HHV8 oligomix Alert kit Nachweis von HHV8-spezifischer DNA

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1 INHALT ANWENDUNGSGEBIET Seite 1 TESTPRINZIP Seite 2 KITBESCHREIBUNG Seite 2 IM KIT ENTHALTENES MATERIAL Seite 2 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES, NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL Seite 3 ANDEREN PRODUKTEN ERFORDERLICH Seite 3 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Seite 4 PROBENMATERIAL UND KONTROLLEN Seite 5 VERFAHREN Seite 6 GRENZEN DES VERFAHRENS Seite 11 MERKMALE DES PRODUKTES Seite 12 LITERATUR Seite 12 PROBLEMLÖSUNGEN Seite 13 ERKLÄRUNG DER SYMBOLE Seite 14 ANWENDUNGSGEBIET Nanogen Advanced Diagnostics S.p.A. Corso Torino, 89/d Buttigliera Alta (TO) ITALY Büro: Tel Fax E. mail: emd.support@elitechgroup.com Internetseite: C Das Produkt ist ein qualitativer Nukleinsäure-stest zum Nachweis der DNA des menschlichen Herpesvirus 8 (HHV8) in DNA-Extrakten aus EDTA-Plasma, EDTA-Vollblut und aus Leukozyten- und Lymphomonozyten-Suspensionen. Das Produktist in Kombination mit klinischen Daten und anderen Laboruntersuchungen in der Diagnostik von HHV8-Infektionen einsetzbar. TESTPRINZIP Das Verfahren sieht zwei aufeinander folgende sreaktionen (nested) mit einem programmierbaren Thermostat (Thermocycler) vor. Eine erste sreaktion, die für eine kodierende Genregion des HHV8-Kapsidproteins (gp27) spezifisch ist, wird im ersten Reaktionsgefäß ausgeführt, ausgehend von der aus den Testproben extrahierten DNA. Dann wird im zweiten Reaktionsgefäß, ausgehend von dem Produkt der ersten sreaktion, eine zweite spezifische sreaktion für die Genregion des Kapsidproteins (gp27) von HHV8 durchgeführt. Das Auftreten des spezifischen Genprodukts in der zweiten sreaktion zeigt an, dass HHV8-DNA im Ausgangsmaterial vorhanden war. Der Kit enthält die folgenden Komponenten. OligoMIX für die erste KITBESCHREIBUNG Optimierter Reaktionsmix für die der Nukleinsäuren in einer Stabilisationslösung, voraliquotiert in gebrauchsfertigen FARBLOSEN «Monotest» Reaktionsgefäßen. Jedes Reaktionsgefäß enthält 40 µl Lösung und 50 µl Vaselinöl. Der Reaktionsmix liefert die Oligonukleotid-Primer für die erste, das Puffersystem, das Magnesiumchlorid und die Nukleotidtriphosphate. Die Oligonukleotid-Primer sind spezifisch für eine Genomregion, die das Kapsidprotein (gp27) von HHV8 (Region ORF26) kodiert. OligoMIX für die zweite Optimierter Reaktionsmix für die der Nukleinsäuren in einer Stabilisationslösung, voraliquotiert in gebrauchsfertigen ROTEN «Monotest» Reaktionsgefäßen. Jedes Reaktionsgefäß enthält 44 µl Lösung und 50 µl Vaselinöl. Der Reaktionsmix liefert die Oligonukleotid-Primer für die zweite, das Puffersystem, das Magnesiumchlorid und die Nukleotidtriphosphate. Die Oligonukleotid-Primer sind spezifisch für eine Genregion, die das Kapsidprotein (gp27) von HHV8 kodiert. Mit dem Kit können 50 Reaktionen inklusive Positiv- und Negativ-Kontrollen durchgeführt werden. IM KIT ENTHALTENES MATERIAL Komponente Beschreibung Menge Zusammensetzung Etikettierung OligoMIX für die erste smix in FARBLOSEN 0,2- oder 0,5 ml- Reaktionsgefäßen 50 x 90 µl Externe Primer, Kaliumchlorid, TRIS Base, TRIS-HCl, Triton X-100, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotidtriphosphat-mix, Vaselinöl - OligoMIX für die zweite smix in ROTEN 0,2- oder 0,5 ml- Reaktionsgefäßen 50 x 94 µl Interne Primer, Kaliumchlorid, TRIS Base, TRIS-HCl, Triton X-100, Magnesiumchlorid, Desoxynukleotidtriphosphat-mix, Vaselinöl - SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 1/14 SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 2/14

2 ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES, NICHT MITGELIEFERTES MATERIAL - Laminarfluss-Werkbank (Laminarbox). - Ungepuderte Einweghandschuhe aus Latex o.ä. - Tisch-Mikrozentrifuge ( U/min). - Mikropipetten und sterile Pipettenspitzen mit Aerosolfilter oder Direktverdrängungs- Dispensierpipetten (0,5-10 µl, 2-20 µl, 5-50 µl, µl). - Steriles bidestilliertes Wasser. - Programmierbarer Thermostat (PCR-Thermocycler). ANDEREN PRODUKTEN ERFORDERLICH NICHT in diesem Kit enthalten sind die Reagenzien für die DNA-Extraktion aus den zu testenden n, für die positive Extraktions-kontrolle, für die positive skontrolle, für die interne Eignungskontrolle und für den Nachweis der amplifizierten DNA. Für diese Analysenschritte werden die folgenden Ergänzungskits von Nanogen Advanced Diagnostics S.p.A. zur Anwendung empfohlen. «EXTRAcell» (Katalognr. EXTD02), Kit für die DNA-Extraktion aus zellulären n. Mit dem Kit können 50 Extraktionen durchgeführt werden. «CPE-DNA - Internal Control» (Katalognr. CTREXTG), Positivkontrolle für die Extraktion von Plasmid-DNA für DNA-Extraktionssysteme aus nicht-zellulären n. Mit dem Kit können 50 Extraktionen durchgeführt werden. «HHV8 - Positive Control» (Katalognr. CTR038), positive skontrolle der Plasmid-DNA. Mit dem Kit können 25 Extraktionen durchgeführt werden. «DNA Polymerase 2U / µl» (Katalognr. ER140), thermostabile DNA-Polymerase für die von Nukleinsäuren. Mit dem Kit können 100 Reaktionen durchgeführt werden. «DECK» (Katalognr. DK100), interne Eignungskontrolle, nutzt das humane Beta-Globin-Gen als Target. Mit dem Kit können 100 Reaktionen durchgeführt werden. «ELECTROPHORESIS 2» (Katalognr. EPH02), Nachweis der amplifizierten DNA mittels Agarosegel- Elektrophorese. Mit dem Kit können 64 Nachweise durchgeführt werden. SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 3/14 HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Dieser Kit ist ausschließlich für die In-vitro-Diagnose bestimmt. Allgemeine Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen Alle biologischen n müssen so gehandhabt und entsorgt werden, als ob sie Infektionserreger übertragen könnten. Der direkte Kontakt mit den biologischen n ist zu vermeiden. Es dürfen keine Spritzer oder Aerosol erzeugt werden. Material, das mit den biologischen n in Kontakt gekommen ist, muss vor der Entsorgung mindestens 30 Minuten lang mit 3%-igem Natriumhypochlorit behandelt oder eine Stunde lang bei 121 C autoklaviert werden. Alle Reagenzien und im Test verwendeten Materialien müssen so gehandhabt und entsorgt werden, als ob sie Infektionserreger übertragen könnten. Der direkte Kontakt mit den Reagenzien ist zu vermeiden. Es dürfen keine Spritzer oder Aerosol erzeugt werden. Abfälle müssen gemäß den geltenden Sicherheitsvorschriften behandelt und entsorgt werden. Brennbares Einwegmaterial muss verbrannt werden. Flüssige Abfälle, die Säuren oder Basen enthalten, müssen vor der Beseitigung neutralisiert werden. Geeignete Schutzkleidung und -handschuhe tragen. Augen und Gesicht sind zu schützen. Lösungen niemals mit dem Mund pipettieren. Im Arbeitsbereich nicht essen, trinken, rauchen und keine Kosmetika auftragen. Nach der Arbeit mit n und Reagenzien gründlich die Hände waschen. Überschüssige Reagenzien und Abfälle nach den geltenden Vorschriften entsorgen. Vor dem Test alle Gebrauchsanweisungen zum Kit lesen. Bei der Testdurchführung sind die im Kit enthaltenen Anweisungen zu befolgen. Das Verfallsdatum des Kits ist einzuhalten. Nur die im Kit enthaltenen oder vom Hersteller empfohlenen Reagenzien verwenden. Nie Reagenzien verschiedener Chargen gegeneinander austauschen. Keine Reagenzien aus Testbestecken anderer Hersteller verwenden. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen für die Molekularbiologie Die Verfahren der Molekularbiologie wie Extraktion, reverse Transkription, und Nachweis von Nukleinsäuren erfordern geschultes Personal, um falsche Ergebnisse bedingt durch den Abbau von Nukleinsäuren in den n oder Kontamination der n durch sprodukte zu vermeiden. Die DNA-Extraktion aus den n und die Vorbereitung der sreaktionen müssen räumlich separat von der und dem Nachweis der sprodukte durchgeführt werden. Ein sprodukt darf nie in den Arbeitsbereich Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen gelangen. Für die Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen einerseits und für die /Nachweis der sprodukte andererseits müssen jeweils gesondert Kittel, Handschuhe und Instrumente zur Verfügung stehen. Die Kittel, Handschuhe und Instrumente aus dem Bereich /Nachweis der sprodukte dürfen nie in den Bereich Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen gelangen. Die n dürfen ausschließlich für diese Art von Analyse verwendet werden. Die n müssen an einer Laminarfluss-Werkbank gehandhabt werden. Reaktionsgefäße mit verschiedenen n dürfen nie gleichzeitig geöffnet werden. Die Pipetten zum Pipettieren der n dürfen ausschließlich dafür verwendet werden. Die Pipetten müssen Direktverdrängungs-Dispensierpipetten sein, andernfalls müssen Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet werden. Die verwendeten Spitzen müssen steril, DNAse/RNAsefrei sowie DNA/RNA-frei sein. Die Reagenzien müssen an einer Laminarfluss-Werkbank gehandhabt werden. Die für die erforderlichen Reagenzien müssen so vorbereitet werden, dass sie in einer Sitzung aufgebraucht werden. Die Pipetten zum Pipettieren der Reagenzien dürfen ausschließlich dafür verwendet werden. Die Pipetten müssen Direktverdrängungs-Dispensierpipetten sein, andernfalls müssen Pipettenspitzen mit Aerosolfilter verwendet werden. Die verwendeten Spitzen müssen steril, DNAse/RNAsefrei sowie DNA/RNA-frei sein. Die sprodukte müssen so gehandhabt werden, dass ihre Verbreitung in die Umgebung weitestgehend begrenzt wird, um Kontaminationen zu vermeiden. Die Pipetten zum Pipettieren der sprodukte dürfen ausschließlich dafür verwendet werden. SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 4/14

3 Spezielle Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen für die Komponenten Die Reaktionsgefäße mit OligoMIX für die erste und für die zweite sind Einweggefäße und dürfen daher nur einmal für sreaktionen verwendet werden. Für OligoMIX für die erste und für die zweite gelten folgende Sicherheitsempfehlungen (S-Sätze): n S Gas/Rauch/Dampf/Aerosol nicht einatmen. Berührung mit den Augen vermeiden. PROBENMATERIAL UND KONTROLLEN Verwenden Sie mit diesem Produkt nur aus den folgenden biologischen n extrahierte DNA: in EDTA gesammeltes Vollblut, Leukozyten- und Lymphomonozyten-Suspensionen. In EDTA gesammeltes Vollblut Die Vollblutproben für die DNA-Extraktion müssen nach den Laboranweisungen in EDTA gesammelt und bei +2 bis +8 C transportiert werden. Bei +2 bis +8 C können sie maximal drei Tage aufbewahrt werden. n von EDTA-Vollblut nicht einfrieren, um die Lyse der Zellen und den Verlust des DNA- Virentiters zu vermeiden. Die Arbeitsvorschriften für eine eventuelle Vorbehandlung der klinischen und für die Extraktion der DNA sind im Handbuch zum Kit «EXTRAcell» enthalten. Leukozyten- und Lymphomonozyten-Suspensionen Suspensionen von peripheren Leukozyten oder Lymphomonozyten für die DNA-Extraktion müssen nach den Laboranweisungen präpariert werden, in steriler physiologischer Lösung oder PBS resuspendiert und gezählt werden. Bei +2 bis +8 C können Sie max imal vier Stunden aufbewahrt werden. Leukozyten- und Lymphomonozyten-Suspensionen nicht einfrieren, um die Lyse der Zellen und den Verlust des DNA-Virentiters zu vermeiden. Die Arbeitsvorschriften für eine eventuelle Vorbehandlung der klinischen und für die Extraktion der DNA sind im Handbuch zum Kit «EXTRAcell» enthalten. Interferierende Substanzen Die aus den Ausgangsproben extrahierte DNA darf kein Heparin oder Hämoglobin enthalten, um Hemmeffekte und ungültige Testergebnisse zu vermeiden. Es liegen keine Daten zu eventuellen Inhibitionsphänomenen durch Virustatika, Chemotherapeutika oder Immunsuppressiva vor. skontrollen Es ist absolut notwendig, jeden slauf zu validieren, indem eine negative und eine positive Kontrolle mitgeführt werden. Für die Negativkontrolle verwendet man steriles bidestilliertes Wasser (nicht im Kit enthalten), das der Reaktion anstelle der aus der extrahierten DNA hinzugefügt wird. Für die Positivkontrolle wird DNA aus einer bereits getesteten positiven oder die «HHV8 - Positive Control» verwendet. Qualitätskontrollen Es wird empfohlen, das gesamte Analyseverfahren, DNA-Extraktion plus, in jeder Sitzung zu validieren, indem eine Negativ- und eine Positiv-Kontrolle mitgeführt werden. Als Negativkontrolle wird eine bereits negativ -getestete oder steriles bidestilliertes Wasser verwendet. Als Positivkontrolle wird eine bereits positiv -getestete verwendet. VERFAHREN Programmierung des Thermocyclers (im Arbeitsbereich /Nachweis der sprodukte auszuführen) Vor dem Beginn des Laufs sind folgende Vorbereitungen zu treffen: - Überprüfen, ob der Temperaturblock des programmierbaren Thermostats (Thermocycler) kompatibel mit dem Format der im Kit enthaltenen Reaktionsgefäße «Monotest» ist (0,2 oder 0,5 ml- Reaktionsgefäße); - Im Handbuch des Cyclers prüfen, wie die Temperaturkontrolle erfolgt; - Möglichst die direkte Temperaturkontrolle am Heizblock auswählen (z.b. beim Thermocycler Hybaid TM oder Eppendorf TM ); - Wenn dies nicht möglich ist (z.b. beim Thermocycler GeneAmp PCR System von Applied Biosystems TM ) die Kontrolle der Temperaturvoreinstellung wählen; - Wenn abgefragt, am Thermocycler das Reaktionsvolumen 100 µl einstellen; - Am Thermocycler die Parameter des Reaktionszyklus laut den folgenden Tabellen einstellen: Programm der ersten Anzahl der Zyklen Temperatur Zeitdauer 1 Zyklus 95 C 4 min. 35 Zyklen 95 C 1 min. 55 C 1 min. 72 C 1 min. 1 Zyklus 72 C 5 min. Programm der zweiten Anzahl der Zyklen Temperatur Zeitdauer 1 Zyklus 95 C 2 min. 30 Zyklen 95 C 1 min. 55 C 1 min. 72 C 1 min. 1 Zyklus 72 C 5 min. Vorbereitung der ersten (im Bereich Extraktion/Vorbereitung der sreaktion auszuführen) Jede erfordert ein eigenes Röhrchen. Ein Kit ermöglicht die Durchführung von 50 Reaktionen inklusive Positiv- und Negativ-Kontrollen. Pro Lauf müssen mindestens drei Reaktionen inklusive Positiv- und Negativ-Kontrolle durchgeführt werden. Vor dem Beginn des Laufs sind folgende Vorbereitungen zu treffen: - Die n für die Analyse, die interne Eignungskontrolle «DECK» und die «HHV8 - Positive Control» auftauen, 5 Sekunden zentrifugieren, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, und in Eis stellen. - Jeweils ein farbloses Reaktionsgefäß «Monotest» für jede Analyseprobe, für die Negativkontrolle und für die Positivkontrolle auftauen, 5 Sekunden zentrifugieren*, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, gut lesbar mit einem wasserfesten Stift beschriften und in Eis stellen. *Hinweis: Die Reaktionsgefäße «Monotest» sind "dünnwandig und müssen vorsichtig gehandhabt werden, damit sie nicht kaputt gehen. Das Zentrifugieren muss gegebenenfalls mit geeigneten Adaptatoren und gemäß den Angaben in diesem Gebrauchshandbuch ausgeführt werden. - «DNA pol. 2U / µl» entnehmen, 5 Sekunden zentrifugieren, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, und in Eis stellen. 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4 - Die «DNA pol. 2U / µl» nach den Angaben in der folgenden Tabelle mit «DECK» verdünnen. Man stellt ein Volumen verdünnter DNA-Polymerase her (Gesamtvolumen), das für alle vorgesehenen Reaktionen (einschließlich Kontrollen) plus eine ausreicht, um eine Sicherheitsspanne zu haben. Das verdünnte Enzym kann nicht aufbewahrt werden. Anzahl der Reaktionen DNA pol. 2U / µl DECK Gesamtvolumen 4 2,0 µl 18,0 µl 20 µl 5 2,5 µl 22,5 µl 25 µl 6 3,0 µl 27,0 µl 30 µl 7 3,5 µl 31,5 µl 35 µl 8 4,0 µl 36,0 µl 40 µl 9 4,5 µl 40,5 µl 45 µl 10 5,0 µl 45,0 µl 50 µl 11 5,5 µl 49,5 µl 55 µl 12 6,0 µl 54,0 µl 60 µl 13 6,5 µl 58,5 µl 65 µl 14 7,0 µl 63,0 µl 70 µl 15 7,5 µl 67,5 µl 75 µl 16 8,0 µl 72,0 µl 80 µl 17 8,5 µl 76,5 µl 85 µl 18 9,0 µl 81,0 µl 90 µl 19 9,5 µl 85,5 µl 95 µl 20 10,0 µl 90,0 µl 100 µl 21 10,5 µl 94,5 µl 105 µl 1. In jedes farblose Reaktionsgefäß «Monotest» 5 µl der verdünnten thermostabilen DNA-Polymerase (1U) pipettieren. 2. In jedes farblose Reaktionsgefäß «Monotest» 5 µl der extrahierten DNA pipettieren. Für die Negativkontrolle und die Positivkontrolle geht man in der gleichen Weise vor. 3. Die farblosen Reaktionsgefäß «Monotest» in den Thermocycler im Arbeitsbereich /Nachweis der sprodukte stellen und das Programm für die erste starten. Vorbereitung der zweiten (im Bereich Extraktion/Vorbereitung der sreaktion auszuführen) Vor dem Beginn des Laufs sind folgende Vorbereitungen zu treffen: - DECK auftauen, 5 Sekunden zentrifugieren, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, und in Eis stellen. - «DNA pol. 2U / µl» entnehmen, 5 Sekunden zentrifugieren, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, und in Eis stellen. - Ebenso viele rote Reaktionsgefäße «Monotest» auftauen, wie farblose verwendet wurden, 5 Sekunden zentrifugieren*, um den gesamten Inhalt am Gefäßboden zu konzentrieren, gut lesbar mit einem wasserfesten Stift beschriften und in Eis stellen. *Hinweis: Die Reaktionsgefäße «Monotest» sind "dünnwandig und müssen vorsichtig gehandhabt werden, damit sie nicht kaputt gehen. Das Zentrifugieren muss gegebenenfalls mit geeigneten Adaptatoren und gemäß den Angaben in diesem Gebrauchshandbuch ausgeführt werden. - Die «DNA pol. 2U / µl» wie vorher beschrieben mit «DECK» verdünnen. 4. In jedes rote Reaktionsgefäß «Monotest» 5 µl der verdünnten temperaturbeständigen DNA- Polymerase (1 U) pipettieren. 5. In jedes rote Reaktionsgefäß «Monotest» 1 µl des Produkts aus der ersten dazu pipettieren. Hinweis: Das Produkt der ersten kann die folgenden Tests kontaminieren. Halten Sie die überschüssigen Produkte aus der ersten separat und wechseln Sie die Handschuhe am Ende dieses Schrittes. 6. Die roten Reaktionsgefäße «Monotest» in den Thermocycler im Arbeitsbereich /Nachweis der sprodukte stellen und das Programm für die zweite starten. SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 7/14 Hinweis: Das Reaktionsprodukt kann bei -20 C für maximal e inen Monat aufbewahrt werden. Nachweis des spezifischen sprodukts (im Arbeitsbereich /Nachweis der sprodukte auszuführen) Das spezifische Produkt der zweiten kann durch elektrophoretische Trennung nachgewiesen und identifiziert werden. Dazu verwendet man ein 4%iges Agarosegel mit 1 µg/ml Ethidiumbromid in 1x TAE-Puffer, (20 mm TRIS Base, 20 mm TRIS Acetat, 1 mm Dinatrium-EDTA), analog zum Produkt «ELECTROPHORESIS 2». Das spezifische Produkt für HHV8 der zweiten hat eine Größe von 185 bp. Hinweis: Das Produkt der zweiten kann spätere Analysen kontaminieren. Überschüssige Produkte aus der zweiten und der beim Nachweis erzeugte Abfall müssen separiert werden. Das Beispiel zeigt das Schema eines Elektrophoresegels nach Auftrennung der sprodukte aus einem PCR-Lauf, in dem drei n analysiert wurden. Taschen 1380 bp Positive HHV8 Positive HHV8 Molekulargewichtsmarker Positivkontrolle Negativkontrolle Negativkontrolle 517 bp 459 bp 600 bp 600 bp 387 bp 247 bp 75 bp 65 bp 46 bp 185 bp 185 bp 185 bp Molekular ungeeignete gewichts marker Bei Eignung der n müssen die für das HHV8-sprodukt negativen n das sprodukt des humanen Beta-Globin-Gens in einer Größe von ca. 600 bp aufweisen, wenn «DECK» eingesetzt wurde. Bei Eignung der n weisen die für das HHV8-sprodukt positiven n nicht immer das sprodukt des humanen Beta-Globin-Gens in einer Größe von ca. 600 bp auf, wenn «DECK» eingesetzt wurde. Die weniger effiziente sreaktion des humanen Beta-Globin-Gens in «DECK» kann kompetitiv durch die hocheffiziente sreaktion von HHV8 unterdrückt werden. Es ist unbedingt notwendig, die Spezifität des zweiten sprodukts zu validieren. Dazu vergleicht man seine Wanderungsstrecke im Gel mit der eines Markers mit bekannter Basenpaar-Länge und mit der Wanderung des zweiten sprodukts der Positivkontrolle. Das eventuelle Vorhandensein von unspezifischen Produkten bei der zweiten hat für den Nachweis der HHV8-DNA keinerlei Bedeutung. SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 8/14

5 Bewertung der Ergebnisse Die Ergebnisse der negativen und der positiven Kontrollreaktionen werden verwendet, um die Sitzung laut der folgenden Tabelle zu validieren: der Negativkontrolle Spezifisches Produkt HHV8 NICHT VORHANDEN der Positivkontrolle Spezifisches Produkt HHV8 VORHANDEN KORREKT KORREKT Wenn das spezifische sprodukt in der negativen Kontrollreaktion vorhanden ist, sind Probleme in der sphase aufgetreten (Kontamination), die zu falschen Positivergebnissen führen können. Die Sitzung ist ungültig und muss ab der wiederholt werden. Wenn das spezifische sprodukt in der positiven Kontrollreaktion nicht vorhanden ist, sind Probleme in der sphase aufgetreten (unwirksame oder keine ), die zu falschen Negativergebnissen führen können. Die Sitzung ist ungültig und muss ab wiederholt werden. Mit diesem Kit kann eine Mindestmenge von 10 DNA-Kopien des HHV8-Gens, das das Kapsidprotein (gp27) kodiert, erfasst werden, was einem Genäquivalent pro Reaktion entspricht (Nachweisgrenzen des Produkts, siehe Abschnitt Merkmale des Produktes auf Seite 12). Die Reaktionsergebnisse der Analysenproben werden, wie in der folgenden Tabelle beschrieben, verwendet, um die Präsenz von HHV8-DNA nachzuweisen. Spezifisches Produkt HHV8 NICHT VORHANDEN der Spezifisches Produkt DECK Eignung der Testergebnis HHV8-DNA NICHT VORHANDEN nicht geeignet ungültig - VORHANDEN geeignet gültig, negativ NICHT ERFASST Berechnung der Nachweisgrenzen Die Nachweisgrenze des Tests wird ausgehend von der Nachweisgrenze der sreaktion gemäß folgender Formel berechnet, unter der Voraussetzung, dass eine bestimmte Extraktionsmethode benutzt und Bezug auf eine bestimmte Referenz-Maßeinheit genommen wird. Nachweisgrenze = Fe x Ee x Fa x 10 geq/reaktion Fe ist der Quotient aus der Referenz-Maßeinheit und der in der Extraktion tatsächlich verwendeten nmenge, z.b.: Extraktion Referenz-Maßeinheit extrahierte nmenge Fe «EXTRAcell» geq/ Zellen Zellen Fe = Z. / Z. = 0,2 Ee ist die reziproke Extraktionseffizienz, z.b.: Extraktion Extraktionseffizienz Ee «EXTRAcell» Effizienz ca. 100%, d.h. 1,0 Ee = 1 / 1,0 = 1 Fa ist der Quotient aus dem Volumen des DNA-Extrakts und dem in der sreaktion verwendeten Volumen, z.b.: Extraktion Volumen des Extrakts Volumen in Reaktion Fa «EXTRAcell» 100 µl 5 µl Fa = 100 µl / 5 µl = 20 Wenn man die Extraktionskits von Nanogen Advanced Diagnostics S.p.A. verwendet, ergibt obige Formel: Extraktion «EXTRAcell» Nachweisgrenzen Nachweisgrenze = 40 geq/ Zellen VORHANDEN NICHT VORHANDEN geeignet* gültig, positiv VORHANDEN VORHANDEN geeignet gültig, positiv VORHANDEN Wenn bei der Reaktion einer weder das spezifische Produkt der HHV8- noch das des humanen Beta-Globin-Gens (analysiert mit «DECK») nachgewiesen werden, sind Probleme in der sphase (unwirksame oder keine ) oder in der Extraktionsphase (keine DNA oder Präsenz von Inhibitoren) aufgetreten, die zu Fehlergebnissen und falschen negativen Ergebnissen führen können. Die ist nicht geeignet, der Test ist ungültig und muss von der Extraktion einer neuen an wiederholt werden. Wenn in der Reaktion einer Analysenprobe das spezifische sprodukt für HHV8 fehlt und das des humanen Beta-Globin-Gens der Mischung «DECK» vorhanden ist, wurde die HHV8-DNA in der aus der extrahierten DNA nicht erfasst. Man kann aber nicht ausschließen, dass die HHV8-DNA mit einem Titer vorhanden ist, der unter der Nachweisgrenze des Produkts liegt (siehe Abschnitt Merkmale des Produktes auf Seite 12). In diesem Fall würde es sich um ein falsch negatives Ergebnis handeln. Bei der Bewertung der mit diesem Test erhaltenen Ergebnisse müssen alle klinischen Daten und die anderen Laborwerte des Patienten berücksichtigt werden. *Hinweis: Auch wenn das spezifische HHV8-Produkt nach der sreaktion vorhanden ist, kann das spezifische Produkt des menschlichen Beta-Globin-Gens fehlen. In der Tat kann die weniger effiziente sreaktion des humanen Beta-Globin-Gens in «DECK» kompetitiv durch die hocheffiziente sreaktion von HHV8 unterdrückt werden. In diesem Fall ist die dennoch geeignet und das positive Testergebnis gültig. SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 9/14 SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 10/14

6 GRENZEN DES VERFAHRENS MERKMALE DES PRODUKTES Verwenden Sie mit diesem Produkt nur aus den folgenden menschlichen n extrahierte DNA: in EDTA gesammeltes Vollblut, Leukozyten- und Lymphomonozyten-Suspensionen. Verwenden Sie mit diesem Produkt keine DNA aus heparinisierten n: Heparin hemmt die sreaktion der Nukleinsäuren und führt zu ungültigen Ergebnissen. Verwenden Sie mit diesem Produkt keine mit Hämoglobin kontaminierte extrahierte DNA: Hämoglobin hemmt die sreaktion der Nukleinsäuren und kann zu ungültigen Ergebnissen führen. Es liegen keine Daten zu eventuellen Inhibitionsphänomenen durch Virustatika, Chemotherapeutika oder Immunsuppressiva vor. Die mit diesem Produkt erzielten Resultate hängen von der korrekten Entnahme, Transport, Lagerung und Vorbereitung der n ab. Um Fehlergebnisse zu vermeiden, ist besondere Sorgfalt während dieser Arbeitsschritte sowie die strikte Einhaltung der Arbeitsanleitung im Handbuch für die Extraktion der Nukleinsäuren angezeigt. Die nested für Nukleinsäuren, die in diesem Produkt angewendet wird, unterliegt wegen ihrer hohen analytischen Sensitivität leicht der Kontamination durch HHV8-positive klinische n, die Positivkontrollen und die Produkte der sreaktion selbst. Die Kontaminationen führen zu falsch positiven Ergebnissen. Das Produkt wurde so ausgeführt, dass die Kontaminationswahrscheinlichkeit begrenzt ist; dennoch können nur die technisch einwandfreie Durchführung der Experimente und die sorgfältige Einhaltung der Anweisungen in diesem Handbuch Kontaminationen vermeiden. Das Personal, das mit diesem Produkt arbeitet, muss praktische Erfahrung mit der Handhabung von potenziell infektiösen biologischen n und als gefährlich eingestuften chemischen Präparaten haben, um Unfälle mit eventuell schweren Folgen für den Anwender oder andere Personen zu vermeiden. Dieses Produkt erfordert geeignete Arbeitskleidung und Arbeitsbereiche für die Handhabung von potenziell infektiösen biologischen n und als gefährlich eingestuften chemischen Präparaten, um Unfälle mit eventuell schweren Folgen für den Anwender oder andere Personen zu vermeiden. Das Personal, das mit diesem Produkt arbeitet, muss praktische Erfahrung mit molekularbiologischen Methoden wie Extraktion, und Nachweis von Nukleinsäuren haben, um Fehlergebnisse zu vermeiden. Dieses Produkt erfordert separate Arbeitsbereiche für die Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen und die /Nachweis der sprodukte, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Dieses Produkt erfordert separate Arbeitskleidung und -instrumente für die Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen und die /Nachweis der sprodukte, um falsch-positive Ergebnisse zu vermeiden. Ein negatives Ergebnis, das mit diesem Produkt erreicht wurde, zeigt an, dass die HHV8-DNA in der aus der extrahierten DNA nicht nachweisbar war. Man kann jedoch nicht ausschließen, dass die HHV8-DNA mit einem Titer vorhanden ist, der unter der Nachweisgrenze des Produkts liegt (Nachweisgrenzen des Produkts, siehe Abschnitt Merkmale des Produktes auf Seite 12); in diesem Fall handelt es sich um ein falsch negatives Ergebnis. Wie bei allen diagnostischen Verfahren müssen bei der Bewertung der Ergebnisse dieses Produktes alle klinischen Daten und die anderen Laborwerte des Patienten berücksichtigt werden. Wie bei allen diagnostischen Verfahren besteht ein Restrisiko, mit diesem Produkt ungültige, falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu erhalten. Dieses Restrisiko kann nicht eliminiert oder weiter reduziert werden. Diese Restgefahr kann in besonderen Situationen zu Fehlentscheidungen beitragen, die für den Patienten potenziell schwere Folgen haben können. Analytische Sensitivität: Nachweisgrenze Die analytische Sensitivität dieses Tests ermöglicht den Nachweis von ca. 10 Molekülen der Ziel- DNA in 5 µl DNA-Extrakt, die in der sreaktion eingesetzt werden. Die analytische Sensitivität des Tests, d.h. seine Nachweisgrenze, wurde mit Plasmid-DNA als Referenzmaterial bestimmt. Die Plasmid-DNA enthielt das sprodukt, dessen Anfangskonzentration spektrophotometrisch gemessen wurde (phhv8). Die Plasmid-DNA wurde auf einen Titer von 10 Kopien/5 µl verdünnt. Die Verdünnung wurde als Doppelwert in vier unabhängigen Sitzungen der nested mit den Produkten von Nanogen Advanced Diagnostics S.p.A., eingesetzt. Die Endergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. n Anzahl Sitzungen Replikate positiv negativ 10 Kopien phhv Diagnostische Sensitivität: Nachweiseffizienz an verschiedenen Genotypen/Subtypen Die diagnostische Sensitivität des Tests, d.h. die Nachweiseffizienz an verschiedenen Genotypen/Subtypen, wurde durch den Vergleich von Sequenzen mit Nukleotid-Datenbanken bewertet. Das Allinement der Abschnitte, die für die Hybridisierung der Oligonukleotid-Primer für HHV8 von OligoMIX gewählt wurden, mit den in der Datenbank vorhandenen Sequenzen der HHV8-Region, die das Kapsidprotein (gp27) kodiert, zeigt ihre Konserviertheit und die Abwesenheit von Mutationen. Diagnostische Spezifität: negative n Die diagnostische Spezifität des Tests als Bestätigung für negative n wurde mit HHV8- negativen n der humanen genomischen DNA nachgewiesen. Die diagnostische Spezifität wurde mit humaner genomischer DNA als Referenzmaterial bewertet, die für die HHV8-DNA negativ getestet und auf eine Konzentration von 500 ng pro Reaktion eingestellt wurde. Die Verdünnung wurde als Doppelwert in vier verschiedenen Sitzungen der nested mit den Produkten von Nanogen Advanced Diagnostics S.p.A., eingesetzt. Die Endergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. n Anzahl Sitzungen Replikate positiv negativ 500 ng Genom-DNA, HHV8-DNA negativ Analytische Spezifität: Potenziell interferierende Marker Die analytische Spezifität des Tests als Kreuzreaktivität mit anderen potenziell interferierenden Markern wurde durch den Vergleich von Sequenzen mit Nukleotid-Datenbanken bewertet. Das Allinement der gewählten Abschnitte für die Hybridisierung der Oligonukleotid-Primer für HHV8 aus OligoMIX mit den in der Datenbank verfügbaren Sequenzen von anderen als HHV8-Organismen, darunter jenen des vollständigen Genoms von EBV dem menschlichen Herpesvirus, das dem HHV8 am ähnlichsten ist wurde geprüft und hat ihre Spezifität und das Fehlen von signifikanten Homologien erwiesen. Hinweis: Die vollständigen Daten und Ergebnisse der Tests, die für die Merkmale des Produktes durchgeführt wurden, sind in Abschnitt 7 der Technischen Produktmappe "", FTP BAN038 registriert. LITERATUR B. Bigoni et al. (1996) J Inf. Dis 173: SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 11/14 SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 12/14

7 PROBLEMLÖSUNGEN Das spezifische sprodukt ist in der negativen Kontrollreaktion vorhanden Mögliche Ursachen Fehler bei der Dispensierung der extrahierten DNA. Fehler bei der Dispensierung des Produkts aus der ersten. Kontamination der für die Sitzung vorbereiteten Reagenzien. Kontamination des sterilen Wassers für die Enzymverdünnung. Kontamination des Enzymvorrats. Kontamination des Bereichs für die Extraktion/Vorbereitung der sreaktionen. Lösungen Öffnen Sie nur ein Reaktionsgefäß zur gleichen Zeit, vermeiden Sie, den Inhalt austreten zu lassen, wechseln Sie immer die Pipettenspitze. Öffnen Sie nur ein Reaktionsgefäß zur gleichen Zeit, vermeiden Sie, den Inhalt austreten zu lassen, wechseln Sie immer die Pipettenspitze. Befolgen Sie sorgfältig die Verdünnung und Dispensierung des Enzyms, wechseln Sie immer die Pipettenspitze. Verwenden Sie ein neues Aliquot von sterilem Wasser. Verwenden Sie ein neues Enzymaliquot. Reinigen Sie Oberflächen und Instrumente mit wasserlöslichen Detergenzien, waschen Sie die Kittel, ersetzen Sie die verwendeten Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen. Das spezifische sprodukt ist in der Positive Control reaktion nicht vorhanden Mögliche Ursachen Enzym zu stark verdünnt oder Fehler bei der Dispensierung des Enzyms. Fehler bei der Dispensierung der Positivkontrolle. Abbau der Positivkontrolle. Lösungen Überprüfen Sie die Verdünnungsberechnungen, beobachten Sie aufmerksam die Dispensierung des Enzyms und mischen Sie gut. Beobachten Sie aufmerksam die Dispensierung der Positivkontrolle. Verwenden Sie ein neues Aliquot der Positivkontrolle. Katalognummer. Oberer Temperaturgrenzwert. Chargencode ERKLÄRUNG DER SYMBOLE Zu verwenden bis (letzter Tag des Monats). In-vitro-Diagnostikum. Entspricht den Anforderungen der Europäischen Richtlinie 98\79\EG über In-vitro- Diagnostika. Inhalt ausreichend für "N" Tests. Achtung, lesen Sie die Gebrauchsanleitung. Hersteller. Fehler bei der Programmierung. Fehler bei der Dispensierung des Produkts aus der ersten. Fehler bei der Dispensierung des Produkts der zweiten in die Geltaschen. Kontrollieren Sie die Zeit-Temperatur-Folge, die am Thermocycler eingestellt ist. Entnehmen Sie das Produkt der ersten vorsichtig und dispensieren es sorgfältig in der zweiten. Laden Sie das Produkt der zweiten vorsichtig ins Gel. Unspezifische sprodukte in den Reaktionen der n vorhanden. Mögliche Ursachen Enzym zu stark konzentriert. Lösungen Überprüfen Sie die Berechnungen für die Enzymverdünnung. Die Vorbereitung der ersten sreaktion dauert zu lange. Fehler bei der Programmierung. Zu viel extrahierte DNA in der Reaktion. Halten Sie die Reaktionsgefäße, denen bereits der DNA- Extrakt zugesetzt wurde, auf Eis, bis sie in den Thermocycler gestellt werden Kontrollieren Sie die Zeit-Temperatur-Folge, die am Thermocycler eingestellt ist. Beurteilen Sie die Konzentration der extrahierten DNA, fügen Sie nicht mehr als 1 µg DNA pro Reaktion hinzu. SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 13/14 Der Kauf des Produktes berechtigt den Käufer zur von Nukleinsäure-Sequenzen im Rahmen der In-vitro- Humandiagnostik. Dieses Recht wird nur dann gewährt, wenn dieses Erzeugnis zusammen mit den lizensierten Produkten für "Positive Control" und Nachweis von Nanogen Advanced Diagnostics S.p.A. verwendet wird. Mit dem Kauf wird kein allgemeines Patent oder eine andere Lizenz als dieses spezifische Nutzungsrecht übertragen. SCH mban038_de 09/03/11 Revisionsstand 01 Seite 14/14