Quantitative Analytik Chromatographie

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1 Quantitative Analytik Chromatographie 8. CHROMATOGRAPHIE 8.1 Einführung Der Begriff der Chromatographie umfasst eine Gruppe von Methoden bei welchen die Analyte mittels eines Verteilungsgleichgewichtes zwischen einer stationären und einer mobilen (flüssigen oder gasförmigen) Phase voneinander und von der Matrix getrennt werden. Die beiden Phasen dürfen nicht mischbar sein. Die mobile Phase (Eluent) transportiert den Analyten, aber die Zeit welche der Analyt in der mobilen Phase verbringt hängt von der relativen Affinität des Analyten zu den beiden Phasen ab. Das Verteilungsgleichgewicht für eine Substanz lässt sich so beschreiben: A M A S und mittels eines Verteilungskoeffizienten quantifizieren: K c = C s C m Da verschiedene Substanzen unterschiedliche, dynamische, Verteilungsgleichgewichte aufweisen,! lassen sie sich auf diese Weise trennen. Chromatographische Trennmethoden gehören heute zu den wichtigsten Analysenmethoden. Sie lassen sich anhand der Beschaffenheit der beiden Phasen und instrumenteller Kriterien einteilen.

2 Quantitative Analytik Chromatographie 8.2 Dünnschichtchromatographie / DC (Thin Layer Chromatography / TLC) Die Trennung wird auf einer mit einer dünnen Schicht von Kieselgel- oder Aluminiumoxidpulver beschichteten Platte (etwa 5 x 10 cm) durchgeführt. Die Probenlösung wird mittels einer Kapillare auf das eine Ende der Platte aufgebracht. Anschliessend wird das Chromatogramm durch partielles Eintauchen in ein Lösungsmittel entwickelt. Das Lösungsmittel wird als mobile Phase durch Kapillarkräfte langsam zum oberen Ende der Platte transportiert. Die aufgebrachten Substanzen wandern mehr oder weniger schnell mit und werden so getrennt. Dabei muss darauf geachtet werden, dass der Innenraum des Entwicklungstanks mit Lösungsmitteldampf gesättigt ist um ein Austrockenen der Platte zu verhindern. Die Trennung wird durch die Aktivität (d.h. vom Vermögen

3 Quantitative Analytik Chromatographie polare Substanzen aufzunehmen) der Platte beeinflusst, welche von der Luftfeuchtigkeit abhängt. Bei hoher Luftfeuchtigkeit (Tropen) muss unter Umständen die Platte im Ofen aktiviert, d.h. adsorbiertes Wasser entfernt, werden. Anschliessend wird die Platte aus dem Tank entfernt, getrocknet und die Substanzen sichtbar gemacht. Dies kann durch Bestrahlung mit UV-Licht, durch Bedampfung mit Jod oder mittels Besprühen mit spezifischen Reagenzien erfolgen. Durch Vergleich mit Standardsubstanzen kann die Anwesenheit von Analyten in der Probe nachgewiesen werden. Die Substanzen sind durch deren Rf-Wert charakterisiert.

4 Quantitative Analytik Chromatographie Durch Verwendung von mehr oder weniger polaren Lösungsmitteln, oder der Veränderung eines Mischungsverhältnisses, wird der Eluent auf die Probe abgestimmt. Zur Verbesserung der Trennleistung kann eine zweidimensionale (2D) Entwicklung durchgeführt werden bei der zwei verschiedene Eluenten zum Einsatz kommen. Für Routinemessung kann die Dünnschichtchromatographie auch mit automatischen Probenaufgabegeräten und Lesegeräten für semiquantitative Bestimmungen durchgeführt werden. Where is planar chromatography being used? Pharmaceutical industry TLC is especially suited for content uniformity tests and other QC analyses. Food analysis, regulatory tasks Natural products, herbals, plant extracts Cosmetics Environmental analysis, e.g. pesticides in drinking water Biochemical research Clinical analysis, e.g. therapeutic drug monitoring, metabolism disorders Toxicology, forensic and doping analysis

5 Quantitative Analytik Chromatographie 8.3 Säulenchromatographie Grundlagen Säulenelution (Column Elution): Die Probe wird durch eine röhrenförmige Anordung transportiert. Die Säule wird entweder mit einem porösem Pulver als stationäre Phase bepackt, oder die Analyte werden an der entsprechend beschichteten Wand der Säule selbst zurückgehalten. 1. Die Probe wird auf das Einlassende der Säule aufgebracht. 2. Mobile Phase/Eluent (eluent) fliesst durch die Säule. 3. Die eluierten (eluted) Spezies werden beim Austreten aus der Säule durch einen Detektor elektronisch erfasst. Für einfache Trennungen genügen gepackte Glasrohre mit einem Durchmesser von etwa 1 cm und einer Länge von 30 cm. Der Eluent wir kontinuierlich zugeführt und fliesst mittels Gravität durch die senkrecht montierte Säule. Diese Anordnung wird oft in der organischen Synthese zur Reinigung von Reaktionsprodukten angewandt ist aber für analytische Zwecke nicht tauglich.

6 Quantitative Analytik Chromatographie Chromatogramme: Chromatogramme erhält man durch Aufzeichnen des Detektorsignals gegen die Zeit. Jeder Analyt ist gekennzeichnet durch einen sogenannten Peak. t r = Retentionszeit (retention time) Die Retentionszeit bezeichnet die Zeit die ein Analyt benötigt um durch die Säule zu gelangen und diese ist charakteristisch für eine Analytspezies. Es ist allerdings wichtig zu beachten, dass die Retentionszeit kein absoluter Nachweis für die Anwesenheit einer bestimmten Spezies ist da zwei oder mehrere verschiedene Substanzen gleiche oder sehr ähnliche Retentionswerte aufweisen können (Coelution). Auch sind die Elutionszeiten nicht perfekt konstant, so dass es manchmal zweckmässig ist die Identität eines Peaks durch Zugabe von Standard zur Probe zu überprüfen. Für die Quantifizierung der Analyten in der Probe werden die Peakhöhen (peak height) oder die Peakflächen (peak area) benützt. Die Verwendung von Peakflächen ist in der Regel vorzuziehen, da durch die Integration über die Zeit das Signal-zu-Rausch- Verhältnis und damit die Präzision und die Nachweisgrenzen verbessert werden. Peakflächen werden heute in der Regel rechnerisch durch ein PC-gestütztes Datenerfassungs- und Verarbeitungsprogramm ermittelt (früher von Hand mit Triangulationsmethoden, durch Ausschneiden und Wägen von Papier, oder durch spezielle elektronische Geräte, sogenannte Integratoren). Es ist zu beachten, dass chromatographische Detektoren meist auf verschiedene Substanzen unterschiedliche Empfindlichkeiten aufweisen, so dass eine Eichung für jeden Analyten erfolgen muss.

7 Quantitative Analytik Chromatographie Retentionsfaktor (retention factor): Aus der Retentionszeit lässt sich ein Retentionsfaktor k (früher Kapazitätsfaktor, capacity factor, genannt) herleiten: k = t R " t M t M = t ' R t M! t M = Totzeit für eine nicht zurückgehaltene Substanz (= Eluent). Der Retentionsfaktor kann als Mass für das Verhältnis der Zeit die der Analyt in den beiden Phasen verbringt gesehen werden. Dies lässt sich aber auch mit dem Konzentrationsverhältnis in den beiden Phasen (und damit mit dem Verteilungsgleichgewicht) in Bezug setzen, wenn das Verhältnis der Volumen der beiden Phasen (ß) in der Trennsäule bekannt ist. k = C s C m " #! " = V m V s! In der Praxis sollen die Retentionsfaktoren zwischen etwa 1 und 5 liegen. Für kleinere Werte sind die Retentionszeiten schlecht reproduzierbar und daher die Identitätsbestimmung der Peaks zweifelhaft, und für grössere Werte werden die Retentionszeiten unhandlich lange. Ein Vergleich der Retentionsfaktoren zweier Substanzen ergibt den Trennfaktor α (separation factor): " = k 2 k 1! α wird auch als Selektivität bezeichnet. Für α = 1 werden die zwei Substanzen nicht getrennt.

8 Quantitative Analytik Chromatographie Bandenverbreiterung (band broadening): Drei verschiedene Effekte arbeiten gegen eine Auftrennung und verursachen eine Verbreiterung von Peaks welches eine unvollständige Trennung zur Folge haben und damit die Leistung einer chromatographischen Säule vermindern: 1. Ungleichmässiger Fluss (unevenness of flow): => Abhilfe: Verwendung von kleineren Partikeln in der Säule oder von Säulen welche keine Partikel aber einen engen Durchmesser aufweisen (Kapillarsäulen) (capillary columns). Dieser Effekt ist unabhängig von der Flussrate. 2. Längsmässige Diffusion (Longitudinal Diffusion): Die Diffusion wird durch Konzentrationsgradienten angetrieben. => Dieser Faktor hängt von der Viskosität und der Temperatur ab. Er nimmt zu mit Verkleinerung der Durchflussrate.

9 Quantitative Analytik Chromatographie 3. Widerstand gegenüber Massentransfer (Resistance to Mass Transfer): Die mobile Phase bewegt sich fort bevor sich ein Gleichgewicht zwischen den zwei Phasen eingestellt hat, da für diesen Vorgang eine gewisse Zeit benötigt wird. => Wird verbessert durch alles was die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung erhöht: hohe Temperatur, niedrige Viskosität. Dieser Effekt ist weniger signifikant für niedrige Durchflussraten.

10 Quantitative Analytik Chromatographie Stufentheorie (Plate Theory): Eine Chromatographiesäule wird als eine Serie von winzigen Extraktionsgefässen (Stufen oder Böden/plates) betrachtet. Je grösser die Anzahl der Stufen einer Säule desto besser die Trenneffizienz. Die Anzahl der theoretischen Stufen (Number of Theoretical Plates), N, einer Säule kann aus t r und der Basisbreite (base width), w, jedes Peaks berechnet werden. N = 16 ( t r w )2 Es ist jedoch genauer die Peakbreite auf halber Höhe zu messen (width of the peak at half height / FWHM, full width at half maximum) und die folgende Gleichung zu benutzen: t r N = 5.55 ( FWHM )2 Die Äquivalenthöhe (Height Equivalent of a Theoretical Plate) (HETP oder H) kann aus der Anzahl der Stufen berechnet werden. Je kürzer die theoretische Stufe umso effizienter ist die Säule. HETP = L/N hier bezeichnet L die Länge der chromatographischen Säule. Die Bodenhöhe liegt in der Regel zwischen etwa 0.05 mm und 1 mm und die Bodenzahlen zwischen etwa 2000 und 100'000 (die Länge der Säule je nach System zwischen etwa 25 cm und 25 m). Oft wird die Bodenzahl auch normalisiert: Bodenzahl pro Meter, N/m

11 Quantitative Analytik Chromatographie Die Van Deemter-Gleichung bringt die Stufenhöhe in Beziehung mit den drei Ursachen der Bandenverbreiterung: HETP = A + B v + Cv v = Fliessgeschwindigkeit (flow velocity) A Unregelmässigkeit des Flusses (uneveness of flow) B längsmässige Diffusion (longitudinal diffusion) C Widerstand zum Massentransfer (resistance to mass transfer) Peak-Auflösung (Resolution): R = 2(t ra - t rb ) W A + W B R = 1, entspricht einer Überlappung von etwa 2% der Peakflächen. Ein R von besser als 1,5, welches einer Überlappung von weniger als 0.1% entspricht, ist für eine quantitative Analyse mehr als akzeptabel. Die Auflösung R ist ein besseres Mass für die Quantifizierung der Trennung zweier Peaks als die Selektivität α da die Bandenverbreiterung berücksichtigt wird. R lässt sich aus a, N und k errechnen: $ R = " #1 ' $ k & )* 2 ' N & )* % " ( % 1+ k 2 ( 4!

12 Quantitative Analytik Chromatographie Trennprinzipien in der Flüssigchromatographie: Verschiedene Effekte lassen sich zur Trennung ausnützen: - Adsorption an einer polaren festen Oberfläche ("normale Phase") - Absorption (Auflösung) in einer stationären nicht-polaren flüssigen Phase ("Umkehrphase", reversed phase (RP) column) - Elektrostatische Anziehung (Ionenaustauschchromatographie)(ion-exchange chromatography) - Grössentrennung (size exclusion) (Gelpermeationschromatographie)

13 Quantitative Analytik Chromatographie Geräteaufbau: Pumpen: Für analytische Anwendungen werden Trennsäulen benötigt welche mit sehr feinen Partikeln gepackt sind um die Bandenverbreiterung klein zu halten, und dies bedeutet, dass Drücke von bis zu 500 bar benötigt werden um den Eluenten zu pumpen. Die benötigten Drücke können nur mit Kolbenpumpen erzielt werden. Meistens werden zwei Zylinder eingesetzt die sich koordiniert bewegen um Pulsationen klein zu halten. Spezielle nichtkorrosive Materialien werden eingesetzt. Injektionsventile (Injection Valve): Injektion mittels Rotationsventilen welche ein fixiertes Pobenvolumen (sample loop) aufweisen, das vor der eigentlichen Injektion bei Normaldruck mittels einer Spritze gefüllt wird. Durch Drehen wird die Probe in den Trägerstrom (eluent) und an den Säulenanfang gebracht.

14 Quantitative Analytik Chromatographie Detektoren: Verschiedenste Detektoren werden eingesetzt. Idealerweise sprechen sie nicht-selektiv auf alle Analyte an, geben aber kein Signal für den Eluenten, da elektronisches Rauschen, erzeugt durch Hintergrundsignale, die Nachweisgrenzen verschlechtert. Methoden der optischen Spektroskopie (wie Absorption, Fluoreszenz oder Brechungsindex) werden häufig einsetzt, weniger gebräuchlich sind elektrochemische Detektoren. Elektronisches Rauschen tritt allerdings bei allen Detektoren auf. Dieses Rauschen beeinflusst direkt die Nachweisgrenze und ein hohes Signal-zu-Rausch-Verhältnis (signal-to-noise-ratio) ist immer wünschenswert. Die Detektoren enthalten daher in der Regel einen eingebauten verstellbaren elektronischen Filter (Tiefpassfilter) der elektronisches Rauschen unterdrückt. Dies wird umso besser unterdrückt je langsamer der Filter auf eine Änderung des Signals anspricht. Die Ansprechszeit wird als Zeitkonstante (time constant) oder Anstiegszeit angegeben und entspricht der Zeit die benötigt wird um einer sprunghaften Änderung um 63% zu folgen.

15 Quantitative Analytik Chromatographie In der Praxis soll, um die beste Nachweisgrenze zu erzielen, die Zeitkonstante am Gerät immer so eingestellt werden, dass die Peaks gerade noch ohne Verzerrung erfasst werden. Der Einstellbereich umfasst etwa von 20 ms bis 10 s. Das Signal-zu-Rausch- Verhältnis verbessert sich in der Regel um die Quadratwurzel der Verlängerung der Zeitkonstante. Mit dieser Massnahme lassen sich kurzzeitige Signalfluktuationen und langfristige Drifts allerdings nicht unterdrücken.

16 Quantitative Analytik Chromatographie Hochleistungsflüssigchromatographie (High-Performance Liquid Chromatography), HPLC Obwohl die Säulenchromatographie mit flüssiger mobiler Phase bereits 1906 (Tswett), und die theoretischen Grundlagen in den 40er Jahren (Martin und Synge, Nobelpreis 1952) bechrieben wurden, wurde die moderne HPLC, bedingt durch apparatetechnische Schwierigkeiten, erst in den 70er-Jahren entwickelt, d.h. nach der weiter unten beschriebenen Gaschromatographie. Eluent: Wässrige, teilwässrige und reine organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemische werden eingesetzt. In wässrigen oder teilwässrigen Systemen ist in der Regel ein ph- und/oder Ionenstärkepuffer enthalten. Eluenten müssen vor dem Einsatz in der HPLC entgast werden da Gasblasen in der Pumpe, der Trennsäule oder dem Detektor Probleme verursachen. Entgasen erfolgt durch: - Ultraschallbad (Problem der Reabsorption von Luft) - Erhitzen (problematisch mit organischen Lösungsmitteln) - Spülen mit Helium (Sparging, weit verbreitet) - On-line mit Vacuum (gasdurchlässige Teflonschläuche, etwas teurer in der Anschaffung) Spezielle für HPLC gereinigte Lösungsmittel sind im Handel erhältlich (HPLC grade). Da sie als Chemikalienabfall entsorgt werden müssen ist dies ein Kostenfaktor. Trennsäulen: Normale Phase (normal phase): Die Säule ist mit kleinen Partikeln ( 5 µm) aus Siliziumdioxid (SiO 2, Kieselgel), Aluminiumoxid (Al 2 O 3 ) etc. gefüllt. Ein unpolares Lösungsmittel oder ein Lösungsmittelgemisch wird als Eluent benützt. Die am wenigsten polare Substanz wird zuerst eluiert.

17 Quantitative Analytik Chromatographie Nachteil: die Aktivität der Säule wird durch Spuren von Wasser im Eluenten beeinträchtigt, so dass die Retentionszeiten nicht stabil sind. Historisch war dies die erste Variante. Heute relativ selten benützt. Umkehrphase (reversed phase): Die Kieselgelpartikel werden durch Beschichtung lipophil gemacht. Der Eluent is polar. Die am meisten polaren Analyte werden zuerst eluiert. Die Umkehrphasen(RP)-HPLC ist heute die Standardmethode, da stabiler, und wässrige Proben direkt analysiert werden können.

18 Quantitative Analytik Chromatographie Die Beschichtung der Kieselgelpartikel erfolgt durch chemische Modifizierung mit Alkylchlorsilanen, z. B. in der folgenden Reaktion: Die Länge des Alkylrestes bestimmt die Lipophilie der stationären Phase. C2, C4, C8 und C18 sind erhältlich, wobei C8 (RP-8) und C18 (RP-18) am häufigsten verwendet werden. 'End-Capping': Bei der Silanisierung reagieren nicht alle freien Silanolgruppen und diese polaren Gruppen können dann ebenfalls noch mit den Analyten interagieren. Dies kann zu nachhängenden Peaks (peak tailing) führen. Aus diesem Grund werden die verbleibenden Silanolgruppen oft mit Trimethylchlorsilan passiviert. Dieser Prozess wird als 'End-capping' bezeichnet. Porengrösse: Die eingesetzten Kieselgelpartikel weisen Poren mit Durchmessern in der Grössenordnung von 5-10 nm ( Å) auf. Die Porengrösse wird bei der

19 Quantitative Analytik Chromatographie Herstellung der Partikel kontrolliert and beeinflusst die reale Oberfläche der Partikel und damit die Partitionierung der Analyte. Der Bedeckungsgrad mit Alkylresten hängt auch von der Effizienz der gewählten Derivatisierungsreaktion ab. Dieser Parameter wird of als 'Carbon-Load', d.h. Kohlenstoffanteil, in Prozent angegeben. Zur Trennung von mittelmässig polaren Analyten werden oft RP-Säulen die mit polaren Amin- (-CH 2 -CH 2 -CH 2 -NH 2 ) oder Cyano- (-CH 2 -CH 2 -CH 2 -CN) Gruppen versehen sind eingesetzt. Packungsmaterialien mit Phenylgruppen werden oft zur Trennung von benzolringhaltigen Analyten eingesetzt. Die Trennung von Enantiomeren (chirale Trennung) lässt sich nur mit Säulen bewerkstelligen welche chirale funktionelle Gruppen aufweisen die mit den Analyten interagieren.

20 Quantitative Analytik Chromatographie Einfluss der Säulengeometrie: Standardsäulen sind gefüllt mit Partikel von 5 µm Durchmesser, haben einen Innendurchmesser von 4.6 mm und eine Länge von 25 cm. In den letzten Jahren sind alternative Säulen mit kleineren Partikeln (3 µm), kleinerem Innendurchmesser und kürzeren Längen erhältlich geworden. Partikelgrösse. Kleinere Partikel führen zu höherer Effizienz (für 3 µm, N etwa 50% besser für gleiche Säulenlänge, R 22% besser). Höhere Effizienz bedeutet höhere Peaks und damit verbesserte Nachweisgrenzen. Andererseits erhöht sich der benötigte Druck um den Faktor 2. Dies bedeutet, dass Säulen die länger sind als 10 cm oft nicht eingesetzt werden können. Säulenlänge. Die Analysenzeit ist mehr oder weniger proportional zur Länge. Kürzere Säulen bedeuten aber schlechtere Trennung (N ~ Länge). Die Säulenlänge soll so gewählt werden, dass die benötigte Trennung gerade noch möglich ist. Säulendurchmesser. Dies hat kaum einen Einfluss auf the Trennung, aber kleinere Durchmesser bedeuten weniger Lösungsmittelverbrauch und die Möglichkeit kleinere Probenvolumen zu analysieren. Die geringeren Volumenflüsse sind auch besser kompatibel mit der MS-Detektion (siehe unten). Standardgeräte können in der Regel auch mit Säulen von 3.2 mm eingesetzt werden, manchmal auch mit 2.1 mm. Kleinere Durchmesser bedingen spezielle Geräte mit entsprechenden Pumpen, Injektionsventilen, Verbindungsschläuchen und Detektoren. Grössere Säulendurchmesser (10 mm) werden zur präparativen HPLC eingesetzt.

21 Quantitative Analytik Chromatographie Praxis: Beste Reproduzierbarkeit in thermostatisierten Geräten Kosten der Säulen ca. Fr Fr Lebensdauer begrenzt durch allmählichen Verlust der funktionellen Gruppen ph-wert zwischen 2 und 8 einhalten (< ph 2: Hydrolyse der funktionellen Gruppen; > ph 8: Auflösung des Kieselgels) Partikelfilter für Eluent und Proben (0.45 µm Teflonfilter) Vermeiden Lufteintritt (Eluent entgasen, Vorsicht beim Aufstarten) Guardsäulen (0.5-3 cm) einsetzen damit stark zurürckgehaltenene Verbindungen nicht in die Trennsäule gelangen Fliessrichtung beachten Zur Optimierung der Trennung wird die Polarität des Eluenten angepasst. In der Regel geht man von Wasser als Eluenten aus dem ein organisches Lösungsmittel zugeben wird (Acetonitril, Methanol, Tetrahydrofuran). Eine Verringerung der Polarität der mobilen Phase verringert die Retentionszeit in der Umkehrphasenchromatographie. Computergestützte Simulationsprogramme können bei der Methodenentwicklung herangezogen werden.

22 Quantitative Analytik Chromatographie Gradientenelution: Die Polarität des Lösungsmittels kann während der Aufnahme eines Chromatogrammes graduell geändert werden um einen grösseren Bereich von Analytpolaritäten zu erfassen und/oder um die Analyse schneller durchzuführen. Dies wird erzielt durch Benützung von zwei Pumpen welche das Mischverhältnis zwischen zwei Lösungsmitteln kontinuierlich ändern. Detektion: UV-Vis-Absorptionsdetektor: Dies ist der Standarddetektor und tauglich für alle Substanzen die im sichtbaren und UV-Bereich (> 190 nm) absorbieren. Dazu müssen die Substanzen eine der folgenden Gruppen aufweisen: Doppelbindung neben einem einsamen Elektronenpaar (z.b: -C=C-O-C-) Heteroatome (Br, I, S etc.) Carbonylgruppe (-C=O) konjugierte Doppelbindungen (-C=C-C=C-) aromatischer Ring Die Empfindlichkeit (Absorptionskoeffizient nach Lambert-Beer) und der absorbierende Wellenlängenbereich sind von der Substanz abhängig. 3 Varianten des Detektors werden eingesetzt: Spektrometer mit einstellbarer Wellenlänge Photometer mit festeingestellter Wellenlänge (oft 254 nm, Quecksilberdampflampe) Diodenarrayspektrometer

23 Quantitative Analytik Chromatographie Die Detektoren sind für die Messung kleiner Absorptionen optimiert, so dass noch Werte bis zu Absorptionseinheiten erfasst werden können (die optische Wegstrecke ist auch hier in der Regel 1 cm). Diodenarrayspektrometer erlauben die Aufnahme von ganzen Spektren während der Elution (jede 20 ms), welches die Optimierung der Wellenlänge für jede Substanz erlaubt und zusätzliche Informationen über die Peakreinheit und Identität ergibt, haben aber eine etwas geringere Empfindlichkeit. Die unterschiedliche Transparenz der Eluenten muss beim Arbeiten im UV-Bereich beachtet werden: Die Lösungsmittel müssen hochrein sein um Absorptionen durch Verunreinigungen zu vermeiden und dürfen keinen gelösten Sauerstoff enthalten da dieser unterhalb von 260 nm absorbiert.

24 Quantitative Analytik Chromatographie Brechungsindexdetektor (RI-Detector): Universell, d.h. auch für Substanzen geeignet die im UV nicht absorbieren, aber wenig empfindlich (Nachweisgrenzen etwa 1000 mal höher als Absorption). Kohlenhydrate, Alkohole. ELSD (Evaporative Light Scattering Detector): Bei diesem Dektor wird die Mobile Phase versprüht und der Eluent verdampft. Die Lichtstreuung durch die verbleibenden Partikel erzeugt das Signal. Universell, heikel im Betrieb, wenig empfindlich. Fluoreszenzdetektor: Empfindlicher ( mal) als der Absorptionsdetektor aber nur für fluoreszierende Substanzen. Amperometrischer und Coulometrischer Detektor: Oft auch als "elektrochemischer Detektor" bezeichnet. Empfindlicher als Absorptionsdetektor aber nur für elektroaktive Substanzen. Bei Reduktionen muss Sauerstoff entfernt werden. Langzeitstabilität etwas problematisch (manuelles Polieren). Amine, heterozyklische Stickstoffverbindungen, Nitroverbindungen, Phenole, Aldehyde and Ketone. Neurotransmitter (Adrenalin, Noradrenalin und Dopamin) in klinischen Proben. Massenspektrometrischer Detektor: Sehr leistungsfähig und oft benützt, da Information über die Struktur der Substanzen und damit der Identität der Peaks gewonnen wird. Dies ist bei komplexen Proben unbekannter Zusammensetzung oft von enormer Wichtigkeit. Computerisierte Datenbanken werden zur automatisierten Erkennung der Massenspektren herbeigezogen. Die Geräte sind teuer und durch die Kopplung der Systeme etwas anfällig auf Störungen. Derivatisierung: Analyte welche keine oder nur schwache Absorption zeigen werden oft chemisch umgesetzt um sie der UV-Vis-Detektion zugänglich zu machen oder um die hohe

25 Quantitative Analytik Chromatographie Empfindlichkeit der Fluoreszenzdetektion nützen zu können. Dies erfolgt in der Regel durch Beimischen einer Reagenz nach der Elution. Besonders wichtig für Aminosäuren und daraus aufgebaute Biomoleküle (Peptide, Proteine etc.). Anwendungsbeispiele: The Methode findet unter anderem breiten Einsatz in der Bestimmung von Pharmazeutica und der Analyse von klinischen Proben.

26 Quantitative Analytik Chromatographie Gelpermeationschromatographie (Gel-Permeation Chromatography, Size Exclusion Chromatography) Die Trennung basiert auf der Grösse der Analytmoleküle. Die Säulen bestehen aus Gelen mit kontrollierter Porengrösse. Wird in der Trennung von grossen Molekülen (z.b. Proteine oder Polymere mit unterschiedlicher Kettenlänge) benützt: Die Detektion erfolgt oft anhand des Brechungsindexes.

27 Quantitative Analytik Chromatographie Ionenchromatographie (Ion-Chromatography), IC, 1975 Für anorganische und organische Kationen und Anionen. Besonders wichtig für die Bestimmung von bestimmten Anionen (Phosphat, Sulfat) da kaum andere instrumentelle Methoden für diese Spezies existieren. Die Instrumentierung ist ähnlich wie in der HPLC. Die Säulen werden mit einem Ionenaustauscherharz gepackt: Die Analytionen werden durch die Coulombsche Kraft festgehalten und die Elution erfolgt durch Ionenaustausch mit einem Ion des Eluenten. Doppelt geladene und kleine Ionen (mit Hydrathülle) Ionen werden allgemein später eluiert, da sie die stärkste elektrostatische Anziehung erfahren. Die Trennzeiten werden durch die Art des Eluentions, dessen Konzentration und die Flussrate beeinflusst.

28 Quantitative Analytik Chromatographie Zur Detektion wird häufig die Leitfähigkeitsmessung eingesetzt da diese Methode für Ionen praktisch universell ist. Anderseits besitzt auch der Eluent eine Hintergrundleitfähigkeit so dass die chromatographischen Peaks (bedingt durch Unterschiede in der spezifischen Leitfähigkeit zwischen Eluent- und Analytion) Änderung auf diesem Hintergrund darstellen. Das Vorhandensein der Hintergrundleitfähigkeit schränkt die Nachweisgrenze ein (Rauschen des Hintergrundsignales maskiert die Peaks). Aus diesem Grund wird zwischen Säulenausgang und Detektor oft ein chemischer Suppressor eingebaut welcher den Puffer neutralisiert. Die Nachweisgrenzen für anorganische Anionen und Kationen betragen in der Ionenchromatographie mit Leitfähigkeitsdetektion etwa 100 ppb.

29 Quantitative Analytik Chromatographie Neben anorganischen Anionen und Kationen können auch ionische organische Moleküle bzw. Substanzen welche sich in Ionen überführen lassen (wie Kohlenhydrate bei hohen ph-werten) bestimmen. Für organische Ionen werden oft andere Detektionsmethoden (UV-Absorption, Amperometrie) eingesetzt, da bedingt durch die relative Grösse deren spezifische Leitfähigkeit geringer als die der anorganischen Ionen ist.

30 Quantitative Analytik Chromatographie Gaschromatographie (Gas-Liquid Chromatography) Für flüchtige Proben oder Analyte welche durch eine chemische Derivatisierung flüchtig gemacht werden können. Die Gaschromatographie wurde in den 50er Jahren entwickelt, ist also etwa 20 Jahre älter als die HPLC. Viele der für die Gaschromatographie enwickelten Anwendungsmethoden wurden später durch HPLC-Methoden ersetzt. Die Gaschromatographie hat aber nach wie vor oft Vorteile in Bezug auf die Trenngeschwindigkeit, die Peakkapazität, die Präzision, die Nachweisgrenze und die Kosten. Trägergase (Carrier Gases) sind He, N 2, Ar, oder H 2. Die Probe wird auf das Ende der Säule mit einer Mikrospritze ( 1 µl) mittels Injektion durch ein Septum aufgebracht. Der Injektionsblock wird auf einer Temperatur welche die Siedepunkte der Probenkomponenten überschreitet gehalten (50 C höher als der Siedepunkt der am höchsten siedenden Probenkomponente) um eine rasche Verdampfung (volatilization) zu gewährleisten.

31 Quantitative Analytik Chromatographie Da es schwierig ist Injektionsvolumen exakt zu reproduzieren wenn kleine Probenvolumen benützt werden, wird of die interne Standardisierung angewandt. Interne Standardisierung in der Gas-Chromatographie: Die Peakfläche ist proportional zur Menge des Materials welches den Peak verursacht (in GC werden üblicherweise Volumen gemessen da flüssige Proben injiziert werden). Da die Empfindlichkeit des Detektors von der Spezies abhängt, muss ein Ansprechsfaktor (response factor) R, für den Analyten relativ zu einem internen Standard gefunden werden indem eine bekannte Mischung der zwei Substanzen eingegeben wird (eine gerade Ansprechskurve ist Voraussetzung). R ist dann gegeben durch: R = Area analyte / Volume analyte Area standard / Volume standard Das Volumen des Analyten in der Probe wird dann gefunden indem man ein bekanntes Volumen des Standards zur Probe gibt und die resultierenden Peakflächen bestimmt. Das Volumen des Analyten in der Mischung ergibt sich aus: Volume analyte = Area analyte / R Area standard / Volume standard Zum Schluss wird noch das Volumen des Analyten in der Probe berechnet indem man die Verdünnung durch den Standard berücksichtigt.

32 Quantitative Analytik Chromatographie Säulen: Gepackte Säulen bestehen aus Stahl- oder Glasröhren (2-4 mm Innendurchmesser, 1-4 m Länge, aufgerollt um in den Ofen zu passen) die mit einem feinen Granulat eines inerten Materiales (Kieselgel / silicagel) gefüllt sind welches mit einer nichtflüchtigen flüssigen stationären Phase beschichtet ist (Ausnahme Gas/Fest Chromatographie, nur selten). Flüssige Phasen verschiedener Polarität werden verwendet in Abhängigkeit der Polarität der Analyten. Kapillarsäulen besitzen etwa µm Innendurchmesser, sind m lang und die stationäre Phase ist auf der Innenseite der Wand aufgebracht. Diese Säulen ergeben eine bessere Auflösung als gepackte Säulen (Minimierung des ungleichmässigen Flusses) und sind heute Standard. Die Säulen werden in sorgfältig thermostatisierten Öfen gehalten bei Temperaturen von etwa 50 C bis 200 C abhängig von der Art des Analyten. Die Anwendung eines Temperaturgradienten kann oft die Auflösung verbessern.

33 Quantitative Analytik Chromatographie Detektoren: Verschiedene Arten von Detektoren sind gebräuchlich. - Wärmeleitfähigkeitsdetektor / WLD (Thermal Conductivity Detector / TCD): Die zwei Heizdrähte werden mittels eines durchfliessenden Stromes geheizt. Ihr Widerstand nimmt mit der Temperatur zu. Dies tritt dann ein wenn ein Analyt eluiert wird da diese gewöhnlich eine niedrigere Wärmeleitfähigkeit als das reine Trägergas (carrier gas) (H 2 or He) besitzen. Dadurch wird der Heizdraht weniger gekühlt. Der zweite Heizdraht kommt nur mit reinem Trägergas in Berührung (Referenz) und der Unterschied im Widerstand zwischen den beiden Drähten wird mittels einer Wheatstoneschen Brücke ermittelt. Dies ist der einfachste Detektor hat aber geringe Empfindlichkeit. Hauptsächlich für kleine, anorganische Gase. - Flammenionisationsdetektor (Flame Ionization Detector) / FID:

34 Quantitative Analytik Chromatographie Der Eluent wird verbrannt. Organische Moleküle (Analyte) produzieren dabei Ionen in der Flamme, welche einen messbaren elektrischen Strom zwischen zwei Elektroden verursachen. Besitzt eine sehr viel bessere Empfindlichkeit als der WLD. - Elektroneneinfangdetektor (Electron Capture Detector) / ECD: Ein ß-Teilchenstrahler (Nickelisotop) bewirkt eine Ionisation des Trägergases und damit wieder einen Stromfluss zwischen zwei Elektroden. Organische Moleküle welche Halogenatome besitzen fangen (capture) die Elektronen ein und damit wird der elektrische Strom verringert. Dieser Detektortyp spricht nur auf halogenierte Verbindungen an, hat aber für diese eine bessere Empfindlichkeit (und damit bessere Nachweisgrenzen) als die anderen Detektoren. Er wird deshalb oft in der Spurenanalyse von Pestiziden und ähnlichen Verbindungen eingesetzt. - Massenspektrometrischer Detektor / GC-MS: Je nach Auflösung des Massenspektrometers der mit dem GC gekoppelt wird spricht man von MSD (MS-Detector) oder von der Kopplungsmethode (hyphenated method) GC-MS wenn die Strukturaufklärung wichtig ist. Die Kopplung ist einfacher und robuster als für die Flüssigchromatographie.

35 Quantitative Analytik Chromatographie Beispiele für typische Anwendungen: