragments in dem Bereich des Plasmids liegt, der für die β-galaktosidase (lacz) kodiert. Die funktionsfähige β-galaktosidase spaltet das Galaktosemolekül von dem synthetischen X-Gal ab, woraufhin der blaue Farbstoff 5-Bromo-Chlor-Indigo entsteht. Wird aber das DNA-Fragment eingebaut, geht die Galaktosidaseaktivität verloren und der Klon verfärbt sich nicht blau. Folglich wurde das gewünschte Tie-1 Fragment nur von den weiß bleibenden Klonen eingebaut. Je ein weißer Klon wurde in ein Gefäß mit 5 ml LB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin überführt und bei 37 C im Rüttler über Nacht kultiviert.

31 Material und Methoden Isolierung der Plasmid-DNA aus den transfizierten E. coli Plasmid-DNA Mini-Präparation Es wurden 2 verschieden Protokolle für die Plasmid-DNA Mini-Präparation ausgetestet: Das Protokoll für alkalische Lyse (Sambrook et al., 1989) und das Plasmid Mini Purification Protocol von Qiagen. Die folgenden Arbeitsschritte wurden - mit Modifikationen - nach dem Protokoll für alkalische Lyse durchgeführt. Von den 5 ml der über Nacht auf dem Rüttler gestandenen Kultur wurden 1,4 ml in ein 1,5 ml RG gegeben und eine Minute bei 2500g zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in 100 µl der Lösung 1 aufgenommen und resuspendiert, dann 5 Minuten bei RT inkubiert. Nach einer zehnminütigen Zentrifugation bei 2500g und 4 C wurde der Überstand abgenommen und das gleiche Volumen Phenol : Chloroform (1 : 1) hinzugegeben, gevortext und dann bei 2500g für 10 Minuten zentrifugiert. Die DNA- Ausfällung wurde mit doppeltem Volumen Ethanol bei 12000g 15 Minuten lang durchgeführt. Schließlich wurde das Pellet nochmals in 1 ml 70 %-igem Ethanol bei 12000g für 10 Minuten gewaschen. Nachdem das Pellet getrocknet war, wurde es in 40 µl TE-Puffer (ph 8,0) und 2 µl RNase (1 mg/ml) aufgenommen Restriktionsverdau der Plasmid-DNA Der Vektor pcr 2.1 TOPO wird von dem Restiktionsenzym EcoR Ι (Invitrogen) an zwei bekannten Positionen geschnitten, wobei zwei DNA-Fragmente entstehen: das Fragment des Vektors pcr 2.1 TOPO (3,9 kbp) selbst und das Fragment mit der inserierten DNA (in diesem Fall ca bp) Strukturanalyse der zu untersuchenden DNA Sequenz Zusammensetzungen der eingesetzten Lösungen: Lösung µl 0,1 M EDTA; 50 µl 20 %-ige Glukose in Wasser; 25 µl 1 M Tris ph 8,0; 825 µl Wasser Lösung 2 Lösung 3 40 µl 10 N NaOH; 200 µl 10 %-iges SDS; 1760 µl Wasser 60 ml 5 M Kaliumacetat; 11,5 ml Eisessig; 28,5 ml Wasser TE-Puffer (ph 8,0) 10 mm Tris-Cl ph 8,0; 1 mm EDTA ph 8,0 Tabelle 3-5: Lösungen zur Strukturanalyse der DNA-Sequenz

32 Material und Methoden Restriktionsverdau von Plasmid-DNA Mit Hilfe des Webcutter Internetprogramms der Yale University, Conneticut, USA, ( wurden sowohl die Vektorsequenz als auch die Tie-1 DNA-Sequenz auf mögliche Restriktionsschnittstellen hin untersucht. Daraufhin wurde das Restriktionsenzym EcoR Ι ausgewählt. Die Restriktionsanalyse wurde dem Herstellerprotokoll entsprechend durchgeführt und mit jeweils 1-5 µg Plasmid-DNA und 5 IU Restriktionsenzym bei 37 C über Nacht verdaut Sequenzierreaktion A In diesem Arbeitsschritt wurde nach dem Protokoll (BigDye Sequenzing Reaction) der Core Facility, Zentrum für klinische Forschung der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. gearbeitet. Reagenzien: Komponenten für die Sequenzierreaktion Plasmid DNA (als Template) Menge 250 ng Primer M13 Reverse (-34) 1 µl Big Dye Mix 4 µl (Mischung der durch Fluoreszenzfarbstoffe markierten dntps) Wasser auf 20 µl Tab. 3-6: Die Komponenten der Sequenzierreaktion A entsprechend dem Protokoll der Core Facility, Zentrum für klinische Forschung der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br. Cyklerprogramm: 25 Zyklen Denaturierung bei 96 C 30 Sekunden Annealing bei 50 C 13 Sekunden Elongation 4 Minuten Tab. 3-7: Cyklerprogramm der Sequenzierreaktion A Sequenzierreaktion B Nachdem die Sequenzierergebnisse, die sich nach dem Protokoll für alkalische Lyse ergaben, unbefriedigend waren, wurde mit dem Plasmid Mini Purification Protocol von Qiagen gearbeitet:

33 Material und Methoden 29 Nach einer Nacht auf dem Rüttler wurden 5 ml der Bakterienkultur abgenommen und zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde in 0,3 ml Puffer P1 resuspendiert. Hierzu wurden 0,3 ml Puffer P2 gegeben, vermischt und nach 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur 0,3 ml des gekühlten Puffer P3 hinzugefügt. Das Gemisch wurde sofort durchmischt. Daraufhin wurde 10 Minuten bei 3000g zentrifugiert. Währenddessen wurde gleichzeitig 1 ml Puffer QBT über eine QIAGEN-20 Säule laufen gelassen, so dass der klare Überstand nach dem Zentrifugationsschritt direkt auf die Säule gegeben werden konnte. Anschließend wurde die Säule 4-mal mit je 1 ml Puffer QC gespült. Nachdem die 4 ml vollständig durchgelaufen waren, wurde die DNA in Puffer QF gelöst, indem 0,8 ml auf die Säule gegeben wurden und die unten austretende Flüssigkeit in einem 1,5 ml RG aufgefangen wurde. Im Folgenden wurde die DNA mit 0,56 ml Isopropanol ausgefällt und bei 3000g für 30 Minuten zentrifugiert. Danach wurde der Überstand abgenommen und das DNA-Pellet in 1 ml 70 %-igem Ethanol gewaschen und 5 Minuten lang luftgetrocknet. Abschließend wurde es in 50 µl TE Puffer aufgenommen. Zusammensetzungen der eingesetzten Lösungen: Puffer P1 Puffer P2 50 mm Tris-Cl, ph 8,0; 10 mm EDTA; 100 µg/ml RNase A 200 mm NaOH; 1% SDS Puffer P3 3,0 M Kaliumacetat, ph 5,5 Puffer QBT 750 mm NaCl; 50 mm MOPS, ph 7,0; 15% Isopropanol; 0,15 % Triton X-100 Puffer QC Puffer QF TE 1,0 M NaCl; 50 mm MOPS, ph 7,0; 15 % Isopropanol 1,25 M NaCl; 50 mm Tris-Cl, ph 8,5; 15 % Isopropanol 10 mm Tris-Cl, ph 8,0; 1 mm EDTA Tab. 3-8: Die Komponenten der Sequenzierreaktion B Die Reinigung der Reaktionsprodukte fand durch Waschen in Isopropanol statt, anschließend wurden sie getrocknet, um dann in der Core Facility zunächst am ABI 377a Sequenzautomaten (ABI 377a automated Sequencer; Applied Biosystems, CA, USA), in späteren Versuchen im Mega BACE 500 (Amersham Biosciences), einem Kapillarsequenziergerät, eingesetzt zu werden.

34 Material und Methoden Sphäroidales Angiogenese-Assay Dieses dreidimensionale Assay ermöglicht es, verschiedene Substanzen auf deren proliferationsfördernde und angiogene Potenz hin zu testen. Das Prinzip besteht darin, aus einer definierten Anzahl von Zellen ein kugelförmiges Zellsystem, den Sphäroid, auszubilden und diesen anschließend in ein Kollagengel einzubetten. In diesem Gel kann der Sphäroid auf Stimulation entweder mit vermehrter, gleich bleibender oder verminderter Sprossungsaktivität, dem sogenannten Sprouting, reagieren. In dieser Arbeit wurden Sphäroide aus den folgenden drei verschiedenen Zellarten hergestellt: GC, HUVEC und hgl-5 Zellen. Des Weiteren wurden Kokultur-Sphäroide aus den Zellarten GC und HUVEC gebildet Reagenzien Methozel Zu dessen Herstellung wurden 6 g Methylcellulose (Sigma) in einer 500 ml Glasflasche mit Magnetrührstab autoklaviert. Anschließend wurden 250 ml auf 60 C erhitztes ECBM zugegeben und die Methylcellulose während 20 Minuten auf einem Magnetrührer darin gelöst. Nach Zugabe von weiteren 250 ml ECBM wurde die Lösung über Nacht bei 4 C gerührt. Diese Stocklösung wurde in 50 ml Röhrchen aliquotiert und bei 5000g drei Stunden lang zentrifugiert. In den Versuchen wurde ausschließlich der klare, hochvisköse Überstand eingesetzt Kollagen Typ 1 Zunächst wurden 2 mittellange Rattenschwänze (Wystar-Kyoto-Ratte) für 20 Minuten in 70 %-igen Ethanol eingelegt, um deren Haut anschließend steril abziehen zu können. Die hautlosen Rattenschwänze wurden zur Desinfektion nochmals in Ethanol gewaschen. Im Folgenden wurden nacheinander - mit dem am weitesten distal liegenden Vertebra beginnend - alle Wirbel abgetrennt und die Sehnenfäden aus dem verbliebenen Schwanzstück gezogen. Zwischenzeitlich wurden die Rattenschwänze zum Feuchthalten immer wieder kurz in Ethanol gelegt. Nachdem alle Sehnen entnommen waren, wurden diese 20 Minuten lang in 500 ml 70 %-igen Ethanol gegeben. Anschließend wurden die Sehnenfäden für ca. 30 Minuten unter einem Abzug getrocknet, um dann für 48 Stunden bei 4 C in 250 ml steril filtrierten Eisessig : Aqua dest. (1 : 1000) gelöst zu werden. Diese Endlösung wurde in 50 ml

35 Material und Methoden 31 Röhrchen gegeben und bei 4 C und 17000g 60 Minuten lang zentrifugiert. Es wurde ausschließlich der klare Überstand abgenommen. Da das Kollagen je nach Präparation und Sehnenanteil verschiedene Dichten aufweisen kann, wurde mit 10-fach HBSS und verdünntem Eisessig (1 : 1000) gemischt, bis die optisch Dichte (OD) bei 280 nm bei 2,5 lag. Das isolierte Kollagen wurde erst nach 4-wöchiger Lagerung eingesetzt, um Sprossungsartefakte durch im Kollagen gelöste Wachstumsfaktoren zu vermeiden %-iges Paraformaldehyd (PFA) Zunächst wurden 50 g PFA (Sigma) in 400 ml bidestilliertem Wasser gelöst. Anschließend wurden 5-6 Plätzchen NaOH zugegeben und die Lösung unter Rühren auf mindestens 40 C erwärmt. Sobald die Lösung klar war, wurde sie mittels HCl-Titration auf einen ph-wert zwischen 7,2 und 7,4 eingestellt. Es wurde mit bidestilliertem Wasser ad 500 ml aufgefüllt Sphäroidherstellung Am Beispiel der HUVEC-Sphäroide wird das Herstellungsprozedere beschrieben. Das Protokoll zur Herstellung von Sphäroiden anderer Zellarten unterscheidet sich lediglich in der verwendeten Zellart Ansetzen der Sphäroide Ein Sphäroid wurde aus 400 HUVEC hergestellt. Hierfür wurden die Zellen des HUVEC- Monolayers von der 25 cm² Zellkulturflasche mit 3 ml Trypsin/EDTA abgelöst, die Reaktion mit 1 ml FCS abgestoppt und die Flüssigkeit mit den darin enthaltenen Zellen in ein 50 ml RG überführt. Es folgte ein 4-minütiger Zentrifugationsschritt bei 1000g. Anschließend wurden die Zellen in 10 ml ECBM (ohne Supplement) mit 10 % Hitze-inaktiviertem FCS aufgenommen und mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Daraufhin wurden 400 HUVECs in ECBM (ohne Supplement) mit 10 % FCS : Methocel (4 : 1) gegeben. In jede Vertiefung von 4 bereitstehenden nicht-adhäsiven, U-förmigen 96-well Platten (Platten mit 96 U-förmigen Vertiefungen) wurden 100 µl dieses Zell-Medium-Gemischs mit je 400 HUVEC pipettiert. Es wurden nicht-adhäsive Platten ausgewählt, um zu verhindern, dass die Zellen an der Wand der Vertiefung anhafteten. Stattdessen sammelten sich diese am Grund der Vertiefung, wo sie während der 24-stündigen Inkubation bei 37 C und 5% CO 2 bei 100 % Luftfeuchtigkeit einen Zellverband, den Sphäroid, ausbildeten.

36 Material und Methoden Sphäroidernte Nachdem die HUVECs für 24 Stunden in den 96-well Platten inkubiert worden waren, hatten sich die Sphäroide ausgebildet. Diese wurden mit einer Mehrkanalpipette (Research Pro 1200; Eppendorf) geerntet; die Sphäroide aus je vier 96-well Platten wurden in einem 50 ml RG gesammelt. Es befanden sich also ca. 400 Sphäroide in einem RG. Danach fand eine 3- minütige Zentrifugation bei 1000g statt. Nachdem der Überstand abgenommen war, wurden die ca. 400 Sphäroide mit 4,5 ml Methocel : FCS (4 : 1) bedeckt, allerdings fand keine Durchmischung statt Herstellung der Sphäroidgele Vorbereitend wurden pro 400 Sphäroide je 0,5 ml Medium-199 (10-fach) mit 4,0 ml Kollagen auf Eis vermischt. Um den ph-wert dieser Lösung auf 7,2 bis 7,4 einzustellen, wurde so viel NaOH (0,2 N) zugegeben, bis die Mischung fleischfarben, jedoch noch nicht nach pink umgeschlagen, war. Im folgenden wurden die Sphäroide mit den 4,5 ml des Methocel-FCS- Gemischs aufgezogen, in das vorbereitete Kollagengemisch gegeben und zweimal durchmischt. Daraufhin wurde sofort zügig je 1 ml in die mittigen 8 Vertiefungen einer vorgewärmten 24-well Platte (Platte mit 24 zylinderförmigen Vertiefungen) pipettiert. Zuvor wurde in alle randständigen Wells je 1 ml PBS vorgelegt und die Platte auf 37 C aufgewärmt. Nachdem die entstandenen Gele nach 30 Minuten bei 37 C auspolymerisiert waren, fand die Stimulation mit den zu untersuchenden Stoffen und Medien über einen Zeitraum von 24 Stunden statt. Nach dieser Zeit wurde die Reaktion mit 10 %-igem Paraformaldehyd abgestoppt Auswertung der Sphäroidgele Die Auswertung der Sphäroidversuche fand mit Hilfe eines inversen Mikroskopes (Olympus IX50) statt. Dazu wurden zunächst jeweils 10 unterschiedliche, aber repräsentative, Sphäroide einer Stimulationsgruppe und eines jeden Experimentes digital erfasst (Kamera DP50, Olympus). Die Auswertung wurde computergestützt anhand der Software analysis 3.1 durchgeführt, wobei sowohl die Anzahl der entstandenen Sprossen, als auch die additive Gesamtlänge aller von einem Sphäroid herrührenden Sprossen (cumulative sprout length, kumulative Sprossungslänge, CSL) Beachtung fand.

37 Material und Methoden Statistik Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe des student`s t-tests für abhängige Stichproben ausgewertet. Das Signifikanzniveau lag bei p<0,05 (signifikant) bzw. p<0,01 (hochsignifikant). Die Ergebnisse sind als Mittelwert + Standardfehler ausgedrückt. Die Auswertung erfolgte rechnergestützt mit Hilfe des Softwareprogramms Microsoft Excel XP. Signifikante Ergebnisse wurden mit einem Querbalken und darüberliegender Sternmarkierung dargestellt. In den PCR-Versuchen wurde jeder Primer in mindestens drei unabhängigen Versuchen unter den oben genannten Bedingungen eingesetzt und ausgewertet. Die zum Einsatz gekommenen Vorlagen (Templates) stammten jeweils aus der isolierten mrna von mehreren verschiedenen Frauen, wobei die mrna einer jeden Frau nur zur Herstellung einer Vorlage verwendet wurde. Die Untersuchungen an den Sphäroiden wurden jeweils mindestens 3 mal durchgeführt, wobei pro Experiment und aufgetragener Substanz je 10 Sphäroide ausgewertet wurden. Somit wurden insgesamt pro aufgetragener Substanz mindestens 30 Sphäroide ausgewertet. 3.6 Stimulanzien humanes Choriongonadotropin follikelstimulierendes Hormon KDR-Fc luteinisierendes Hormon Progesteron RU 486 Tie-2/Fc TIMP-1 TIMP-1(Ab-2) humanes rekombinantes VEGF-A Zell-konditioniertes Medium 1; 5; 10 IU/ml 0,1; 0,5; 1;5 IU/ml 5 µg/ml 35 miu/ml 33 ng/ml 10 nm 1 µg/ml 3 nm 1 µg/ml 25 ng/ml 200 µl/ml (Gel) 3 ml/25 cm 2 (PCR) Tabelle 3.9: In Stimulationsversuchen eingesetzte Reagenzien

38 Ergebnisse 34 4 Ergebnisse Für die Entwicklung eines funktionsfähigen Corpus luteum (CL) spielt die zelluläre Interaktion zwischen Granulosazellen (GC) und einwandernden Endothelzellen (EC) eine entscheidende Rolle. Auf Grund der raschen Größenzunahme kann sich das CL nur dann regelrecht ausbilden, wenn eine ausreichende Vaskularisierung gewährleistet ist. Dabei üben GC auf EC eine proangiogene Wirkung aus (Redmer et al., 1996; Christenson et al., 1997). Die zelluläre Kommunikation wird hierbei von den gonadotropen Hormonen LH und hcg reguliert. Um ein besseres Verständnis für die Situation der EC zu erhalten, ist es wesentlich herauszufinden, welche Faktoren in den EC durch GC bzw. gonadotrop aktivierte GC reguliert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden daher die Interaktionen zwischen EC und GC näher beleuchtet. Zunächst wurde der Einfluss löslicher, von GC sezernierter, Faktoren auf EC untersucht. Dazu wurde im ersten Teil der Arbeit die angiogene Potenz der von GC sezernierten Faktoren auf zellulärer Ebene mit Hilfe eines dreidimensionalen sphäroidalen Angiogenese-Modells dargestellt. Im zweiten Teil wurden Veränderungen im Expressionsniveau der EC folgender, im Zusammenhang mit angiogenen Prozessen stehender, Faktoren nach Inkubation der EC mit GC-konditioniertem Medium untersucht: VEGF-A, -B, -C, -D und den Rezeptoren sflt-1; KDR; FLT1-R. PGF, PDGF-A und -B; FGF-α; FGF-β; TIMP-1; Ang-1 bis -4 sowie Tie-1 und TEK/Tie-2; IL-6; IL6-R; gp-130; LIF; LIF-R; OSM; OSM-R; IL-8; IL-11; IL11-R; FSH-R; LH/hCG-R; NF-1; NF-2; p53; APC; VHL; RB-1; EFNB2; Hif-1α; Hif-3α; EPAS; CTGF; BAX; BCLX. Darüber hinaus wurde untersucht, ob das konditionierte Medium von unstimulierten GC einen anderen Einfluss auf das Expressionsprofil der EC hat, als das konditionierte Medium von hcg-stimulierten GC. Basierend auf der Annahme, dass GC möglicherweise endothelialem Ursprung sein könnten, gelang im dritten Teil der vorliegenden Arbeit erstmalig die Ausbildung von GC-Sphäroiden. Im vierten Abschnitt wurde schließlich ein Modellsystem für das CL entwickelt, in dem EC und GC einen zellulären Verbund ausbilden und somit auch Zell-Zell-vermittelte Interaktionen dargestellt werden können.

39 Ergebnisse Sphäroidales Angiogenese-Assay HUVEC-Sphäroide Im ersten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welchen Einfluss die von Granulosazellen sezernierten löslichen Faktoren auf angiogene Prozesse auf zellulärer Ebene ausüben. Um diesen Einfluss darstellen zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit das sphäroidale Angiogenese-Assay eingesetzt. Dieses dreidimensionale Assay ermöglicht die Analyse der Aktivität verschiedener Wachstumsfaktoren in einer definierten Umgebung. Des Weiteren stellt es ein Modell dar, in dem die Zellen durch das Vorhandensein eines Zellverbundes Differenzierungsschritte eingehen können. Damit ist es möglich, der in vivo Situation besonders nahe zu kommen (Korff et al., 1998). Bild 4-1: unstimulierter HUVEC-Sphäroid in der 96-well Platte nach 24-stündiger Kultivierung direkt vor der Einbettung ins Kollagengel Stimulation der HUVEC-Sphäroide mit GC-konditioniertem Medium Um die GC-vermittelten Auswirkungen auf die Angiogenese im CL zu untersuchen, wurden GC zunächst für 72 Stunden kultiviert, um die Ausgangssituation aller während dieser Arbeit verwendeten GC vergleichbar zu halten. Nach dieser Zeit wurde die Hälfte der Zellen mit 10 IU/ml humanem Choriongonadotropin (hcg) stimuliert. Nach weiteren 48 Stunden wurde das konditionierte Medium abgenommen und auf in einem Kollagengel befindliche EC-Sphäroide gegeben. Soweit nicht anders angegeben, wurden in den Sphäroid-Versuchen n=30 Sphäroide aus 3 Ansätzen ausgewertet.

40 Ergebnisse 36 Durch die Stimulation mit GC-konditioniertem Medium konnte ein Anstieg der kumulativen Sprossungslänge (CSL) hervorgerufen werden. Dabei war die Zunahme sowohl zwischen Basalwert und Medium mit hcg-stimulation der GC als auch zwischen Medium mit und Medium ohne hcg-stimulation der GC signifikant (Abb.4.1-1; Bild 4-2 a-c). CSL [µm] * * Abb : Effekt der Stimulation von HUVEC-Sphäroiden mit GC-konditioniertem Medium auf die kumulative Länge der Sprossen (CSL). Nicht stimulierte HUVEC-Sphäroide (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (2); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium, wobei diese GC vorher mit hcg inkubiert worden waren (3) (n=60 Sphäroide aus 6 Ansätzen; p<0,01) Im Sinne der Entwicklungsbiologie stellen Initiierung von Sprossen und das Wachstum dieser zwei verschiedene Prozesse dar. Aus diesem Grund wurde getrennt von der kumulativen Sprossenlänge auch die Gesamtanzahl an Sprossen bestimmt. Im Vergleich von Basalwert und Medium mit hcg-stimulation, sowie zwischen Medium mit und Medium ohne hcg- Stimulation der GC konnte eine signifikante Zunahme der Anzahl an Sprossen pro EC- Sphäroid beobachtet werden (Abb ).

41 Ergebnisse 37 * * Anzahl an Sprossen Abb : Effekt der Stimulation von HUVEC-Sphäroiden mit GC-konditioniertem Medium auf die Anzahl an Sprossen. Nicht stimulierte HUVEC-Sphäroide (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (2); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium, wobei diese GC vorher mit hcg inkubiert worden waren (3) (n=60 Sphäroide aus 6 Ansätzen; p<0,05) Bild 4-2 a: HUVEC-Sphäroid im Kollagen-Gel nach 24-stündiger Kultivierung. Abgebildet ist ein nicht stimulierter HUVEC-Sphäroid

42 Ergebnisse 38 Bild 4-2 b: HUVEC-Sphäroid im Kollagen-Gel nach 24-stündiger Kultivierung. Abgebildet ist ein stimulierter HUVEC-Sphäroid; die Stimulation erfolgte mit GC-konditioniertem Medium Bild 4-2 c: HUVEC-Sphäroid im Kollagen-Gel nach 24-stündiger Kultivierung. Abgebildet ist ein stimulierter HUVEC-Sphäroid; die Stimulation erfolgte mit GC-konditioniertem Medium, wobei diese GC zuvor mit hcg inkubiert worden waren

43 Ergebnisse Stimulation der HUVEC-Sphäroide mit hcg Um auszuschließen, dass die signifikante Steigerung von CSL und Anzahl an Sprossen ein direkter Effekt auf die HUVEC-Sphäroide von im GC-konditioniertem Medium verbliebenen hcg sein könnte, wurden HUVEC-Sphäroide mit 10 IU/ml hcg inkubiert. Es konnte keine Veränderung der Sprossungsaktivität festgestellt werden (Abb ). Damit konnte gezeigt werden, dass das gesteigerte Sprossungsverhalten kein Effekt des hcg direkt auf EC ist, sondern erst durch die Stimulation der GC mit hcg und die damit verbundene Sekretion löslicher Faktoren durch die GC möglich wird CSL [µm] Abb : unstimulierter HUVEC-Sphäroid (1); mit 10 IU/ml hcg stimulierter Sphäroid (2) Untersuchung auf proangiogene Faktoren im GC-konditioniertem Überstand a Untersuchung des Sprossungsverhaltens nach Blockade von VEGF Als ursächlich für den stimulierenden Effekt des GC-konditionierten Mediums auf die EC- Sphäroide wurden verschiedene im Medium befindliche proangiogene Faktoren vermutet. Wie Senger et al zeigen konnten, induziert der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) die Endothelzellproliferation und steigert sogleich die Permeabilität vaskulärer Endothelien. Auch während der Ausbildung des CL ist die Anwesenheit von VEGF-A von existenzieller Bedeutung (Ferrara et al., 1998). Um einen durch VEGF hervorgerufenen Anteil am Sprossungsverhalten der Endothelzellen nachzuweisen, wurde zunächst VEGF aus dem GC-konditionierten Medium abgefangen. Um dies zu erreichen, wurde der VEGF- Rezeptor-2 (VEGFR-2; KDR) (Terman et al., 1991) in einer Konzentration von 5 µg/ml zum Medium gegeben. Durch die Bindung von VEGF an diesen Rezeptor wurde die VEGF vermittelte proangiogene Wirkung verhindert. Nach Gabe von VEGFR-2 zu GCkonditioniertem Medium (+/- hcg) fielen sowohl die Anzahl an Sprossen wie auch die CSL signifikant geringer aus (Abb und 4.1-5). Dieses Experiment zeigt, dass VEGF-A sowohl von unstimulierten, als auch von hcg-stimulierten GC sezerniert wird. Dabei führt

44 Ergebnisse 40 die Stimulation der GC mit hcg zu einem signifikanten Anstieg der Sekretion von VEGF-A in das umgebende Medium. 700 * * * * * * * CSL [µm] Abb : Darstellung der Auswirkung auf die CSL, wenn VEGF mit seinem Rezeptor VEGFR-2/KDR in dem GC-konditionierten Medium abgefangen wird. Unstimulierte HUVEC-Sphäroide (1); nach Stimulation mit VEGF-A (2); nach Stimulation mit VEGF-A und gleichzeitiger Gabe von KDR (3); nach Gabe von KDR (4). Nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (5); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium und gleichzeitiger Gabe von KDR (6); nach Stimulation mit hcg-stimuliertem GC-konditioniertem Medium (7); nach Stimulation mit hcgstimuliertem GC-konditioniertem Medium und gleichzeitiger Gabe von KDR (8) (p<0,05) * * * * * * * Anzahl an Sprossen Abb : Darstellung der Auswirkung auf die Anzahl an Sprossen, wenn VEGF mit seinem Rezeptor VEGFR-2/KDR in dem GC-konditionierten Medium abgefangen wird. (1) bis (8) in dieser Abb. entsprechen den Abkürzungen in Abb (p<0,05)

45 Ergebnisse b Untersuchung des Sprossungsverhaltens nach Blockade von Angiopoietinen Da sowohl die CSL als auch die Anzahl an Sprossen nicht komplett bis auf den Ausgangswert zurückgingen, wurde der Einfluss weiterer Faktoren mit ebenfalls proangiogener Potenz untersucht. Neben der VEGF-Familie stellen die Angiopoietine bedeutende Vermittler angiogener Vorgänge dar. Yancopoulos et al., (1998) konnten mit Hilfe des Mouse Cornea Neovascularization Assay zeigen, dass Angiopoietine im Rahmen angiogener Prozesse die Effekte anderer angiogenetischer Zytokine zu potenzieren vermögen. Es wurde deshalb analysiert, ob Angiopoietine in messbarem Ausmaß an der Stimulation zur Ausbildung von Sprossen beteiligt sind. Um selektiv den Angiopoietin-vermittelten Anteil am Sprossen zu untersuchen, wurde zu hcg-stimuliertem GC-konditioniertem Medium der Rezeptor der Angiopoietine Tie-2 (1 µg/ml) gegeben. Daraufhin wurden HUVEC-Sphäroide stimuliert. CSL [µm] * * Abb a: Das Ausschalten des Effektes der Angiopoietine mit dem Rezeptor Tie-2 führt zu signifikant geringerem Sprouting (CSL). Unstimulierte HUVEC-Sphäroide (1); nach Inkubation mit Tie-2 (2); nach Stimulation mit hcg-inkubiertem GC-konditioniertem Medium (3; P-Probe); nach Stimulation mit hcg-inkubiertem GC-konditioniertem Medium und gleichzeitiger Gabe von Tie-2 (4) (p<0,05)

46 Ergebnisse 42 * * 7 6 Anzahl an Sprossen Abb b: Das Ausschalten des Effektes der Angiopoietine mit dem Rezeptor Tie-2 führt zu einer signifikant geringeren Anzahl an Sprossen. Unstimulierte HUVEC-Sphäroide (1); nach Inkubation mit Tie-2 (2);nach Stimulation mit GC- konditioniertem Medium (3; K-Probe); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium und gleichzeitiger Gabe von Tie-2 (4); nach Stimulation mit hcginkubiertem GC-konditioniertem Medium (5; P-Probe); nach Stimulation mit hcg-inkubiertem GC-konditioniertem Medium und gleichzeitiger Gabe von Tie-2 (6) (p<0,05) Wie in den Abbildungen a und b dargestellt, fällt nach Gabe von Tie-2 zur P-Probe (GC-konditioniertes Medium nach Stimulation der GC mit hcg) die im sphäroidalen Angiogenese-Assay sichtbare Sprossungsaktivität signifikant geringer als. Dahingegen fällt die Anzahl an Sprossen in der K-Probe nach Gabe von Tie-2 nicht geringer aus als ohne Tie-2, was bedeutet, dass Angiopoietine von unstimuliertem GC nicht in erheblichem Maße sezerniert werden. Die Stimulation der GC mit hcg führt jedoch zu einer signifikanten Zunahme der von GC freigesetzten Angiopoietine c Untersuchung des Sprossungsverhaltens nach Stimulation mit und Blockade von TIMP-1 Des Weiteren sollte die Bedeutung des Tissue Inhibitor of Matrix-Metalloproteinases (TIMP-1) untersucht werden. Von Pietrowski et al. (unveröffentlicht) konnte gezeigt werden, dass die Expression von m-rna des Faktors TIMP-1 in GC nach Stimulation mit hcg signifikant ansteigt. Von Hayakawa et al. (1991) wurde zuvor berichtet, dass TIMP-1 auf verschiedene Zelltypen einen wachstumsfördernden Einfluss hat.

47 Ergebnisse 43 Zunächst wurde der Effekt von TIMP-1 (3 nm) auf HUVEC-Sphäroide gemessen. Wie in Abb dargestellt, wird dessen proangiogene Potenz durch eine signifikante Steigerung der CSL sichtbar. Die Anzahl an Sprossen bleibt jedoch nach TIMP-1 Gabe unverändert (4.1-8). TIMP-1 führt dementsprechend zu einer Steigerung der Gesamtsprossenlänge, an der Initiierung neuer Sprossen ist der Faktor jedoch nicht beteiligt. * CSL [µm] Abb : unstimulierte HUVEC-Sphäroide (1); Stimulation mit TIMP-1 (2) (p<0,05) 45 Anzahl an Sprossen Abb : unstimulierte HUVEC-Sphäroide (1); Stimulation mit TIMP-1 (2) Daraufhin sollte geprüft werden, ob TIMP-1 einen der Faktoren darstellt, die in mit hcgstimuliertem GC-konditioniertem Medium das HUVEC-Sprouting stimulieren. Dazu wurde zu mit hcg-stimuliertem GC-konditioniertem Medium ein Antikörper gegen TIMP-1 (TIMP-1(Ab)) in einer Konzentration von 1 µg/ml gegeben, um im Medium befindliches TIMP-1 abzufangen. Es konnte keine signifikante Änderung der CSL ausgemacht werden (Abb ). Damit ist TIMP-1 keiner der Faktoren in GC-konditioniertem Medium, die zu einer signifikanten Beeinflussung der CSL in EC-Sphäroiden führen.

48 Ergebnisse * * 400 CSL [µm] Abb : Unstimulierte HUVEC- Sphäroide (1); nach Gabe von TIMP-1 (2); nach Gabe von TIMP-1 und gleichzeitiger Gabe von TIMP-1 Ab (3); nach Gabe von TIMP-1 Ab (4). Nach Gabe von hcgstimuliertem GC-konditioniertem Medium (5); nach Gabe von hcg-stimuliertem GCkonditioniertem Medium unter gleichzeitiger Gabe von TIMP-1 Ab (6) (p<0,05)

49 Ergebnisse Untersuchung des Einflusses von Granulosazell-konditioniertem Medium auf das Expressionsprofil von HUVEC Für ein solches Screening eignet sich die Methode der RT-PCR besonders gut. Dabei muss in Kauf genommen werden, dass kleinere Unterschiede durch die geringe Sensitivität der Methode nicht wahrgenommen werden können Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF): VEGF-A: Dieser Wachstumsfaktor stellt einen der wichtigsten Regulatoren der Angiogenese dar. Versuche mit Mäusen haben gezeigt, dass sowohl hetero- als auch homozygote Nullmutanten unter einer beeinträchtigten Angiogenese leiden und schon während der Embryonalzeit versterben (Breier et al., 1992). Auch im humanem CL konnte eine starke VEGF-A Expression nachgewiesen werden (Gordon et al., 1996). 270 bp 1 K P Abb : Expression des Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) in unstimulierten HUVEC (1), in HUVEC nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K) und in HUVEC nach Stimulation mit GC- konditioniertem Medium, nach vorheriger Stimulation der GC mit hcg (P). Abb und Abb stellen das Ergebnis der RT-PCR für VEGF-A dar. Es wird deutlich, dass die Inkubation von HUVEC mit GC-konditioniertem Medium (K) zu einer Steigerung der VEGF-A Expression führt. Die densitometrische Auswertung ergab einen hochsignifikanten Expressionsunterschied zwischen unstimulierten und stimulierten HUVEC (p<0,01) (n=6). Die vorherige Inkubation der GC mit hcg (10 IU/ml) (P) hatte keine zusätzliche signifikante Expressionsänderung zur Folge. Um dieses Resultat zu verifizieren, wurde die TaqMan-PCR eingesetzt. Mit Hilfe dieser Real Time-PCR konnte das Ergebnis der RT-PCR bestätigen werden (p<0,05) (n=4) (Abb ).

50 Ergebnisse 46 TaqMan 2,5 2 * * MEAN 1,5 1 0,5 0 HUVEC K P Abb : Real Time PCR /TaqMan: VEGF-A Expression in HUVEC; nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium nach vorheriger Stimulation der GC mit hcg (P) (p<0,05) Auch in der TaqMan-PCR konnte kein signifikanter Unterschied zwischen VEGF-Expression nach Stimulation der HUVEC mit GC-konditioniertem Medium mit bzw. ohne vorherige hcg-inkubation (10 IU/ml) der GC nachgewiesen werden (Abb ) VEGF-B und VEGF-D: Ebenso wie VEGF-A spielt auch VEGF-B während angiogener Vorgänge eine Rolle. Mäuse mit homozygoter Nullmutation bilden kleinere Herzen aus und leiden unter Abnormalitäten der Koronargefäße. VEGF-D wirkt als Wachstumsfaktor während angiogener Prozesse, Lymphangiogenese und Endothelzellwachstum, indem die Proliferation und Migration der Zellen stimuliert wird. Des Weiteren wird die Permeabilität von Blutgefäßen beeinflusst. VEGF-D entspricht sowohl strukturell als auch funktionell dem VEGF-C (Achen, 1998). 1 K P 1 K P 1 K P 407 bp ca. 300 bp 207 bp VEGF-A VEGF-B VEGF-D Abb : Expression des VEGF-A, VEGF-B und VEGF-D in HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

51 Ergebnisse 47 Während für VEGF-A ein signifikanter Expressionszuwachs nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium +/- hcg (10 IU/ml) nachweisbar war, veränderte sich das densitometrisch ausgewertete Signal nach Stimulation weder für VEGF-B noch für VEGF-D signifikant (Abb ; Abb ) (p<0,05; n=3). Für VEGF-B stellte sich anstatt des 487 bp langen erwarteten Fragmentes ein ca. 300 bp langes Fragment dar. Vermutlich handelt es sich dabei um ein Spliceprodukt einer zunächst länger transkribierten mrna. VEGF-C konnte in dieser Arbeit in HUVEC nicht nachgewiesen werden. 3,5 3 * * Arbitrary Units 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 K P 1 K P 1 K P VEGF-A VEGF-B VEGF-D Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für VEGF-A, VEGF-B und VEGF-D. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) sflt1 (VEGFR-1): Dieser lösliche VEGF-Rezeptor spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von angiogenen Vorgängen. An diesen Rezeptor binden VEGF-A und -B, sowie PGF (Robinson and Stringer, 2001). Das in dieser Arbeit densitometrisch ausgewertete Signal änderte sich durch Stimulation mit GC-konditioniertem Medium nicht signifikant (Abb ; Abb.4.2-7) (p>0,05; n=3). 722 bp 1 K P Abb : Expression von VEGF-Rezeptor-1 (sflt-1) durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

52 Ergebnisse KDR (VEGFR-2) und FLT1-R: Der auch als Flk-1 bezeichnete VEGF-Rezeptor KDR ist sowohl für die Ausbildung gesunder und funktionstüchtiger hämatopoetischer Zellen als auch von Endothelzellen notwendig. VEGFR-2 dient als Ligand für VEGF-A, -C und -D (Robinson and Stringer, 2001). Die Signalstärke sowohl der KDR- als auch der FLT1-R-Banden änderte sich durch Stimulation nicht signifikant (Abb ; Abb ). 730 bp 1325 bp 1 K P 1 K P KDR FLT1-R Abb : Expression von VEGF-Rezeptor-2 und FLT1-R durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 3 2,5 Arbitrary Units 2 1,5 1 0,5 0 1 K P 1 K P 1 K P sflt FLT-1R KDR Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für sflt, FLT-1R und KDR. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Platelet Derived Growth Factor A und B (PDGF-A und -B), Placental Growth Factor (PGF): Sowohl PDGF-A und -B als auch PGF haben Wachstumsfaktoraktivität. Während PDGF-A und -B für den Prozess der Organisation des Aktinzytoskelettes wichtig sind und ein homozygoter Mangel tödlich ist, führt der homozygote Mangel an PGF lediglich zu

53 Ergebnisse 49 geringradigen Störungen, die auf die verminderte Angiogenese zurückzuführen sind. Es ist ist bekannt, dass PDGFs die Migration, Differenzierung, und Funktion einer Reihe von spezialisierten mesenchymalen Zellen beeinflussen (Hoch et al., 2003). Durch Stimulation mit GC-konditioniertem Medium änderte sich die Expression keines der Gene signifikant (Abb ; Abb ) (p>0,05; n>3). 1 K P 1 K P 1 K P 732 bp 693 bp 553 bp PDGF-A PDGF-B PGF Abb : Expression von PDGF-A und -B und PGF in HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 3 2,5 Arbitrary Units 2 1,5 1 0,5 0 1 K P 1 K P 1 K P PDGF-A PDGF-B PGF Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für PDGF-A, PDGF-B und PGF. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Angiopoietine-1 und -2 und deren Rezeptor Tie-2/TEK und Tie-1 Angiopoietin-1 stellt einen wichtigen Faktor dar, was die Gefäßausreifung und -stabilisierung angeht, Angiopoietin-2 fördert den aktiven Angiogenese-Prozess bei Vorhandensein von ausreichend VEGF (Takayuni, Yancopoulos et al., 1998). Die Angiopoietine binden an den Tyrosin-Kinase-Rezeptor Tie-2/TEK (Davis et al., 1997; Maisonpierre et al., 1997). Bislang konnte für Tie-1 noch kein Ligand identifiziert werden. Weder für die Angiopoietine noch für die Rezeptoren Tie-1 und Tie-2 konnte eine Expressionsänderung nach Stimulation mit

54 Ergebnisse 50 GC-konditioniertem Medium beobachtet werden (Abb und ; Abb ) (p>0,05; n=3). Allerdings stellte sich für Tie-1 unerwarteter Weise eine Doppelbande dar. Wie in Kapitel 4.3 dargestellt, wurde daraufhin untersucht, ob es sich hierbei um eine Splicevariante handelte bp 1 K P 1 K P 636 bp Ang-1 Ang-2 Abb : Expression von Ang-1 und -2 durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Angiopoietin-3 und -4 konnten in dieser Arbeit in HUVEC nicht nachgewiesen werden. 459 bp 347 bp 1 K P 1 K P Tie-1 Tie-2 Abb : Expression vontie-1 und Tie-2 durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

55 Ergebnisse Arbitrary Units K P 1 K P 1 K P 1 K P Ang-1 Ang-2 Tie-1 Tie-2 Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für Ang-1, Ang-2 sowie Tie-1 und Tie-2. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Fibroblast Growth Factor (FGF): Die Proteine der FGF-Familie dienen der Wachstums- und Differenzierungskontrolle von mesenchymalen, epithelialen sowie neurektodermalen Zellarten FGF-b konnte nur sehr unregelmäßig nachgewiesen werden. Die Stimulation von EC mit GCkonditioniertem Medium führte letztlich zu keiner signifikanten Änderung des Expressionsprofils (Abb und Abb ) (p>0,05; n=3). FGF-a konnte in dieser Arbeit nicht detektiert werden. 995 bp 1 K P Abb : Expression von FGF-b in HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

56 Ergebnisse 52 Arbitrary Units 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 K P Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für FGF-b, unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Tissue Inhibitor of Matrix-Metalloproteinases 1 (TIMP-1): TIMP-1 gehört zu der TIMP-Familie, die natürliche Inhibitoren der Matrix- Metalloproteinasen (MMPs) darstellen. TIMP-1 bildet einen Komplex mit verschiedenen MMPs, wie z. B. Kollagenasen und inaktiviert diese irreversibel. Das in dieser Arbeit densitometrisch ausgewertete Signal zeigte mit und ohne Stimulation durch GC-konditioniertes Medium keinen signifikanten Expressionsunterschied (Abb und Abb ) (p>0,05; n=3). 427 bp 1 K P Abb : Expression von TIMP-1 durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 1,2 1 Arbitrary Units 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 K P Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für TIMP-1; Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

57 Ergebnisse Hypoxia-inducible Factor (HIF) und Endothelial PAS Domain Protein (EPAS): HIF-1 reguliert die physiologische Zellantwort auf Hypoxie. Bislang wurden mehrere HIF-1 regulierte Gene identifiziert, wobei diese u. a. die Bereiche Angiogenese, Erythropoese und Zellproliferation betreffen. Die Expression von HIF-3α wird durch hypoxische Zustände besonders rasch erhöht (Heidbreder et al., 2003). EPAS wird auch als Hif like protein bezeichnet. Die Genexpression von HIF-1α, HIF-3α und EPAS konnte durch Stimulation mit GC-konditioniertem Medium nicht signifikant verändert werden (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3) 270 bp 343 bp (HIF-1α /3a) 336 bp (EPAS) 1 K P 1 K P 1 K P HIF-1α HIF-3α EPAS Abb : Expression von HIF-1α, HIF-3α und EPAS durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 3 2,5 Arbitrary Units 2 1,5 1 0,5 0 1 K P 1 K P 1 K P HIF-1α HIF-3α EPAS Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für HIF-1α, HIF-3α und EPAS. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

58 Ergebnisse Interleukin-6 (IL-6): Dieses multifunktionelle Zytokin wird von einer Vielzahl von Zellen, wie z. B. Makrophagen, aktivierten T-Zellen, Fibroblasten, Epithelzellen und Endothelzellen sezerniert (Kishimoto et al. 1995, Akira et al. 1990). Die Beobachtungen von Motro et al. (1990), dass IL-6 mrna während der Ausbildung des Gefäßsystems bei Follikulogenese und der Bildung der maternalen Dezidua während des Implantationsvorganges gebildet wird, wie auch der Expressionsnachweis von IL-6 in Endothelzellen während des Vaskularisations-Prozesses, deuten auf eine Rolle von IL-6 bei angiogenen Vorgängen hin. IL-6 stellte sich in der RT-PCR nur unregelmäßig und keinem Muster folgend dar. Insgesamt führte die densitometrische Auswertung zu keiner signifikanten Signaländerung nach Stimulation (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3). 628 bp 1 K P Abb : Expression von Interleukin-6 in HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Interleukin-6-Rezeptor (IL6-R): Dieser in der Zellmembran sitzende Rezeptor vermittelt nach Bindung seines Liganden die Signaltransduktion. Ebenso wie IL-6, stellte sich auch IL6-R nur unregelmäßig dar. Auch hier konnte insgesamt densitometrisch keine veränderte Genexpression nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium nachgewiesen werden (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3). 240 bp 1 K P Abb : Expression von Interleukin 6-Rezeptor durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

59 Ergebnisse gp-130: gp-130 stellt eine Untereinheit des IL-6 Rezeptors dar. Die Bindung von IL-6 an seinen Rezeptor (IL-6 R) hat die nachfolgende Tyrosinphosphorylierung des Rezeptors selbst sowie seiner assoziierten Untereinheit (gp-130) zur Folge, was wiederum zur Aktivierung von Proteinen der Janus-Kinase-Familie führt (Ihle und Kerr, 1995). Vergleichbar der mit IL6-R, stellte sich auch bei gp-130 die Intensität der sichtbaren Banden in verschiedenen Versuchen nach unterschiedlichen Mustern dar. Die Stimulation mit GC-konditioniertem Medium führte insgesamt zu keiner signifikanten Änderung der gp-130 Expression (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3) bp 1 K P Abb : Expression der gp-130 Untereinheit durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Oncostatin M Rezeptor (OSM-R): OSM ist ein Mitglied der IL-6 Familie. Die Rezeptoren der IL-6 Familie benutzen häufig gp- 130 als Rezeptor-Untereinheit. Die Stimulation mit GC-konditioniertem Medium führte in der vorliegenden Arbeit zu keiner signifikanten Änderung der OSM-R Expression (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3). 384 bp 1 K P Abb : Expression des Oncostatin M Rezeptor durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Die Expression von OSM in HUVEC konnte in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden.

60 Ergebnisse Leukemia inhibitory factor receptor (LIF-R) Das Zytokin LIF reguliert Wachstum und Differenzierung von embryonalen Stammzellen, primordialen Keimzellen, peripheren Neuronen und Endothelzellen. Das in dieser Arbeit densitometrisch ausgewertete Signal seines Rezeptors LIF-R zeigte mit und ohne Stimulation durch GC-konditioniertem Medium keinen signifikanten Expressionsunterschied (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3). 680 bp 1 K P Abb : Expression von Leukemia inhibitory factor receptor durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 3 2,5 Arbitrary Units 2 1,5 1 0,5 0 1 K P 1 K P 1 K P 1 K P 1 K P IL-6 IL6-R gp-130 OSM-R LIF-R Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für IL-6, IL6-R, gp-130, OSM-R und LIF-R. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Die Expression von LIF in HUVEC konnte in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden.

61 Ergebnisse Connective Tissue Growth Factor (CTGF): Dieses Zytokin, das auch von GC sezerniert wird, vermittelt Mitose, Angiogenese, zelluläre Chemotaxis und Remodeling der exrazellulären Matrix epithelialer Zelltypen (Harlow et al., 2002). Die densitometrische Auswertung ergab keinen signifikanten Unterschied nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3). 544 bp 1 K P Abb : Expression von Connective Tissue Growth Factor durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 2,5 2 Arbitrary Units 1,5 1 0,5 0 1 K P Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für CTGF. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Ephrin B2 (EFNB-2): Dieser transmembranär gelegene Ligand der Eph B Rezeptor Tyrosinkinasen wird insbesondere in Gefäßen exprimiert. Die Ephrine und Eph-Moleküle spielen bei der Steuerung der Ausdifferenzierung von neuen Gefäßen zu Arterien, Venen und Kapillaren eine wichtige Rolle. Mäuse mit Mutationen im Ephrin B2 / Eph System weisen schwere Störungen der Angiogenese auf (Gerety und Anderson, 2002).

62 Ergebnisse 58 Die Stimulation mit GC-konditioniertem Medium führte in dieser Arbeit zu keinen signifikanten Expressionsunterschied (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3). 546 bp 1 K P Abb : Expression von Ephrin B2 durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Arbitrary Units 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 K P Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für Ephrin B2. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Neurofibromin (NF-1), transformation related protein 53 (p53), Adenomatosis polyposis coli (APC), von Hippel-Lindau Syndrom (VHL), Retinoblastoma 1 (RB-1), Schwannomin (NF-2): Defekte dieser Gene führen zur Ausbildung verschiedener Tumore, was regelmäßig mit ausgeprägten Angiogeneseprozessen verbunden ist. In der vorliegenden Arbeit konnte für keines der Gene eine Änderung der Expression durch Stimulation mit GC-konditioniertem Medium beobachtet werden (Abb und ; Abb ) (p>0,05; n=3).

63 Ergebnisse 59 1 K P 1 K P 1 K P 641 bp p bp APC 352 bp NF-1 NF-1 p53 APC Abb : Expression von NF-1, p53 und APC durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 1 K P 1 K P 1 K P 842 bp NF bp VHL 455 bp RB-1 VHL RB-1 NF-2 Abb : Expression von VHL, RB-1 und NF-2 durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 5 4 Arbitrary Units K P 1 K P 1 K P 1 K P 1 K P 1 K P -1 NF-1 p53 APC VHL RB-1 NF-2 Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für NF-1, p53 und APC. VHL, RB-1 und NF-2. APC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GCkonditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

64 Ergebnisse Interleukin-11-Rezeptor (IL11-R): Wie auch der IL6-R ist der IL11-R Bestandteil der Plasmamembran und dient der Signaltransduktion. Interleukin-8 (IL-8) wird nach Induktion durch Interleukin-1 (IL-1) oder Tumor Nekrose Faktor (TNF) von Monozyten als chemotaktischer Faktor für neutrophile Granulozyten gebildet. Weder für IL11-R noch für IL-8 konnte densitometrisch ein Expressionsunterschied nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium gemessen werden (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3) 722 bp IL11-R 705 bp IL-8 1 K P 1 K P IL11-R IL-8 Abb : Expression von Interleukin-11-Rezeptor und Interleukin-8 durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) 4 3,5 Arbitrary Units 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 K P 1 K P IL11-R IL-8 Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für IL11-R und IL-8. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Die Expression von IL-11 in HUVEC konnte in dieser Arbeit nicht nachgewiesen werden.

65 Ergebnisse Bcl2-associated X protein (BAX) und Bcl2-like 1(BCLX): Hierbei handelt es sich um gegensinnige Regulatoren der Apoptose. Während BAX proapoptotische Auswirkungen auf die Zelle hat, wirkt BCLX durch Proteinbindung meist antiapoptotisch. Eine veränderte Genexpression nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nachgewiesen werden. (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3). 310 bp 1 K P 1 K P 708 bp BAX BCLX Abb : Expression von BAX und BCLX durch HUVEC. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P) Arbitrary Units 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 K P 1 K P BAX BCLX Abb : Dargestellt sind Arbitrary Units nach Auswertung der densitometrisch gemessenen Werte für BAX, und BCLX. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P)

66 Ergebnisse Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAP-DH): Das GAP-DH Gen gehört zu den sogenannten Housekeeping-Genen. GAP-DH dient dem Glukosemetabolismus und der Glykolyse und ist damit für die Zelle lebensnotwendig (Abb ; Abb ) (p>0,05; n=3). 1 K1 P1 2 K2 P2 188 bp GAP-DH GAP-DH Abb : Expression von Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase durch HUVEC. Dargestellt ist die Expression mit je zwei verschiedenen Templates. Die Stimulation mit GC-konditioniertem Medium führte zu keiner signifikanten Änderung der Expression von GAP-DH. Unstimulierte HUVEC (1 und 2); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (K1 und K2); nach Stimulation mit GC- konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (P1 und P2) Densitometrische Auswertung Abb Dargestellt ist der Mittelwert + SEM der densitometrisch gemessenen Werte für GAP-DH. Unstimulierte HUVEC (1); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium (2); nach Stimulation mit GC-konditioniertem Medium von GC, die mit hcg stimuliert wurden (3)

67 Ergebnisse 63 Die Ergebnisse dieses Abschnittes sind in nachfolgender Tabelle 4-1 dargestellt. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass wesentliche Gene aus dem Bereich der Angiogenese in HUVEC auf RNA-Ebene exprimiert werden. Des Weiteren war es möglich nachzuweisen, dass die Expression von VEGF-A durch Stimulation mit GC-konditioniertem Medium signifikant zunimmt. K im Verhältnis zur Kontrolle P im Verhältnis zur Kontrolle n p VEGF-A x 1,64 x 1,74 5 < 0,05 VEGF-B x 2,03 x 2,91 3 > 0,05 VEGF-D x 0,73 x 0,53 3 > 0,05 sflt1 x 1,30 x 1,77 4 > 0,05 KDR x 0,61 x 0,72 3 > 0,05 FLT1-R x 0,82 x 0,90 3 > 0,05 PDGF-A x 1,20 x 1,70 3 > 0,05 PDGF-B x 1,39 x 1,43 4 > 0,05 PGF x 1,16 x 1,32 4 > 0,05 HIF-1α x 0,90 x 1,03 3 > 0,05 HIF-3α x 0,53 x 1,30 3 > 0,05 EPAS x 1,15 x 0,56 3 > 0,05 BAX x 1,30 x 2,15 3 > 0,05 BCLX x 1,02 x 1,44 3 > 0,05 IL-6 x 1,07 x 1,74 3 > 0,05 IL6-R x 0,88 x 1,10 3 > 0,05 gp-130 x 1,50 x 1,27 4 > 0,05 OSM-R x 1,00 x 0,60 3 > 0,05 LIF-R x 1,21 x 1,01 3 > 0,05 IL11-R x 0,62 x 0,84 3 > 0,05 IL-8 x 0,87 x 0,88 3 > 0,05 CTGF x 0,85 x 1,06 3 > 0,05 TIMP-1 x 0,88 x 0,92 4 > 0,05 EFNB-2 x 0,78 x 0,54 3 > 0,05 FGF-b x 0,45 x 0,50 3 > 0,05 NF-1 x 1,27 x 1,17 4 > 0,05 NF-2 x 0,90 x 0,56 3 > 0,05 p 53 x 1,36 x 3,80 4 > 0,05 APC x 0,94 x 1,09 3 > 0,05 VHL x 0,98 x 0,70 4 > 0,05

68 Ergebnisse 64 RB-1 x 1,71 x 1,46 4 > 0,05 Ang-1 x 0,90 x 1,01 3 > 0,05 Ang-2 x 1,01 x 0,99 3 > 0,05 Tie-1 x 0,92 x 1,00 3 > 0,05 Tie-2 x 0,87 x 1,03 3 > 0,05 Tabelle 1: Dargestellt ist die relative Änderung (Arbitrary Unit) der densitometrisch ausgewerteten Signale zwischen unstimulierten HUVEC und mit GC-konditioniertem Medium (ohne hcg (K) sowie mit hcg (P)) stimulierten HUVEC. Dabei wurden jeweils die Mittelwerte miteinander verglichen.

69 Ergebnisse Untersuchung eines Tie-1 Fragmentes Im Rahmen der Erstellung eines Expressionsprofils für HUVEC fiel auf, dass sich nach RT- PCR eine Doppelbande für Tie-1 darstellte: Das erwartete Tie-1 Fragment (348 Basenpaare) sowie ein kürzeres Fragment (221 Basenpaare) (Abb. 4-25). Abb. 4-25: Expression von Tie-1 in HUVEC dargestellt mit acht verschiedenen Templates. Bei allen Templates ist eine Doppelbande zu beobachten. Für den Tie-1 Rezeptor, der morphologisch dem Tie-2 Rezeptor stark ähnelt, konnte bislang noch kein passender Ligand identifiziert werden. Auf Grund der Tatsache, dass sich das unerwartete Fragment sowohl in ähnlicher Intensität wie das zu erwartende, als auch als Fragment mit der geringeren Basenpaaranzahl abbildete, wurde untersucht, ob dies auf differentielles Spleißen hinweisen könnte. Das kleinere Tie-1 Fragment wurde daraufhin über T-Overhang kloniert und sequenziert Teilsequenz Im folgenden ist die Teilsequenz dargestellt, die von den Primern amplifiziert werden sollte: Es wird ersichtlich, dass Primer 2 an zweierlei Stellen binden kann 721 TTGTGGGGCT GGGCGCTGGG GGCCAGGCTG TACCAAGGAG TGCCCAGGTT GCCTACATGG 781 AGGTGTCTGC CACGACCATG ACGGCGAATG TGTATGCCCC CCTGGCTTCA CTGGCACCCG ACGACCATG ACGGCGAATG TGTATGCCCC CCTGGCTTCA CTGGCACCCG 841 CTGTGAACAG GCCTGCAGAG AGGGCCGTTT TGGGCAGAGC TGCCAGGAGC AGTGCCCAGG CTGTGAACAG GCCTGCAGAG AGGGCCGTT TTGGGCAGAGC TGCCAGGAGC AGTGCCCAGG 901 CATATCAGGC TGCCGGGGCC TCACCTTCTG CCTCCCAGAC CCCTATGGCT GCTCTTGTGG CATATCAGC TGCCGGGGCAC TCACTTTCTG CCTCCCAGAC CCTTATGGCT GCTCTTTGTGG 961 ATCTGGCTGG AGAGGAAGCC AGTGCCAAGA AGCTTGTGCC CCTGGTCATT TTGGGGCTGA ATCTGGCTGG AGAGGAAGCC AGTGCCAAGA AGACCTGGATCCCCCAGATCC 1021 TTGCCGACTC CAGTGCCAGT GTCAGAATGG TGGCACTTGT GACCGGTTCA GTGGTTGTGT

70 Ergebnisse CTGCCCCTCT GGGTGGCATG GAGTGCACTG TGAGAAGTCA GACCGGATCC CCCAGATCCT 1141 CAACATGGCC TCAGAACTGG AGTTCAACTT AGAGACGATG CCCCGGATCA ACTGTGCAGC Wie oben zu sehen, war Ergebnis dieser Untersuchung, dass der Primer 2 in einem Bereich im Tie-1 Gen binden kann, der vor der eigentlich geplanten Bindungsstelle liegt. Somit handelt es sich bei dem kleinen Fragment um ein PCR-Artefakt Das klonierte kürzere Fragment GATACGCAGCTNGTACGACTCGGATTATAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCC CTATGCGTCGANCATGCTGAGCCTAATATCATTGCCGGCGGTCACACGACCTTAAGCGGG TTGGATCTGGGGGATCCAGGTCTTCTTGTGCACTGGCTTCCTCTCCAGCCAGATCCACAA AACCTAGACCCCCTAGGTCCAGAAGAACACGTGACCGAAGGAGAGGTCGGTCTAGGTGTT AGAGCAGCCATAAGGGTCTGGGAGGCAGAAAGTGAGTGCCCCGGCAGCTGATATGCCTGG TCTCGTCGGTATTCCCAGACCCTCCGTCTTTCACTCACGGGGCCGTCGACTATACGGACC GCACTGCTCCTGGCAGCTCTGCCCAAAACGGCCTCTCTGCAGGCCTGTTCACAGCGGGTG CGTGACGAGGACCGTCGAGACGGGTTTTGCCGGAGAGACGTCCGGACAAGTGTCGCCCAC CCAGTGAAGCCAGGGGGGCATACACATTCGCCGTCATGGTCGTAAGGGCGAATTCTGCAG GGTCACTTCGGTCCCCCCGTATGTGTAAGCGGCAGTACCAGCATTCCCGCTTAAGACGTC ATATNCATCACACTGGCGGCGCTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCAATTCGCCCTATAGT TATANGTAGTGTGACCGCCGCGAGCTCGTACGTAGATCTCCCGGGTTAAGCGGGATATCA GAGTCGTATT 370 CTCAGCATAA

71 Ergebnisse Granulosazell-Sphäroide Wie Antczak und Van Blerkom zeigen konnten, weisen Granulosazellen eine Reihe von Endothelzell-spezifischen Markern auf. Sie exprimieren z. B. Tie-1, den Angiopoietinrezeptor Tie-2, VEGFR-2/KDR und können niedrig acetyliertes LDL (AcLDL) schnell internalisieren. Zudem konnte gezeigt werden, dass Granulosazellen in der Lage sind, im Monolayer Gefäß-ähnliche Strukturen auszubilden (Antczak und Van Blerkom, 2000). Diese Eigenschaften deuten daraufhin, dass GC nicht wie bisher angenommen epithelialem, sondern endothelialem Ursprung sind, und als spezialisierte Endothelzell-ähnliche Zellpopulation betrachtet werden können. Aufgrund dieser Informationen sollte geprüft werden, ob auch Granulosazellen in der Lage sind, einen sphäroidalen Zellverbund auszubilden und auf Stimulation hin, evtl. mit morphologischen Veränderungen dieses Verbundes, reagieren können. Die Herstellung der GC-Sphäroide fand entsprechend dem Protokoll für EC-Sphäroide statt. Wie in Bild dargestellt, konnte erstmalig gezeigt werden, dass GC zur Ausbildung von Sphäroiden befähigt sind. Bild 4.4-1: unstimulierter GC-Sphäroid in der 96-well Platte nach 24-stündiger Kultivierung direkt vor Einbettung ins Kollagengel

72 Ergebnisse 68 Nach Einbettung ins Kollagengel wurde ein essentieller Unterschied zwischen Endothelzell- Sphäroiden und Granulosazell-Sphäroiden ersichtlich: Während HUVEC-Sphäroide ohne Stimulation kaum Aussprossungen aufwiesen, fielen die GC-Sphäroide durch eine enorme Anzahl an Sprossen schon ohne Stimulation auf (Bild 4.4-2). Bild 4.4-2: unstimulierter GC-Sphäroid im Kollagengel nach 24-stündiger Kultivierung In der Vergangenheit wurden verschiedene GC-Assays als Modellsystem für das Corpus luteum herangezogen. Da das CL in vivo unterschiedlich auf die Gonadotropine LH und hcg reagiert, wurde im nächsten Schritt dieser Arbeit der Frage nachgegangen, ob GC-Sphäroide in der Lage sind, auf Änderungen im umgebenden Medium zu reagieren Stimulation der GC-Sphäroide mit LH bzw. hcg Im Folgenden sollte deshalb der Einfluss von LH und hcg auf Granulosazellen im sphäroidalen Assay getestet werden. Zunächst wurde eine Dose-Response-Kurve für hcg angefertigt. Hierfür wurden die Sphäroide entweder mit 35 miu/ml LH oder mit 5 bzw. 10 IU/ml hcg stimuliert. Die Inkubation der GC-Sphäroide mit hcg führte zu einer kontinuierlichen Abnahme der CSL, die unstimuliert im Mittel bei 731,46 µm und nach Applikation von 5 IU/ml hcg bei 558,93 µm lag. Die Applikation von 10 IU/ml hcg senkte die CSL signifikant weiter auf 258,82 µm (Abb ; Bild 4.4-3) (p<0,05; n=30 Sphäroide aus 3 Ansätzen).

73 Ergebnisse 69 CSL [µm] * Abb : Die Zugabe von humanem Choriongonadotropin (hcg) führte zu einer Minderung der CSL, die bei Gabe von 10 IU/ml signifikant war. Unstimulierte GC-Sphäroide (1); mit 5 IU/ml hcg stimulierte GC-Sphäroide (2); mit 10 IU/ml hcg stimulierte GC-Sphäroide (3) (p<0,05)

74 Ergebnisse 70 Bild 4-3 a Bild 4-3 b Bild 4-3 c Bild 4.4-3: Dose-Response-Versuch. GC-Sphäroide im Kollagengel 24 Stunden nach Einbettung. Unstimulierte GC-Sphäroide (4-3 a); mit 5 IU/ml hcg stimulierte GC-Sphäroide (4-3 b); mit 10 IU/ml hcg stimulierte GC-Sphäroide (4-3 c)

75 Ergebnisse 71 Die Stimulation der GC-Sphäroide mit LH führte ebenfalls zu einer signifikanten Abnahme der CSL (Abb ) (p<0,05; n=30 aus 3 Ansätzen). Dies bedeutet, dass die Hormone LH und hcg in GC-Sphäroiden zu einer gleichsinnigen Signalweiterleitung mit der Folge eines Rückganges der CSL führen. * CSL[µm] Abb : Die Zugabe von luteinisierendem Hormon (LH) führte zu einer signifikanten Minderung der CSL. Unstimulierte GC-Sphäroide (1); mit LH stimulierte GC-Sphäroide (2) (p<0,05) Stimulation der GC-Sphäroide mit follikelstimulierendem Hormon : Eine Stimulation der GC-Sphäroiden mit dem follikelstimulierenden Hormon (FSH) veränderte das Sprouting nicht signifikant (Abb ). CSL [µm] Abb : Unstimulierte GC-Sphäroide (1); mit 1 IU/ml FSH stimulierte GC-Sphäroide (2); mit 5 IU/ml FSH stimulierte GC-Sphäroide (3)

76 Ergebnisse Stimulation der GC-Sphäroide mit EC-konditioniertem Medium: Ausgehend von der Tatsache, dass im wachsenden CL eine wechselseitige Beeinflussung zwischen GC und EC stattfindet, wurde auch der Einfluss von EC-konditioniertem Medium auf GC-Sphäroide überprüft. Es konnte keine signifikante Einflussnahme auf das Sprossungsverhaltens der GC-Sphäroide festgestellt werden. Auch die vorherige Stimulation der EC mit dem im CL gebildeten Schwangerschaftshormon Progesteron führte zu keiner signifikanten Änderung des Sprossungsverhaltens (Abb ). Dieses Ergebnis legt nahe, dass EC weder unstimuliert noch durch Progesteron stimuliert parakrin auf das Aussprossen der GC-Sphäroide einzuwirken vermögen CSL [µm] Abb : Unstimulierte GC-Sphäroide (1); Nach Stimulation mit EC-konditioniertem Medium (2); nach Stimulation mit Progesteron-stimuliertem EC-konditioniertem Medium (3)

77 Ergebnisse hgl-5 Sphäroide Die Möglichkeit der Verwendung einer immortalisierten GC-Zelllinie sollte mittels der hgl- 5 Zelllinie getestet werden. Diese Zellen bildeten ebenfalls Sphäroide aus, allerdings mit sehr niedrigem Baselinesprouting (Bild 4.4-4). Damit wurde es unmöglich, etwaige das Sprossungsverhalten einschränkende Effekte z.b. durch hcg zu beobachten. Die Verwendung dieser Zelllinie wurde daher nicht weiter verfolgt. Bild 4.5-1: unstimulierter hgl-5-sphäroid 24 Stunden nach Einbettung ins Kollagengel

78 Ergebnisse EC-GC-Kokultur-Sphäroide In vivo besteht das Corpus luteum zu 95 % aus Endothelzellen und Granulosazellen (Davis et al., 2003), die sich in engem räumlichen Kontakt und regem Austausch zueinander befinden. Gängige bestehende Corpus luteum Modellsysteme können diesem Aufbau nur unzureichend gerecht werden, da es sich in der Regel um Modelle handelt, die entweder nur aus GC bestehen, oder um Modelle, die zwar aus EC und GC zusammengesetzt sind, die beiden Zellarten hierbei jedoch nicht miteinander in einem gemeinsamen Zellverbund kommunizieren. Aus diesem Grund schien es sinnvoll, die von uns eingeführten GC-Sphäroide weiter zu einem zwei-zell CL-Modell zu entwickeln, und zu untersuchen, ob sich EC und GC zu einen gemeinsamen sphäroidalen Zellverbund zusammenfügen würden. Das sphäroidale Angiogenese-Assay wurde dahingehend modifiziert, dass anstelle von 400 Zellen einer Zellart jeweils 200 Zellen der zwei verschiedenen Zellarten eingesetzt wurden. Die Bilder und zeigen während unserer Experimente entstandene EC-GC- Kokultursphäroide. Es konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass HUVEC und GC in der Lage sind, spontan einen EC-GC-Kosphäroid auszubilden. Bild 4.6-1: Unstimulierter EC-GC-Kosphäroid in der 96-well Platte nach 24-stündiger Kultivierung direkt vor Einbettung ins Kollagengel

79 Ergebnisse 75 Bild 4.6-2: unstimulierter EC-GC-Kosphäroid im Kollagengel nach 24-stündiger Kultivierung Im Vergleich der EC-GC-Kosphäroiden mit den GC-Sphäroiden fiel die CSL der unstimulierten Kosphäroide weniger hoch aus. Morphologisch wurden jedoch die meisten Aussprossungen eindeutig den Granulosazellen zugeordnet. Auch im GC-Sphäroid erschienen die Sprossen sehr dünn und zerbrechlich, wohingegen die der EC-Sphäroide ein wesentlich kräftigeres Erscheinungsbild hatten. Diese morphologische Beobachtung konnte mittels Zellfärbungen der GC durch den roten Fluoreszenzfarbstoff PKH 26 und der EC durch den grünen Fluoreszenzfarbstoff PKH 67 bestätigt werden (s. u.) (Abb ) Stimulation der EC-GC-Kosphäroide mit GC-konditioniertem Medium sowie hcg Die Kosphäroide wurden im Kollagengel zunächst mit GC-konditioniertem Medium (mit und ohne vorherige hcg-stimulation der GC) (Abb und 4.6-2) stimuliert. Anschließend wurde dieser Versuch leicht abgeändert, indem die EC-GC-Kosphäroide parallel direkt mit hcg (10 IU/ml) stimuliert wurden (Abb und 4.6-5). Der Anstieg der Sprossungsaktivität der EC aus dem EC-GC-Kosphäroid auf hcg-stimuliertes GCkonditioniertes Medium (P-Probe) hin, führte sowohl zu einem signifikanten Anstieg der CSL, als auch der Anzahl an ausgebildeten Sprossen zwischen Basalwert und stimulierten Sphäroiden. Dies entspricht der oben beschriebenen Reaktion der EC-Sphäroide auf das GCkonditionierte Medium. EC reagieren folglich in direktem zellulären Kontakt mit GC