4 Chiroptische Methoden
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- Harald Keller
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1 15 4 Chiroptische Methoden Circulardichroismus (CD) Optische otationsdispersion (OD) 4.1 Polarisiertes icht inear polarisiertes icht inear polarisiertes icht setzt sich aus rechts- und links-circular polarisiertem icht zusammen. Der Betrag sowie die Drehfrequenzen von E und E sind gleich. Circular polarisiertes icht Erzeugung aus zwei linear polarisierten Wellen, die 90 phasenverschoben sind. inks circular polarisierter icht E E 2 läuft E 1 voraus links circular polarisiertes icht E 2 hinkt E 1 hinterher rechts circular polarisiertes icht
2 Circulardichroismus Die Extinktionskoeffizienten für rechts- und links circular polarisiertes icht sind für eine optisch aktive Substanz unterschiedlich. Messaufbau Monochromator E λ E λ,45 Billingscell E, Sample Detector Double refracting material Optical axes Modulator Optical axes θ λ Computer Extraordinary beam Ordinary beam different velocities Erzeugung von circular polarisiertem icht mit dem λ/4-plättchen bestehend aus einem doppelbrechenden Material definierter Dicke. Doppelbrechende Materialien sind aufgrund ihrer Gitterstruktur optisch anisotrop. In ihnen breitet sich das icht inverschiedenen ichtungen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten aus. Bei Eintritt eines ichtstrahls wir dieser in zwei Teilstrahlen aufgespalten, einen ordentlichen und einen außerordentlichen Strahl., die in aufeinander senkrecht stehenden Ebenen polarisiert sind. Wenn icht senkrecht zur optischen Achse auftrifft, dann breiten sich die beiden Strahlen in der gleichen ichtung aus, aber ihre Geschwindigkeiten sind unterschiedlich. Sie verlassen den
3 17 Kristall mit erin Phasendifferenz, die von dessen Plattendicke und von der Wellenlänge des einfallenden ichts abhängt. Benutzt man ein solches Plättchen mit einer Dicke von λ/4, so treten zwei senkrecht aufeinander stehende Strahlen, die um 90 phasenverschoben sind, aus dem Plättchen aus. Optisch aktive Moleküle Ein elektronischer Übergang ist erlaubt, wenn ein von Null verschiedenes Übergangsdipolmoment existiert. µ = Ψ µ Ψ el 21 2 el 1 Die Oszillatorstärke band el el εν D 21 = µ µ dν ν Einige Übergänge sind elektronisch verboten, aber magnetisch erlaubt. Diese haben ein nicht verschwindendes magnetisches Übergangsmoment: µ = Ψ µ Ψ m 21 2 m 1 Die otationsstärke band el m Θν 21 = Im( µ µ ) dν ν In symmetrischen Molekülen ist das magnetische Übergangsmoment immer senkrecht zum elektrischen Übergangsmoment, deshalb ist 21 = 0. Es muss eine Parallelkomponente von µ el zu µ m existieren. Jedes Molekül, welches kein Symmetriezentrum besitzt zeigt optische Aktivität (Quantentheorie der optischen Aktivität von osenfeld, 1929) Coronen (optisch inaktiv) Hexahelicen (optisch aktiv)
4 18 Was wird gemessen? Die Messgröße ist die Differenz der Extinktionskoeffizienten des rechts und links polarisierten ichts. Also gilt nach ambert-beer: ( ε ε ) E = E E = c d Angegeben wird allerdings die Elliptizität Θ: Θ= ln10 4 π ( ε ε ) cd E E b Θ b = E + Ε E a a = E E E T E T E : änge des E-Feld-Vektors des circular polarisierten ichts (: rechts, : links) T : Transmission tan E E T T a + Ε T + T b Θ= = = E erweitern mit ( T T ) + liefert T T tanθ = T + 2 T T + T Der Unterschied zwischen T und T ist klein, daraus folgt: tan Θ Θ und T + 2 T T + T 4T
5 19 Θ = mit T = T T 4T Nach ambert gilt: logt E log T + = E = und eihenentwicklung um = 0: ln T + T = lnt + T 1 log T + T = logt + T ln E E = ( E E) = logt + logt = T ln10 T ln10 E = E E = T 1 Θ = = ln10 E 4T 4 1 ln10 E = ε cd = ε ε c d Θ = ln10 ε ε 4 π cd Spezifische Elliptizität Θ Θ = in grad cm 2 g -1 cd [ ] zur Berechnung benötigt man die genaue Konzentration bei Proteinen: ε 190 = M -1 cm -1 pro Aminosäurerest (nicht genau genug) ε 280 (in 6 M GuHCl) = x Trp M -1 + y Tyr M -1 Molare Elliptizität [ ] [ Θ] M Θ = in grad cm 2 dmol -1 (100 hat historische Gründe) M 100 M = molare Masse des Moleküls
6 20 Mean residue weight ellipticity [ ] [ Θ] MW Θ = in grad cm 2 dmol -1 MW 100 MW = mittlere molare Masse des Monomers des Polymers Elektronische CD von Proteinen Circulardichroismus wird in dem Bereich der elektronischen Übergange der Moleküle gemessen. UV-Spektrum Poly--Alanin (α-helix) CD-Spektrum Poly--Alanin (α-helix) Bestimmung von Sekundärstrukturen in Proteinen Sind über ein Protein keine kristallographischen Daten verfügbar, so hilft die CD- Spektroskopie, die Sekundärstrukturanteile in einem Protein zu bestimmen.
7 21 Poly--ysin Annahme: Ein CD-Spektrum eines Proteins ist die Summe der CD-Spektren der einzelnen Sekundärstrukturelemente A) Bestimmung von Sekundärstrukturen mittels eferenzspektren von Poly--ysin Θ = Θ + Θ + Θ T χhelix helix λ χsheet sheet λ χrandom random λ B) Bestimmung von Sekundärstrukturen mittels eferenzspektren eines Protein- Datensatzes (öntgenkristallstrukturdaten) CONTIN (S. Provencher, Comput. Phys. Commun. 1982, 27, , ) SECON3 (N. Sreerama &.W. Woody, J.Mol.Biol. 1994, 242, ) Varselec (.A. Compton,. A. & W. C. Johnson, Anal. Biochem. 1986, 155, P. Manavalan & W. C. Johnson, Anal. Biochem. 1987, 167, ) K2D - neural network method (Andrade et al. Prot Engineering 1993, 6, )
8 22 Hämoglobin Hemoglobin Tumor necrosis factor Eco I α-helix: 68 % β-sheet: 5 % C: 27 % α-helix: 68 % β-sheet: 0 % C: 32 % Tumor Nekrose-Faktor Hemoglobin Tumor necrosis factor α Eco I Endonuclease α-helix: 33 % β-sheet (antiparallel): 20 % β-sheet (parallel): 5 % β-turns: 17 % C: 27 % α-helix: 26 % β-sheet (antiparallel): 20 % β-sheet (parallel): 8 % β-turns: 25 % C: 21 %
9 23 Kinetische Betrachtung der Proteinfaltung und -entfaltung ückfaltung von ysozym nach Guanidiumhydrochlorid (6 M) Verdünnung. Insertion von Peptiden in ipidmembranen offene Kreise: POPC geschlossene Kreise POPG c B : gebundenes Peptid c f : freies Peptid c : Gesamt-ipidkonzentration
10 Elektronische CD von Nukleinsäuren AMP: Purine besitzen keine Asymmetrie und demnach ist das Molekül optisch inaktiv. Eine leichte Asymmetrie wird in das Nukleotid durch die N-glykosidische Bindung zur Desoxyribose eingeführt, so dass optische Aktivität im CD-Spektrum beobachtet werden kann. dapa: Das Dinukleotid zeigt durch die Kopplung der beiden Basen bereits deutlich optische Aktivität. Poly-A: In einem Polymer liegt eine starke Kopplung vor, so dass die Elliptizität stark zunimmt. Zudem tragen die Anordnung der Basen im aum zusätzlich zur optischen Aktivität bei. Sekundärstruktur von DNA CD-Spektren von DNA geben Aufschluss über die Konformation der DNA in ösung. Pohl und Jovin (1972) entdeckten mittels CD-Spektroskopie die Z-Form der DNA.
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