Dissertation. Zur Erlangung des akademischen Grades. doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der
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1 Regulation der NAD(P)H-Oxidase und LOX- durch vasoaktive Substanzen und laminare im kardiovaskulären System Dissertation Zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Frau Nicole Dürrschmidt, geb. Hänel geboren am 3. Juli 974 in Plauen Gutachter:. Prof. Henning Morawietz 2. Prof. Roos 3. Dr. Münzel Halle (Saale), den verteidigt am urn:nbn:de:gbv: [
2 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Einleitung Bedeutung von Superoxidanionen bei der Entstehung der Arteriosklerose Die NAD(P)H-Oxidase als wichtigste Quelle der vaskulären Superoxidanionen-Bildung Bedeutung des oxldl-rezeptors LOX- in der Arteriosklerose ET- und Ang II als pro-arteriosklerotische Stimuli Anti-arteriosklerotische Wirkung von laminarer Ziel der Arbeit Material und Methoden Chemikalien Probenmaterial Kultur von humanen Endothelzellen in Kulturschalen Kultur von humanen Endothelzellen in Pyrex-Röhrchen Präparation von humanen Granulozyten Gewebeproben des linken Ventrikels Applikation von auf Endothelzellen Wasserqualität RNA-Isolation RNA-Isolation aus humanen Endothelzellen mittels TRI REAGENT RNA-Isolation aus humanen Gewebeproben mittels Cäsiumchlorid- Ultrazentrifugation Bestimmung von Nukleinsäurekonzentrationen durch Absorptionsmessung Reverse Transkription Semiquantitative Polymerase-Kettenreaktion Standard-kalibrierte kompetitive Polymerase-Kettenreaktion Konstruktion der internen Standards Klonierung der Standardfragmente Plasmidisolation Restriktionsverdau von Plasmid-DNA
3 Polymerase-Kettenreaktion mit internem Standard Agarose-Gelelektrophorese Elektroelution von Nukleinsäuren DNA-Sequenzierung Protein-Isolation Protein-Isolation aus humanen Endothelzellen Protein-Isolation aus humanem Myokardgewebe Polyacrylamid-Gelelektrophorese Western-Blot Elektrophoretischer Proteintransfer Proteinnachweis Chemilumineszenz-Reaktion mit dem ECL-System Bestimmung der NAD(P)H-Oxidase-Aktivität Bestimmung der Superoxidanionen-Bildung durch die Coelenterazinvermittelte Chemilumineszenz Bestimmung der Superoxidanionen-Bildung durch die Cytochrom c- Nachweismethode Bestimmung der Superoxidanionen-Bildung durch die ESR-Spektroskopie Bestimmung der oxldl-aufnahme Statistik Ergebnisse Expression von Nox4 in humanen Endothelzellen Einfluss von ET- auf die Regulation der NAD(P)H-Oxidase und LOX- Regulation der endothelialen NAD(P)H-Oxidase durch ET- Regulation des oxldl-rezeptors LOX- durch ET- Einfluss von Ang II auf die Regulation von LOX- Einfluss von laminarer auf die Regulation der NAD(P)H- Oxidase und LOX- Regulation der endothelialen NAD(P)H-Oxidase durch Applikation von laminarer Regulation des oxldl-rezeptors LOX- durch Applikation von laminarer Expression von Nox4 im humanen Myokard
4 3.6 Einfluss von ACE-Hemmer-Therapie auf die NAD(P)H-Oxidase im linken Ventrikel von Patienten mit chronischer Herzinsuffizienz Diskussion Gp9 phox -homologe Untereinheiten in humanen Endothelzellen Induktion der Superoxidanionen-Bildung und oxldl-aufnahme durch ET- und Ang II in humanen Endothelzellen Induktion der NAD(P)H-Oxidase durch ET- Induktion von LOX- durch ET- und Ang II Circulus vitiosus der endothelialen Radikalbildung Verminderte Superoxidanionen-Bildung und oxldl-aufnahme durch arterielle laminare in humanen Endothelzellen Herabregulation der NAD(P)H-Oxidase durch arterielle laminare Herabregulation der oxldl-aufnahme durch arterielle laminare Verminderte Protein-Expression der NAD(P)H-Oxidase-Untereinheiten durch ACE-Hemmer-Therapie Zusammenfassung 79 6 Literatur 82 Anhang
5 Abkürzungsverzeichnis ACE Angiotensin-Konvertierungs- ICAM- interzelluläres Adhäsionsenzym molekül- Ang II Angiotensin II K Kontrolle AT Angiotensin II-Rezeptor Typ k. A. keine Angaben AT 2 Angiotensin II-Rezeptor Typ 2 LDL low density-lipoprotein BSA Rinderserum-Albumin L-NAME N G -Nitro-L-Argenin- CAT Katalase methylester cdna komplementäre DNA LOX- Lektin-ähnlicher oxldlcgmp zyklisches Guanosin- Rezeptor- monophosphat MAP-Kinase mitogen activated protein DEPC Diethylpyrocarbonat kinase DEPMPO 5 -Diethoxyphosphoryl-5- mrna messenger-rna methyl--pyrrolin-n-oxid NAD(P)H Nikotinsäureamidadenin- DETA-NO 2,2 -Hydroxynitrosohydrazino- dinukleotid-(phosphat) bis-ethanamin NO Stickstoffmonoxid dh 2 O deionisiertes Wasser Nox NAD(P)H-Oxidase DiI, -Dioctadecyl-3,3,3,3 - O 2 Superoxidanion tetramethylindocarbocyanin- ONOO Peroxynitrit perchlorat oxldl oxidiertes low density- DMPO 5,5-Dimethylpyrrolin-N-oxid Lipoprotein DNA Desoxyribonukleinsäure p Protein dntp Desoxyribonukleosid- PBS Phosphatgepufferte triphosphat Kochsalzlösung D-PBS Dulbecco s Phosphatgepufferte PCR Polymerase-Kettenreaktion Salzlösung phox Phagozyten-Oxidase DTT Dithiotreitol PKC Proteinkinase C ECE Endothelin-Konvertierungs- ppet- Preproendothelin- enzym RAS Renin-Angiotensin-System E. coli Escherichia coli RNA Ribonukleinsäure EDTA Ethylendiamin-N,N,N,N - ROS reaktive Sauerstoffspezies tetraacetat RT reverse Transkriptase enos endotheliale NO-Synthase SAC stretch-activated cation ESR Elektronen-Spin-Resonanz channels ET- Endothelin- SDS Natriumdodecylsulfat ET A Endothelin-Rezeptor Typ A SOD Superoxid-Dismutase ET B Endothelin-Rezeptor Typ B TE Tris-EDTA-Puffer FAD Flavinadenindinukleotid TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer gp Glykoprotein TBS-T Tris-gepufferte Salzlösung + G-Protein GTP-bindendes Protein Tween GTP Guanosintriphosphat Tris Tris(hydroxymethyl)- HBSS Hank s gepufferte Salzlösung aminomethan HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-- UV ultra-violett piperazinyl]-ethansulfonsäure X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β- HIF-α Hypoxie-induzierender Faktor- D-galaktosid α HO Hydroxylradikal HUVEC humane Endothelzellen der Nabelschnurvene
Ergebnisse kda. 30 kda
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