Zellbiologie. Lehrbücher

Transkript

1 Zellbiologie

2 Zellbiologie Lehrbücher

3 Vorlesung/ Seminar Zellbiologie (SS 2011) 2. Semester Ort: Histologiesaal der Zellbiologie, Robert-Koch-Str. 6 Zeit: Mo 10:15 12:00 Uhr; Do 9: Uhr Verantwortlich: Prof. Dr. Roland Lill, Prof. Dr. Ralf Jacob, PD Dr. Christopher Lillig Institut für Zytobiologie, Robert-Koch-Str. 6 (Tel ) Doppelstunde Thema Stichworte Lichtmikroskopie: Präparationsmethoden, Mikroskopaufbau, Durchlichtmikroskopie, (Vergrößerung, Auflösung, Tiefenschärfe), Phasenkontrastmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Anwendungsbeispiele (Prof. Jacob) Endoplasmatisches Retikulum I: Morphologie der glatten und rauhen ER, Funktionen des glatten ER, Cytochrome P450. Ribosomen, Rauhes ER, Signalhypothese, Translocon (Prof. Lill) Endoplasmatisches Retikulum II: Weitere Funktionen des rauhen ER, Proteinfaltung und Modifikationen im ER, Chaperone, Quality control, Disulfidverbrückung, N-Glykosylierung Elektronenmikroskopie: Präparationsmethoden, Mikroskopaufbau, Transmissions-EM, Raster-EM, Anwendungsbeispiele Proteintransport durch Fission und Fusion von Membranvesikeln: vesikulärer Transport, Fusion und Fission von Membranvesikeln, anterograder/retrograder Proteintransport Biologische Membranen: Aufbau, Lipide, Cholesterin, Membranproteine, Fluidität, Membrananker, Detergentien Golgi-Apparat I: Morphologie, Funktionen der Golgi Stapel, Modifikationen im Golgi-Apparat (z.b. O-Glykosylierung, Proteolyse, Sulfatierung) Nach Absprache Nach Absprache Membranverbindungen I: Tight junctions, Adhesion junctions, Cadherine, Desmosomen Membranverbindungen II: Gap junctions, Connexine, Hemidesmosomen, Integrine Zytoskelett Einführung/Mikrotubuli I: Einteilung der Zytoskelettsysteme; Morphologie der Zytoskelettsysteme; Mikrotubuliaufbau; Dynamische Instabilität in vitro; Dynamische Instabilität in vivo; Mikrotubuli II: intrazelluläre Mikrotubuliorganisation; Centrosom; Mikrotubuli-bindende Proteine; Mikrotubuli-assoziierter Transport; Kinozilien; Mitosespindel Aktinzytoskelett: G-Aktin/F-Aktin; Polymerisation/Depolimerisation; Aktin-bindende Proteine; Mikrovilli; Aktin-assoziierte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen; Aktin-assoziierte zelluläre Bewegungen Intermediärfilamente: Struktur der Intermediärfilamente; Polymerisation/Depolymerisation; Einteilung der Intermediärfilamente; Zelltypspezifische Verteilung und Funktion der Intermediärfilamente; Verbindung zwischen Intermediärfilamenten und Mikrotubuli Extrazelluläre Matrix: Zell-Matrix Wechselwirkung; Basalmembran; Struktur, Synthese und Sekretion von Kollagen; Störungen im Kollagenstoffwechsel (Ehlers-Danlos Syndrom); Kollagentypen; Elastin und Störungen im Elastinstoffwechsel (Marfan Syndrom); Proteoglykane und Hyaluronsäure; Fibronectin Tutorium: Membranen Tutorium: Zytoskelett Golgi-Apparat II: Proteintransport im Golgi-Apparat, Sortierung im Trans-Golgi-Netzwerk; Sortierung lysosomaler Proteine Endosomales Kompartiment, Exocytose, Endozytose: regulierte und konstitutive Sekretion, frühes und spätes Endosom, Rezeptorgekoppelte Endozytose, Pinozytose. Lysosomen: Funktion, Hydrolasen, Biogenese von Lysosomen, Proteinimport in Lysosomen; lysosomale Erkrankungen Mitochondrien I Morphologie, Funktionen und Bestandteile der einzelnen Kompartimente, Überblick zur oxidativen Phosphorylierung, Biogenese (Proteinimport und -sortierung) Mitochondrien II Genexpressionsapparat der Mitochondrien (mtdna, Nukleoid, Transkription und Translation), rho-zero Mitochondrien, Vererbung und Segregation, Fusion und Fission (Dynamik des mitochondrialen Retikulums), Endosymbiontentheorie, mitochondriale Erkrankungen (Myopathien etc.) Peroxisomen: Morphologie, Funktionen, Biogenese (Proteinimport, Peroxine), peroxisomale Erkrankungen (Zellweger-Syndrom, Adrenoleukodystrophie) (PD Dr. Lillig) Ersatztermin Nach Absprache Nach Absprache Tutorium: Sekretorischer Transportweg Tutorium: Lysosomen, Peroxisomen, Mitochondrien Abschlussklausur (9:00-11:00 Uhr)

4 Zellbiologie Lichtmikroskopie Elektronenmikroskopie Biologische Membranen Membranverbindungen

5 Über 1,5 Millionen verschiedene Spezies sind bis heute von Biologen beschrieben worden! ~ Pflanzen ~ Insekten ~ Vertebraten Alle Lebewesen sind aus einer oder mehreren Zellen aufgebaut!

6 Zeitlicher Ablauf der Zellentwicklung vor ca. Jahren: 4,7 Milliarden Entstehung der Erde 3,9 Milliarden erste membranumschlossene Einzeller 3,5 Milliarden Bakterien entstehen 3 Milliarden Sauerstoffproduktion durch Blaualgen 700 Mio. primitive Vielzeller (Schwämme) bilden sich 450 Mio. erste Vertebraten tauchen auf 200 Mio. Erscheinen der Säugetiere homo sapiens

7 Die Zelle: Der kleinste Baustein aller Organismen

8 Vergleich Prokaryonten Eukaryonten Eubakterien Archebakterien Einzellig Organismus Organisationsform Pilze Pflanzen Tiere ein- oder mehrzellig Organellen, Cytoskelett, Zellteilungsapparat nicht vorhanden vorhanden, kompliziert, spezialisiert

9 Prokaryonten Vergleich Eukaryonten klein, circulär, keine Introns DNA groß, im Zellkern, viele Introns RNA: Synthese und Reifung einfach, im Cytoplasma kompliziert, im Zellkern einfach, mit RNA- Synthese gekoppelt Protein: Synthese und Reifung kompliziert, im Cytoplasma und rauhen Endoplasmat. Reticulum anaerob oder aerob sehr anpassungsfähig Stoffwechsel meist aerob

10 Zellkompartimente Zellkern Plasmamembran rer Golgi-Apparat Ribosom Lysosom Mitochondrium

11 Zelle als Produktionsstätte

12 Warum Mikroskopie? weil es mehr gibt als man mit dem Auge erfassen kann Quelle: Leica Microsystems

13 Strahlengang des Auges Rose in weiter Entfernung Linse entspannt

14 Strahlengang des Auges Rose näher am Auge Strahlen werden stärker gebrochen Linse wird dicker vergrößertes Abbild

15 Auflösungsvermögen des menschlichen Auges 0.2 mm Tiere Haare Insekten Blätter

16 Auflösungsvermögen des menschlichen Auges 0.2 mm menschl. Auge Tiere Haare Blätter Insekten

17 Größenbereiche biologischer Präparate 0.2 nm 0.2 µm 0.2 mm Elektronenmikroskopie Lichtmikroskopie menschl. Auge Atomkraftmikroskopie Tiere Blätter Haare Insekten. 0.1 nm 1 nm 10 nm 100 nm 1 µm 10 µm 100 µm Atome Organische Moleküle Viren Bakterien/ Organellen Makromoleküle Eukarytische Zellen

18 Linsen convex lenses (collecting lenses) concave lenses (divergent lenses) bibiconvex convexconcave concaveconvexcv biconcave planoconvex concaveconvexcv planoconcave Brechung an einer bikonvexen Linse Brechung an einer bikonkaven Linse Fokuslänge Fokuslänge Quelle: University of Vienna, cell imaging group

19 Erstes Jahrhundert: Lesesteine - ursprünglich aus Beryll (Silicat-Mineral) image object extw Çz áàéçx Source: University of Vienna, cell imaging group

20 Die ersten Jahre Athanasius Kircher ( ) Jesuiten Pater, Universalgelehrter Robert Hooke ( ) Engl. Physiker, Erfinder Antoni van Leeuwenhoek ( ) Engl. Physiker, Erfinder

21 Die ersten Jahre Athanasius Kircher ( ) Jesuiten Pater, Universalgelehrter Robert Hooke ( ) Engl. Physiker, Erfinder Antoni van Leeuwenhoek ( ) Engl. Physiker, Erfinder

22 Das Mikroskop

23 Vergrößerung einer Lupe eines Mikroskops γ = Sehwinkel mit Lupe = α 1 Sehwinkel in 25 cm Entfernung α 0 γ = α 1 = G s 0 = s 0 α 0 f G f γ Obj = B = t G f 1 γ = γ Obj γ Ok = t s 0 f 1 f 2

24 Auflösung Objektiv: 100x Okular: 10x Objektiv: 40x Okular: 25x

25 Numerische Appertur 2α 2α 2α A = n sin α (ABBE) Brechungsindex

26 Numerische Appertur α Deckglas Immersionsöl Objektträger A = n sin α Brechungsindex (ABBE) Luft, n=1 Öl, n=1,52 Glas, n=1,52

27 Ernst Abbe 1873 Auflösung

28 RA8 RA9 RA10 Auflösung A = n sin α Brechungsindex (ABBE) d min = λ A Obj + A Kond. rotes blaues Licht

29 Folie 28 RA8 RA9 RA10 Wellenlänge des verwendeten Lichts: nm max. Empfindlichkeit des Auges: 555 nm RAD; Für den Kontrast ist es wichtig, dass A(Kondensor) < A(Objektiv) ist Optimum: A (Kondensor) = 2/3 A (Objektiv) d= lambda/(2/3 A(Obj.) + A(Obj.)) = lambda/1,66 A(Obj.) Bei 555 nm: d= 555/1,66 1/A(Obj.) = 334 1/A(Obj.) RAD; Beispiele: A (Obj.) d(nm) 0, , ,3 257 Richtwert für Auflösungsgrenze: 200 nm RAD;

30 Mikroskop-Strahlengang Okular Tubus mit Prisma Objektivrevolver Objektive Kreuztisch Kondensor Aperturblende Spiegel Feldblende Kollektor Lampenhaus

31 RA4 1. Die Köhlersche Beleuchtung (Prof. August Köhler, 1893) 2. schlecht ausgeleuchtetes Präparat 3. Leuchtfeldblende schließen 4. Über den Kondensor scharf einstellen zentrieren 5. Blende öffnen scharf einstellen zentrieren Blende öffnen Präparat ausleuchten

32 Folie 30 RA4 Punkteabstand im Präparat: 5 µm 10 x Objektiv: Zwischenbild 50 µm aber: d(auge) ~300 µm > Nachvergrößerung RAD;

33 Färbetechniken Azan-Färbung Quergestreifter Skelettmuskel quer HE-Färbung längs Eisenhämatoxilin-Färbung

34 Kontrastverfahren Mikroskopiertechniken 1. Dunkelfeld 2. Phasenkontrast to see, or not to see that is the question 3. Differenzinterferenzkontrast Fluoreszenzmikroskopie 4. Fluoreszenz 5. Laser-Scanning

35 Dunkelfeld-Mikroskopie Das Präparat wird nicht direkt angestrahlt Vom Präparat ausgehendes Streulicht wird gemessen

36 Refraktion (Brechung) Richtungsänderung einer Welle durch veränderte Geschwindigkeit in verschiedenen Medien Die Brechung erfolgt zum Lot, wenn ein Lichtstrahl in ein Medium mit größerer Brechzahl eintritt (zum Beispiel aus Luft in Wasser oder Glas) Diffraktion (Beugung) Ablenkung an einem Hindernis (Spalt, Gitter, Linsenrand usw) Eine Spaltbreite kleiner als die Wellenlänge ergibt eine vom Spalt ausgehende Kreiswelle, deren Intensität auch in Richtungen, die sich stark von der ursprünglichen Ausbreitungsrichtung abweichen, noch groß ist. Wellenwanne

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38 Phasenkontrast (1953 Physik-Nobelpreis an Fritz Zernike) Kontraststeigerung durch Veränderung in der Mikroskopoptik Kondensor und Objektiv sind mit verschiedenen Ringblenden versehen Wechselwirkung (Interferenz) des direkten Mikroskopierlichts mit dem am Präparat gebeugten Licht Ergebnis: Objekte mit hohem Brechungsindex (z.b. Zellen) werden dunkler abgebildet als Objekte mit geringem Brechungsindex (z.b. Wasser)

39 Phasenkontrast (1953 Physik-Nobelpreis an Fritz Zernike)

40 Differential Interferenz Kontrast (DIC) Linear polarisiertes Licht wird in einem Winkel von 45 auf ein Wollaston-Prisma geleitet Aufspaltung in zwei senkrecht zueinander schwingende Wellenzüge gleicher Amplitude Vereinigung mit einem zweiten Wollaston-Prisma Interferenz am Analysator gemessen

41 Differential Interferenz Kontrast (DIC) Phasenkontrast DIC

42 Differential Interferenz Kontrast (DIC)

43 Fluoreszenz Fluoritkristalle unter UV-Licht Der Name Fluoreszenz stammt von dem Fluoreszierenden Mineral Fluorit (CaF 2 ) 1824 entdeckt der Mineraloge Friedrich Mohs Fluoreszenz unter UV-Licht Der Ausdruck Fluoreszenz wurde in einer Veröffentlichung von G.G. Stokes erstmals 1852 erwähnt

44 Fluoreszenz Energien der Elektronenübergänge, die bei Absorption und Emission von Photonen auftreten Delokalisierte Elektronen in bindenden - Orbitalen werden bei Absorption eines Anregungsphotons auf ein höheres *- Orbital katapultiert (angeregter Zustand S1 o. S2) Beim Übergang in den Grundzustand wird die freiwerdende Energie als Fluoreszenzphoton emittiert

45 Fluoreszenzierende Moleküle

46 Absorptions- und Emissionsspektrum

47 Anregungs- und Emissionsfilter

48 Fluoreszenzmikroskop

49 Fluoreszenzmikroskop

50 Konfokales Fluoreszenzmikroskop Konventionelles Fluoreszenzmikroskop konfokales Fluoreszenzmikroskop

51 Konfokales Fluoreszenzmikroskop Medulla Muskel Getreidekorn konventionelles konfokales Fluoreszenzmikroskop

52 Laser-Scanning Mikroskop

53 Aktin-abhängiger Transport der Saccharase SI-YFP Actin-CFP Scale bars: 10 µm

54 Transient interference between galectin-3 containing vesicles and the trans Golgi GT-CFP Gal3-YFP