k T (R) = (1/t D ) [R o /R] 6

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Andrea Hase
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1 FRET - Grundlagen Förser T: Zwischenmoleulare Energiewanderung und Fluoreszenz. n: nn. Physi. 437, 948, S. 55 ipol-ipol Wechselwirung, NCHT: Emission und Re-absorpion Energieransfer-Rae: (ipol-ipol) T (R) = (/ ) [R o /R] 6 - onor Lebensdauer ohne zepor R o - Förser Radius

2 Förser Radius Förser Radius: R0 J( l) 4 n ngsröm ipol Orienierungsfaor (von 0 bis 4, =2/3 für zufällig orienier) n Brechungsindex - Fluoreszenz uanenausbeue des onors in bwesenhei des zepors J(l) - Überlapp negral 2

3 Orienierungsabhängigei 2cos cos sin sin cos 2 =4 2 = 2 =0 Bei gleichmäßiger Winelvereilung:

4 Einschub: eails zum Überlappinegral uanensperum des onors F (n) * und Exinionsoeffizien des zepors (n) J( ) 0 F ( ) d ( ) 4 chung: Nich dire negral sondern /n 4, bzw. l 4! * F : Fluoreszenzinensiä des onors im Frequenzbereich n + dn (Gesaminensiä auf eins normier) 4

5 Förser Radius Messung R0 J( l) 4 n ngsröm 2-2/3 für zufällige Orienierung (nisoropie messen!) J(l) Numerische negraion der Speren n - n der Regel.4 für Biomoleüle in Lösung - Fluoreszenz uanenausbeue: emiiere / absorbiere Phoonen (nur ^/6): 6 Vergleiche mi beannem Sandard: (Rhodamine0) = von nm (rexhage, 973; Karsens and Kobs,980) Emissionssperen von Rhodamine 0 und marierer Probe aufnehmen Probe n n 2 Probe 2 Rh0 Rh0 Probe (545) (545) i i F F Probe Rh0 (545, l ) (545, l ) i i Rh0 nregungswellenlänge Clegg, BiophysJ, 996 5

6 Beispiele: Förser Radius (für 2 = 2/3) onor ccepor R o (Å) Fluorescein Teramehylrhodamine 55 ENS Fluorescein 46 ENS abcyl 33 Fluorescein Fluorescein 44 lexa 546 SY lexa 594 SY

7 Krierien für FRET Um eine möglichs effiziene srahlungsfreie Energieüberragung vom onorfarbsoff auf den zeporfarbsoff über den Förser-Resonanzenergieransfer zu ermöglichen, müssen drei wesenliche Krierien erfüll sein: bsand: onorfarbsoff und zeporfarbsoff sollen nur wenige Nanomeer voneinander enfern sein. Sperum: as Srahlungsemissionssperum des onorfarbsoffs muss mi dem bsorpionssperum des zeporfarbsoffs überlappen. Orienierung: onor- und zeporfarbsoff sollen möglichs parallele eleronische Schwingungsebenen haben (oder zumindes frei roieren). 7

8 Beispiele: RN Polymerase 2 Wo verläss die RN die Polymerase? 8

9 Triangulaion von Fluorophoren um den dee: GPS Pfad der RN zu finden: 9 Schnipun dreier Kugeln gib die gewünsche Posion

10 Beispiel: RN Polymerase Michaelis, PNS 2008 Berechnung? Förserradien hängen von der Umgebung ab 0

11 RN Exi durch Triangulaion der RN32 The uncerainies of hese posiion deerminaions were ±.5, ±.9 and ±4.7 when he nenna ye Molecule was excluded from he Pol inerior Michaelis, PNS 2008

12 Transfereffizienz E: (nzahl der zum zepor ransferieren Phoonen, normier auf gesame bsorpion) R R E T T Transfereffizienz - bsandsabhängigei onorlebensdauer ohne zepor nr r T T onorabsorpion Energieransferrae E R R T 2

13 Transferrae <-> Messgrößen E Lebensdauer des onors in nwesenhei des zepors. Lebensdauer des onors in bwesenhei des zepors. E + Gesaminensiä -nensiä im zeporanal bei onoranregung. -nensiä im onoranal bei onoranregung in nwesenhei des zepors. Korreurfaor für unerschiedliche eeionseffizienen und uanenausbeuen. 3

14 onorlebensdauer mi zepor E onorlebensdauer ohne zepor Transfereffizienz - Lebensdauern Beweis (Einschub): T T T T T E r nr + T r nr + + 4

15 FRET Effizienz aus nensiäen E + + / d e d e 0 / 0 / nnahme: = - uaneneffizienz Einschub: 5

16 inensiy Korreurfaor Korreurfaor is im Volumen (bul) nich sehr genau besimmbar. Einzelmoleülmessungen erlauben eine sehr gue Messung: Effizienz: E + mi: zeporinensiä onorinensiä (in nwesenhei von zepor) x eeionseffizienz x uanenausbeue (in nwesenhei von zepor) donor accepor d a x Signaländerung beim Bleichen des zepors ime 6

17 Beispiel: Fluoreszenz-Mariere N Zwei verschiedene Farbsoffe: TTO 550 = 80 % Zwei verschiedene Enfernungen d 20 Å zepor Effizienzen? onor TTO 647 = 65 % Förser-Radius R 0 = 65 Å d 84 Å (<?) 7

18 uswerung: E a a + d a d E + ( R / R ) 6 0 high FRET efficiency low FRET efficiency disance 20 Å Å γ heoreically calculaed efficiency measured efficiency.02 ± 2% 0.40 ± 7%! 8

19 Versuchsaufbauen für FRET 9

20 smfret in TR Geomerie M Exciaion Laser 532 nm dichroic mirrors P l/2 waveplae PBS S objecive prism chamber zepor onor Kamera 20

21 Single Molecule TR-FRET seup (2 Farben nregung) 2

22 22

23 23

24 Beispiel: Konformaionsänderungen in Hsp90 open closed N-omain Middle-omain C-omain 24 Micler e al., T.H. NSMB (2009)

25 Einzelmoleüldaen von Hsp90 Δ = s Rohdaen Rohdaen Effizienz Gesaminensiä Zei in Seunden 25

26 Raze e al., T. H. PNS (200) Raze e al., T.H., PNS (200) 26 Movie: W. Schürmann, Medienlabor (TUM

27 Laborführung 27

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