Extrarenale Regulation des Natriumhaushalts bei Ratten mit Mineralokortikoidexzess

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1 Aus der Medizinischen Klinik IV mit Poliklinik der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Kai-Uwe Eckardt Extrarenale Regulation des Natriumhaushalts bei Ratten mit Mineralokortikoidexzess Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Katharina Bauer aus Bayreuth

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3 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 Hintergrund und Ziele 1 Methoden 1 Ergebnisse 2 Praktische Schlussfolgerung 2 Abstract 3 Background 3 Methods 3 Results 4 Conclusion 4 1. Einleitung Klassisches Konzept des Natriumstoffwechsels Erkenntnisse über wasserfreie Na + -Akkumulation 8 2. Material und Methoden Tierexperimenteller Ansatz Bestimmung der Blutserumkonzentrationen von Na + und K Veraschung Bestimmung der Elektrolytkonzentrationen der Asche mittels 13 Atom-Absorptions-Spektrometrie 2.5. Datenanalyse Berechnungen Statistische Auswertung Ergebnisse Behandlung mit Deoxycorticosteron-Azetat (DOCA) führt zu 16 vermindertem Wachstum

4 3.2. DOCA-Behandlung führt zu Flüssigkeitsretention in 17 Gesamtkörper und Haut, aber nicht in der Skelettmuskulatur 3.3. DOCA-Behandlung führt zu Na + -Retention in den Geweben, 19 besonders in Kombination mit Hochsalzdiät 3.4. Beziehung zwischen Na + -, K + - und Wasserretention: Nachweis 21 wasserfreier Na + -Akkumulation 3.5. Nachweis der osmotisch inaktiven Na + -Speicherung in der Haut Nachweis des osmotisch neutralen Na + /K + -Austausches in der 26 Muskulatur 3.7. Elektrolyt- und Wassergehalt verschiedener Gewebe im 29 Vergleich zur Elektrolytkonzentration im Serum 3.8. Wasserfreie Na + -Retention ermöglicht Volumenhomöostase trotz 31 massiver Na + -Akkumulation bei DOCA-Hochsalz-behandelten Ratten 4. Diskussion Induktion wasserfreier Na + -Akkumulation im Organismus Wasserfreie Na + - Akkumulation durch osmotisch inaktive Na Speicherung 4.3. Wasserfreie Na + -Akkumulation durch osmotisch neutralen 36 Na + /K + -Austausch 4.4. Vermindertes Wachstum durch DOCA-Hochsalz-Behandlung Zusammenfassung und Ausblick 38 Literaturverzeichnis 39 Abkürzungsverzeichnis 43 Danksagung 45 Lebenslauf 46

5 1 Zusammenfassung Hintergrund und Ziele Natrium als wichtigstes extrazelluläres Kation des Körpers, sowie Kalium als wichtigstes intrazelluläres Kation, determinieren über ihre osmotische Aktivität den Volumenhaushalt des Organismus. Um ständige Flüssigkeitsverschiebungen zwischen intra- und extrazellulärem Raum zu vermeiden existieren spezielle Regulationsmechanismen im Körper, um die sog. Iso- Osmolalität zu erhalten. Es wird derzeit davon ausgegangen, dass eine hohe alimentäre Kochsalzbelastung zu einer Zunahme des extrazellulären Natriumgehaltes und dadurch zwangsläufig zu Volumenretention im Extrazellulärraum führt. Entgegen dieser Lehrmeinung zeigten human- wie auch tierexperimentelle Studien, dass eine positive Natriumbilanz auch ohne überschießende Wasserretention möglich ist. In früheren Tierstudien konnten wir bereits die Haut als ein Gewebe identifizieren, in dem osmotisch inaktive Natriumspeicherung möglich ist. Ziel dieser Arbeit war es, herauszufinden, ob es unter einem weiteren Natriumexzess durch Behandlung mit Deoxycorticosteron-Azetat (DOCA) weitere Gewebe gibt, in denen wasserfreie Natriumspeicherung stattfinden kann und ob es dafür weitere Mechanismen gibt, außer osmotisch inaktiver Speicherung. Methoden 40 weibliche Sprague-Dawley Ratten wurden fünf Wochen beobachtet und in vier Gruppen eingeteilt. Zwei Gruppen wurden mit DOCA behandelt, ebenfalls zwei Gruppen bekamen Niedrigsalzfutter und 1%iges NaCl-Wasser zu trinken. Nach fünf Wochen wurden die Tiere getötet, wir entnahmen Blut, häuteten die Tiere und entnahmen bei 20 Tieren den Quadrizeps. Haut und Restkarkasse wurden anschließend getrocknet bzw. verascht, wir trennten die Knochen von der Restkarkasse und lösten die einzelnen Gewebe in Salpetersäure. Mittels Atom-Absorptionsspektrometrie konnten wir die jeweiligen Elektrolytgehalte in den gelösten Aschen bestimmen und auswerten.

6 2 Ergebnisse Unter DOCA-HS-Behandlung speicherten die Tiere 4,75 mmol Na +. Unter physiologischen Bedingungen bei einer Natriumkonzentration von etwa 145 mmol Na + pro Liter würde man nun eine Wasserretention von etwa 32 ml erwarten. Tatsächlich beobachteten wir aber nur eine Zunahme des Wassergehaltes um 7,75 ml, was einer Menge von 1,16 mmol Na + als osmotisch aktivem Osmolyt entspricht. Die restlichen 75-80% des retinierten Natriums wurden wasserfrei gespeichert. Etwa die Hälfte der wasserfreien Speicherung fand osmotisch inaktiv, die andere Hälfte osmotisch neutral statt. Als Gewebe, in dem osmotisch inaktive Natriumspeicherung stattfindet, konnten wir die Haut identifizieren. Setzte man die Summe aus (Na + + K + ) in Relation zum Wassergehalt, so beobachteten wir in der Haut der Kontrolltiere eine lineare Zunahme des Wassergehaltes bei steigendem (Na + + K + )- Gehalt. Nach DOCA-Behandlung war dieses Verhältnis im Vergleich zu den Kontrolltieren deutlich nach rechts verschoben. Es fand somit keine übersteigerte Flüssigkeitsretention in der Haut der DOCA-Tiere statt und wir beobachteten osmotisch inaktive Natriumspeicherung. In der Muskulatur ließ sich keine Veränderung des (Na + + K + )/Wasser- Quotienten induzieren. Die beobachtete wasserfreie Na-Akkumulation erfolgte demnach durch osmotisch neutralen Na + /K + -Austausch, ohne eine Zunahme der effektiven Osmolyte. Praktische Schlussfolgerung Neben der Haut als Ort der osmotisch inaktiven Natriumspeicherung konnte mit diesem Experiment die Muskulatur als Gewebe identifiziert werden, in dem wasserfreie Natriumretention möglich ist. Im Gegensatz zur Haut findet hier die Natriumretention allerdings in Form eines osmotisch neutralen Na + /K + -Austausches statt.

7 3 Abstract Background Sodium as the main extracellular cation of the human organism, as well as potassium as the main intracellular cation, determine by their osmotic activity the body fluid balance. To avoid constant fluidshifts between intra- and extracellular space, special regulatory mechanisms exist, which obtain the so-called iso-osmolality. It is currently anticipated that a high alimentary sodium-uptake leads to an increased extracellular sodium content and body fluid retention and that inevitably leads to volume retention in the extracellular space. Contrary to this doctrine, human- as well as animalstudies showed that a positive sodium balance is possible without excessive water retention. In previous animalstudies we were able to identify the skin as a tissue, where osmotically inactive sodium storage is possible. The aim of this study was to examine whether there exist other tissues which can retain sodium without fluidretention under an exaggerated sodium excess provoked by a treatment with Deoxycorticosteron-Azetat (DOCA), and if there are other mechanisms for water free sodium-retention besides osmotically inactive storage. Methods 40 female Sprague-Dawley rats were observed for five weeks and divided into four groups. Two groups were treated with DOCA, also two groups were given a low salt chow and 1% NaCl drinking water. After five weeks the animals were killed, we took samples of blood, skinned the animals and removed the quadriceps of 20 animals. Skin and carcass were then dried and ashed, we separated the bones from the carcass and dissolved each tissue in nitric acid. Using atomic absorption spectrometry, we were able to determine and analyze the respective electrolyte levels in the dissolved ashes.

8 4 Results After DOCA-HS treatment the animals retained 4.75 mmol Na +. Physiological conditions with a sodium content of 145 mmol per liter provided, we would expect a fluid retention of about 32 ml. In fact, however, we only observed a fluid retention of 7.75 ml, which corresponds to an amount of 1.16 mmol Na + as osmotically active osmolytes. The remaining 75-80% of the retained sodium had been saved without water retention. About half of the water-free sodium-retention was osmotically inactive, the other half occurred as osmotically neutral sodium/potassium-exchange. As a tissue, where osmotically inactive sodium-retention happens, we were able to identify the skin. We brought the sum of (Na + + K + ) in relation to water, and observed a linear increase of the water content with increasing (Na + + K + ) in the skin of the control animals. After DOCA treatment, this ratio was shifted significantly rightwards compared to that of the control animals. Thus, there was no excessive fluid retention in the skin of the DOCA animals and we noticed osmotically inactive sodium storage. In muscle we were not able to induce changes in the relation of (Na + + K + ) to water. The observed water-free sodium accumulation happened by osmotically neutral Na + /K + exchange, without an increase of the effective osmolytes. Conclusion With this experiment we could identify the muscle as a tissue where waterfree sodium retention is possible in addition to the skin as a place of osmotically inactive sodium retention. In contrast to the skin sodium retention in muscles occurs as osmotically neutral Na + /K + exchange.

9 5 1. Einleitung 1.1. Klassisches Konzept des Natriumstoffwechsels Natriumsalze sind die führenden Osmolyte der extrazellulären Flüssigkeit, deren osmotischer Druck den extrazellulären Wassergehalt und somit die Osmolalität des Blutplasmas determiniert. Dagegen vermitteln in erster Linie Kaliumsalze durch Osmose das intrazelluläre Flüssigkeitsvolumen. Zusammen stellen diese beiden Kationen (Na + + K + ) nebst ihrer begleitenden Anionen etwa % der effektiven Osmolyte des Körpers dar. Obwohl die Zellmembran in gewissen Grenzen sowohl für Na +, als auch für K + durchlässig ist, sind diese Ionen dennoch nahezu ausschließlich entweder außerhalb (Na + ) oder innerhalb (K + ) der Zelle zu finden, da beide Kationen mittels der zellmembranständigen Na + /K + -ATPase entgegen ihrer Konzentrationsgradienten unter Energieverbrauch entweder in die Zelle, oder aus der Zelle zurückgepumpt werden. Es entsteht somit ein funktionelles Dysäquilibrium an der Membran, wodurch der Organismus effektive Osmolyte generiert und so nicht nur das Flüssigkeitsvolumen innerhalb und außerhalb der Zelle reguliert, sondern auch die ebenso lebensnotwendigen Elektrolytgradienten über der Zellmembran. Um ständige Flüssigkeitsverschiebungen zwischen extra- und intrazellulärem Raum zu vermeiden, muss die Konzentration der effektiven extra- und intrazellulären Osmolyte gleich sein. Auch die Flüssigkeitsverteilung zwischen Extra- und Intrazellulärvolumen wird vom Organismus weitgehend konstant gehalten, indem zwischen den beiden Kompartimenten die sogenannte Iso-Osmolalität erhalten wird, welche durch folgende Gleichung beschrieben wird: (Na + + K + EZV ) extra (Na + + K IZV + ) intra

10 6 Um die Iso-Osmolalität der extrazellulären Flüssigkeit zu gewährleisten, werden bereits bei geringen Veränderungen der Serumosmolalität im Körper spezielle Regulationsmechanismen eingeschaltet: Osmoregulation (Aufrechterhaltung der extrazellulären Osmolalität): Osmorezeptoren im Hypothalamus registrieren Veränderungen der Serumosmolalität. Bei der Messung einer zu hohen Serumosmolalität wird unmittelbar ADH (Antidiuretisches Hormon = Vasopressin) freigesetzt. ADH wirkt vor allem am Sammelrohr der Niere, wo es über eine Permeabilitätssteigerung in den distalen Tubuli und Sammelrohren zu einer vermehrten Wasser-Rückresorption und somit zu einer Wasserretention und verstärkten Harnkonzentrierung führt. Darüber hinaus reagiert der Körper mit Durstgefühl auf eine zu hohe Serumosmolalität und freies Wasser wird dem Extrazellulärvolumen zugeführt. Es kommt zu einer Zunahme des Extrazellulärvolumens. Eine Na + -Akkumulation im Extrazellulärraum steht demnach immer in Zusammenhang mit einer extrazellulären Volumenretention. Volumenregulation (Aufrechterhaltung des extrazellulären Na + -Gehaltes) Im Gegensatz zur Osmoregulation, bei der Veränderungen der Serumosmolalität gemessen werden, ist für die Volumenregulation eine Stimulation bestimmter Rezeptoren durch Veränderung des Extrazellulärvolumens ausschlaggebend: - Der juxtaglomeruläre Apparat der Niere misst den Perfusionsdruck in der afferenten Arteriole des Glomerulus und supprimiert bei zu hohem Druck das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System, so dass Na + - Retention und Gefäßtonus vermindert werden. - Im Vorhof des Herzens wird bei zu hohem Druck ANP (atriales natriuretisches Peptid) freigesetzt, welches neben Vasokonstriktion zu einer Erhöhung der Na + -, sowie der Wasser-Ausscheidung führt. - Dehnungsrezeptoren im Karotissinus vermitteln hingegen bei zu geringer Aktivierung, also bei zu geringem Druck, Sympathikusaktivierung und volumetrische ADH-Freisetzung.

11 7 Demnach wird derzeit davon ausgegangen, dass eine hohe alimentäre Kochsalzbelastung zu einer Na + -Akkumulation im Extrazellulärraum führt und einen passageren Anstieg der Plasmaosmolalität mit sich bringt. Um Isomit Durst Osmolalität der Körperflüssigkeiten zu erhalten, reagiert der Körper und verminderter Wasserausscheidung, was zwangsläufig zu extrazellulärer Volumenretention führt. Um eine Volumenüberladung des Extrazellulärraums zu verhindern, reagiert der Körper mit Natriurese (Suppression des Renin- Angiotensin-Aldosteron-Systems und Freisetzung von ANP), bis ein neuer Steady State zwischen Natriumzufuhr und ausscheidung erreicht ist [20]. Abbildung 1: Eine abrupte Erhöhung der Salzbelastung von 20 auf 150 mmol/d hat eine Körpergewichtszunahme um ca. 1 kg zur Folge, wobei sich nach 5 Tagen ein neues Gleichgewicht (Steady State) zwischen Na + -Zufuhr und Na + -Ausscheidung einstellt. Ein entsprechendes Absetzten der Na + -Zufuhr bewirkt das Gegenteil.

12 8 Entsprechend des Konzeptes der Iso-Osmolalität ist die aktuelle Lehrmeinung, dass: 1. Na + -Akkumulation nahezu ausschließlich extrazellulär stattfindet, 2. Na + -Akkumulation immer mit extrazellulärer Volumenretention assoziiert ist, 3. der Gesamtkörper-Na + -Bestand in engsten Grenzen gehalten werden muss, um extrazellulären Volumenexzess zu verhindern, 4. die Niere den extrazellulären Gehalt an effektiven Osmolyten kontrolliert und somit das zentrale Organ für die Kontrolle des Na + - und Wasserhaushaltes darstellt Erkenntnisse über wasserfreie Na + -Akkumulation Neuere Langzeitstudien zur Natriumbilanz des Menschen lieferten erstaunliche Befunde, die nicht mit der Lehrbuchmeinung einhergingen. Heer et al. führten eine Bilanzstudie über die Dauer von 20 Tagen durch [12]. Bei dieser Studie wurden männliche Probanden einer wochenweise ansteigenden diätetischen Natriumbelastung von 220, 440 bis zuletzt 660 mmol/d unterzogen. Am Ende des Versuchszeitraumes hatten die Probanden im Mittel ca mmol Na + akkumuliert, so dass eine extrazelluläre Flüssigkeitsakkumulation von ca. 12 Litern Wasser zu erwarten gewesen wäre. Jedoch blieben das Körpergewicht, wie auch das Extrazellulärvolumen, gemessen anhand der Inulin-Clearance, trotz der ausgeprägten Erhöhung des Gesamtkörpernatriums konstant. Eine ähnliche Beobachtung machten während einer 135 Tage dauernden Weltraumsimulationsstudie Titze et al. [31]. Hierbei konnte bei männlichen Probanden ebenfalls gezeigt werden, dass positive Na + -Bilanzen nicht zwingend eine erhöhte Volumenretention mit sich bringen mussten. Diese Befunde ließen den Schluss zu, dass entgegen der Lehrbuchmeinung erhebliche Mengen von Natrium ohne begleitende Wasserretention im Organismus eingelagert werden können.

13 9 Schon 1956 nannten Farber und Soberman zwei Wege, die eine Zunahme des Gesamtkörpernatriums ohne Änderung des Körperwassers ermöglichen [7]: Osmotisch inaktive Na + -Speicherung Für osmotisch inaktive Na + -Speicherung ist eine Zunahme des (Na + +K + )/Wasser-Quotienten charakteristisch. Als Kompartiment für diese Form der Na + -Speicherung nannte Farber das Bindegewebe, bzw. dessen Bestandteil Chondroitin-Sulfat. Chondroitin-Sulfat zählt zu den Glykosaminoglykanen, einer Stoffgruppe mit polyanionischem Charakter, welcher die Bindung von Kationen ermöglicht [6]. Osmotisch neutraler Na + /K + -Austausch Osmotisch neutraler Na + /K + -Austausch ist durch einen simultan zur Na + - Akkumulation stattfindenden K + -Verlust gekennzeichnet. Durch diesen Austausch von intrazellulärem K + durch Na + und die darauf folgende K + - Exkretion bleiben die Zahl der effektiven Osmolyte im Organismus unverändert, und demzufolge die Iso-Osmolalität auch ohne zusätzliche Wasserretention gewahrt. Diesen Zusammenhang bezüglich wasserfreier Na + -Akkumulation im Austausch gegen intrazelluläres Kalium untermauerten Edelman et al mit folgender Gleichung [4]: [Na + [Na e + K = 1,11 TBW + + e ] Plasma ] 25,6 Na + e = austauschbares Natrium K + e = austauschbares Kalium Man kann aus dieser Gleichung deutlich erkennen, dass mit einer Erhöhung des Na + e nicht zwingend eine Erhöhung des Gesamtkörperwassers einhergehen muss, um die Na + -Plasmakonzentration zu erhalten, sondern dass auch ein Verlust an K + e die Zunahme des Na + e ausgleichen kann. Edelman und Leibman beschrieben zudem 1959, wie sich Natrium auf die Kompartimente des menschlichen Organismus aufteilt. Sie nannten Bindegewebe, Knorpel und Knochen als Hauptspeicherort mit ~55 % des

14 10 Gesamtkörpernatriums. Etwa 40 % lokalisierten sie in den extrazellulären Flüssigkeiten Plasma und Lymphe. Die übrigen ~5 % befinden sich nach Edelman und Leibman intra- und transzellulär [5]. Hiermit lieferten sie nach Farber weitere Anhaltspunkte zu der Erforschung einzelner Kompartimente für osmotisch inaktive bzw. neutrale Na + -Speicherung. Um jedoch die Änderungen des Natriumgehaltes einzelner Gewebe in Relation zu deren Wassergehalt zu untersuchen, bestand die Notwendigkeit von tierexperimentellen Ansätzen, in denen sich die Möglichkeit bot, einzelne Gewebe chemisch zu analysieren. Titze et al. veröffentlichten 2003 einen solchen tierexperimentellen Versuchsansatz. Sie bestimmten für separat veraschte Gewebe (Haut, Karkasse, Knochen) jeweils den Natriumgehalt mittels chemischer Analyse, sowie den Wassergehalt durch die Differenz von Feucht- und Trockengewicht. Hierbei wurde gezeigt, dass die Haut einen Ort der osmotisch inaktiven Na + -Speicherung darstellt, da der Quotient des relativen Na + -Gehaltes der Haut zu deren Wassergehalt unter Hochsalzbehandlung stark anstieg [29] konnten Titze et al. weiterhin zeigen, dass die Na + - Akkumulation im Bindegewebe der Haut unter Hochsalzbelastung mit einem Anstieg des Gehaltes an Glykosaminoglykanen einhergeht. Die Glykosaminoglykane wiesen zudem einen höheren Sulfatierungsgrad auf. Der polyanionische Charakter und damit die Fähigkeit zur Bindung von Kationen durch erhöhte negative Ladungsdichte waren demnach gesteigert [32]. Ziel dieser Arbeit war es nun, herauszufinden wie sich eine weitere Steigerung der Natriumakkumulation auswirken würde. Dazu wurden jeweils die Hälfte der untersuchten Tiere zusätzlich zur Hochsalzdiät mit DOCA (Deoxycorticosteron-Azetat), einem Mineralokortikoid, das, ähnlich wie Aldosteron, zu vermehrter Natriumretention führt, behandelt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte betrachtet: Gibt es außer der osmotisch inaktiven Na + -Speicherung weitere Mechanismen der wasserfreien Na + -Retention, wie z.b. osmotisch neutralen Na + /K + -Austausch? Ist die Haut das einzige Gewebe, in dem wasserfreie Na + -Retention stattfinden kann?

15 11 2. Material und Methoden 2.1. Tierexperimenteller Ansatz 40 weibliche Sprague Dawley (SD) Ratten (Charles River, Sulzfeld, Deutschland) im Alter von sieben bis acht Wochen wurden in vier Gruppen aufgeteilt und für die Dauer von fünf Wochen unterschiedlich behandelt. Gruppen 1 und 2 waren unbehandelte Kontrollgruppen, wohingegen den Tieren der Gruppen 3 und 4 zu Beginn des Experiments unter Betäubung ein subkutanes DOCA-Pellet (50,0 mg/pellet, Innovative Research of America, Sarasota, Florida, USA) implantiert wurde, welches nach drei Wochen durch ein zweites Pellet ersetzt wurde. Aus den Pellets wurde während der Dauer des Experimentes der Wirkstoff Deoxycorticosteron-Azetat (=DOCA) gleichmäßig freigesetzt und im Organismus der Ratten verteilt. DOCA aktiviert sowohl den Glukokortikoid-Rezeptor, wie auch den Mineralokortikoid-Rezeptor, ähnlich wie Aldosteron, was für unser Experiment die wesentlichere Bedeutung hat. Dadurch kommt es zu einer Supprimierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS), wodurch der Aldosteron-Spiegel im Organismus niedrig ist. Darüber hinaus führt es zu einer erhöhten Na + -Retention und K + -Exkretion im distalen Tubulus der Niere. Alle Ratten bekamen natriumarmes Futter mit < 0,1% NaCl, 0,95% Calcium und 0,70% Kalium. Die Tiere der Gruppen 1 und 3 (Niedrigsalzdiät, NS) bekamen Leitungswasser ad libitum, Gruppen 2 und 4 (Hochsalzdiät, HS) bekamen 1%iges NaCl-Wasser zu trinken. Nach fünf Wochen wurde den Tieren in Narkose jeweils 3 ml Blut aus dem rechten Ventrikel abgenommen. Anschließend wurden die Tiere mittels Genickbruch getötet und vollständig gehäutet. Der Magen-Darm-Trakt wurde entfernt, um eine Verfälschung der Ergebnisse durch darin enthaltene Nahrungsreste und Fäzes zu vermeiden. Bei 20 Tieren entnahmen wir zusätzlich etwa 2g Muskulatur (Quadrizeps).

16 Bestimmung der Blutserumkonzentrationen von Na + und K + Wie beschrieben wurden jedem Tier 3ml Blut aus dem Herzen abgenommen. Dies wurde zentrifugiert und aus dem so gewonnenen Serum bestimmten wir die Na + - und K + -Konzentrationen, welche mittels eines Flammenphotometers (Modell EFIX 5055; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) bestimmt wurden Veraschung Nach Häutung der Tiere und Entfernung des Magen-Darm-Traktes, sowie nach Entnahme des Quadrizeps bei der Hälfte der Tiere wurde das Feuchtgewicht der gehäuteten Karkasse (KarFG), der Haut (HFG) und der Muskulatur (MFG) bestimmt. Aus der Summe aller einzelnen Feuchtgewichte ergab sich das Feuchtgewicht des Gesamtkörpers (GkFG). Im Muffelofen (W. C. Heraeus GmbH, Hanau, Deutschland) wurde die entnommene Muskulatur in kleinen Schmelztigeln zunächst 24 h bei 200 C, daraufhin 24 h bei 400 C und schließlich 48 h bei 600 C vollständig verascht. Haut und Karkasse hingegen trockneten und veraschten wir nach folgendem Protokoll: Nach der Bestimmung des Feuchtgewichtes von Karkasse und Haut wurden diese separat in großen Schmelztigeln zur Trocknung für 72 h bei 90 C aufbewahrt. Danach wurden die jeweiligen Trockengewichte bestimmt. Da eine weitere Trocknung keine Veränderung der Gewichte zur Folge hatte, betrachteten wir die Differenz aus den einzelnen Feucht- und Trockengewichten als Wassergehalt der jeweiligen Gewebe. Die getrockneten Gewebe wurden im weiteren Verlauf zuerst für 24 h bei 190 C, anschließend für 24 h bei 450 C verascht. Nach diesem Schritt wurden die Proben aus dem Ofen genommen, um die Knochen mittels vorsichtigen Siebens durch ein rostfreies Stahlsieb von der Karkasse zu trennen. Anschließend wurden die Aschen der Karkasse wieder in die jeweiligen Tigel zurückgegeben, die Knochen separat in Quarzschalen gegeben und alle Gewebe für weitere 48 h bei 600 C endverascht. Die gewonnenen Aschen wurden dann in Salpetersäure unterschiedlicher Konzentrationen und

17 13 Volumina aufgenommen (s. Tabelle 1). In die Tigel wurden hierfür die entsprechenden Volumina an Säure gegeben, und ca. 20 min vorsichtig geschüttelt bis sich die Aschen darin gelöst hatten. Die Aschen der Knochen jedoch wurden auf Grund der schlechten Löslichkeit über Nacht geschüttelt. Die gelösten Aschen dienten nun der Analyse der Elektrolytgehalte der Gewebe. Gewebe HNO 3 Lösung Volumen Haut 5%ig 20 ml Knochen 10%ig 100 ml Karkasse 10%ig 40 ml Tabelle 1: Lösungen und Volumina zum Lösen der Aschen 2.4. Bestimmung der Elektrolytkonzentrationen der Asche mittels Atom-Absorptions-Spektrometrie Im Atomabsorptionsspektrometer (Modell 3100; Perkin Elmer; Rodgau, Deutschland) wurden die Proben in einer Flamme (Brenngas: Acetylen) atomisiert. Die Strahlungsquelle (Hohlkathodenlampe) bestand jeweils aus dem zu analysierenden Alkali-Metall (Na + bzw. K + ) und sandte nach entsprechender Anregung Strahlung mit jeweils substanzspezifischer Wellenlänge aus. Diese konnte dann von den entsprechenden, atomisierten Analyten absorbiert werden. Aus der gemessenen Absorption durch die atomisierte Probenlösung konnte deren Gehalt des entsprechenden Analyten in der Probe berechnet werden. Da die Standardkurve der Absorption für Na + im Bereich von 0 0,6 mg/l und für K + im Bereich 0 5 mg/l linear verläuft, wurden zur Kalibrierung des Atomabsorptionsspektrometers folgende Standards verwendet (in mg/l): Na + -Messung 0,2 0,4 0,6 K + -Messung 2,0 3,0 4,0 5,0

18 Datenanalyse Berechnungen Na + -Überschuss in Relation zum Wassergehalt (R Na + /Wasser ) Wasser freie Natriumakkumulation ist charakterisiert durch eine Zunahme des Na + -Wasser-Verhältnisses (R Na + /Wasser ) in den Geweben. Wir untersuchten das Verhältnis zwischen den Änderungen des Natriumgehaltes, sowie den Änderungen des Wassergehaltes im Gesamtkörper, der Haut, der Muskulatur und der Restkarkasse, indem wir das Verhältnis zwischen dem Gesamtnatrium (in mmol) und dem Gesamtwasser (in ml) der einzelnen Gewebe in Relation zueinander setzten: R + Na /Wasser + Gewebe Na (mmol) = Gewebe - Wasser (ml) Die absolute Menge an überschüssiger Natriumakkumulation in Relation zum Wasser (ΔNa (i) + ; mmol) wurde berechnet aus dem Unterschied zwischen Δ R Na + /Wasser (in mmol/ml) und dem Wassergehalt der Gewebe (in ml): Δ Gewebe-Na (i) + = Δ R Na + /Wasser (mmol/ml) x Wasser (ml) Unter der Annahme, dass Na + das wichtigste extrazelluläre und K + das wichtigste intrazelluläre Kation ist und beide osmotisch aktiv wirken, wurde die Zunahme des R Na + /Wasser der einzelnen Gewebe verglichen mit dem Verhältnis von (Na + + K + ) gegenüber dem Wassergehalt [R (Na + + K+ )/Wasser ]. Parallele Zunahmen von R Na + /Wasser und R (Na + + K+ )/Wasser deuteten auf einen Überschuss von Natrium gegenüber Wasser und somit auf osmotisch inaktive Natriumspeicherung in den Geweben hin. In dem Fall, dass das R Na + /Wasser in den Geweben anstieg, während R (Na + + K+ )/Wasser unverändert blieb, wurde der Natriumüberschuss gegenüber dem Wasser durch einen relativ zum Wassergehalt gesehenen Kaliumverlust ausgeglichen, was auf einen osmotisch neutralen Na + /K + -Austausch in den Geweben hindeutet.

19 15 Osmotisch aktive Natriumakkumulation Basierend auf der Annahme, dass ein Anstieg des Wassergehaltes (ΔW; ml) auf eine osmotisch aktive Natrium- und Kaliumakkumulation zurückzuführen ist, wurde die osmotisch aktive (Na + +K + )-Retention [Δ(Na + +K + ) (a) ; mmol] aus dem Unterschied zwischen dem relativen Gewebs-Wasser-Gehalt (ΔrW; ml/g Feuchtgewicht), dem Feuchtgewicht der einzelnen Gewebe (FG; g), sowie der Serum (Na + +K + )-Konzentration [(Na + + K + ) Serum ; mmol/ml] berechnet: Δ(Na + + K + ) (a) = ΔrW (ml/g) x FG (g) x (Na + + K + ) Serum (mmol/ml) Bezieht man den Unterschied zwischen dem Serum-Na + und dem Serum-K + mit ein, so stimmten die Werte von Δ(Na + +K + ) (a) und ΔNa + (a) ungefähr überein Statistische Auswertung Alle Ergebnisse werden als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben. Der Vergleich dieser Mittelwerte wurde mittels multivariater Analyse (SPSS; Version 16.0) durchgeführt (Allgemeines Lineares Modell). Die graphischen Darstellungen der Ergebnisse (Balkendiagramme und scatter plots) sowie die Regressionsanalysen wurden mit ORIGIN (Version 6.0) erarbeitet. Als signifikant unterschiedlich wurden nur Ergebnisse bezeichnet, deren p-wert < 0,05 war.

20 16 3. Ergebnisse 3.1. Behandlung mit Deoxycorticosteron-Azetat (DOCA) führt zu vermindertem Wachstum Nach fünf Wochen unterschiedlicher Salzbelastung und DOCA-Behandlung beobachteten wir in den 1%-NaCl-Gruppen ein niedrigeres Feuchtgewicht nach DOCA-HS gegenüber den HS-Tieren der Kontrollgruppe (s. Tabelle 2), die Tiere hatten durch DOCA-HS-Behandlung weniger Gewicht zugenommen. Durch alleinige HS-Diät, bzw. durch DOCA-Behandlung in den NS-Gruppen, ließen sich keine Veränderungen im Feuchtgewicht der Tiere erkennen. Nach Trocknung der Tiere beobachteten wir wiederum keinen Effekt durch HS-Diät. Allerdings führte nun DOCA-Behandlung auch in den NS-Gruppen zu einem verminderten Trockengewicht der Tiere. DOCA-Behandlung führte somit zu vermindertem Wachstum. Gleiche Effekte zeigten sich in der Haut der Tiere. Innerhalb der Kontrollgruppen führte die Hochsalzdiät weder zu einer Änderung des Feucht-, noch des Trockengewichtes der Haut. DOCA-Behandlung führte im Vergleich zu den Kontrolltieren zu einem geringeren Trockengewicht. Innerhalb der DOCA-Gruppen beobachteten wir beim Feuchtgewicht der Haut einen Diäteffekt. Unter HS-Diät nahm das Feuchtgewicht der Haut im Vergleich zu allen drei anderen Gruppen weiter ab. Bei den enthäuteten und knochenfreien Restkarkassen konnten wir im Feuchtgewicht keine signifikanten Unterschiede nachweisen. Im Trockengewicht sahen wir aber, dass die Restkarkassen der DOCA-Tiere deutlich leichter waren als die der Kontrolltiere. Da die Restkarkassen zum Großteil aus Muskulatur bestehen, kann man hier von einer Verminderung der Muskelmasse unter DOCA-Behandlung ausgehen.

21 17 Kontrolle DOCA n Leitungswasser 1% NaCl Leitungswasser 1% NaCl Gesamt FG (g) ,6 ± 12,2 225,0 ± 14,1 213,1 ± 12,6 209,7 ± 15,1 Gesamt TG (g) 10 77,00 ± 6,06 78,20 ± 5,82 69,10 ± 5,93 66,07 ± 5,17 Haut FG (g) 10 42,11 ± 3,91 42,49 ± 3,70 41,21 ± 3,04 36,68±2,78* Haut TG (g) 10 18,82 ± 2,28 18,87 ± 2,26 15,91 ± 2,24 13,88 ± 1,31* Muskel FG (g) 5 2,11 ± 0,14 2,06 ± 0,21 2,00 ± 0,10 2,12 ± 0,08 Muskel TG (g) 5 0,546±0,042 0,522 ± 0,062 0,526 ± 0,039 0,532 ± 0,019 Restkarkasse FG (g) ,5 ± 8,8 182,5 ± 11,4 171,9 ± 10,3 173,0 ± 12,7 Restkarkasse TG (g) 10 58,19 ± 3,95 59,33 ± 3,88 53,19 ± 4,27 52,19 ± 4,03 Tabelle 2: Feucht (FG)- und Trockengewichte (TG) des Gesamtkörpers, der Haut, der Muskeln und der Restkarkassen von unbehandelten bzw. Deoxycorticosteron-Azetat (DOCA) behandelten weiblichen Sprague Dawley Ratten nach fünfwöchiger Niedrigsalz- (Leitungswasser) bzw. Hochsalzdiät (1% NaCl- Wasser). DOCA-Behandlung führte zu vermindertem Wachstum der Tiere, vor allem unter HS-Diät. * P Diät < 0,05; P DOCA < 0,05; P DOCA*Diät < 0, DOCA-Behandlung führt zu Flüssigkeitsretention in Gesamtkörper und Haut, aber nicht in der Skelettmuskulatur Da der absolute Wasser- bzw. Elektrolytgehalt von der Gewebemasse abhängt, normalisierten wir die Werte auf das jeweilige Feuchtgewicht der Tiere. Wir berechneten hierzu den relativen Wassergehalt im Gesamtkörper, der Haut und der Muskulatur der Tiere angegeben als ml/g Feuchtgewicht (s. Abb. 2).

22 18 0,8 NS HS 0,8 ml g -1 FG 0,7 0,6 0,7 0,6 ml g -1 FG 0,5 0,5 0,4 Kontrolle DOCA rgkw Kontrolle DOCA rhw Kontrolle DOCA rmw 0,4 Abbildung 2: Relativer Wassergehalt des Gesamtkörpers (rgkw), der Haut (rhw) und der Muskulatur (rmw); angegeben als ml/g Feuchtgewicht (FG). DOCA-Behandlung führte zu erhöhtem Wassergehalt in Gesamtkörper und Haut, aber nicht in der Muskulatur. In keinem der Gewebe zeigte sich eine Veränderung durch Hochsalzdiät. P DOCA < 0,05 DOCA-Behandlung erhöhte den Wassergehalt im Gesamtkörper um 0,022 ml/g FG ( 3 %) und in der Haut um 0,063 ml/g FG ( 11 %). Keinen Effekt durch DOCA-Behandlung beobachteten wir beim relativen Wassergehalt der Muskulatur. Ein Einfluss durch Fütterung der Hochsalzdiät konnte bei der Betrachtung des relativen Wassergehaltes in keinem der Gewebe nachgewiesen werden. Hochsalzdiät führte demnach zu keiner nennenswerten Volumenretention im Organismus der Tiere. Eine Zunahme des Flüssigkeitsgehaltes in den Geweben ist in der Regel mit der Zunahme der effektiven Osmolyte des Organismus assoziiert. Na + und K + nebst ihren begleitenden Anionen gelten als > 95% der effektiven Osmolyte. Änderungen des Na + - und K + -Gehaltes führen deshalb in der Regel zu Änderungen des Wassergehaltes im Organismus. Deshalb untersuchten wir im nächsten Schritt den Na + - und K + - Gehalt in den Geweben.

23 DOCA-Behandlung führt zu Na + -Retention in den Geweben, besonders in Kombination mit Hochsalzdiät Abbildung 3 zeigt den relativen Na + -, bzw. K + -Gehalt des Gesamtkörpers und der Haut, angegeben als mmol/g Trockengewicht. Der Na + - bzw. K + -Gehalt der Muskulatur wurde nicht auf das Trockengewicht bezogen, da wir stets 2g Muskulatur untersuchten. rgkna + (mmol g -1 TG) 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 NS HS * * 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 rgkk + (mmol g -1 TG) 0,00 Kontrolle DOCA Kontrolle DOCA 0,00 Abbildung 3a Relativer Na + - und K + -Gehalt des Gesamtkörpers (rgkna +, rgkk + ); angegeben in mmol/g Trockengewicht (TG) DOCA-Behandlung führte zu erhöhtem Na + -Gehalt im Gesamtkörper; DOCA-HS steigerte diesen Wert weiter. DOCA alleine steigerte den K + -Gehalt im Gesamtkörper; unter DOCA-HS fiel der K + -Wert wieder auf Kontrollniveau ab. Innerhalb der Kontrollgruppen zeigte sich keine Veränderung durch HS-Diät. * P Diät < 0,05; P DOCA < 0,05; P DOCA*Diät < 0,05. Im Gesamtkörper der Tiere zeigte sich unter DOCA-NS-Behandlung eine Zunahme des relativen Na + -Gehaltes. Durch zusätzliche HS-Diät nahm dieser Wert weiter zu (s. Abb. 3a). DOCA-Behandlung führte zu einer geringen, aber statistisch signifikanten Zunahme des K + -Gehaltes im Gesamtkörper. Dieser DOCA-Effekt war mit zusätzlicher HS-Diät nicht mehr nachweisbar. Die K + -Werte im Gesamtkörper

24 20 von DOCA-HS-behandelten Tieren waren im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht unterschiedlich. Innerhalb der Kontrollgruppen sahen wir keine Veränderungen des relativen Na + -, bzw. K + -Gehaltes der Gesamtkörper durch Fütterung der Hochsalzdiät. 0,3 NS HS * 0,3 rhna + (mmol g -1 TG) 0,2 0,1 * 0,2 0,1 rhk + (mmol g -1 TG) 0,0 Kontrolle DOCA Kontrolle DOCA 0,0 Abbildung 3b: Relativer Na + - und K + -Gehalt der Haut (rhna +, rhk + ); angegeben in mmol/g Trockengewicht (TG). DOCA-Behandlung und HS-Diät führten jeweils zu erhöhtem relativem Na + -Gehalt der Haut. Die höchsten Werte sahen wir unter DOCA-HS-Behandlung. Weder DOCA, noch HS hatte einen Effekt auf den relativen K + -Gehalt der Haut. * P Diät < 0,05; P DOCA < 0,05; P DOCA*Diät < 0,05 In der Haut der Tiere führte die NaCl-Belastung schon bei den Kontrolltieren zu einer Zunahme des relativen Na + -Gehaltes (s. Abb. 3b). Den gleichen Diät-Effekt konnten wir innerhalb der DOCA-Gruppen beobachten. Schon die alleinige DOCA-Gabe unter NS-Diät führte aber zu einer Steigerung des relativen Na + -Gehaltes der Haut um 29 % gegenüber den Kontrolltieren. DOCA-HS-Diät führte zu einem Na + -Exzess in der Haut. Im Vergleich zur Kontrollgruppe nahm der Na + -Gehalt in der Haut unter DOCA-HS-Diät um 48% zu. Auf den relativen K + -Gehalt der Haut hatte weder NaCl, noch DOCA einen Einfluss.

25 21 0,20 LS HS 0,20 MNa + (mmol) 0,15 0,10 * 0,15 0,10 MK + (mmol) 0,05 0,05 0,00 Kontrolle DOCA Kontrolle DOCA 0,00 Abbildung 3c: Na + - und K + -Gehalt der Muskulatur (MNa +, MK + ); angegeben in mmol. Die Elektrolytwerte der Muskulatur wurden nicht auf das Trockengewicht bezogen, da die Muskelgewichte innerhalb der verschiedenen Gruppen identisch waren. DOCA, sowie DOCA-HS steigerten den Natriumgehalt der Muskulatur. DOCA führte zu einer Abnahme des Kaliumgehaltes der Muskulatur. Salz zeigte hier keinen Effekt. * P Diät < 0,05; P DOCA < 0,05; P DOCA*Diät < 0,05 In der Muskulatur konnten wir innerhalb der Kontrollgruppen keine Veränderung des Na + -Gehaltes durch HS-Diät feststellen (s. Abb. 3c). DOCA-Behandlung führte zu einem Anstieg des Na + -Gehaltes im Muskel. Dieser Wert konnte durch DOCA-HS weiter gesteigert werden. Gegenläufig hierzu nahm der K + -Gehalt der Muskulatur durch DOCA im Vergleich zu den Kontrolltieren ab. HS-Diät zeigte hier keinen Einfluss Beziehung zwischen Na + -, K + - und Wasserretention: Nachweis wasserfreier Na + -Akkumulation Entsprechend der geltenden Lehrmeinung geht man davon aus, dass Na + - Retention im Organismus unweigerlich zu Flüssigkeitsakkumulation führt. Die Befunde einer zunehmenden Na + -Akkumulation unter DOCA-HS-Behandlung (s. 3.3.) bei jedoch unverändertem Wassergehalt (s. 3.4.) lassen Zweifel an dieser Lehrmeinung aufkommen. Deshalb untersuchten wir im nächsten Schritt das Verhältnis zwischen dem Na + -, K + - und (Na + +K + )-Gehalt und der Änderung des Wassergehaltes in den Geweben der Tiere (s. Abb. 4).

26 22 rgkw (ml g -1 FG) 0,70 0,68 0,66 0,64 0,62 Kontrolle Leitungswasser Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser DOCA 1%-NaCl-Wasser 0,15 0,20 0,25 0,30 rgkna + (mmol g -1 TG) Abbildung 4a: Beziehung zwischen relativem Gesamtkörpernatrium (rgkna + ; mmol/g TG) und relativem Gesamtkörperwasser (rgkw; ml/g FG). Es zeigte sich ein linearer Zusammenhang sowohl bei den Kontroll-, als auch bei den DOCA- Tieren. DOCA-Behandlung führte zu einer Rechtsverschiebung des Verhältnisses zwischen Na + - und Wasserretention im Organismus. Im Vergleich zu den Kontrolltieren führte DOCA-Behandlung also zu wasserfreier Na + -Retention. Das Verhältnis von relativem Gesamtkörper-Na + zum relativen Wassergehalt zeigte bei den Kontrolltieren, die entweder Leitungswasser oder 1%iges NaCl-Wasser erhalten hatten, einen linearen Zusammenhang, dessen Steigung sehr steil verläuft (s. Abb. 4a). Eine Zunahme des Gesamtkörper- Na + von 0,15 auf 0,20 mmol/g Trockengewicht ging mit einer Zunahme des Gesamtkörperwassers von 0,63 auf 0,67 ml/g Feuchtgewicht einher. DOCA- Behandlung änderte diese fixierte Beziehung zwischen Körper-Na + und Körperwasser grundlegend. Es zeigte sich eine deutliche Rechtsverschiebung des Na + /Wasser-Verhältnisses, so dass die unter DOCA-HS-Behandlung zu beobachtende massive Zunahme des Körper-Na + - Gehaltes von 0,20 auf 0,30 mmol/g Trockengewicht nur von einem moderaten Anstieg des Wassergehaltes von 0,65 auf 0,70 ml/g Feuchtgewicht begleitet war. Ein erheblicher Teil des akkumulierten Na + war ohne begleitende Flüssigkeitsretention im Organismus eingelagert worden.

27 23 rgkw (ml g -1 FG) 0,70 0,68 0,66 0,64 Kontrolle Leitungswasser Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser DOCA 1%-NaCl-Wasser 0,62 0,15 0,20 0,25 rgkk + (mmol g -1 TG) Abbildung 4b: Beziehung zwischen relativem Gesamtkörperkalium (rgkk + ; mmol/g TG) und relativem Gesamtkörperwasser (rgkw; ml/g FG). Es zeigte sich ein linearer Zusammenhang innerhalb der Kontrollgruppen. Kein signifikanter Zusammenhang ließ sich innerhalb der DOCA-Gruppen nachweisen. Die Wechselbeziehung zwischen relativem Gesamtkörper-K + gegenüber relativem Gesamtkörperwasser zeigte nur bei den Kontrolltieren einen linearen Zusammenhang (s. Abb. 4b). Bei den Tieren der DOCA-Gruppen konnten wir keinen Zusammenhang nachweisen, es zeigte sich jedoch eine Linksverschiebung des K + /Wasser-Verhältnisses. Dieser Befund lässt vermuten, dass ein erheblicher Teil der wasserfreien Na + -Retention (s. Abb. 4a) durch begleitenden K + -Verlust, und somit einer nur geringen Zunahme der effektiven Osmolyte, begleitet war. rgkw (ml g -1 FG) 0,71 0,70 0,69 0,68 0,67 0,66 0,65 0,64 0,63 0,62 Kontrolle Leitungswasser Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser DOCA 1%-NaCl-Wasser 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 rgkna + + rgkk + (mmol g -1 TG) Abbildung 4c: Beziehung zwischen der Summe der beiden Elektrolyte (rgkna + + rgkk + ; mmol/g TG) und relativem Gesamtkörperwasser (rgkw; ml/g FG). Es ergeben sich zwei Geraden, wobei die der DOCA-Tiere gegenüber der der Kontrolltiere nach rechts verschoben ist. Da Na + und K + mehr als 95% der kationischen Osmolyte des Körpers ausmachen, deutet diese Rechtsverschiebung entweder auf eine Zunahme der Osmolalität (Hypertonizität), oder aber auf einen partiellen Verlust der osmotischen Eigenschaft des akkumulierten Na + und K + hin (osmotisch inaktive Na + - Speicherung).

28 24 Zur Untersuchung dieser Hypothese analysierten wir im Anschluss das Verhältnis aus der Summe des relativen Gesamtkörper-Na + und des relativen Gesamtkörper-K +, als effektive Osmolyte des Körpers, gegenüber dem relativen Gesamtkörperwassergehalt. Es zeigten sich zwei Geraden, deren Steigungen unabhängig von Diät oder DOCA-Behandlung konstant blieben (s. Abb. 4c). Damit war gezeigt, dass ein erheblicher Anteil der wasserfreien Na + -Akkumulation mit K + -Verlust und damit nur mäßiggradiger Zunahme der effektiven Osmolyte im Organismus assoziiert war. Allerdings blieb das (Na + +K + )/Wasser-Verhältnis auf Gesamtkörperebene bei DOCA-behandelten Tieren im Vergleich zu Kontrolltieren nach rechts verschoben. Diese Rechtsverschiebung ging mit einer signifikanten Zunahme des (Na + +K + )/Wasser-Verhältnisses bei DOCA-behandelten Tieren einher (0,208 ± 0,009 vs. 0,196 ± 0,006 mmol/ml, Tabelle 3). Eine solche Zunahme der effektiven Osmolyte (Na + +K + ) ohne begleitende Flüssigkeitsretention weist entweder auf hypertone Flüssigkeitsakkumulation, oder aber per definitionem auf osmotisch inaktive Na + -Speicherung im Organismus hin Nachweis der osmotisch inaktiven Na + -Speicherung in der Haut Wir versuchten deshalb im Anschluss Gewebe zu identifizieren, die unter DOCA-HS-Behandlung Na + in osmotisch inaktiver Form akkumulieren. Da wir in früheren Experimenten bereits die Haut als osmotisch inaktiven Natriumspeicher identifiziert hatten, untersuchten wir auch nach erfolgter DOCA-Behandlung das Verhältnis von Na +, K +, sowie (Na + +K + ) und Wassergehalt in der Haut der Tiere (s. Abb. 5).

29 25 rhw (ml g -1 FG) 0,72 0,70 0,68 0,66 0,64 0,62 0,60 0,58 0,56 0,54 0,52 ( ) 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 ( rhna + (mmol g -1 TG) ) Kontrolle Leitungswasser Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser DOCA 1%-NaCl-Wasser Abbildung 5a: Beziehung zwischen relativem Natriumgehalt der Haut (rhna + ; mmol/g TG) und relativem Wassergehalt der Haut (rhw; ml/g FG). Es zeigte sich bei den Kontrolltieren ein linearer Verlauf. Eine weitere massive Natriumakkumulation bei den DOCA-Tieren steigerte den Wassergehalt der Haut nicht signifikant. Bei den Kontrolltieren, die Leitungswasser oder 1%iges NaCl-Wasser zu trinken bekommen hatten, zeigte sich ein linearer Verlauf des Verhältnisses von relativem Na + -Gehalt gegenüber dem relativen Wassergehalt der Haut (s. Abb. 5a). Dagegen führte DOCA-Behandlung zu einer deutlichen Rechtsverschiebung des Na + /Wasser-Verhältnisses in der Haut. Die Kurve ergab einen sigmoidalen Verlauf im Sinne einer wasserfreier Na + -Retention. rhw (ml g -1 FG) 0,72 0,70 0,68 0,66 0,64 0,62 0,60 0,58 0,56 Kontrolle Leitungswasser 0,54 Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser 0,52 DOCA 1%-NaCl-Wasser 0,50 0,05 0,10 0,15 rhk + (mmol g -1 TG) Abbildung 5b: Beziehung zwischen relativem Kaliumgehalt der Haut (rhk + ; mmol/g TG) und relativem Wassergehalt der Haut (rhw; ml/g FG). Es zeigte sich sowohl bei den Kontrolltieren, als auch bei den DOCA-Tieren ein linearer Verlauf. Nach DOCA-Behandlung kam es zu einer Verschiebung der Kurve nach links oben, was zeigt, dass bei gleichem Wassergehalt der Kaliumgehalt der Haut verhältnismäßig niedriger war als in den Kontrollgruppen. Das Verhältnis von relativem K + -Gehalt gegenüber relativem Wassergehalt der Haut zeigte sowohl bei den Kontroll-, als auch bei den DOCA-Tieren, eine lineare Beziehung (s. Abb. 5b). Allerdings war die Kurve unter DOCA-

30 26 Behandlung nach oben verschoben, was bedeutet, dass die Tiere bei einem gegebenen Wassergehalt einen niedrigeren K + -Gehalt in der Haut aufwiesen. rhw (ml g -1 FG) 0,72 0,70 0,68 0,66 0,64 0,62 0,60 0,58 0,56 0,54 0,52 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 rhna + + rhk + (mmol g -1 TG) ( ) Kontrolle Leitungswasser Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser DOCA 1%-NaCl-Wasser Abbildung 5c: Beziehung zwischen der Summe der beiden Elektrolyte (rhna + + rhk + ; mmol/g TG) und relativem Wassergehalt der Haut (rhw; ml/g FG). Es zeigte sich ein lineares Verhältnis bei den Kontrolltieren. Nach DOCA-Behandlung ergab sich ein sigmoidaler Verlauf der Kurve. Dies bedeutet entweder eine Zunahme der Osmolalität (Hypertonizität), oder aber einen partiellen Verlust der osmotischen Eigenschaft des akkumulierten Na + und K + (osmotisch inaktive Na + - Speicherung). Der definitive Nachweis osmotisch inaktiver Na + -Speicherung bzw. Hypertonizität in der Haut von DOCA-NaCl behandelten Tieren erfolgte durch die Untersuchung des (Na + +K + )/Wasser-Verhältnisses im Gewebe. Die Zunahme des (Na + +K + )-Gehaltes in der Haut führte zu einer linearen Zunahme des Wassergehaltes bei Kontrolltieren (s. Abb. 5c). Dagegen zeigten DOCA-behandelte Tiere vor allem unter HS-Diät eine deutliche Rechtsverschiebung des (Na + +K + )/Wasser-Verhältnisses im Vergleich zu den Kontrolltieren. Die Zunahme von effektiven Osmolyten fand demnach in erheblichem Umfang ohne begleitende Flüssigkeitsretention in der Haut statt und war damit per definitionem als osmotisch inaktive Na + -Speicherung aufzufassen Nachweis des osmotisch neutralen Na + /K + -Austausches in der Muskulatur Wasserfreie Na + -Retention kann entweder, wie bereits dargestellt, durch osmotisch inaktive Na + -Speicherung, oder aber durch osmotisch neutrale

31 27 Na + -Speicherung erfolgen. Osmotisch neutrale Na + -Speicherung impliziert eine Zunahme des Na + /Wasser-Verhältnisses, dagegen aber keine Veränderungen des (Na + +K + )/Wasser-Verhältnisses, sowie keine Zunahme von (Na + +K + ) im Gewebe (s. Abb. 4c). In der Muskulatur konnten wir einerseits eine Na + -Zunahme, sowie andererseits eine K + -Abnahme nach DOCA-Behandlung sehen (s. Abb. 3c), was darauf hindeutet, dass hier ein osmotisch neutraler Na + /K + -Austausch stattgefunden hatte. Wir bezogen deswegen die gemessen Elektrolytwerte der Muskulatur ebenfalls auf den Wassergehalt der Muskulatur (s. Abb. 6). Die Parameter wurden nicht auf das Feucht- bzw. Trockengewicht normalisiert, da wir stets 2g Muskulatur untersuchten. 1,75 MW (ml) 1,70 1,65 1,60 1,55 1,50 1,45 1,40 1,35 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 MNa + (mmol) Kontrolle Leitungswasser Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser DOCA 1%-NaCl-Wasser Abbildung 6a: Beziehung zwischen Muskelnatriumgehalt (MNa + ; mmol) und Muskelwassergehalt (MW; ml FG). Es zeigte sich keine Korrelation der Parameter. In der Muskulatur ließ sich im Gegensatz zum Gesamtkörper und der Haut der Tiere keine Beziehung zwischen Na + - und Wassergehalt feststellen, weder unter HS-Diät, noch unter DOCA-Behandlung (s. Abb. 6a).

32 28 1,75 1,70 Abbildung 6b: MW (ml) 1,65 1,60 1,55 1,50 1,45 1,40 1,35 Kontrolle Leitungswasser Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser DOCA 1%-NaCl-Wasser Beziehung zwischen Muskekaliumgehalt (MK + ; mmol) und Muskelwassergehalt (MW; ml FG). Es zeigte sich bei den Kontrolltieren ein linearer Verlauf. Bei DOCA-behandelten Tieren ließ sich kein Zusammenhang nachweisen. 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 MK + (mmol) Das Verhältnis von Muskelkalium zu Muskelwasser zeigte nur bei den Kontrolltieren einen linearen Verlauf (s. Abb. 6b). Bei DOCA-behandelten Tieren ließ sich kein Zusammenhang zwischen den beiden Parametern nachweisen. 1,75 MW (ml) 1,70 1,65 1,60 1,55 1,50 1,45 1,40 1,35 Kontrolle Leitungswasser Kontrolle 1%-NaCl-Wasser DOCA Leitungswasser DOCA 1%-NaCl-Wasser Abbildung 6c: Beziehung zwischen der Summe der beiden Elektrolyte (MNa + + MK + ; mmol) und Muskelwassergehalt (MW; ml). Es zeigte sich ein sigmoidales Verhältnis unabhängig von HS-Diät oder DOCA-Behandlung. 0,24 0,26 0,28 0,30 0,32 MNa + + MK + (mmol) Obwohl sich ausschließlich zwischen Muskelkalium und Muskelwasser der Kontrolltiere ein signifikanter Zusammenhang nachweisen ließ, ergab sich bei der Betrachtung des Verhältnisses von (MNa + + MK + ) gegenüber Wasser ein sigmoidales Verhältnis, welches unabhängig von Salzbelastung bzw. DOCA-Behandlung war (s. Abb. 6c).

33 Elektrolyt- und Wassergehalt verschiedener Gewebe im Vergleich zur Elektrolytkonzentration im Serum Tabelle 3 zeigt die mittleren Na + /Wasser-, K + /Wasser- und (Na + +K + )/Wasser- Quotienten in den verschiedenen Geweben, sowie die Na + - und K + - Konzentrationen im Serum. Kontrolle DOCA n Leitungswasser 1% NaCl Leitungswasser 1% NaCl A. Na + / Wasser (mmol/ml) GKNa + / GKW 10 0,092±0,002 0,092±0,003 0,105±0,005 0,117±0,008* HNa + / HW 10 0,122±0,004 0,136±0,011* 0,125 ± 0,007 0,161±0,021* MNa + / MW 5 0,051±0,006 0,047±0,007 0,066±0,007 0,074±0,010 B. K + / Wasser (mmol/ml) GKK + / GKW 10 0,104±0,005 0,104±0,005 0,103±0,005 0,091±0,008* HK + / HW 10 0,079±0,008 0,079±0,006 0,068±0,003 0,064±0,006* MK + / MW 5 0,121±0,008 0,127±0,010 0,106±0,009 0,102±0,007 C. (Na + + K + ) / Wasser (mmol/ml) GK(Na + + K + ) / GKW 10 0,196±0,005 0,196±0,006 0,208±0,009 0,208±0,009 H(Na + + K + ) / HW 10 0,201±0,011 0,215±0,015* 0,193 ± 0,010 0,225±0,025* M(Na + + K + ) / MW 5 0,172±0,004 0,173±0,005 0,172±0,007 0,176±0,013 D. Serum Na +, Serum K + (mmol/l) Serum Na ,3±0,9 144,0±1,1 146,4±1,6 146,0±1,5 Serum K ,64±0,56 4,02±0,66* 3,67±0,49 3,36±0,38 Tabelle 3: Verhältnis von Na +, K +, sowie (Na + +K + ) gegenüber Wasser, sowie Serum-Na + und Serum-K + der Kontrolltiere und der DOCA-behandelten Tiere nach fünfwöchiger NS-, bzw. HS-Diät. DOCA-Behandlung führte zu einem Anstieg des Na + /Wasser-Verhältnisses im Gesamtkörper, der Haut und der Muskulatur, sowie zu einem Abfall des K + /Wasser-Verhältnisses in den Geweben. Das Verhältnis von (Na + +K + ) gegenüber Wasser stieg im Gesamtkörper nach DOCA-Behandlung, in der Haut nach HS-Diät an. In der Muskulatur zeigten sich keine Veränderungen. Serum-Na + stieg nach DOCA-Behandlung; Serum-K + fiel innerhalb der Kontrollgruppen nach HS-Diät, sowie nach DOCA-Behandlung. Sowohl unter Kontroll-, als auch unter Interventionsbedingungen waren die (Na + +K + )/Wasser- Quotienten in den Geweben stets höher als im Serum. * P Diät < 0,05; P DOCA < 0,05; P DOCA*Diät < 0,05

34 30 Bei den Kontrolltieren zeigte sich keine Veränderung des Na + -Wasser- Verhältnisses im Gesamtkörper durch Fütterung der Hochsalzdiät (s. Tab. 3). Nach DOCA-NS-Behandlung stieg dieses Verhältnis schon auf 0,105 ± 0,005 mmol/ml, nahm nach DOCA-HS weiter bis auf 0,117 ± 0,008 mmol/ml zu und zeigte wasserfreie Na + -Akkumulation an. In der Haut bewirkte schon die Gabe des 1%igen NaCl-Wassers innerhalb der Kontrollgruppen einen Anstieg des Na + -Wasser-Verhältnisses von 0,122 ± 0,004 mmol/ml auf 0,136 ± 0,011 mmol/ml. Die alleinige Gabe von DOCA führte zu keiner Veränderung. Unter DOCA-HS-Diät beobachteten wir dagegen den höchsten Wert von Na + gegenüber Wasser der Haut und damit die deutlichste wasserfreie Na + -Retention im Vergleich zu allen drei anderen Gruppen. Im Skelettmuskel führte Hochsalzdiät zu keiner Änderung des Na + /Wasser- Verhältnisses. Weder in den Kontroll-, noch in den DOCA-Gruppen stieg Na + gegenüber Wasser nach 1%igem NaCl-Wasser an. DOCA-Behandlung führte aber zu einer Zunahme des MNa + /MW-Verhältnisses. Wasserfreie Na + -Retention ließ sich somit durch DOCA-, aber nicht durch Hochsalzdiät induzieren. Das Verhältnis von K + gegenüber Wasser veränderte sich innerhalb der Kontrollgruppen in keinem der untersuchten Gewebe nach Salzdiät. Im Gesamtkörper kam es nach DOCA-HS-Behandlung zu einem mäßigen Abfall von K + gegenüber Wasser. Ebenso verhielt es sich in der Haut und der Muskulatur der Tiere, allerdings bewirkte hier schon die alleinige Gabe von DOCA eine geringe Abnahme der K + -Werte. HS-Diät alleine führte zu keiner Veränderung des (Na + +K + )/Wasser- Quotienten im Gesamtkörper bei den Kontrollgruppen. DOCA-Behandlung führte zu einem Anstieg des Verhältnisses. Eine zusätzliche NaCl-Belastung brachte keine weitere Steigerung des Wertes. In der Haut bewirkte schon die Gabe des NaCl-Wassers eine Zunahme des (Na + +K + )/Wasser-Quotienten. DOCA-Behandlung alleine führte zu keiner Änderung des (Na + +K + )/Wasser- Quotienten im Vergleich zu Kontrolltieren. Innerhalb der beiden DOCA- Gruppen führte die Salzdiät jedoch wiederum zu einer Zunahme des (Na + +K + )/Wasser-Quotienten. Wasserfreie Na + -Akkumulation in der Haut erfolgte damit durch osmotisch inaktive Na + -Speicherung und war diätetisch