Studieneinheit II Lichtmikroskopie WMechanik & -Prüfung; LMW Uni BT; R. Völkl Aufbau eines Lichtmikroskops

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1 Lichtmikroskopie Studieneinheit II... ufbau eines Lichtmikroskops... Die uflösung des Lichtmikroskops... Einteilung der Lichtmikroskope..4. Beleuchtungsarten..5. Kontrastarten.. Lichtmikroskopie... ufbau eines Lichtmikroskops Okular Tubus bbildungsstrahlengang Kondensorsystem Lichtquelle jektiv Probe Beleuchtungsstrahlengang WMechanik & -Prüfung;

2 Strahlengang eines einfachen Mikroskops lle optischen Systeme werden in lediglich zwei Linsensysteme, dem jektiv und dem Okular bzw. Projektiv zusammengefasst. Das jektiv bildet das sich kurz vor der objektseitigen Brennebene, F, befindliche jekt, y, umgekehrt und vergrößert ab. Das reelle Zwischenbild, y, wird dann mit dem als Lupe wirkendem Okular betrachtet, d.h. y befindet sich in der objektseitigen Brennebene des Okulars. Das uge nimmt ein jekt als virtuelles Bild im Unendlichem wahr Die Gesamtvergrößerung V M des Mikroskops ergibt sich aus dem bbildungsmaßstab β des jektivs multipliziert mit der Lupenvergrößerung V L des Okulars V M = β O V L... Die uflösung des Lichtmikroskops Es ist zweckmäßig das jekt als ein Gitter mit einem bstand d anzunehmen Das Gitter werde parallel zur optischen chse mit Licht der Wellenlänge λ beleuchtet Zwischen jekt und jektiv befindet sich ein optisches Medium mit Brechungsindex n Es entsteht zunächst ein Bild mit M Beugungsmaxima in der hinteren Brennebene des jektivs Für den Winkel zwischen der m. und der 0.-Beugungsordnung, also der optischen chse, gilt: m λ sinϕ = n d Um aus diesem sog. Beugungsbild wieder ein reales Bild zu gewinnen, müssen mindestens die Maxima 0.- und.-ordnung miteinander interferieren können, d.h. durch die Öffnungsblende gelangen: λ d n sinϕ Je größer der Öffnungswinkel φ des jektives und je kleiner die Lichtwellenlänge λ ist, umso besser löst das Mikroskop auf! jektivöffnungsblende φ φ 4 WMechanik & -Prüfung;

3 uflösungsgrenze des Lichtmikroskops Bei genauerer Betrachtung wird noch ein Faktor von 0,6 berücksichtigt werden Theoretische uflösungsgrenze: λ = 400 nm (violettes Licht) φ = 90 n =.6 für Monobramnaphtalin als Immersionsmedium zwischen jektivlinse und jekt Die Theoretische uflösungsgrenze wird von modernen Lichtmikroskopen erreicht! d min 0.6 λ = n sinϕ d min 0,5 µm Tiefenschärfe eine Lichtmikroskops: ε = Sehwinkel in Bogenminuten,85 Δz = 0,5 + ε λ 5 uswirkungen Lichtwellenlänge auf die uflösung HF Perlitaufnahme mit jektiv pochromat 60 0,95; β = 60:: a) λ = 46 nm b) λ = 548 nm c) λ = 667 nm 6 WMechanik & -Prüfung;

4 Die Qualität des jektivs ist entscheidend für die bbildungsqualität des gesamten Mikroskops Je größer der Öffnungswinkel φ des je größer der Brechungsindex n des sog. Immersionsmediums ist, umso besser löst das jektiv auf! Definition der Numerische pertur: = n sinϕ Je höher die Numerische pertur, umso höher ist das uflösungsvermögen! Kennzeichnung von jektiven Das jektiv 7 uswirkungen der Öffnungsblende auf die uflösung ufnahme eines in Metall eingeritzten Kreuzgitters mit verschiedenen Blenden: a) Vier Beugungsmaxima der. Ordnung der feineren Gitterteilung werden durchgelassen b). Ordnungen werden einseitig ausgeblendet c). Ordnungen werden allseitig ausgeblendet a) Lamellarer Perlit: a) Ohne bzw. mit großer Blende b) Kleinere Blende c) Enge Spaltblende 8 WMechanik & -Prüfung; 4

5 uswirkungen der Numerischen pertur auf die uflösung a) und b) sind mit gleichem Bildmaßstab, jedoch mit jektiven verschiedener Numerischer pertur aufgenommen. ufnahme c) ist mit gleichen jektiv wie b), jedoch mit geringerem Bildmaßstab aufgenommen: a) = 60 0,95 b) = 0,65 c) = 0,65 Das jektiv mit höherer Numerischer pertur liefert bei gleichem Bildmaßstab das bessere Bild Jedes jektiv hat entsprechend seiner Numerischen pertur einen optimalen Bildmaßstab 9 Planobjektive Die einfachsten jektive, sog. Chromaten, sind nicht weiter korrigiert. Sie zeigen sowohl Farbfehler als auch Verzeichnungen des bbildes bei einer ebenen Projektion. Sog. pochromaten sind farbkorrigiert, sodass Lichtstrahlen unterschiedlicher Wellenlänge die gleiche Brechung erfahren. llerdings zeigen auch pochromaten Bildverzeichnungen. Sog. Planobjektive liefern ein nahezu verzeichnungsfreies, scharfes Bild über die gesamte Projektionsfläche einer planen Probe. Planapochromaten sind sowohl farbkorrigiert als auch nahezu verzeichnungsfrei. Planobjektive jektive eigenen sich gut für quantitative Bildanalysen. a) en: Bildfeld eines pochromaten a) unten: Schnitt durch die Frontlinse eines pochromaten b) en: Bildfeld eines Planapochromaten b) unten: Schnitt durch die Frontlinse eines Planapochromaten 0 WMechanik & -Prüfung; 5

6 Nützliche Vergrößerung bzw. Maßstab Unter realistischen Umständen beträgt nach bbe die Sehschärfe bzw. der Sehwinkel ε eines normalen uges ca. Bogensekunden Bei der angenehmen Bezugssehweite von 5 cm ergibt sich die Forderung, dass zwei jekte für das uge mindestens Δy = 50 mm tan ε von einander entfernt wahrgenommen werden müssen, d.h. Δy V M = 50 mm tan ε Berücksichtigt man das uflösungsvermögen des jektives Δy = 0.6 λ min erhält man einen Richtwert für die nützliche Vergrößerung des Mikroskops, bei der die kleinsten jekteinheiten, welche von einem jektiv mit der numerischen pertur gerade noch aufgelöst werden, auch für das uge aufzulösen sind: V nütz 50 mm tan' 0,6 λ[mm] = 0, 660 λ[mm] Dies bedeutet z.b. für blaues Licht der Wellenlänge von 500 nm und einer jektivapertur von =0,9 eine nützlicher Vergrößerung: V nütz 600 Veranschaulichung der nützlichen Vergrößerung Wenn die Sehweite größer als 5 cm ist, wie z.b. im Hörsaal, ist natürlich die nützliche Vergrößerung entsprechend höher ufnahmen der selben Probenstelle mit unterschiedlichen Maßstäben bzw. Vergrößerungen aber gleicher Detailfülle. Je kleiner die Vergrößerung, umso näher muss man herantreten, um alle Bilddetails zu erkennen! Vergrößerungen deutlich über der nützlichen Vergrößerung bringen keine zusätzliche Informationen! Die Endvergrößerung ist stets dem usgabemedium anzupassen. WMechanik & -Prüfung; 6