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1 r._ Besimmung von W eichweizen in hochemperaurgerockneen Teigwaren: Besandsaufnahme und zukünfige Perspekiven J.C. Auran und J. Bonicel. Monpellier/Frankreich reagierenden monoclonalen Anikörper (Prof. Paraf. Laboraoire dlnnunologie INRA, Tours. Frankreich und Mr. Violle. Laboraoire de Technologie des Cereales INRA. Monpellier. Frankreich! Durumweizen fmmunes. basierend auf einem monoclonalen Anikörper gegen das Friabilin (Prof. Simson. Universiy of Srahclyde und Mr. Bony. Rhöne Poulenc. Problemsellung l Diagnosic. Glasgow, UK und Lyons. Frankreich!. 2. Einsazmöglichkeien und Grenzen der verschiedenen Mehoden Teigwaren sind in Europa ein wichiges Lebensmiel. insbesondere in Ialien (25 kg Roheigwaren/Kopf/Jahr}. Griechenland. Frankreich (6 kgl und Spanien. Die bese Qualiä hinsichlich Nährwer und Kochpoenial erreich man mi Durumeigwaren. Wegen dieser Qualiäsdifferenz und wegen des im Januar 993 beginnenden Binnenmarkes mi einem freien Lebensmielhandel zwischen den M igliedssaaen muß der Verbraucher darüber informier werden. ob es sich um eine Hargrießeigware oder um eine Teigware handel, die 2.. Elekrophor ese und Quanifizierung von D-w-Gliadin Frakionen (Dr. Auran und Mrs. Bonicel. Laboraoire de Technologie des Cereales INRA. Monpellier Prinzip Frankreich) aus einer Mischung von WeichVJeizen und Durumweizen hergesell wurde. Diese Verbraucherinforrnaion muß leich und versändlich sein. In den lezen Jahren wurden verschiedene Mehoden für die Weichweizenbesimmung vorgeschlagen. insbesondere elekrophoreische und immunochemische Besimmungen der Proeine (Albumine) oder der Enzyrne (Peroxidasen). speziell für das D Genom des Weichweizens. Sämliche vorgeschlagenen Mehoden sind jez nich mehr verrauenswürdig, da bei der Teigwarenhersellung die Hochemperaurrocknung eingeführ wurde und auch neue Produke in Forrn von vorgekochen Teigwaren am Mark sind. Daher mußen andere Mehoden zur Besimmung des Weichweizenaneiles rn Teigwaren enwickel werden. um auch bei hochemperaurgerockneen Teigwaren die verschiedenen Prozensäze exak erlassen zu können. Daher ha die Kommission der Europäischen Gerneinschal lcomrnuniy Bureau of Reference. DG XIII ein dreijähriges Forschungsprogramrn finanziell unersüz l ). urn neue geeignee Mehoden zu enwickeln und sie auch inernaional zu vergleichen. Diese neuen Mehoden basieren auch auf der Besimmung von Proeinkomponenen, die spezifisch für das D Genom von Weichweizen sind. Im Gegensaz zu den äleren Mehoden müssen sie hizeresisene Komponenen erlassen oder den denaurierenden Effek der Hochemperaurrocknung berücksichigen. Vier Mehoden wurden unersuch und eine fünfe Mehode wurde außerhalb des EG Prograrnrnes in diese Unersuchungen mi einbezogen. Im folgenden verden die fünf verschiedenen Mehoden beschrieben. vor allem ihre Möglichkeien und Perspekiven rrn Hinblick auf die Erlassung von Weichweizen in hochernperaurgerockneen Teigwaren: r! { j i Diese Mehode beruh auf der w Gliadin Frakion. die zu den am meisen hizeresisenen Proeinen des Weizenkornes zähl (diese Frakion is schwefellrei und daher nich in der Lage. S S Bindungen durch Hizeeinwirkung einzugehen). Nach der elekrophoreischen Frakionierung mi einern konvenionellen Polyacrylamidgel werden die sich langsam bewegenden Triple Banden, die von den Genen auf dem D Genom kodier sind, für die Besimmung des Weichweizenaneiles verwende. Die D ~v Gliadin Banden werden enweder mi Hilfe eines Densiomeers quaniaiv besinn oder nur visuell durch einen Vergleich mi mehreren Sandardmischungen bewere. Um mögliche Differenzen zu verrneiden. die durch den unerschiedlichen Oenaurierungsgrad in Abhängigkei von den Trocknungsemperauren ensehen können, und um diese Unersuchungen nur auf die einzige w Gliadin Frakion zu begrenzen. werden alle Proben für 5 Minuen gekoch. bevor rnan die Gliadine exrahier Versuchsergebnisse Nach der Exrakion erfolg die elekrophoreische Frakionierung und die densiomerische Besimmung des D-w Gliadins: dio Wiederfindung des Aneiles Weichweizen durch die densiornerische Auswerung verhäl sich linear bis zu einem Weichweizenaneil von 50o/o. Die normale Form der Kurve veränder sich nich, unabhängig, ob Flächen oder relaive Prozensäze des D w Gliadinpeaks berache werden. Zum Beispiel erhielen wir ähnliche Ergebnisse für die drei Probenreihen der Fa. Barilla, die bei 60 C, 92 C und 78 C bzw. 00 C gerockne waren. Eine befriedigende Messung rni niedrigeren Kosen kann auch ohne Densiomeer und Sofware erreich werden. indem man die Kurve visuell mi einigen bekannen Elekrophorese und Quanifizierung von D w Gliadin Frakionen (Dr. Auran and Mrs Bonicel. Laboraroire de Technologie des Cer6ales INRA. Monpellier. Frankreich! Umkehrphasen Hochdruckflüssigchronaographie der J Gliadin Frakionen (Prof. Griff in und Mr. Barnwell, Noinghan Polyechnic, UK) Sandardbesimmungen von Weich /Durumweizen vergleich. Die asächliche Abweichung beräg ± 2% für Weichweizenaneile uner 0 /o. 3 4 O,& für Weichweizenaneile zwischen 0 und 20o/o, 8 0% für Weichweizenaneile zwischen 20 und 40 /o und ± 5% für Weichweizenaneile größer als 40 0,c>. Besimrnung der spezifischen Albumine (" A". "8". "C"l des Weichweizens und (" ") des Durumweizens!Prof. Resmini und Mr. Denoni, Universiä di Milano. Ialien) Da die verschiedenen Weichweizensoren nich eine verschiedene konsane Menge von D w Gliadin enhalen, is die sorenmäßige Zusammensezung der Weichweizennischung und Immunbesimmung, basierend auf einem auf das 0.9 Albumin des Weichweizens L

2 70 7 der daraus hergesellen hochemperaurgerockneen Teigware der Haupgrund für die Begrenzung dieser Mehode. Daher nuß man bei der Anwendung dieser Mehode die mögliche Varia ionsbreie immer beachen. die darauf beruh. daß unerschiedliche Weichweizensoen verwende worden sein können Benerkunge Wegen des Einflusses der sorennäßigen Zusamnensezung auf das Ergebnis kann diese Gliadin Mehode nur semiquaniaiv durchgeführ werden. Man kann mi dieser Mehode daher auch nur besimme Bereiche einer Weichweizenmischung erkennen. z.b. O s~. 6 5 /o, 5 30 /o, 30 50% und > 50o/o. Der große Voreil dieser Mehode beseh jedoch darin. daß sie für jede hochemperaurgerocknee Teigware anwendbar is, auch wenn die Trocknung mi sehr hohen Temperauren erfolge. z.b. vorgekoche Teigwaren, Couscous. Die Ursache hierfür is die exreme Hizeresisenz der ol Gliadine. Außerdem is diese Mehode eine konvenionelle Polyacrylamidgel-Elekrophorese. Diese Mehode benöig keine weieren, Unersuchungen. Es is nunmehr eine Vergleichsunersuchung in verschiedenen Laboraorien mi verschiedenen echnischen Kräfen durchzuführen Ul<chrphascn Hochdruck flüssigchroaographie der f Gliadin-Frakionen (Prof. Griffin und Mr. Barnvell. Noingham Polyechnic. UKI Prinzip Bei dieser Mehode beruh die Besinimung des Weichweizenaneiles auf einer anderen Gliadinfrakion. die durch Umkehrphasen Hochdruckflüssigchromaographie idenifizier werden. Diese spezielle Chromaographie der Hexaploiden und Durumweizen-Gliadine zeig, daß Peaks mi Reensionszeien zwischen 4 7 und 49 Minuen eine Frakion repräsenieren, die auch zu der Gruppe der J Gliadine gehör; es sind auch D-Genom-spezifische Proeine. Die gesame Peakfläche, die von dem Eluionsprofil bei 206 nm berechne wird, bilde die Basis für die Besimnung des Weichweizenaneiles in Teigwaren. Außerdem wurden A niseren hergesell, in den inan J" -Gliadin verwendee, das bei Reensionszeien von 4 7 bis 49 Minuen rniels der Umkehrphasen Hochdruckflüssigchromaographie isolier wurde; so kann die Besimnung des Weichweizens auch alernaiv auf immunchemischer Weise durchgeführ werden Versuchsergebnisse Basierend auf dein Voreil der vollsändigen Auornaisierung und exaken Quaniaiven Möglichkeien der Hochdruckflüssigchromaographie erlaub diese Mehode die Erkennung von Weichweizen in Teigwaren ab 3 bis 4 lli. Es gib jedoch eine Reihe von Begrenzungen für diese M ehode. Bei der Besinnung von Weichweizen in Teigwaren. hergesell von Barilla, mi Troc knungsemperauren von 60 C oder C raen keine Schwierigkeien auf. Wurden jedoch Trocknungsemperauren von 00 C angewand. so w ar die Genauigkei wesenlich geringer. Diese Schwierigkei konne bisher nich reslos gelös werden. auch nach Modfizicrug e beirr Lösungsmiel. urn eine bessere Exrakion der Gliadine zu erhalen., j l i l L Auch bei dieser Mehode gab es Schwierigkeien in Abhiingigkei von cler sorennäßigen Zusanrnensezung des Weichweizens in den Proben. Obgleich bisher kein h" Gliadinpeak für ein Ourumweizenmuser beobache wurde. fand man höhere Were für das D f Gliadin bei einigen Soren. w ie z.b. Albaros in Vergleich zu anderen Soren. wie Canp R~ny Benierkungen Die Umkehrphasen Hochdruckflüssigchromaographie-Mehode ha das Poenial. um Weichweizenaneil in Teigwaren bei niedrigen Prozensäzen reproduzi erbar zu erfassen. Man benöig jedoch ein sehr eures Gerä und eine SeQuenz-Analyse der Muser (ein Muser = 55 mini. Außerden sind die Probleme bei sehr hohen Trocknungsemperauren und der Soreneinfluß noch nich gelös. Wenn man die immunchemische Alernaivmehode (polyclonale Anikörper) in Berach zieh. so selle man auch les. daß die Weichweizengliadine in Abhängigkei von der Weichweizensore schwanken. und die Ar des Einsazes von Anigenen zu Anikörpern von der Anikörperwirksamkei abhängig is. Diese Akiviä der Anikörper war in Teigwaren geringer als im Rohsoff Grieß Besinnung der spezifischen Albumine (" A". " B". "C"I des W eichweizens und (" " I des Durumweizens (Prof. Resmini und Mr. Denoni. Universiä di Milano, Ialien) Prinzip Drei elekrophoreische Albumfrakionen (" A". "B". "C"I wurden als spezilisch für Weichweizen idenifizier. Man fand außerdem eine durumspezifische Frakion (" "I. Obwohl diese Albuminfrakionen während der Teigwarenrocknung ni erhöhen Tenpera uren denaurier werden. sind sie immer noch z.t. exrahierbar. wenn inan ein effizienes Lösungsmiel auswähl. Da die Denaurierungsrae für "A". "B" "C" und "O "-Proeine uner den Trocknungsbedingungen ewa gleich is. kann inan das Verhälnis (A + B + Cl/D für die Besimmung des Weichweizenaneiles in Teigwaren benuzen. Das gil auch für Teigwaren. die bei sehr hoher Temperaur gerockne wurden Versuchsergebnisse Die Quaniaive Besimmung dieser Proeine is durch isoelekrische Fokussierung möglich. oder auch alernaiv durch Umkehrphasen Hochdruckflüssigchromaographie bzw. immun chemische Besimmungen (Aniserum von Kaninchen). Die relaiven Mengen der spezifischen Frakionen des Weichweizens und des Durunweizens korrelieren gu ni <lern Aneil von Weichweizen in Teigwaen. Diese Ergebnisse werden durch die sorennäßige Zusarnensezung nich beeinfluß. da die A. B-. C und 0 Albuminkomponenen in den verschiedenen Soren der zwei Weizenspezies sehr konsan sind. Es is möglich. bereis.5% Weichweizenzusaz zu erlassen. aber die Eichkurve häng sehr sark von den Trocknungsbedingungen ab. Bei Trocknungsemperauren von 00 C kann inan keine Albuninbande exrahieren. roz zahlreicher Modifikaionen bei

3 72 73 der Exrakion und den verschiedenen Trennungsschrien Bemerkungen 2.5. Durumweizen-Immunes, basierend auf einem monoclonalen Anikörper gegen das Friabilin!Prof. Simson, Universiy of Srahclyde und Mr. Sony, RhOne Poulenc Diagnosic. Glasgow. UK und Lyons, Frankreich). Diese Mehode arbeie sehr exak bei Teigwarenmusern, die nich mi hohen Trocknungsemperauren hergesell wurden. Die Mehode ha den großen Voreil, von der sorenmäßigen Zusanmensezung des Rohsoffes bei der Teigware unabhängig zu sein. Sie kann jedoch dann nich eingesez werden, wenn Teigwaren bei Temperauren mi 00 C gerockne wurden oder auch bei vorgekochen Teigwaren lmmunl.jesinmung. basierend auf einem auf das 0.9-Albumin des W eichw eizens reagierenden monoclonalen Anikörper (Prof. Paraf, Laboraoire dlmmunologie INRA, Tours. Frankreich und Mr. Violle, Laboraoire de Technologie des Ccrcalcs INRA. Monpellier. Frankreich) Prinzip Monoclonale Anikörper wurden gegen gereiniges Friabilin eingesez. Ein 4. 7K-Basisproein codier auf dem 5D Chromosom der hexaploiden Weizen. welches veranworlich gemach wird für die bzw. weiche Srukur des Weizenmehles. Ein spezifisch monoclonaler Anikörper codier als F7F, schien spezifisch auf die C-endsändige S S Brücke des Fribialins zu reagieren. Durumweizen enhalen kein Friabilin. Zwei Mehoden wurden enwickel: Ein semiquaniaiver Tauchsabes und ein ELISA Tes Versuchsergebnisse Prinzip Zwei Alburninc, die für W eichweizen spezifisch sind. und zu der Gruppe der o Amylase Inhibioren gehören, wurden gereinig. Monoclonale Anikörper wurden hergesell und als alb 0. 9 bezeichne. Uner diesen Anikörpern wurden einige gefunden. die mi der naiven Form des Proeins reagieren. während einige andere nur mi der denaurieren Eiweißform reagieren. Mi großem Aufwand wurde ein Anikörper isolier. der eine Anigenbindungsselle aufweis und der sowohl mi der naiven als auch der denaurieren Eiweißform reagier. Dieser Anikörper ha das Poenial. um die spezifischen Alburnine in naiver und denaurierer Form zu erkennen und kann somi auch Weichweizen in Teigwaren. unabhängig von der Hizebehandlung, schnell und einfach erfassen, und zwar in Form eines Sandwich ELISA Teses. Reines Friabilin is hizeempfindlich. Es ha sich jedoch gezeig. daß in einer Mischung, wie bei Teigwaren, die anderen Proeine Fribialin gegen die Hizeeinwirkung beschüzen. so daß kein signifikaner Unerschied bei Teigwaren von Buioni oder RHM gefunden wurde. die 0, 30 und 60 Minuen bei 00 C gerockne wurden. Bei Teigwaren. die bei 90 C + 78 C bzw. 00 C gerockne wurden. fand man jedoch geringere Mengen Weichweizen als bei Teigwaren. die bei 60 C gerockne wurden. Bei den 00 C gerockneen Teigwaren konne man das Friabilin gu erkennen. Mi einer geringeren Ausbeue als bei 60 C, daher wird empfohlen. Sandards zu verwenden, die bei der gleichen Temperaur gerockne wurden. Einige geneische Variaionen wurden beobache. Sie Sore Norman enhäl weniger Friabilin. Bei den 350 geeseen Durumweizensoren wurde kein Friabilin eriniel Versuchsergebnisse Bemerkungen Die Bedingungen der Lösung <.les Proeins wurden opimrer, um eine quaniaive und reproduzierbare Exrakion bei niedrig und hochemperurgerockneen Proben vorzunehmen. Ein Sandwich ELISA Tes wurde enwickel. der auf der Bindung des Anigens durch einen monoclonalen Anikörper beruh. der dann durch ein klassisches policlonales Serum umhüll wird. Die Spezifiä dieses monoclonalen Anikörpers is jedoch noch nich abgesicher. Einige Dururnweizensonen werden auch mi diesem Anikörper erkann Bernerkungen Die Verwendung der spezifischen rn onoclonalen Anikörper zur Erkennung des Albumins in hochemperaurgerockneen Teigwaren benöig weiere Enwicklungsarbeien. Vielleich muß man ein anderes monoclonales Sysem für die denauriere Form des Eiweißes enwickeln oder evl. eine Kombinaion von zwei verschiedenen monoclonalen Anikörpern verwenden: Ein Anikörper zur Fessellung der Proeinveränderung und einen weieren Anikörper Jnich besonders weichweizenspezifisch und unbeeinfluß von Trocknungsemperauren). urn den Aneil Weichweizen dann zu besimmen. Diese Mehode kann direk verwende werden und reagier sehr empfindlich bei niedrigeren Trocknungsemperauren. Diese Mehode solle jez auch im Ringes in verschiedenen Laboraorien überprüf werden. 3. Schlußfolgerungen Bis heue gib es keine Mehode. mi der man exak den Aneil von Weichweizen n Teigwaren bis zu einer Trocknungsemperaur von 00 C besimnen kann. Besondere Probleme reen dann auf. wenn die hohen Temperauren am Anfang der Trocknungsphase eingesez wurden. d.h. bei relaiv hohen Teigwarenfeuchigkeien. Sämliche Mehoden, die Weizenalbumine verwenden. haben Probleme mi der Trocknungsemperalur und manchmal auch mi den verschiedenen Soren bei Weichweizen und Durumweizen. Die Mehoden. die auf der Erfassung des Gliadins basieren. werden durch geneische und Umweleinflüsse beeinfluß. Daher muß ein Komprorniß gefunden w erden, und zwar im gemeinsamen Gespräch mi der Wirschaf. wobei die Möglichkeien und Grenzen der jez vorhandenen Mehode ausführlich zu diskuieren sind. Es is auch möglich,

4 74 75 eine KonJinaion verschiedener Mehoden zu crnpfehlen. Jede der fünf vorgeschlagenen Mehoden ha eine Anzahl von Voneilen. aber auch Beschränkungen. Diese beruhen enweder auf einer Veränderung in der Eichkurve bei hohen Trocknungsemperauren (z.b. 00 C oder manchmal bereis bei 9 2 Cl oder einer nich ausreichenden Speziliä des Weichweizens oder auf den Einfluß der sorenmäßigen Zusarnmensezung. Eine Zusammenfassung dieser Vor- und Nacheile ergib sich aus der nachfolgenden Tabelle: Spezifiä/ unabhängig unabhängig unabhängig Bewerung der Mehode W~ii;hweizen von der ~or~ li! 2 C b~i Q0 C w-gliadin HPLC IEF-Albumin Mab/Albumin Durum Tes/Friabilin Die w-gliadinmehode is bei den hohen Trocknungsemperauren am wenigsen empfindlich. Sie is daher auch nur eine semiquaniaive Mehode, nur für fesgelege Weichweizenbereiche. Die Beschreibung der Mehode is abgeschlossen; es sind keine weieren Forschungsarbeien nowendig. Der Durumes lmmunoassay is auch ferig. Es schein. daß diese Mehode einen guen Kompromiß darsell hinsichlich der Unabhängigkei von der sorenmäßigen Zusammensezung und der Trocknungsemperaur. obwohl die Eichkurve zwischen 60 und 92 C nich linear verläuf. Die Beschreibung der Mehode is feriggesell. Die Forschungsarbeien rni der Umkehrphasen Hochdruckllüssigchromaographie sind im Prinzip abgeschlossen. Die Ergebnisse zeigen den deulichen Einfluß der sorenmäßigen Zusammensezung. Die Ergebnisse werden nur geringfügig durch die Höhe der Trocknungsemperauren beeinfluß. Die Mehodenvorschril wird in wenigen Wochen ferig sein. Hieraus is zu schlußfolgern, daß diese drei Verfahren weier eingesez werden sollen. Hierzu is es nowendig, daß man umfangreiche Ringess mi verschiedenen Laboraorien durchführ. um die asächliche Brauchbarkei zu ermieln. 4. Zukünfige En wicklungen In 992 werden die folgenden drei Mehoden in einem Ringes verglichen: Elekrophorese der ~v-gliadine Umkehrphasen Hochdruckllüssigchromaographie der J" Gliadine Durumes lnrnunoassay. Hersellung der Proben (unerschiedliche Weichweizenaneile, cmperauren und verschiedene Soren). Diese Proben Sandardmusern unersuch werden. verschiedene Trocknungssollen im Vergleich zu Durchführung eines zweiägigen Workshops evl. in Monpellier, Frankreich. um diese drei Mehoden allen Teilnehmern an der Vergleichsunersuchung zu erklären. Jeder Teilnehmer erhäl dann Arbeisvorschrifen für diese drei Mehoden. Außerdem die Vergleichsmuser. die Sandardnuser und Muser für die Berichersaung. Die Ergebnisse des Ringeses zusammengesell. Die Mehoden, Kommission übernomrnen 5. Zusarnmenfassung werden die die zu einern Berich für besen Ergebnisse liefern die Kommission werden von der Teigwaren werden in der Europäischen Gemeinschaf aus Durumweizengrieß oder auch Mischungen von Durumweizengrieß und Weichweizenmahlerzeugnissen hergesell. Aufgrund der verwendeen Rohsoffmischung erfolg die Angabe der Verkehrsbezeichnung: z.b. Hargrießeigware. Teigware. Da die Preise zwischen Dururn- und Weichweizen mahlerzeugnisscn unerschiedlich sind. ß es eine Kon rollniiglichkci hinsichlich der verwendeen Verkehrsbezeichnung gehen. Die vorharrdenen Besinmungsmehoden für Weichweizenaneile bei Teigwaren sind heue nur noch bcschr änk verwendbar. da immer mehr Teigwaren am Mark sind, die mi Trocknungsemperauren bis zu 00 C hergesell wurden. Daher ha die Europäische Gerneinschaf ein dreijähriges Forschungsprogramm (990 bis 992 finanzier. in dem verschiedene Mehoden hinsichlich ihrer Brauchbarkei zur Erkennung von Weichweizen in hochemperaurgerockneen Teigwaren überprüf werden sollen. Von fünf verschiedenen Mehoden können nunrnehr die folgenden drei Mehoden in einem Ringes inernaional hinsichlich der Reproduzierbarkei und Brauchbarkei verglichen werden: Elekrophorese der w Gliadine Umkehrphasen Hochdruckllüssigchrornaographie der Gliadine Durumes lmmunoassay Die w Gliadinmehode is bei hohen Trocknungsemperauren nur wenig ernpfindlich und kann daher nur Weichweizenbereiche in Teigwaren erfassen. Bei der Umkehrphasen Hochdrucklfüssigchromaographie der y -Gliadine ha sich herausgesell. daß diese Mehode z.t. von der sorenmäßigen fusammensezung des Weichweizenaneiles abhängig is. Dagegen wird diese Mehode nich durch hohe Trocknungsemperauren negaiv beeinfluß. Folgender Plan wird vorgeschlgen: Ermilllung von ewa 20 Laboraorien. die an diesem Ringes auf freiwilliger Basis miarbeien Ergänzung und Verbesserung der Arbeisvorschrif Der Durunes lnnunoassay is sehr wahrscheinlich ein guer Konproniß: Diese Mehode wird nich durch die sorenmäßige Zusammensezung und hohe Trocknungsemperauren beeinrächig. Es gib jedoch bei Trocknungsernperauren z, ischen 60 und 92 C nich imrner ein lineares Verhalen zu den Sandardrnusern.

5 Berici über die 5. Du~um- und Teigwaren-Tagug, 992, Vorräge, gehalen anläßlich der Tag.ng der Arbeisgemeinschaf Gereideforschung e. V. vom. bis 2. April 992 Veröffenlichungen der Arbeisgemeinschaf Gereideforschung e. V., Demold, Band 24 Granum Verlag, Demold 992