Skript-Sammlung. freitags, 2-stündig

Transkript

1 2. Studienabschnitt Modul 23 VoBI Skript-Sammlung Durchflusszytometrische Leukozyten- Charakterisierung im menschlichen Blut (S. 4-9) Life Cell Imaging dynamischer zellulärer Prozesse im Laser Scanning Mikroskip (S ) Expressionsanalyse mittels quantitativer Poly Chain Reaction (PCR) (S ) Tracheotomie und broncho-alveoläre Lavage bei Mäusen (S ) Biochemische Analyse von Proteinen (S ) freitags, 2-stündig Wir machen Sie mit der Durchführung von Experimenten aus der Zell- und Molekularbiologie, Proteinbiochemie sowie Tiermodellen vertraut. Sie erhalten Einblicke in die aktuelle translationale Lungenforschung und in praktische Kenntnisse im Umgang mit den modernen Methoden eines Forschungslabors. Comprehensive Pneumology Center, Großhadern Max-Lebsche-Platz 31, 1.OG, Seminarraum Weitere Informationen: Dr. Thomas Hofer,

2 2 Wir begrüßen Sie herzlich zu unserem Wahlfach im 2. Studienabschnitt Dieses Wahlfach wird veranstaltet vom Comprehensive Pneumology Center (CPC). Im CPC haben sich folgende Kooperations- Partner zusammen geschlossen: Helmholtz Zentrum München, Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt Ludwig-Maximilians-Universität München mit dem Klinikum der Universität Asklepios Fachkliniken, München-Gauting Fachkliniken München-Gauting Grußwort Liebe Studentinnen und Studenten, im Bereich der modernen biomedizinischen Forschung sind heute neue Ansätze zum Verständnis der Pathomechanismen von einzelnen Erkrankungen wichtig, um innovative Möglichkeiten zur Prävention und Therapie von chronischen Erkrankungen zu entwickeln und zu etablieren. Für chronische Lungenerkrankungen gilt das im speziellen, da diese zwar weit oben in der Rangliste der häufigsten Erkrankungen stehen (die chronisch obstruktive Lungenerkrankung COPD ist die vierthäufigste Todesursache weltweit), kausale Therapien aber nach wie vor rar sind. Das Translationszentrum für Lungenforschung CPC (Comprehensive Pneumology Center) in München wurde gegründet, damit Experten aus Medizin und Lebenswissenschaften gemeinsam grundlegende Mechanismen von chronischen Lungenerkrankungen, wie z. B. COPD, Lungenfibrose, Lungenkrebs, oder Asthma, erforschen und neue Ansätze für deren Prävention, Diagnostik und Therapie entwickeln. Das Kennenlernen von experimentellen Grundlagen in der Zell- und Molekularbiologie, sowie von Tiermodellen zur Erforschung von chronischen Lungenerkrankungen ist ein guter erster Schritt um die Vielfältigkeit der modernen Lungenforschung kennenzulernen. Nutzen Sie die Chance moderne Forschung selbst zu erleben Viel Freude und Erfolg bei uns am CPC! Prof. Dr. Oliver Eickelberg Chairman, Experimentelle Pneumologie, Comprehensive Pneumology Center

3 3 Ablauf Wir bieten Ihnen in einer Vielzahl von VoBI Veranstaltungen einen praktischen Einblick in ein breites Spektrum wissenschaftlicher Methoden und Experimenten an. In kompakten, zweistündigen Kursen erhalten Sie Einblick in die Durchflusszytometrische Leukozyten-Charakterisierung im menschlichen Blut, betrachten und analysieren im Life cell imaging dynamische(r) zelluläre(r) Prozesse am Laser Scanning Mikroskop, führen eine Expressionsanalyse mittels quantitativer PCR durch, erwerben Erfahrung in der Tracheotomie und broncho-alveolären Lavage bei Mäusen oder sammeln Erfahrung in der Biochemischen Analyse von Proteinen - je nachdem, für welchen Kurs Sie sich angemeldet haben. Zur leichteren Orientierung ist in diesem Skript jedem der o.g. Kurse ine Farbe zugeordnet. Ihre Betreuer in den jeweiligen Kursen sehen sie unten. Neben kurzen, theoretischen enthält das Skript auch praktische Hintergrund-Informationen zu den Experimenten. Die Teile der Experimente, die Sie selbst durchführen, sind durch einen Kasten gekennzeichnet. Ihre Betreuer Dr. Marion Frankenberger, Dr. Thomas Hofer, Prof. Dr. Peter Nelson, Prof. Dr. Elfriede Nössner Dr. Gerald Burgstaller Dr. Stefan Dehmel, PD Dr. Susanne Krauss-Etschmann, Dr. Ralf Zarbock Dr. Gerrit John-Schuster, Dr. Dr. Melanie Königshoff, Dr. Tobias Stöger, Dr. Ali Önder Yildirim Dr. Katharina Heinzelmann, PD Dr. Silke Meiners, Dr. Claudia Staab-Weijnitz, Dr. Oliver Vosyka Lust auf mehr? Wie wäre es mit unserem Blockpraktikum? Die oben beschriebenen, im Semester angebotenen Einzel-Termine enthalten einzelne Experimente aus unserem 4-tägigen Blockpraktikum Einführung in wissenschaftliches Arbeiten im Labor am Beispiel aktueller Lungenforschung. Wenn wir mit dem vorliegenden Kurs Ihr Interesse geweckt haben und Sie tieferen Einblick in experimentelles Arbeiten gewinnen möchten, dann wäre das Blockpraktikum genau das richtige für Sie! Aus seiner Beschreibung: In diesem Blockkurs wird ganz auf praktische Tätigkeit gesetzt. Nach einer kurzen Einführung machen wir Sie mit der Durchführung vielfältiger Experimente aus der Zell- und Molekularbiologie sowie mit Tiermodellen vertraut. Auf diese Weise gewinnen Sie am Beispiel der aktuellen translationalen Lungenforschung Einblicke in die modernen Methoden eines Forschungslabors. Damit ist dieser Kurs auch ein idealer Einstieg bzw. Entscheidungshilfe für eine experimentelle Doktorarbeit. Am Ende des Kurses berichten und interpretieren Sie die von Ihnen erhobenen Daten. Die Lernziele dieser Veranstaltung sind: Einführung in Zellkultur, Durchflusszytometrie, Zellseparation, Life Cell Imaging, RNA-Isolierung, quantitiative PCR, Genotypisierung mittels PCR, Tracheotomie und Lungenfunktion an der Maus, Bronchoalveoläre Lavage und Histologie. Infos und Skript:

4 4 Durchflusszytometrische Leukozyten-Charakterisierung im menschlichen Blut Übersicht Die Zellen des peripheren Bluts haben ihren Ursprung im Knochenmark, wo sie sich aus pluripotenten Stammzellen zu den verschiedenen Subpopulationen weiter entwickeln (Abb. 1). Abb.1 Neben den Erythrozyten und Thrombozyten stellen die Leukozyten die morphologisch und funktionell am stärksten heterogene Zellart dar, die sich weiter in folgende Klassen unterteilen läßt. Granulozyten o neutrophile Granulozyten o basophile Granulozyten o eosinophile Granulozyten Lymphozyten o B-Lymphozyten (B-Zellen) o T-Lymphozyten (T-Zellen) o Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) Monozyten o Classical monocytes CD14++CD16- o Non-classical monocytes CD14+CD16++ o Intermediate monocytes CD14++CD16+ PBMC (ca. bis 500/µl Vollblut) (ca. bis 50/µl Vollblut) (ca. 5-10/µl Vollblut)

5 5 Differentialblutbild Normwerte Lymphozyten: Subpopulationen relativ* 10 3 Zellen/mm 3 (x10 9 Zellen/l) Lymphozyten 1,6-2, B-Lymphozyten CD19+ T-Lymphozyten CD3+ % der Lymphozyten EDTA-Vollblut absolut* Zellen/µl ,2-0, ,1-1, CD4+ T-Zellen ,7-1, CD8+ T-Zellen ,5-0, NK-Zellen CD16/ ,2-0,4 relativ* % der T-Lymphozyten HLA-DR+ T-Zellen CD25+ T-Zellen Ratio CD4/CD8-Quotient 1,0-1,5 Hannet I. et al., Developmental and maturational changes in human blood Tab. 1 Quelle: lymphocyte subpopulations. Immunol Today 1992; 13; Erwachsene von 18. bis 70. Lebensjahr. *Angabe der relativen und absoluten Werte in Perzentilen ( Perzentile). Differentialblutbild Normwerte: Tab. 2 Norm Parameter relativ in [%] Blutbild Erwachsene absolut in [1/µl] Stabkernige Lymphozyten- Segmentkernige Eosinophile Basophile Monozyten Lymphozyten

6 6 Ausgangsmaterial für viele immunologische Untersuchungen ist humanes venöses Blut. Zahlreiche Nachweise von Oberflächenantigenen können zwar im Vollblut vorgenommen werden, d. h. ohne die Leukozyten in ihre Subpopulationen aufzutrennen, in vielen Fällen erfordert der Versuchsaufbau aber eine Auftrennung der weißen Blutzellen in ihre Untergruppen. Humanes Blut enthält neben den roten Erythrozyten, die Zellfraktion der Leukozyten, die sich wiederum in Granulozyten, Monozyten plus Lymphozyten aufteilt. Zu den Lymphozyten zählen dann B-Zellen, T- Zellen und NK-Zellen (siehe Abb. 1). Eine morphologische weitere Differenzierung mit dem Mikroskop ist ohne Zuhilfenahme von immunologischen Färbemethoden nicht weiter möglich. Mit der Blutseparation über eine Dichtegradientenzentrifugation erhält man als Endergebnis sog. PBMC = peripheral blood mononuclear cells, also die Gesamtheit aus Lymphozyten plus Monozyten. Die für die meisten immunologischen Fragestellungen eher störenden Granulozyten, sowie Erythrozyten und Thrombozyten werden mit dieser Methode entfernt. PBMC liefern dann das Ausgangsmaterial für weitere analytische Vorgehensweisen wie z.b. das Sortieren von bestimmten Zelltypen (CD4, CD8, B-Zellen) oder die Differenzierung von reiferen Makrophagen aus den monozytären Vorläufern. Cluster of differentiation (CD) Nomenklatur Die verschiedenen Leukozyten tragen unterschiedliche Oberflächenstrukturen (vor allem Rezeptoren) an ihrer Oberfläche, anhand derer sie sich unterscheiden und unterschiedlichen Immunfunktionen zuordnen lassen. Eine Auswahl ist in der unten stehende Tabelle aufgelistet. CD Zelltyp Funktion des Proteins CD3 T-Zellen CD4 T-Helfer-Zellen CD8 zytotox. T-Zelle CD14 Monozyten CD16 Phagozyten CD19 alle B-Zellen CD45 alle Leukozyten CD56 NK-Zellen Signaltransduktion, T-Zell-Rezeptor (TCR) Bindung von MHC-II Bindung von MHC-I Bindung von Lipopolysacchariden (LPS) FcgRIII, bindet Fc-Domäne von IgG, vermittelt Phagozytose B-Zell-Corezeptor, substanzielle Funktion in B-Zell-Homöostase, -Aktivierung und Differenzierung Tyrosinphosphatase Adhäsion Immunfluoreszenz-Färbung im Vollblut zur Darstellung von Monozyten Subpopulationen (CD14++CD16- und CD14+CD16++) und Bestimmung ihrer absoluten Zellzahl Reagenzien - Pro Ansatz 100 µl Vollblut - Monoclonale Antikörper in 1:20 Verdünnung (je Antikörper) - PBS/2% FCS - Lysereagenzien A, B und C für Coulter Q-Prep Workstation - Counting beads (zur Bestimmung der absoluten Zellzahl)

7 7 Antikörper CD45-APC CD14-FITC CD16-PE HLA-DR-PC5 Durchführung - Blut im EDTA-tube gut aufsuspendieren (Röhrchen invertieren) µl Blut entnehmen und in ein 5 ml Röhrchen überführen (dabei darauf achten, dass die Röhrchenwand nicht mit Blut benetzt wird) - Zugabe der Antikörper direkt in das Blut (20µl AK-Mix) - Probe vortexen und für 20 Min auf Eis im Dunkeln inkubieren - Lyse der Erythrozyten am Coulter Q-Prep - + Zugabe von 800 µl aqua dest µl PBS/2% FCS µl Coulter counting beads (beads/µl siehe Original-Fläschchen) - Messung am LSR II und am EpicsXL Durchflusszytometer Beispiel einer Messung der Monozyten Subpopulationen am LSRII Abb. 2

8 8 Die Anzahl der absoluten CD14+CD16++ und CD14++CD16- Monozyten wird dann mit Hilfe der gemessenen Anzahl der Counting beads nach folgender Formel berechnet: bzw. absolute Zahl der CD14++CD16- Monozyten (Zellen/µl) = absolute Beads (Beads/µl) x gemessene CD14++ Monozyten gemessene Beads absolute Zahl der CD14+CD16++ Monozyten (Zellen/µl) = absolute Beads (Beads/µl) x gemessene CD14+CD16++ Monozyten gemessene Beads Anzahl CD14++CD16- und CD14+CD16++ Monozyten im Blut Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 Probe 6 Probe 7 abs. Anzahl Beads (Beads/µl) gemessene Anzahl Beads Anzahl Anzahl CD14++CD16 CD14+CD16++ errechnete Anzahl CD14++CD16 errechnete Anzahl CD14+CD16++ Tab. 3

9 9 Life Cell Imaging dynamischer zellulärer Prozesse im Laser Scanning Mikroskop Übersicht Lichtmikroskope (v. griechisch μικρός: klein; σκοπεiν: betrachten) sind optische Geräte für die visuelle oder bildliche Darstellung von Objekten die unterhalb des Auflösungsvermögens des menschlichen Auges liegen. Das Auflösungsvermögen eines klassischen Lichtmikroskops ist unter anderem von der Wellenlänge des verwendeten Lichts abhängig und beträgt im besten Fall 0.2 µm, was bedeutet dass zwei Objekte, die einen Abstand von 0.2 µm haben, noch als getrennt wahrgenommen werden können. Abhängig von der Beleuchtungstechnik unterscheidet man in der Lichtmikroskopie zwischen Durchlicht- und Auflichtmikroskopie. Die Durchlichtmikroskopie benötigt dünn geschnittene und durchsichtige Präparate, da das Licht durch das gesamte Präparat hindurchgeleitet werden muss. Durch verschiedene Färbemethoden oder auch durch verschiedene Kontrastverfahren (Phasenkontrast, Lichtpolarisation, Differentialinterferenzkontrast) können die meist farblosen bzw. grundsätzlich kontrastarmen Strukturen von Zellen und Geweben sichtbar gemacht werden. Bei der Auflichtmikroskopie wird das Licht durch das Objektiv (= die dem Gegenstand (Objekt) zugewandte Linse) auf das Präparat geleitet. Am Präparat wird das einfallende Licht reflektiert und wiederum vom Objektiv aufgefangen. Einen Spezialfall der Auflichtmikroskopie stellt die Fluoreszenzmikroskopie dar, wobei die Fluoreszenz ein physikalischer Prozess ist, bei dem ein Farbstoff (Fluorophor) durch einfallendes Licht (= Exzitation) einer bestimmten Wellenlänge angeregt wird (z.b.: blaues Licht) und durch das Aussenden (= Emission) von Licht mit einer nun höheren Wellenlänge reagiert (z.b.: grünes Licht) (Abb. 4). Abb. 4 Jablonski Diagramm (vereinfacht) Einen Spezialfall der Fluoreszenzmikroskopie stellt das Laserscanning Konfokalmikroskop (LSM) dar. Das Präparat wird hier mit einem Laserstrahl punktförmig abgetastet. Durch eine Lochblende (= Pinhole) kann emittiertes Licht aus Ebenen des Präparates, die sich nicht im Fokus befinden, ausgeblendet werden. Dadurch kann eine höhere Bildqualität erreicht beziehungsweise Strukturen in 3D dargestellt werden. Wichtige Werkzeuge in der Fluoreszenzmikroskopie sind mit fluoreszierenden Farbstoffen gekoppelte Antikörper, mit denen man spezifisch Proteine in der Zelle und somit subzelluläre Strukturen (z.b.: Mitochondrien, Zellmembranen, Mikrotubuli, etc.) zum Leuchten bringen kann.

10 10 Um die Dynamik von Proteinen in lebenden Zellen zu untersuchen, können Proteine direkt mit fluoreszierenden Farbstoffen markiert oder auch durch molekularbiologische Methoden in Form einer Plasmid-DNA (= ringförmiges DNA Molekül) mit der DNA eines fluoreszierenden Proteins (z.b.: EGFP, mcherry, etc) fusioniert werden. Gefärbte Proteine werden durch Mikroinjektionen in die lebenden Zellen eingebracht. Plasmid-DNA hingegen muss durch Transfektionsmethoden (z.b.: mit Hilfe von Liposomen) in die lebenden Zellen eingebracht und anschließend zuerst von den Zellen als Protein exprimiert werden. Für die Beobachtung von lebenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop müssen Zellen in kleinen Inkubatoren gehalten werden. Dazu muss die Temperatur konstant auf 37 C beziehungsweise auch der ph Wert des Mediums im physiologischen Bereich (7,0 7,7) gehalten werden. Durch die Anregung der Fluorophore durch Licht können in den Zellen sogenannte phototoxische Effekte ausgelöst werden, welche die Zellen sterben lassen. Deshalb ist die Anregung durch Licht kurz und auch die Lichtintensität so gering als möglich zu halten. Weiters besteht die Gefahr, dass Fluorophore durch langen und intensiven Lichteinfluss gebleicht werden. Durchführung Die Studenten sollen an Hand von transfizierten Lungenfibroblasten (CLL206) (siehe Tab. 1), die in einem Kollagen 3D Zellkultursystem kultiviert sind, am Live-Cell Imaging System Bildreihen von dynamischen Prozessen innerhalb der Zellen erstellen. Zuerst werden die korrekten Parameter eingestellt. Danach geben die Studenten die Zellen in die Inkubationskammer und suchen nach transfizierten Zellen. Anschließend wird mit Hilfe der Zeiss Software Axiovision die korrekte Belichtungszeit für den grünen Kanal (egfp) eingestellt und Bildreihen mit einem Zeitintervall von 5s erstellt. Danach werden die Bildreihen als zvi Dateien abgespeichert und über den Server auf die Bildanalyse-Workstations transferiert. Dort werden die Bildreihen (zvi Dateien) mit der Axiovision-Software (Zeiss) hinsichtlich Helligkeit/Kontrast nachbearbeitet und als Movie/Video (avi) exportiert. Tab. 1: Transfektion von Lungenfibroblasten (CLL206) Färbung A Färbung B Färbung C EB3-EGFP Paxillin-EGFP Vimentin-EGFP EB3 = Protein an Enden von Mikrotubuli bindet. Paxillin = Protein in fokalen Zell-Matrix Kontakten. Vimentin = Intermediärfilamentprotein.

11 11 Expressionsanalyse mittels quantitativer PCR Übersicht Bei der quantitativen PCR, kurz qpcr, ist die Amplifikation und der Nachweis der PCR-Produkte simultan in einem Reaktionsgefäß möglich. Ursprünglich werden für die quantitative PCR spezielle fluorogene Sonden (sog. TaqMan Probes) verwendet, die im mittleren Teil des Amplikons an die Zielsequenz binden. Die 5-3 Exonukleaseaktivität der DNA Polymerase wird dazu genutzt, einen Quencher, der kovalent mit der Sonde verbunden ist und normalerweise das Fluoreszenzsignal des Fluorochromes der Sonde unterdrückt, abzuspalten und so das Fluoreszenzsignal zu erhöhen. Bei jedem neuen Zyklus der PCR-Reaktion erhöht sich so die Intensität des Fluoreszenzsignals. Diese Intensitätszunahme kann innerhalb eines geschlossenen Reaktionsgefäßes gemessen werden. Daher besteht bei der quantitativen PCR, im Gegensatz zur herkömmlichen PCR, bei der es sich um eine reine Endpunktanalyse handelt, die Möglichkeit, die Amplifikation des Produktes in jedem Zyklus zu verfolgen. Daher wird die qpcr auch oft als real-time PCR bezeichnet. Mit dieser Methode kann also ermittelt werden, ob ein Produkt schon sehr früh (hohe Ausgangsmengen), oder erst zu einem relativ späten Zeitpunkt (niedrige Ausgangsmengen) über die Nachweisgrenze amplifiziert wird. Statt der TaqMan Sonden kann man zur Quantifizierung von PCR-Produkten auch Farbstoffe verwenden, die den DNA-Doppelstrang spezifisch binden. So wird für die Versuche in diesem Praktikum der Farbstoff SYBR Green 1 benutzt. Dieser Farbstoff verfügt über eine hohe Sensitivität und Spezifität für DNA-Doppelstränge. Durch Bindung von SYBR Green 1 an den DNA-Doppelstrang erhöht sich die Fluoreszenz des Farbstoffs um das bis 100-fache. Dieses Fluoreszenzsignal wird genutzt, um den Amplifikationsprozess im Laufe der PCR darzustellen. Genauso wie im ursprünglichen 5 -Exonucleaseassay wird die Fluoreszenz über den Verlauf der Reaktion aufgezeichnet. Aufgrund der Tatsache, dass im SYBR Green Assay jede doppelsträngige DNA zu einem Fluoreszenzsignal führt, dient neben der sorgfältigen Primerauswahl die Schmelzkurvenanalyse als weitere Spezifitätskontrolle. Nach jedem PCR-Lauf werden die Dissoziationskurven der entstandenen Produkte aufgezeichnet, so kann das Vorliegen von Primerdimeren und unspezifischen Nebenprodukten, die ein verfälschtes Fluoreszenzsignal generieren würden, beurteilt werden. Durchführung Jeder Student erhält zu Beginn des Versuchs cdnas, die aus Lungen von Mäusen stammen, die für 3 Wochen Zigarettenrauch exponiert waren (Testgruppe, CS) bzw. die normale Atemluft erhielten (Kontrollgruppe, AIR). Jede Gruppe besteht aus 4 cdna-proben (1-4). Mit Hilfe der hier vorgestellten Methodik, soll die mrna-expression des Zielgenes Tbx21 bestimmt werden. Tbx21, auch bekannt als Tbet, ist ein Transkriptionsfaktor, der spezifisch von T-Helferzellen des Subtyps Th1 gebildet wird und die Ausprägung der Immunantwort wesentlich beeinflusst. Zentrale Fragestellung dieses Versuchs ist also, ob die Bildung dieses Faktors durch Exposition mit Zigarettenrauch beeinflusst wird.

12 12 Quantitative PCR am LightCycler 480 System Zur relativen Quantifizierung wird neben dem Zielgen auch die Expression eines Referenzgens (z.b. Tbp) bestimmt. Zunächst werden zwei qpcr-mastermixe mit den Primern für das Ziel- und das Referenzgen für jeweils 12+1 Proben (Proben Air/Smoke 1-4, 2x RT- Kontrolle und 2x NTC, +1x Pipettierüberschuß) angesetzt: 1x MM 13x MM Wasser 3,8 µl 49,9 µl 2x SybrGreen Mastermix 10,0 µl 130,0 µl Fwd-Primer (10 pmol/µl) 0,6 µl 7,8 µl Rev-Primer (10 pmol/µl) 0,6 µl 7,8 µl Gesamtvolumen 15,0 µl 195,0 µl Von jedem Mastermix werden 12 Wells auf der 96-Well-Platte mit je 15 µl von jedem Studenten befüllt (siehe Pipettierschema unten). Danach werden je 5.00 µl cdna-probe bzw. RT- oder Negativ-Kontrolle zugegeben. Die RT- ( RT minus ) Kontrolle dient dazu Verunreinigungen mit genomischer DNA auszuschließen und wird durch weglassen des Enzyms während der reversen Transkription hergestellt. Bei der Negativkontrolle wird statt der cdna nur Wasser pipettiert. Dies dient zur Kontrolle auf Verunreinigungen durch verschleppte PCR-Produkte in den verwendeten Reagenzien. Haben alle Studenten ihre Proben pipettiert wird die Platte mit Folie verschlossen, abzentrifugiert und in das LightCycler-Gerät gestellt. Pipettierschema für LightCycler 96-Well qpcr-platte: A Air1 Air2 Air3 Air4 CS1 CS2 CS3 CS4 RT- RT- NTC NTC B Air1 Air2 Air3 Air4 CS1 CS2 CS3 CS4 RT- RT- NTC NTC C Air1 Air2 Air3 Air4 CS1 CS2 CS3 CS4 RT- RT- NTC NTC D Air1 Air2 Air3 Air4 CS1 CS2 CS3 CS4 RT- RT- NTC NTC E Air1 Air2 Air3 Air4 CS1 CS2 CS3 CS4 RT- RT- NTC NTC F Air1 Air2 Air3 Air4 CS1 CS2 CS3 CS4 RT- RT- NTC NTC G Air1 Air2 Air3 Air4 CS1 CS2 CS3 CS4 RT- RT- NTC NTC H Air1 Air2 Air3 Air4 CS1 CS2 CS3 CS4 RT- RT- NTC NTC Student 1 Student 2 Student 3 Student 4 Zielgen: Tbx21 Referenz- Gen: Tbp Abb. 5

13 13 Nun wird die Quantifizierung mit folgendem Programm gestartet: Denat. & Aktivierung 1x 95 C 10:00 Amplifikation 45x 95 C 00:10 60 C 00:15 72 C 00:10 78 C 00:01 Messpunkt Schmelzkurve 1x 95 C 00:05 60 C 01:00 99 C - kont. Messung Kühlung 1x 40 C 00:10 Nach Ablauf des Programms (ca. 1,5h) stehen die Daten zur Auswertung zur Verfügung und werden von den Studenten unter Anleitung der Betreuer analysiert. Da der Kurs allerdings nur 1.5h dauert werden die Studenten Daten einer bereits gelaufenen PCR analysieren. Formeln zur Berechnung der Expressionsunterschiede DCq = Mittelwert Cq (Zielgen) Mittelwert Cq (Referenzgen) DDCq = DCq (CS) DCq (Air); CS = Rauchexpositionsgruppe -DD Cq Fold change = 2 Ergebnisprotokoll Quantitative PCR am LightCycler 480 System Bedingung AIR Mittelwert Cq Zielgen Mittelwert Cq Ref.gen DCq DDCq fold change CS Abb. 6 Beispiel für die Datenanalyse nach einem PCR-Lauf

14 14 Tracheotomie und broncho-alveoläre Lavage bei Mäusen Einleitung Um die Immunpathogenese von Erkrankungen weitergehend zu erforschen, sind Tierversuche bzw. Tiermodelle oftmals erforderlich. Tiermodelle liefern relevante, aussagekräftige Daten. Insbesondere die Maus wird als Spezies für unterschiedliche Modelle akuter oder chronischer Lungenerkrankungen verwendet. Darüber hinaus ist die Maus auch aus immunologischer Sicht, insbesondere aufgrund des vielfältigen Angebots an analytischen Werkzeugen (z.b. Antikörper), als sehr gut geeignetes Tiermodell akzeptiert. Der Vorteil der Maus als Modelltier liegt, abgesehen von Größe und Haltungseigenschaften, insbesondere in der Verfügbarkeit einer sehr großen Anzahl an Inzucht-Stämmen mit genetisch exakt definiertem Hintergrund. Durchführung Es wird eine Tracheotomie sowie eine Lungenlavage an einer bereits euthanasierten Maus (Ketamin / Rompun) durchgeführt. Reagenzien Phosphatpuffer PBS 1x mit Protease-Inhibitor 1ml Spritzen mit 500 µl Protease-Inhibitor (auf Eis!) Spritzen, Falcon und Eppendorf tubes, Schere, Pinzetten, Faden, Tubus, Tupfer und Kanülen Tracheotomie Maus an den Gliedmaßen fixieren, Kopf überstrecken und an der Schnauze fixieren, Halsbereich mit Ethanol besprühen; Von der Brust Richtung Schnauze das Fell öffnen; Mit zwei Pinzetten Gewebe vor der Trachea vorsichtig (Blutgefäße!) nach links und rechts wegpräparieren; Muskeln entlang der Trachea mit Pinzetten nach oben und unten wegpräparieren; Gebogene Pinzette vorsichtig unter der Trachea hindurchführen und Faden durchziehen; Nahe am Kehlkopf mit einer spitzen Schere ein kleines Loch in die Trachea schneiden und vorsichtig entlang der Trachea vergrößern; Tubus für Lungenfunktion durch leichtes Drehen einführen (bis zum zweiten Ring) und mit Doppelknoten fixieren; Bronchoalveoläre Lavage Spritze an Tubus befestigen und PBS/Protease-Inhibitor langsam in die Lunge hineindrücken; Spritze wieder langsam aufziehen, eventuell Tubus ein wenig drehen, falls keine Flüssigkeit kommt (insgesamt 3x mit je 500µl spülen); BAL in 1,5ml Tube geben und sofort auf Eis stellen; Beachte: Die Spritze nicht mehrmals aufziehen und wieder reindrücken, da die Lunge dadurch beschädigt wird und nicht mehr für die Histologie zu gebrauchen ist!

15 Aufbereitung der BAL Aus zeitlichen Gründen haben wir die BAL für Sie schon weiter verarbeitet. Im folgenden lesen Sie, wie man verfahren muss, um die Zellen aus der BAL auf Objektträger aufzubringen. Objektträger werden in eine Metallklemme mit Filter und Trichter eingespannt und in eine Cyto-Zentrifuge gestellt; max der zuvor gezählten BAL Zellen werden in die Trichter. eingefüllt und die Objektträger zentrifugiert. Nach der Zentrifugation befinden sich die Zellen auf dem Objektträger, die überschüssige Flüssigkeit wurde vom Filter aufgesaugt. Nach Lufttrocknung folgt eine May-Grünwald / Giemsa Differenzialfärbung, die die Zellen in Makrophagen und in die drei Granulozyten- Typen unterscheidbar macht. 10 min in May-Grünwald (konz.) 2 min wässern in H2O 15 min Giemsa (1:20 verdünnen in H2O) 2 min wässern in H2O Trocknen lassen Eindeckeln (Entellan, Deckgläser 25x25 mm) Zur Auswertung der BAL werden 200 Zellen pro Objektträger randomisiert in verschiedenen Sichtfeldern ausgezählt und gemäß ihrer Morphologie und Färbung den Gruppen Makrophagen / Lymphozyten / Neutrophile Granulozyten / Eosine Granulozyten zugeordnet. 15 Abb. 7 Zytospin einer bronchoalveolären Lavage der Maus

16 16 Biochemische Analyse von Proteinen Einleitung Der menschliche Körper verfügt über ca Proteine, die letztendlich für die zelluläre Funktion zuständig sind. Die Funktionen von Proteinen reichen von Strukturgebung, Informations-weiterleitung und Katalyse bis hin zu Abwehr und Bewegung. Die koordinierte Synthese von Proteinen, deren komplexe dreidimensionale Faltung, ihre Reaktion und Interaktion mit anderen Proteinen, die posttranslationale Modifikation einzelner Aminosäuren im Protein sowie der kontrollierte Abbau und das Recycling der Aminosäuren, bezeichnet man als Protein-Homöostase, Proteostasis oder Proteinqualitätskontrolle, i.e. Proteinmanagement im Sinne eines zellulären facility managements. Proteine bestehen aus unverzweigten Ketten von Aminosäuren, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind und das Rückgrat der Proteine bilden. Jedes Protein besitzt eine spezifische Reihenfolge von Aminosäuren, die sich infolge verschiedener chemischer Bindungen der Aminosäuren untereinander zu einer Sekundär-, Tertiär und Quartärstruktur faltet und somit seine funktionelle Struktur annimmt. Dabei bestimmen die Aminosäureseitenketten maßgeblich die Faltungseigenschaften der Proteine. Abb. 8 Peptidbindung, dreidimensionale Struktur Durchführung Mittels zweier colorimetrischer Verfahren soll die Proteinkonzentration einer Lösung bestimmt werden. Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford Der Farbstoff Coomassie-Blau reagiert mit basischen Aminosäuren in saurer Lösung. Dabei verschiebt sich das Absorptionsmaximum hin zu 595 nm (Blau). Durch die Messung der Absorption bei dieser Wellenlänge kann die Konzentration einer unbekannten Proteinlösung einfach bestimmt werden, wenn man ein Protein mit definierter Konzentration und somit definierter Absorption als Standardkurve mitführt. BCA Proteinkonzentrationsbestimmung (modifiziert nach Lowry) In einem ersten Schritt reagieren zweiwertige Kupferionen quantitativ mit den Peptidbindungen der Proteine zu einwertigen Kupferionen in alkalischer Lösung. Im zweiten Schritt werden die zweiwertige Kupferionen reduziert mittels Bicinchoninsäure (BCA) der damit in einen intensiv violetten Farbstoff umgewandelt wird, dessen Absorption bei einer Wellenlänge von 562 nm photometrisch ausgewertet werden kann.

17 17 Bei allen Versuchen unbedingt Kittel und Handschuhe tragen und die Sicherheitsvorschriften des Labors beachten! 1. BSA-Standardlösungen für das Erstellen einer Kalibrationsgerade Setzen Sie die Kalibrationslösungen (BSA-Standards) in den Konzentrationen 2.0, 1.0, 0.5, 0.25, mg/ml an (eine Stammlösung von 2.0 mg/ml wird zur Verfügung gestellt) Gehen Sie dabei folgendermaßen vor: Berechnen Sie die nötigen Volumina und erstellen Sie ein Pipettierschema (s. Tabelle). Pipettieren Sie zuerst das jeweilige Volumen der Proteinlösung in ein 1,5ml Reaktionsgefäß und füllen Sie mit der entsprechenden Menge Wasser auf. Pipettieren sie je 25 µl der Standards (incl. Leerwert = 25 µl Wasser) in eine 96-well-Mikrotiterplatte Für jeden Messpunkt soll eine Doppelbestimmung durchgeführt werden. c (BSA) final [mg/ml] V (BSA, 2.0 mg/ml) [µg] V (H 2 O) [µg] Bestimmung der Proteinkonzentration einer unbekannten Probe Pipettieren Sie je 25 µl der Proteinprobe in ein microplate well. Auch hier soll eine Doppelbestimmung durchgeführt werden. Fügen Sie nun zu allen Standards und Proben 200 µl BCA-Lösung hinzu. Verschließen Sie die Mikrotiterplatte mit einem Deckel und inkubieren Sie 30 min bei 37 C Die Extinktion bei 562 nm wird nach Anleitung am Microplate reader gemessen. Erstellen Sie die Kalibrationsgerade in Excel (A562 über Proteinkonzentration). Sollte die Extinktion außerhalb des linearen Bereichs der Kalibrationskurve liegen, so verdünnen Sie die Proben so, dass deren Extinktionen im Kalibrati onsbereich liegen und wiederholen Sie die Messung! Bestimmen sie nun anhand der erstellten Kalibrationskurve die Proteinkonzentration Ihrer Probe.

18 T. Hofer