Abschlussbericht für die DBU Herrn Dr. Maximilian Hempel

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1 Abschlussbericht für die DBU Herrn Dr. Maximilian Hempel Projekt Entwicklung neuer Methoden für die systematische Erfassung von gesundheitsschädlichen Schimmelpilzen AZ Sension GmbH In Kooperation mit der Abteilung Umweltambulanz, Klinikum Augsburg Erstellt von Dr. med. Monika Schulze und Dr. rer. nat. Peter Schneider Im Zeitraum von Dezember 2003 bis Oktober 2005 wurden die im Folgenden erläuterten Arbeiten durchgeführt und die beschrieben Ergebnisse erzielt. Die Arbeiten erfolgten in Anlehnung an den F&E-Plan des Antrages bei der DBU. 1

2 Inhaltsverzeichnis: 1 ANLASS UND ZIELSETZUNG DES PROJEKTS KURZFASSUNG DES BERICHTS KLINISCHER BERICHT EINLEITUNG METHODEN Wohnbereich Probenahme Analytik Klinische Untersuchungen Anamnese: Fragebogen: Körperliche Untersuchung: Laboruntersuchungen: Allergologische Untersuchungen: Lungenfunktionsanalyse: ERGEBNISSE Klinische Untersuchungen Wohnraumuntersuchungen Statistische Auswertungen Zusammenhänge zwischen klinischen Befunden und kulturellem Schimmelnachweis in der Wohnung Zusammenhänge zwischen klinischen Befunden und Glucannachweis im Hausstaub Zusammenhänge zwischen Staub-CFU und Glucankonzentration Nachbefragung ZUSAMMENFASSUNG ELISA-ENTWICKLUNG METHODEN ZUR ELISA-ENTWICKLUNG Herstellung von Hapten-Konjugaten für die Immunisierung Gewinnung polyklonaler β-glucan-antikörper Optimierung des ELISAs Plattenbeschichtung (Coating) Austestung verschiedener Blockaden und der Plattenkonservierung Auswahl weiterer Reagenzien und Optimierung der Testbedingungen Strategien zur Optimierung der Kit-Haltbarkeit RESULTIERENDE REAGENZIENZUSAMMENSETZUNG DER ELISA-TESTS Herstellung der beschichteten Mikrotiterplatten Darstellung der Kit-Reagenzien Darstellung der Kit-Konzepte Ergebnisse und resultierende Vorschriften zur Durchführung des ELISAs zur Analytik von Staubproben Testdurchführung Schematische Darstellung des ELISA-Formats ERGEBNISSE ZUR ELISA-VALIDIERUNG Charakterisierung und Validierung des ELISAs zur Erfassung von β-(1 3)-Glucanen Erstellung der Standardkurve Spezifität und Kreuzreaktionen zu anderen Glucanen Bestimmung der β-(1 3)-Glucangehalte verschiedener kultivierter Schimmelpilzspezies METHODEN ZUR AUFBEREITUNG VON STAUBPROBEN ERGEBNISSE ZUR VALIDIERUNG DER ELISA-ANALYTIK MIT STAUBPROBEN ALS MATRIX Linearität von Verdünnungsreihen Wiederfindungsmessungen mit bekannten Staubproben MODIFIZIERTE METHODEN ZUR SAMMLUNG VON STAUBPROBEN ERGEBNISSE ZUR METHODIK PRAKTIKABLER STAUBPROBENSAMMLUNGEN MESSUNG DER Β-(1 3)-GLUCAN-KONZENTRATIONEN VON STAUBPROBEN, DIE VON DER UMWELTAMBULANZ GESAMMELT WURDEN Vergleich von Endotoxin- und β-(1 3)-Glucankonzentrationen

3 5 TESTSTREIFENENTWICKLUNG TESTSTREIFEN AUFBAU PRINZIP DES TESTSTREIFENS METHODIK ZUR OPTIMIERUNG DES LATERAL-FLOW-TESTSTREIFENS Optimierung des Probenpuffers Optimierung der Antigenlösung zur Herstellung der Fängerlinie Variationen in der Beschichtungskonzentration und Zusammensetzung der Beschichtungslösung für Kontrolllinie Conjugate Release Pads (CRPs) Variationen in der Linienhöhe Auswahl geeigneter Membrantypen Sample Pads ERGEBNISSE DER TESTSTREIFENENTWICKLUNG Zusammensetzung der optimierten Lösungen nach dem gegenwärtigen Stand VALIDIERUNGSVERSUCHE MITTELS HPLC DISKUSSION Β-(1 3)-GLUCAN-ELISA-TEST Single-Spezies-Untersuchungen Probennahme und Auswertung von Staubproben sowie klinische Bewertung der Resultate Analytik von Baumaterialien Geplante weitere Anwendungen des β-glucan-elisas ETABLIERUNG UND KÜNFTIGE ANWENDUNG DES β-glucan-teststreifens QUALITÄTSKONTROLLE, ERGÄNZENDE HPLC-ANALYTIK UND ERSTELLUNG VON SOPS FAZIT KOOPERATIONEN, ÖFFENTLICHKEITSARBEIT UND VERMARKTUNGSAKTIVITÄTEN LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Anlage 1: Anlage 2: Anlage 3: Anlage 4: Anlage 5: Anlage 6: Anlage 7: Protokoll Wohnraumbegehung Probenahme in der Wohnung des Patienten Bewertungshilfe von Staubproben Berechnung von 0,95-Konfidenz- und Prognoseintervallen Instructions to: SensioMold ELISA β-glucan Enzyme Immunoassay Kit Instructions to: Dust Collector zur unkomplizierten Staubprobensammlung Poster zur Testentwicklung 3

4 1 Anlass und Zielsetzung des Projekts Das gehäufte Auftreten gesundheitlicher Beschwerden in feuchten bzw. schimmeligen Wohnungen wurde in zahlreichen Studien beschrieben (Pirhonen, Nevalainen et al. 1996; Kollar, Reinhold et al. 1997; Rylander 1997; Andriessen, Brunekreef et al. 1998; Hirvonen, Ruotsalainen et al. 1999; Mücke und Lemmen 1999; Rylander 1999; Douwes, Zuidhof et al. 2000; Moriske 2001). Berichtet wird über Erkrankungen der Atemwege aber auch über allgemeine unspezifische Befindlichkeitsstörungen. Schimmelpilze wirken infektiös, allergen und entzündlich-toxisch. Echte Infektionen der Atemwege (z.b. Pneumonien) mit Schimmelpilzen stellen hauptsächlich ein Problem bei immunsupprimierten Patienten dar z.b. mit Leukämie, Lymphom, nach Organtransplantationen. Die Kolonisierung bzw. Infektion erfolgt durch Inhalation der Pilzsporen. Schimmelpilze führen zu allergischen Reaktionen vom Typ I (Rhinitis, Konjunktivitis, Asthma bronchiale) und Typ III (exogen-allergischer Alveolitis). Eine Sonderform stellt die allergische bronchopulmonale Aspergillose dar. Der Zusammenhang zwischen einer Schimmelpilzbelastung im Wohnbereich und kindlichen Atopien ist inzwischen gut belegt (Loidolt, Gailhofer et al. 1989). Mehrere Studien (Andriessen, Brunekreef et al. 1998; Garrett, Rayment et al. 1998) zeigten eine positive Korrelation zwischen einer erhöhten Raumluftkonzentration an Schimmelpilzen und kindlichem Asthma bronchiale. Von 209 asthmatischen Kindern reagierten 14% im Hauttest auf Schimmelpilze (Moriske 2001). Asthma ist die Hauptmanifestation von IgE-vermittelten Pilzallergien, da Schimmelpilzsporen mit einem Durchmesser < 10 µm direkt in den Bereich der Bronchiolen gelangen. Pilzsporen können auch obere Atemwegssymptome in Form einer Typ I Rhinitis und Konjunktivitis auslösen. Eine Untersuchung in einer HNO-Klinik bei Patienten mit Inhalationsallergien ergab eine Prävalenz von Pilzsporenallergien von 3%. Über entzündlich-toxische Wirkungen ist noch wenig bekannt. Sie werden in Zusammenhang gebracht mit Mykotoxinen, sog. MVOCs (microbial volatile organic compounds) und β- Glucanen. Beschrieben werden Atemwegsbeschwerden und unspezifische Symptome wie Müdigkeit, Kopfschmerzen, Gelenkschmerzen, Schwindel, gastrointestinale Störungen. In der Literatur ist ein Zusammenhang zwischen Schimmelpilzexposition und menschlicher Gesundheit belegt, auch unabhängig von den Allergien (Kollar, Reinhold et al. 1997; Douwes, Zuidhof et al. 2000; Chew, Douwes et al. 2001). Außer den epidemiologischen Studien konnten Untersuchungen anhand der Messung von Entzündungsparametern einen Einfluss der Schimmelpilze auf die Gesundheit nachweisen (Douwes, Doekes et al. 1996). Dharmage et al (Dharmage, Bailey et al. 2001) konnte bei Schimmelexposition in Innenräumen eine erhöhte bronchiale Hyperreagibilität zeigen. Die Zellwand von Schimmelpilzen enthält Glucane, Mannane und weitere Polysaccharide (Gehring, Douwes et al. 2001). (1-3)-beta-D-Glucane sind endotoxinähnliche Zellwandbestandteile mit entzündungsfördernden Wirkungen insbesondere von Pilzen, aber auch einigen Bakterien sowie niederen und höheren Pflanzen (Douwes, Doekes et al. 1996; Douwes, Zuidhof et al. 2000; Chew, Douwes et al. 2001; Milton, Alwis et al. 2001). Betaverknüpfte Glucane sind die häufigste Form, die in Pilzen auftritt. Von diesen von den Pilzen 4

5 abgeleiteten beta-d-glucanen wird berichtet, dass sie eine Vielzahl von Aspekten der Immunantwort modulieren (Beijer, Thorn et al. 2002). Thorn (Thorn und Rylander 1998) konnte einen Zusammenhang zwischen der (1-3)-beta-D- Glucan Exposition und einem Anstieg der Allergiehäufigkeit, der Myeloperoxidase im Serum und einem Abfall des Lungenfunktionsparameters FEV1 zeigen. Gewertet wurden diese Befunde als Hinweis auf eine unspezifische Entzündung. Bei Arbeitern in der Müllabfuhr fand sich eine erhöhte Zahl von Blutlymphozyten in Abhängigkeit von der (1-3)-beta-D- Glucan-Konzentration am Arbeitsplatz sowie vermehrt Symptome im Sinne von Diarrhoe, verlegter Nasenatmung und Müdigkeit (Beijer, Thorn et al. 2002). Wan (Wan und Li 1999) fand eine enge Korrelation zwischen (1-3)-beta-D-Glucan und den Beschwerden der Betroffenen, insbesondere Müdigkeit. Rylander (Rylander 1997; 1999) untersuchte Schüler einer Schule mit einem Schimmelproblem im Vergleich zu einer Kontrollschule. In der Problemschule war die Konzentration des (1-3)-beta-D-Glucans signifikant höher, die Schüler hatten vermehrt respiratorische und allgemeine Symptome (Schleimhautirritationen, Husten, Heiserkeit, Müdigkeit, Kopfschmerzen). Hohe (1-3)-beta-D-Glucan-Konzentrationen im Hausstaub führten bei Kindern zu erhöhten Schwankungen bei der Messung des Peak-flows (PEF). Beim Personal einer Tagesstätte mit einem Schimmelproblem wurden Symptome und bronchiale Empfindlichkeit gemessen sowie der (1-3)-beta-D-Glucan-Gehalt in der Raumluft. Nach der Renovierung fielen die (1-3)-beta-D-Glucan-Konzentrationen ab und eine geringere Personenzahl wies eine bronchiale Hyperreagibilität auf. Es besteht somit eine Beziehung zwischen (1-3)-beta-D-Glucan als Indikator der Biomasse und der Symptomausprägung der Patienten (Atemwegssymptome, Müdigkeit, Kopfschmerzen). (1-3)-beta-D-Glucan ist somit ein Risikoparameter. Wie demonstriert, wird die Inhalation von (1-3)-beta-D-Glucan in Zusammenhang mit Beschwerden der oberen Atemwege und der Induktion von Entzündungsparametern gebracht. Ein Zusammenhang zwischen der Höhe der (1-3)-beta-D-Glucan-Konzentration im Umfeld und Symptomausprägung der Patienten, Entzündungsparametern und Lungenfunktion konnte, wie beschrieben, gezeigt werden. Schimmelpilzbelastungen in Innenräumen stellen somit ein ernsthaftes gesundheitliches Risiko für die betroffenen Personen dar und besitzen eine eindeutige umweltmedizinische Relevanz. Da Schimmelbelastungen in direktem Zusammenhang mit möglicherweise erforderlichen Sanierungsmaßnahmen und auch zu Fragestellungen einer gezielten und ausgewogenen Wärmedämmung stehen, sind Routineverfahren zur Abschätzung möglicher Schimmelbelastungen auch für weitere umweltrelevante Fragestellungen von hoher Bedeutung. Bislang gibt es keine einheitlichen Erfassungsmethoden und Bewertungsmaßstäbe für Schimmelbefall in Innenräumen. Insbesondere die sachgemäße Probennahme steht wiederholt in der Diskussion. Die etablierten Verfahren zur differenzierten mikrobiologischen Schimmelanalytik sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Für Routineuntersuchungen zur raschen und wirtschaftlichen Detektion möglicher Schimmelbelastungen wurde ein rasches und effizientes Verfahren etabliert. Die etablierte Analytik wird unterschiedlichen Anwendergruppen wie beispielsweise Fachleuten aus der Umweltmedizin kommerziell angeboten werden. 5

6 2 Kurzfassung des Berichts In Innenräumen breiten sich Schimmelpilze zunehmend aus. Sie entstehen in besonderem Maße durch Feuchteschäden und werden durch zu strikte Isoliermaßnahmen und durch schlechtes Lüften in ihrem Wachstum begünstigt. Mehr als 80% seiner Zeit verbringt der Mensch in Innenräumen. Daher ist das Risiko an Erkrankungen, die beispielsweise durch Innenraumallergene ausgelöst werden können, auch nicht zu unterschätzen. Zu den Erkrankungen und Befindlichkeitsstörungen, die mit Schimmelpilzen in Zusammenhang gebracht werden, zählen insbesondere allergische Reaktionen sowie reizende und toxische Effekte. Nach Angaben des Arbeitskreises Gesundes Wohnen werden mikrobiologisch belastete Wohnungen nicht ausreichend untersucht. Dies ist jedoch die Voraussetzung, um das Schadensausmaß einer Belastung abschätzen zu können. Hierfür stehen eine ganze Reihe mikrobiologischer Untersuchungsverfahren zur Verfügung. Diese Verfahren sind jedoch ausgesprochen arbeitsintensiv und erfordern ein hohes Maß an Fachkenntnissen. Deshalb sollte zusätzlich ein Verfahren entwickelt, validiert und kommerziell verfügbar gemacht werden, das für den Routineanwendung geeignet ist und die Analytik auch einer größeren Stichprobenzahl erlaubt. Schimmelwachstum in der Wohnung sollte aus präventivmedizinischen Gründen vermieden werden. Aufgabe der Forschung ist es, die Bedeutung von Schimmelnachweis hinsichtlich der menschlichen Gesundheit zu klären. Die Messung von Schimmelkonzentrationen durch mikrobiologische Methoden erlaubt bisher keinen Rückschluss auf gesundheitliche Wirkungen. Grundvoraussetzung ist deshalb ein methodisch zuverlässiger Schimmelnachweis im Innenraum. Im Rahmen dieses Forschungsprojektes wurde der Schimmelnachweis nach bisher empfohlenen kulturellen Verfahren der Mikrobiologie durchgeführt (Leitfaden zur Vorbeugung, Untersuchung, Bewertung und Sanierung von Schimmelpilzwachstum in Innenräumen des Umweltbundesamtes; Schimmelpilze in Innenräumen Nachweis, Bewertung, Qualitätsmanagement des Arbeitskreises Qualitätssicherung Schimmelpilze in Innenräumen am Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg). Für den methodisch zuverlässigen Nachweis wurde mit β-glucan eine Komponente ausgewählt, die in Schimmelpilzen, bzw. Schimmelsporen praktisch ubiquitär vorkommt und daher als Marker für Schimmelpilzwachstum herangezogen werden kann. Zudem besitzt β- Glucan eine eindeutige gesundheitliche Relevanz. Mit β-glucan wird neben keimfähigem auch nicht mehr keimfähiges Material nachgewiesen, was aufgrund der möglichen Wirkungen auch nicht mehr keimfähigen Materials auf die Gesundheit durchaus vorteilhaft ist. Ein ELISA zum Nachweis von β-glucanen als gesundheitsrelevantem Marker für Schimmelpilze (Schimmelpilze, Schimmelpilzsporen, keimfähiges und nicht keimfähiges Material) wurde etabliert, optimiert und validiert. Es steht ein sensitiver, hochspezifischer und robuster ELISA-Test zur Verfügung. Optimierungsschritte zur ausreichenden Lagerfähigkeit aller einzelnen Kit-Bestandteile sind abgeschlossen. Die Konzeption des Test-Kits ist fertig gestellt und steht als Prototyp zur Verfügung. 6

7 Ein Verfahren zur Bestimmung von Staubproben ist etabliert. Dabei geht es um eine sachgemäße Probennahme, Probenaufarbeitung und Probenanalytik. Staubproben aus Wohnräumen von 100 Patienten wurden sachkundig genommen, aufgearbeitet, im ELISA analysiert und mikrobiologisch kultiviert. Personen, die gesundheitliche Störungen durch Schimmel in der Wohnung vermuteten, wurden in der Umweltambulanz internistisch und allergologisch untersucht. Die Ergebnisse der klinischen Untersuchungen wurden statistisch auf Zusammenhänge mit dem Nachweis von Schimmel in der Wohnung überprüft. Die Probennahme wurde für die Zielsetzung einer breiten und praktikablen Anwendbarkeit des ELISA-Test-Kits zur Bestimmung von Staubproben vereinfacht und standardisiert. Hierfür wurden Maßnahmen zur Erleichterung der Extraktion und insbesondere zur unkomplizierten Probennahme erarbeitet. Die Probennahme stellt bei nahezu allen Tagungen einen zentralen Diskussionspunkt dar. Dieser Problematik wird durch die beschriebene Standardisierung mit Hilfe von definierten Verfahren zur Sammlung von Staub begegnet. Neben der Vereinfachung des Verfahrens zur unkomplizierten Sammlung von Staubproben (s. Anlage 6) wurde auch die Bestimmung von stärker kontaminierten und weniger stark kontaminierten Baumaterialien exemplarisch erprobt. Da in der Baubiologie Bedarf an schnellen und wirtschaftlichen Testmöglichkeiten besteht, soll die Beurteilung von Baumaterialien auf Schimmelpilzbelastung künftig weiter validiert und angeboten werden. Die β-glucananalytik könnte im Bereich von Gebäudesanierungen künftig eine wichtige Rolle spielen. Während des Förderzeitraums hat die β-glucananalytik in Staubproben eine zentrale Rolle gespielt. Die Analytik soll auf unterschiedliche Materialien und Oberflächen bedarfsorientiert ausgeweitet werden. Die Etablierung von Lateral-Flow-Teststreifen ist noch nicht abgeschlossen, doch konnten erste Prototypen hergestellt werden. Die Optimierung und Validierung der Lateral-Flow- Tests, sowie die Anpassung an die jeweils spezifischen Applikationen, wird über den Förderzeitraum hinaus weiter verfolgt werden. Ein Technologietransfer, der mit einem USamerikanischen Unternehmen vereinbart wurde, bietet Grundlagen für die bestmögliche Technologie und Unabhängigkeit von externen Patentansprüchen. Für die geplante Produktion der etablierten Nachweissysteme wird es erforderlich sein, ein entsprechendes Qualitätsmanagement verfügbar zu haben. Einige der Voraussetzungen dafür, wie die Erstellung von SOPs, ist in weiten Zügen erstellt. Da im Rahmen von Zertifizierungen wie ISO 9000 oder für eine CE-Kennzeichnung unabhängige Kontrollmethoden zur Verifizierung erforderlich sein werden, wurden die methodischen Vorraussetzungen für eine entsprechende β-glucan-hplc-analytik geschaffen. Zusammenfassend wurden folgende Arbeiten durchgeführt: Entwicklung eines ELISAs zum Nachweis von β-glucan - Gewinnung β-glucan-spezifischer Antikörper - Darstellung unterschiedlicher Protein-Glucan-Konjugate - Optimierung des ELISA-Tests - Etablierung geeigneter Puffersysteme - Stabilisierung der Reagenzein 7

8 Etablierung und Optimierung der Probenahme und der Probenvorbereitung - Etablierung der Gewinnung von Staubproben in Innenräumen - Methodenmodifizierungen zur praktikablen Gewinnung von Staubproben - Vorversuche zur Anwendung der ELISA-Analytik für weitere Probentypen (zusätzlich zu den Staubproben) - Etablierung und Optimierung der Probenvorbereitung Darstellung eines ELISA-Kit-Prototypen zur Staubanalytik - Etablierung eines konfektionierten ELISA-Test-Kits - Erstellung einer Anleitung (Anlage 5) zum Test-Kit und zur Sammlung von Staubproben (Anlage 6) - Vorarbeiten zur Erstellung von SOPs für die geplante Produktion - Vorabeiten für eine ergänzende HPLC-Analytik zur Validierung Pantientenbezogene Untersuchungen - Etablierung der mikrobiologischen Schimmelpilzanalytik am Klinikum mit Technologietransfer vom LGA Baden-Württemberg - Klinische Untersuchungen von 100 Patienten mit spezifischen Symptomen - Mikrobiologiosche Untersuchungen von Staubproben auf Schimmelbelastung der 100 Patienten - β-glucan-analytik mit dem etablierten ELISA der Staubproben der 100 Patienten - Statistische Auswertung des gesamten Datenmaterials Arbeiten zur Etablierung eines Anti-β-Glucan-Teststreifens - Herstellung von Goldkonjugaten für einen Lateral-Flow-Teststreifen - Etablierung eines vorläufigen Prototypen, der bezüglich seiner Empfindlichkeit noch weiter zu optimieren ist Produktvermarktung - Knüpfung von verschiedenen, teilweise internationalen Kontakten zur Produktvermarktung sowie Vorbereitung der Produktpräsentation in Netzwerken. - Ausrichtung und Besuche verschiedener fachspezifischer Veranstaltungen mit Vorträgen und Posterpräsentationen 8

9 3 Klinischer Bericht Klinikum Augsburg, Umweltambulanz 3.1 Einleitung Die gesundheitliche Bedeutung von Schimmelbefall im Wohnraum soll untersucht werden. Dazu werden Personen, die vermeintlich durch Schimmel krank sind, klinisch abgeklärt. Voraussetzung ist ein methodisch korrekter Nachweis von Schimmel in der Wohnung. Hierzu werden die derzeit anerkannten Methoden herangezogen. Nach derzeitigem Stand der Wissenschaft sind die kulturellen Methoden am besten überprüft. Ein standardisiertes Messverfahren zum Schimmelnachweis im Innenraum steht für den umweltmedizinischen Bereich nicht zur Verfügung. Untersucht werden Pilzkulturen aus Luft und Staubproben sowohl quantitativ als auch qualitativ. Da es kein Verfahren zum Nachweis von Schimmelpilzen gibt, das einen eindeutigen Nachweis in allen Situationen erbringt, wird parallel zu den kulturellen Verfahren die entnommene Staubprobe aus dem Wohnraum durch die Firma Sension mittels eines neuen immunologischen Verfahrens untersucht. Die klinische Diagnostik beinhaltet internistische und allergologische Spezialuntersuchungen, die zur Abklärung möglicher allergischer, irritativer oder toxischer Wirkungen von Pilzen zur Verfügung stehen. Patienten, die in der Umweltambulanz vorstellig werden und bei denen Verdacht auf eine Schimmelpilzproblematik besteht, werden im Rahmen des Projektes untersucht. Ist in der Wohnung tatsächlich Schimmel nachweisbar, wird der Patient der schimmelbelasteten Gruppe zugeordnet. Die Beschwerden dieser Patienten werden verglichen mit den Patienten, die sich zwar krank fühlen, bei denen aber objektiv kein Schimmel in der Wohnung nachweisbar ist. 3.2 Methoden Die Untersuchungen gliedern sich in 2 Bereiche: Wohnbereich Klinische Untersuchungen Wohnbereich Die Untersuchung des Wohnraums setzt sich aus einer Ortsbegehung mit Besichtigung der Räumlichkeiten und Erhebung physikalischer Faktoren sowie der eigentlichen Probenahme von repräsentativen Staub- und Luftproben zusammen. Die Bearbeitung der Proben erfolgt im Labor des Klinikums Augsburg. Zur Untersuchung des Wohnbereichs wird vor Begehung durch die Umweltambulanz ein Termin mit dem Patient vereinbart. Der Patient wird wie folgt informiert: - Der zu untersuchende Raum muss mit einem Teppichboden bzw. einem Teppich ausgelegt sein. Wenn kein Teppichbelag vorhanden ist, kann auch ein Teppich od. 9

10 Läufer mit mindestens 1 m² aus einem anderen Raum für die Zeit der Beprobung in das Zimmer gelegt werden. Dieser sollte jedoch vorher gründlich abgesaugt werden. - 7 Tage vor dem vereinbarten Untersuchungstermin dürfen keine Reinigungsarbeiten mehr in dem zu untersuchenden Raum durchgeführt werden (Staubwischen, Staubsaugen, etc.). Die Fenster müssen 6 8 Std. vor dem Termin geschlossen sein. - Am Untersuchungstag wird der Patient vor der Abfahrt nochmals kontaktiert um sicher zu stellen, daß die geforderten Maßnahmen eingehalten wurden und somit der Termin auch eingehalten werden kann. - Falls sich der Patient nicht an die vorgegebenen Maßnahmen hielt, wird ein neuer Termin vereinbart und der Patient nochmals darauf hingewiesen, dass ohne Einhaltung der verlangten Maßnahmen eine Beprobung der Räume nicht stattfinden kann. Zum geplanten Zeitpunkt fahren zwei Mitarbeiter der Umweltambulanz zur Wohnung des Patienten Probenahme Ortsbegehung Eine genaue Wohnraumanamnese wird erhoben, die Baudaten, Lüftungsverhalten, Beobachtungen der Bewohner im zeitlichen Verlauf beinhalten. Die Betroffenen besichtigen mit den Mitarbeitern der Umweltambulanz die auffälligen Stellen. Physikalische Parameter (Feuchtigkeit, Temperatur) werden in den zu beprobenden Räumlichkeiten aufgenommen. Abbildung 1: Sichtbarer Schimmelfleck an Schrankhinterwand. Diese sowie die weiteren Schritte werden in einem Probenahmeprotokoll festgehalten (Anlage 1). In einem zweiten Schritt erfolgt die eigentliche Probenahme, die im Detail in Anlage 2 beschrieben ist. Routinemäßig werden in jeder Wohnung Luft- und Staubproben durchgeführt. 10

11 Luftprobe: Der Raum mit fraglichem Schimmelbefall und die Außenluft werden beprobt mittels eines Luftkeimsammlers (RCS, Fa Biotest), der auf dem Impaktionsprinzip beruht. Ein voreingestelltes Luftvolumen wird angesaugt. Die Pilzsporen gelangen so auf ein im Gerät befindliches Nährmedium. Die Probe im Raum wird in ca. 1,20 m Höhe entnommen, die Außenluft ca. 1 m außerhalb des beprobten Raumes. Abbildung 2: Vorbereitung des Luftkeimsammlers Staubprobe: Im fraglich schimmelbefallenen Raum wird eine repräsentative Stelle ausgesucht. Gesaugt wird der Teppichboden oder ein Teppich, da hier eine höhere Staubdichte zu erwarten ist. Verwendet wird ein Industriestaubsauger, der freundlicherweise vom Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg zur Verfügung gestellt worden ist. Die beprobte Fläche beträgt 1 m 2.Der Filterhalter enthält einen Gelatinefilter, an dem sich der gesammelte Staub abschlägt. Der Filterhalter ist desinfizierbar und wird nach jeder Anwendung aufbereitet. Abbildung 3: Staubsammlung 11

12 Abklatschprobe Bei sichtbarem Schimmelbefall wird zusätzlich eine Abklatschprobe der betroffenen Stellen angefertigt. Ein Nährmedium wird leicht gegen die Oberfläche der befallenen Stelle angedrückt. Abbildung 4: Sichtbare Schimmelecke zwischen Fenster und Türe an Hauswand Analytik Am gleichen Tag erfolgt die Aufarbeitung. Im Labor werden folgende Untersuchungen durchgeführt: Staub: a) Die Staubprobe wird mit dem 100-fachen ihres Gewichtes mit einer 0,9% NaCl / 0,01% Tween 80 Lsg. versetzt und 30 min. geschüttelt bzw. gerührt (Magnetrührer). Dabei löst sich die Gelatine auf. Jeweils 100 µl der erhaltenen Suspension und weiterer Verdünnungen von 1:10, 1:100 (1:1000) werden auf jeweils zwei DG 18-Agar Platten und jeweils zwei Malzextraktplatten ausgespatelt. b) Als Bebrütungstemperatur wird 25 +/- 3 C eingestellt c) Schimmelpilze können sich gegenseitig in ihrem Wachstum behindern. Daher sollten auf Platten, die ausgewertet werden sollen, nicht mehr als 100 KBE pro Platte vorhanden sein. Spezielle Gattungen wie z. B. Chrysonila, Botrytis, Mucor, Rhizopus, Trichoderma und auch die Spezies Aspergillus niger können die Platte sehr schnell überwuchern. Ich solchen Fällen sind rechtzeitig Subkulturen anzulegen. 12

13 d) Bestimmung der Gesamt-KBE Zur Bestimmung der Gesamt-KBE werden je nach Wachstum die Kolonien in der Regel ab dem 3. Tag täglich ausgezählt. Mindestens 10, besser 20 KBE und höchstens 100 KBE pro Platte sollen ausgezählt werden. Hier lassen sich die Kolonien oft am besten quantifizieren. Zur Bewertung kommt die Auszählung mit der höchsten Anzahl KBE, bei der noch keine Sekundärsporen auftreten. Je nach Belastung des Objekts, den zu erwartenden Schimmelpilzen und vor allem dem gewählten Nährmedium kann die Bebrütungszeit bis zu 10 Tagen und länger dauern. Zur Bestimmung der Gesamt-KBE-Zahl wird in der Regel das Ergebnis der DG-18 Platten verwendet. Schimmelpilze die auf DG-18 nicht kultiviert werden können, wie z. B. Stachybotrys chartarum oder Chaetomium spp. werden auf Malzextrakt kultiviert, ausgezählt und zu der auf der DG-18 Platte ermittelten KBE-Zahl zur Gesamt-KBE-Zahl zusammengeführt. Abbildung 5: Auswertung der Kulturplatten im Labor e) Differenzierung Die Differenzierung der Schimmelpilzspezies erfolgt aufgrund der Morphologie des makroskopischen und mikroskopischen Bildes. Abbildung 6: Verschiedene Pilzkolonien auf Kulturplatte 13

14 Indikatororganismen sind auch bei geringer Anzahl zu differenzieren und zu quantifizieren. Die Schimmelpilzspezies müssen in allen Verdünnungsstufen ausgewertet werden und in die Beurteilung mit einfließen. Dazu ist in den niedrigen und hohen Verdünnungsstufen eine semiquantitative Bewertung zur Quellenauffindung unabdingbar. Abbildung 7: Aspergillus fumigatus Als Methode zum mikroskopischen Nachweis wird das Klebefilmpräparat genutzt. Die Präparation kann mit Baumwollblau bzw. Lactophenolblau angefärbt werden. Abbildung 8: Kulturplatte 14

15 ^ Abbildung 9: Mikroskopische Darstellung Luft: Die Differenzierung erfolgt mit Hilfe mehrerer Handbücher über Differenzierungsschlüssel Die Luftkeimindikatoren für Innen- und Außenluft werden bei 25 +/- 3 C bebrütet. Die Auszählung erfolgt makroskopisch. Eine Berechnung der Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Kubikmeter (m³) findet nach folgender Gleichung statt: 3 KBE pro Luftkeimindikator KBE / m = 1000 ( Liter) eingestelltes Sammelvolumen (100 bzw. 200 l) Aufgrund des makroskopischen und mikroskopischen Befundes werden die Pilze weiter differenziert. Abklatsch: Die Abklatschprobe wird bei 25 +/- 3 C kultiviert. Je nach Wachstum werden die Kolonien ab dem dritten Tag täglich ausgezählt. Die Bebrütungszeit kann bis zu 10 Tagen dauern. Gewachsene Kolonien werden auf DG18 u. Malzextrakt-Platten isoliert. Die Differenzierung erfolgt mikroskopisch. Nach Auswertung der Kulturen werden die Ergebnisse schriftlich der Umweltambulanz vorgelegt. 15

16 3.2.2 Klinische Untersuchungen Die Patienten stellten sich zum vereinbarten Termin in der umweltmedizinischen Ambulanz vor. Hier wurden folgende Untersuchungen durchgeführt: Anamnese: Jetzige Beschwerden, frühere Erkrankungen, Sozialanamnese (einschließlich einer genauen Beschreibung des Lebensumfeldes). Abbildung 10: Gespräch mit Patient Fragebogen: Der Patient füllte einen Fragebogen aus, in dem eingehende Angaben zu Beschwerden, Lebensgewohnheiten, Ernährungsgewohnheiten, Lebensumfeld, Wohnbereich, Arbeitsbereich, Krankheitsanamnese, bisherigen Behandlungen und Arztbesuche erhoben werden Körperliche Untersuchung: Es wurde ein Ganzkörperstatus durchgeführt. Schwerpunktmäßig wurden die oberen und unteren Atemwege und Hautbefunde erfasst. 16

17 Laboruntersuchungen: Bestimmt wurden Blutsenkungsgeschwindigkeit, C-reaktives Protein, Kleines Blutbild, Differentialblutbild, Elektrophorese Allergologische Untersuchungen: Bei jedem Patienten wurden Hauttestungen in Form eines Prick-Testes durchgeführt auf: Schimmelpilze (Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum, Penicillium expansum), Hausstaubmilben und Katzenhaare, bei Vorhandensein eines Haustieres entstprechende Tierhaare, ab 1/05 zusätzlich Aureobasidium pullulans, Mucor mucedo, Botrytis cinerea. Zusätzlich wurden Blutuntersuchungen durchgeführt hinsichtlich Allergie: Gesamt IgE, Eosinophiles kationisches Protein, Tryptase, spez. IgE Antikörper auf Schimmelpilze: Gruppe Schimmel (Penicillium notatum, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Alternaria tenuis) und Hausstaubmilbe, ab 5/04 (50. Teilnehmer) zusätzlich Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Phoma betae. Abbildung 11: Hauttest Lungenfunktionsanalyse: Da Schimmelpilze zu Lungenfunktionseinschränkungen führen können wurde bei jedem Patienten eine Spirometrie, Flussvolumenkurve, zentrale Atemwegswiederstände mittels Occlusionsmethode und Blutgasanalyse durchgeführt. 17

18 Abbildung 12: Lungenfunktionsanalyse 3.3 Ergebnisse Klinische Untersuchungen Das Kollektiv setzte sich aus 37 Männern und 63 Frauen zusammen. Das Durchschnittsalter lag bei 47 Jahren (22 79 Jahre). S. Abbildung 13 Altersgruppe männlich weiblich männlich weiblich Altersgruppe Abbildung 13: Alters- und Geschlechtsverteilung der Patienten Folgende Erkrankungen des allergischen Formenkreises waren anamnestisch bekannt: 17 Asthma bronchiale, 16 Heuschnupfen, 12 Neurodermitis. Folgende Beschwerden wurden von den Patienten angegeben (absteigende Reihenfolge): Beschwerden Zahl der Patienten Prozent % Kopfschmerzen 57 57% 18

19 Augenreizungen % Schnupfen 53 53% Kurzatmigkeit % Hautreizungen 46 46% Infektähnliche Symptome 46 46% Tabelle 1: Klinische Beschwerden der Patienten (anamnestische Angabe) Bei den klinischen Untersuchungen zeigten sich folgende Auffälligkeiten: Untersuchung Zahl der Patienten Prozent % Körperliche Untersuchung 58 58% Entzündungsparameter 35 35% Gesamt IgE 17 17% Spirometrie 6 6% spez. IgE Schimmel 4 4% Prick-Test Schimmel 1 1% Tabelle 2: Erhobene Befunde der Patienten (klinische Untersuchung) Bei der körperlichen Untersuchung waren die meisten Auffälligkeiten im Bereich der oberen Atemwege (geröteter Rachen) nachweisbar. Die Entzündungsparameter wurden als auffällig beurteilt, wenn einer der folgenden Werte erhöht war: Blutsenkung, C-reaktives Protein, Elektrophorese, Leukozyten. Folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der in-vitro Allergiediagnostik. Patienten Pilz Spezifisches IgE RAST-Klasse Nummer KU/l (Ref. < 0,34) 53 Cladosporium herbarum Alternaria tenuis 3 1, Rhizopus nigricans 1, Rhizopus nigricans 0, Aspergillus fumigatus Alternaria tenuis Rhizopus nigricans 0,46 6,5 0,

20 Tabelle 3: In-vitro Allergiediagnostik Aufgeführt sind die 4 Patienten mit erhöhten IgE-Antikörpern gegenüber mindestens einem Pilz. Die Häufigkeit der Gesamt-IgE Erhöhungen lag im Bevölkerungs-durchschnitt. Spezifische IgE-Antikörper auf Schimmelpilze waren bei 4 Patienten nachweisbar, im Hauttest (Pricktest) wies ein Patient eine eindeutig positive Reaktion auf. Die Lungenfunktionsanalyse wurde als auffällig beurteilt, wenn eine der folgenden Untersuchungen pathologische Werte zeigte: FVC, FEV1, zentrale Atemwegswiederstände, periphere Flussparameter, Blutgase Wohnraumuntersuchungen Die Bewertung von Schimmel in der Wohnung wurde auf Grund des Leitfadens Schimmelpilze in Innenräumen Nachweis, Bewertung, Qualitätsmanagement des Landesgesundheitsamtes Baden-Württemberg vorgenommen (Anlage 3). In die Bewertung bezüglich des Vorhandenseins von Schimmel gingen die Ergebnisse der Wohnrauminspektion sowie die kulturelle Bewertung von Luft, Staub und Abklatschproben ein. Es wurde, wie im Leitfaden beschrieben, die Einteilung in: Innenraumquelle unwahrscheinlich Innenraumquelle nicht auszuschließen Innenraumquelle wahrscheinlich getroffen, in Abhängigkeit von den jahreszeitlichen Schwankungen. Folgende Befunde wurden erhoben: Kein Schimmelnachweis Schimmelnachweis Zahl der Patienten Tabelle 4: Schimmelnachweis im Wohnraum Schimmel nicht auszuschließen* *Hinweis für Innenraumquelle, weitere Quellensuche und ggf. Sanierung empfohlen Bewertungshilfe Schimmelpilze in Innenräumen, LGA Baden-Württemberg Die häufigsten kultivierbaren Pilze im Hausstaub sind in nachfolgender Tabelle dargestellt. Die Häufigkeit unterliegt jahreszeitlichen Schwankungen und ist in absteigender Reihenfolge aufgeführt: 20

21 Sommer Winter - Penicillium spp. - Penicillium spp. - Aspergillus spp. - Cladosporium spp. - Cladosporium spp. - Aspergillus spp. - Alternaria spp. - Fusarium spp. - Fusarium spp. - Alternaria spp. Tabelle 5: Häufigkeit der kultivierten Pilze in jahreszeitlicher Abhängigkeit Penicillium spp.: Die Gattung Penicillium kommt im gemäßigten Klima insbesondere im Boden vor, kann aber diverse Materialien befallen. Penicillien sind die wichtigsten Lebensmittelverderber. Sie können Allergien und selten Pilzinfektionen auslösen. Die häufigsten Arten sind P. expansum, P. brevicompactum, P. chrysogenum, P. glabrum. Aspergillus spp.: Aspergillen sind häufige und hinsichtlich der gesundheitlichen Relevanz sehr wichtige Schimmelpilze. Die über 100 bekannten Arten sind ubiquitäre Bewohner des Erdbodens, kommen aber auch in Baumaterialien, Lebensmitteln und Pflanzen vor. Viele Arten produzieren Mykotoxine, können Infektionen und Allergien verursachen. Der medizinisch wichtigste Vertreter ist Aspergillus fumigatus, der thermotolerant ist und aufgrund dessen in Wohnungen bei Erwärmung gute Wachstumsbedingungen vorfindet (z.b. Topfpflanzen über Heizkörpern, Müll). Aspergillus fumigatus kann bei abwehrgeschwächten Personen zu schweren Organmykosen führen. Weitere häufig vorkommende Arten sind A. niger, A. flavus, A. ochraceus, A. terreus, A. restrictus, A. nidulans. Cladosporium spp.: Cladosporium kommt weltweit auf abgestorbenen Pflanzen und organischen Materialien vor. Cladosporium herbarum ist der häufigste Vertreter der europäischen Luftsporenflora. Er bildet große Mengen an Sporen, die mit dem Wind sehr weit fliegen können. Allergien können ausgelöst werden. Alternaria spp.: Alternaria gehört zu den Schwärzepilzen und braucht zum Wachstum relativ viel Feuchtigkeit. Die etwa 40 Arten sind verbreitete Materialzerstörer und Lebensmittelverderber. Medizinisch am bedeutsamsten ist Alternaria alternata, der häufig Allergien auslöst. Fusarium spp.: Fusarien sind weltweit verbreitet und insbesondere am Abbau von Pflanzen beteiligt. Fusarien bilden typischerweise Toxine. Cladosporium und Alternaria kommen in großer Zahl in der Außenluft vor, deshalb sind ihre Konzentrationen größeren jahreszeitlichen Schwankungen unterworfen. Die Konzentrationen von Aspergillus spp. und Penicillium spp. gelten als relativ stabil im Jahresverlauf. 21

22 3.3.3 Statistische Auswertungen In der Literatur sind Zusammenhänge zwischen klinischen Beschwerden und Schimmelvorkommen beschrieben Zusammenhänge zwischen klinischen Befunden und kulturellem Schimmelnachweis in der Wohnung Geprüft wurden klinische Merkmale der Patienten sowie Laborparameter in Bezug auf das Vorhandensein von Schimmel (Ja/Nein/Möglich) im Wohnbereich. Für vier verschiedene Patientenbeschwerden ergaben sich, separat geprüft, Abhängigkeiten. Es waren dies die folgenden Beschwerden: Beschwerden im Nasenbereich (Ja/Nein) BKS (verändert/nicht verändert) Gesamt IgE (verändert/nicht verändert) Schimmel (spez. IgE) (verändert/nicht verändert) Es wurden also jeweils zwei qualitative Merkmale miteinander verglichen, was jeweils zur Betrachtung einer (2x3)-Kontingenztafel führte. Bei diesen jeweils größer als (2x2) Kontingenztafeln ( (2 x 3) 2 Zeilen, 3 Spalten) wurde eine Teststatistik (χ 2 -Teststatistik) benutzt, die unter der zu testenden Nullhypothese (Unabhängigkeit zwischen Vorhandensein der Beschwerde und Schimmelpilznachweis ) asymptotisch χ 2 -verteilt ist mit (2-1)*(3-1) = 2 Freiheitsgraden. Dieser Test wird im Folgenden mit χ 2 -Test bezeichnet. Ein Problem bei diesem Test ist also, dass die Teststatistik unter der zu testenden Nullhypothese nur approximativ χ 2 -verteilt ist. Eine grobe Faustregel besagt nun, dass man bei der χ 2 - Teststatistik mit einer zufriedenstellenden Annäherung rechnen kann, wenn in jeder Zelle mindestens fünf Beobachtungen vorliegen. Ist diese Faustregel verletzt, so sollte zumindest die Yarnold-Regel (siehe Hartung: Statistik Lehr- und Handbuch der angewandten Statistik, Seite 439) erfüllt sein, welche folgendes besagt (n ist dabei die Anzahl der Summe aller Zellen, in unseren Beispielen war stets n = 100): Ist n 0 die Anzahl der Zellen in der Kontingenztafel mit Häufigkeit kleiner oder gleich fünf, so sollten alle Häufigkeiten mindestens 5 * n 0 /n sein, damit die Verteilung der χ 2 -Teststatistik ausreichend genau durch die χ 2 -Verteilung beschrieben wird. Da in der Praxis das Ergebnis möglich beim Merkmal Schimmelpilznachweis mit größter Wahrscheinlichkeit als ein JA zu interpretieren ist, präsentieren wir auch noch die Ergebnisse für den Fall, dass man die möglich -Ergebnisse zu JA nimmt. In diesen Fällen ergeben sich dann (2x2)-Kontingenztafeln. Bei diesen (2x2)-Kontingenztafeln wurde jeweils der sogenannte exakte Test von R.A. Fisher angewandt. Die Anwendung dieses Tests ist in diesen Situationen das Beste, was man machen kann, er ist allerdings nur für (2x2)- Kontingenztafeln konzipiert. 22

23 Bei den genannten Tests handelt es sich um sogenannte Niveau-α-Signifikanztests. Bei derartigen Niveau-α-Signifikanztests ist grundsätzlich zu beachten, dass nur der Fehler 1.Art (Entscheidung für die Alternativhypothese H1, obwohl in Wirklichkeit die Nullhypothese H0 richtig ist) durch α beschränkt wird, nicht jedoch der Fehler 2.Art (Entscheidung für H0, obwohl H1 richtig wäre). Ergibt sich aufgrund des Tests eine Entscheidung zugunsten H1, so kann man also sagen, dass die Gültigkeit von H1 statistisch erwiesen ist und die Irrtumswahrscheinlichkeit höchstens α beträgt (das Experiment hat in diesem Fall dann also einen signifikanten Widerspruch zur Gültigkeit von H0 ergeben). Liefert der Test dagegen eine Entscheidung für H0, so ist diese rein formal zu sehen (ohne Überzeugungskraft die Gültigkeit von H0 ist nun also keineswegs statistisch erwiesen). Man kann in diesem Fall lediglich sagen, dass das Experiment keinen signifikanten Widerspruch zur Gültigkeit von H0 ergeben hat ( es spricht nichts dagegen jedenfalls nicht signifikant). Sollen mögliche signifikante Unterschiede auch tatsächlich als solche erkannt werden, so wären in diesem Fall weitere Untersuchungen bzw. weitere Tests nötig. Wir testeten stets zum 5%-Niveau (also α = 0.05). (a) Beschwerden im Nasenbereich und Schimmelpilznachweis (2x3)-Tafel: Beschwerden im Nasenbereich Schimmelpilznachweis Nein Ja Möglich Zeilensumme Nein Ja Spaltensumme Unter Beschwerden im Nasenbereich wurden verlegte Nasenatmung, Niesen, Schnupfen und chronische Nasennebenhöhlenentzündungen zusammengefasst. Die Durchführung des χ 2 -Testes ergab, dass zum 5%-Niveau signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten gesichert sind. Bei Patienten mit Beschwerden im Nasenbereich ist daher signifikant häufiger ein Schimmelpilznachweis (in der Wohnung) feststellbar. Bei diesen war in 37,84 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 48,65 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Bei den Patienten ohne derartige Beschwerden war in 30,77 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 19,23 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Unter den Patienten, bei denen ein eindeutiger Schimmelpilznachweis feststellbar war, hatten 77,78 % Beschwerden im Nasenbereich, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis möglich waren dies sogar 87,80 %, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis Nein hingegen nur 43,48 %. (2x2)-Tafel: Beschwerden im Schimmelpilznachweis Nein Ja Zeilensumme 23

24 Nasenbereich Nein Ja Spaltensumme Der exakte Test von R.A. Fisher ergab, dass auch hier im oben beschriebenen Sinne zum 5%-Niveau signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten gesichert sind (Bestätigung des obigen qualitativen Resultates). (b) BKS und Schimmelpilznachweis (2x3)-Tafel: BKS Schimmelpilznachweis Nein Ja Möglich Zeilensumme Nicht verändert Verändert Spaltensumme Die Durchführung des χ 2 -Testes ergab hier zwar signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten zum 5%-Niveau, jedoch ist dieses Resultat mit äußerster Vorsicht zu genießen, da weder die oben erwähnte Faustregel noch die ebenfalls erwähnte Yarnold- Regel erfüllt sind (siehe die rote Markierung). Die Zellhäufigkeiten sind für eine verlässliche Aussage nicht groß genug. Bei Patienten mit BKS-Resultat verändert war in 83,33 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 16,67 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Bei den Patienten mit BKS-Resultat nicht verändert war in 32,98 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 42,55 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Unter den Patienten, bei denen ein eindeutiger Schimmelpilznachweis feststellbar war, hatten 13,89 % ein verändertes BKS-Resultat, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis möglich waren dies hingegen nur 2,44 % und bei Patienten mit Schimmelpilznachweis Nein sogar nur 0 %. (2x2)-Tafel: BKS Schimmelpilznachweis Nein Ja Zeilensumme Nicht verändert Verändert Spaltensumme

25 Der exakte Test von R.A. Fisher ergab zum 5%-Niveau keine signifikanten Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten (bzw. es war keine klare Entscheidung möglich). Man müsste hier schon eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 20 % zulassen, um behaupten zu können, dass unter den Patienten mit BKS-Ergebnis verändert der Anteil der Patienten mit Schimmelpilznachweis signifikant höher ist als dies unter den Patienten mit BKS-Ergebnis Nicht verändert der Fall ist. Ebenso verhält es sich, was den Anteil der Patienten mit BKS-Ergebnis verändert unter den Patienten mit und ohne Schimmelpilznachweis anbelangt (auch hier α=0.2 für Signifikanz erforderlich). (c) Gesamt IgE und Schimmelpilznachweis (2x3)-Tafel: Gesamt IgE Schimmelpilznachweis Nein Ja Möglich Zeilensumme Nicht verändert Verändert Spaltensumme Die Durchführung des χ 2 -Testes ergab, dass zum 5%-Niveau signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten gesichert sind. Die oben angesprochene Faustregel ist zwar verletzt, aber zumindest ist die schwächere Yarnold-Regel erfüllt, sodass man das Resultat jedenfalls unter diesem Aspekt als akzeptabel bezeichnen kann. Bei Patienten mit Gesamt-IgE-Resultat verändert war in 64,71 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 17,65 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Bei den Patienten mit Gesamt-IgE -Resultat nicht verändert war in 30,12 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 45,78 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Unter den Patienten, bei denen ein eindeutiger Schimmelpilznachweis feststellbar war, hatten 30,56 % ein verändertes Gesamt-IgE- Resultat, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis möglich waren dies hingegen nur 7,32 % und bei Patienten mit Schimmelpilznachweis Nein waren es 13,04 %. (2x2)-Tafel: Gesamt IgE Schimmelpilznachweis Nein Ja Zeilensumme Nicht verändert Verändert Spaltensumme Der exakte Test von R.A. Fisher ergab zum 5%-Niveau keine signifikanten Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten. Man müsste hier schon eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 42 % zulassen, um behaupten zu können, dass unter den 25

26 Patienten mit Gesamt-IgE-Ergebnis verändert der Anteil der Patienten mit Schimmelpilznachweis signifikant höher ist als dies unter den Patienten mit Gesamt- IgE -Ergebnis Nicht verändert der Fall ist. Ebenso verhält es sich, was den Anteil der Patienten mit Gesamt-IgE-Ergebnis verändert unter den Patienten mit und ohne Schimmelpilznachweis anbelangt (auch hier α=0.42 für Signifikanz erforderlich). (d) Schimmel (spez. IgE) und Schimmelpilznachweis (2x3)-Tafel: Schimmel (spez. IgE) Schimmelpilznachweis Nein Ja Möglich Zeilensumme Nicht verändert Verändert Spaltensumme Die Durchführung des χ 2 -Testes ergab hier zwar signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten zum 5%-Niveau, jedoch ist dieses Resultat mit äußerster Vorsicht zu genießen, da weder die oben erwähnte Faustregel noch die ebenfalls erwähnte Yarnold- Regel erfüllt sind (siehe die rote Markierungen). Die Zellhäufigkeiten sind für eine verlässliche Aussage nicht groß genug. Bei Patienten mit Schimmel (spez. IgE) -Resultat verändert war in 100 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar. Bei den Patienten mit Schimmel (spez. IgE) -Resultat nicht verändert war in 33,33 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 42,71 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Unter den Patienten, bei denen ein eindeutiger Schimmelpilznachweis feststellbar war, hatten 11,11 % ein verändertes Schimmel (spez. IgE) -Resultat, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis möglich und nein waren dies jeweils 0 %. (2x2)-Tafel: Schimmel (spez. IgE) Schimmelpilznachweis Nein Ja Zeilensumme Nicht verändert Verändert Spaltensumme

27 Der exakte Test von R.A. Fisher ergab zum 5%-Niveau keine signifikanten Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten (bzw. es war keine klare Entscheidung möglich). Man müsste hier schon eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 35 % zulassen, um behaupten zu können, dass unter den Patienten mit Schimmel (spez. IgE) -Ergebnis verändert der Anteil der Patienten mit Schimmelpilznachweis signifikant höher ist als dies unter den Patienten mit Schimmel (spez. IgE) -Ergebnis Nicht verändert der Fall ist. Ebenso verhält es sich, was den Anteil der Patienten mit Schimmel (spez. IgE) -Ergebnis verändert unter den Patienten mit und ohne Schimmelpilznachweis anbelangt (auch hier α=0.35 für Signifikanz erforderlich). Fazit: Auch unter dem Aspekt, dass die möglich -Resultate wohl ziemlich sicher ein JA bedeuten, das nur nicht ganz zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte, kann man zum 5%- Niveau eigentlich nur hinsichtlich der Beschwerden im Nasenbereich von wirklich signifikanten Zusammenhängen mit dem Merkmal Schimmelpilznachweis sprechen. Allerdings sind aber auch bei den übrigen Merkmalen auch dies zeigte unsere Auswertung diesbezügliche Tendenzen zu erkennen. Somit konnte gezeigt werden, dass Personen, bei denen Schimmel in der Wohnung nachweisbar ist, auch häufiger unter Schnupfen leiden, häufiger eine erhöhte Blutsenkungsgeschwindigkeit als Hinweis für eine mögliche entzündliche Reaktion aufweisen und häufiger Hinweise für eine mögliche Allergie liefern Zusammenhänge zwischen klinischen Befunden und Glucannachweis im Hausstaub Die vier genannten Patientenbeschwerden, für die sich aufgrund statistischer Tests eine Abhängigkeit zum kulturellen Schimmelnachweis in der Wohnung zeigte, wurden jeweils separat mit dem quantitativen Merkmal Glucankonzentration (pro m 2 ) verglichen. Es waren dies die folgenden Beschwerden: Beschwerden im Nasenbereich (Ja/Nein) BKS (verändert/nicht verändert) Gesamt IgE (verändert/nicht verändert) Schimmel (spez. IgE) (verändert/nicht verändert) Entsprechend dem Vorhandensein bzw. Nichtvorhandensein der jeweiligen Beschwerde wurden die 100 Patienten in zwei Kollektive (Gruppen) aufgeteilt. Wir haben zwei verschiedene Testverfahren benutzt und das qualitative Resultat war bei beiden jeweils dasselbe, nämlich keine signifikanten Zusammenhänge. Da in der Literatur (Gehring) die Auffassung vertreten wurde, dass die Glucankonzentrationsmessungen am besten durch eine Lognormalverteilung beschrieben werden könnten, haben wir die Daten logarithmiert und auf diese logarithmierten Daten den entsprechenden t-test angewandt. Zur Sicherheit haben wir aber auch zusätzlich einen Test angewandt, der keine speziellen Verteilungsannahmen voraussetzt (verteilungsfrei), nämlich den Wilcoxon-Rangsummentest (auch Mann- Whitney-U-Test gennant), der auf signifikante Verteilungsunterschiede hin prüft. 27

28 Beide Tests ergaben bei allen vier Merkmalen keine signifikanten Zusammenhänge zur Glucankonzentration Zusammenhänge zwischen Staub-CFU und Glucankonzentration Die Zahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) als Ergebnis der mikrobiologischen Verfahren wurde auf Zusammenhang mit der Glucankonzentration, bestimmt durch immunologische Methoden, untersucht. Die Einzelergebnisse sind in Abbildung 30 aufgeführt. (a) Betrachtung des Korrelationskoeffizienten Da beide Merkmale quantitativ sind, existiert der Korrelationskoeffizient und wir können hierfür Schätzungen berechnen, z.b. den Pearsonschen ( gewöhnlichen ) Korrelationskoeffizienten r p oder den Spearmanschen Rangkorrelationskoeffizienten r s. r s entsteht dadurch, dass man in die Formel für r p statt der tatsächlichen Beobachtungen die entsprechenden Rangzahlen (hier von 1 bis 100) einsetzt. Für den tatsächlichen Korrelationskoeffizienten K zweier Zufallsvariabler X (hier Staub- CFU) und Y (hier Glucankonzentration) gilt stets -1 <= K <= 1. Falls X und Y voneinander unabhängig sind, so gilt K=0 (Unkorreliertheit). Es existiert genau dann ein linearer Zusammenhang zwischen X und Y, wenn entweder K=-1 oder K=1 ist. r p ist hinsichtlich Anwendung und Interpretation vor allem bei Normalverteilungsannahme geeignet. So ist z.b. bei Verwendung von r p die Normalverteilungsannahme Voraussetzung für die Anwendbarkeit der dazugehörigen Signifikanztests. Da davon im vorliegenden Fall nicht ausgegangen werden kann, benutzen wir den (verteilungsfreien) r s und die dazu gehörigen Signifikanztests. Ist r p =1 oder r p =-1, so liegen alle Punkte auf einer Geraden, wobei überhaupt r p lineare Zusammenhänge zwischen X und Y misst bzw. in gewisser Weise den Grad der Linearität zwischen X und Y angibt. Je verstreuter die Punkte liegen, desto näher liegt r p bei 0. Allerdings kann r p unter Umständen auch 0 sein, wenn ein starker nichtlinearer Zusammenhang zwischen X und Y besteht. r s basiert wie gesagt nur auf Rangzahlen und nimmt beispielsweise auch schon dann den Wert 1 an, wenn die Beobachtungen streng monoton wachsend sind, auch wenn kein linearer Zusammenhang besteht. In diesem Fall würde dann also der wahre, aber unbekannte Korrelationskoeffizient K von r s überschätzt. In unserem Fall ergaben sich folgende Werte: r p = 0,1256 r s = 0,2334 Für Signifikanzüberprüfungen benutzten wir also den (verteilungsfreien) Spearmanschen Rangkorrelationskoeffizienten r s und die dazu gehörigen Signifikanztests. Wir 28