Die Öffnung des Pyrazolinon-Heterozyklus im Stoffwechsel von Metamizol und Phenazon Chemische und biochemische Untersuchungen zu Bildung und Verbleib potentiell reaktiver Metabolite dieser Arzneistoffe Von der Gemeinsamen Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Petra Dyckhoff aus Nordhorn
Inhalt SVERZEICHNIS. 1. ALLGEMEINERTEIL 1 1.1 Einleitung 1 1.1.1 Pyrazolinon-Derivate 1.2 Pharmakologie der Pyrazolinon-Derivate 2.2.1 Pharmakodynamik 2.2.2 Unerwünschte Arzneimittelwirkungen (UAW) 4.2.3 Metabolismus 9.2.4 Pharmakokinetik und Metabolismus von Metamizol 11.2.5 Metabolismus von Phenazon 16 1.2 Problemstellung und Zielsetzung 18 1.2.1 Ausgangslage...-. 18 1.2.2 Problemstellung 23 1.2.3 Zielsetzung 24 1.2.4 Übersicht der verwendeten Methoden 25 2. ERGEBNISSE UND DISKUSSION 26 2.1 5-Methyl-2-phenyl-3,4-dioxopyrazolin 26 2.1.1 Untersuchungen zur Stabilität im wässrigen Medium 26 2.1.2 Charakterisierung im physiologischen System 31 2.1.2.1 Lipophilie 31 2.1.2.2 Proteinbindung 33 2.2 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure 36 2.2.1 Analytik von 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure 36 2.2.1.1 HPLC-Analytik 37 2.2.1.2 Probenaufarbeitung 38
2.2.1.3 Wiederfindung aus biologischer Matrix 41 2.2.1.4 Proteinfällung durch methanolische Zinksulfat-Lösung 43 2.2.2 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure im Metamizol-Stoffwechsel 44 2.2.2.1 In vivo-untersuchungen 44 2.2.2.2 Ex vivo-untersuchungen am Modell der isolierten, Hämoglobin-frei perfundierten Rattenleber 48 2.2.2.3 Diskussion der Ergebnisse 50 2.2.3 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure im Phenazon-Stoffwechsel 52 2.2.3.1 In vivo-untersuchungen 53 2.2.3.2 Ex vivo-untersuchungen am Modell der isolierten Hämoglobin-frei perfundierten Rattenleber 57 2.2.3.3 Diskussion der Ergebnisse 64 2.2.4 Zum Verbleib von 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure 64 2.2.4.1 Stabilität von 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure in vitro 64 2.2.4.2 Stabilität von 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure ex vivo 68 2.2.4.3 Diskussion der Ergebnisse 70 2.3 Rubazonsäure und Methylrubazonsäure 74 2.3.1 Analytik von Rubazonsäure und Methylrubazonsäure 74 2.3.1.1 HPLC-Analytik 74 2.3.1.2 Probenaufarbeitung... 76 2.3.2 Untersuchungen zur Stabilität von Rubazonsäure und Methylrubazonsäure... 77 2.3.3 Methylrubazonsäure-Bildung im Phenazon-Stoffwechsel 84 2.3.4 Rubazon- und Methylrubazonsäure-Bildung im Metamizol-Stoffwechsel 91 2.4 Massenspektrometrische Untersuchungen zum Nachweis intakter Phase-II-Metabolite 97 2.5 Mipafox Hemmversuche 106 2.5.1 Bestimmung der Cholinesteraseaktivität in Rattenplasma 107 2.5.2 Hemmung der Ratten-Cholinesterase durch Mipafox in vitro 109 2.5.3 Hemmung der Ratten-Cholinesterase durch Mipafox in vivo 110 2.5.4 Stoffwechselversuche unter Mipafox Belastung an Ratten 111 2.6 Synthese der Referenzsubstanzen 114 3. ZUSAMMENFASSUNG 115
III 4. EXPERIMENTELLERTEIL 119 4.1 Proteinbindung 119 4.1.1 Bindung an Rinderserumalbumin 119 4.1.2 Bindung an Rattenserumprotein 120 4.2 Verteilungskoeffizient 121 4.3 Spektroskopische Untersuchungen zur hydrolytischen Ringöffnung des Pyrazolinon-Heterozyklus 123 4.3.1 Qualitative Untersuchungen 123 4.3.2 Quantitative Untersuchungen 123 4.3.3 Bestimmung des molaren Absorptionskoeffizienten 123 4.4 Test der Übertragbarkeit der Phenylhydrazin-Gruppe von 2-Oxo-3-pheny lhy drazono-buttersäure auf Ketone 124 4.5 In vivo-stoffwechselversuche 124 4.5.1 Human-Versuch 124 4.5.2 Ratten-Versuche 125 4.5.2.1 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure-Ausscheidung im Urin 125 4.5.2.2 Cholinesterasehemmung durch Mipafox 126 4.6 Ex vivo-stoffwechselversuche Modell der isolierten Hämoglobin-frei perfundierten Rattenleber 128 4.6.1 Organpräparation 128 4.6.2 Perfusions-Apparatur 129 4.6.3 Perfusionsversuche 131 4.7 Konjugat-Hydrolyse 132 4.7.1 Saure Hydrolyse 132 4.7.2 Enzymatische Hydrolyse 132 4.8 Untersuchungen zur Stabilität von Rubazonsäure und Methylrubazonsäure 133 4.9 HPLC-Analytik 134 4.9.1 2-Oxo-3-phenylhydrazono-buttersäure(OPBS) 134, 4.9.1.1 Festphasenextraktion zur OPBS-Analytik 135
jv 4.9.1.2 Proteinfällung durch methanolische Zinksulfatlösung 134 4.9.1.3 HPLC-Chromatographie zur OPBS-Analytik 136 4.9.2 Methylrubazonsäure (MRS) 137 4.9.2.1 Festphasenextraktion zurivirs-analytik 137 4.9.2.2 HPLC-Chromatographie zur MRS-Analytik 137 4.9.3 Rubazonsäure (RS) und Methylrubazonsäure (MRS) 138 4.9.3.1 Festphasenextraktion zur RS-und MRS-Analytik 138 4.9.3.2 HPLC-Chromatographie zur RS-und MRS-Analytik 139 4.10 Dünnschichtchromatographie 140 4.11 Massenspektrometrie 141 4.12 Synthese der Referenzsubstanzen 142 4.13 Chemikalien und Pufferlösungen 144 4.14 Statistik 146 4.15 Spektren: IR, EI-MS 146 5. LITERATUR 149 6. ANHANG 163 6.1 Abkürzungen und Symbole 163 6.2 Formelbilder und Nomenklatur 165 6.3 Lebenslauf 169