Aus der Medizinischen Universitätsklinik und Poliklinik Abteilung für Pneumologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Die Rolle des NLRP3- Inflammasom in der Pathogenese der idiopathischen pulmonalen Fibrose und Sarkoidose Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Benedikt Jäger geboren am 07.11.1982 in Lahr-Schwarzwald Freiburg im Breisgau, Juni 2014 http://d-nb.info/1055852905
III Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis III 1 Zusammenfassung 1 2 Einleitung 2 2.1 Spezifische Rezeptoren des angeborenen Immunsystems fördern die Entzündungsreaktionen in den Zellen von Organen des menschlichen Körpers... 2 2.1.1 Muster Erkennungs Rezeptoren Pattern Recognition Rezeptoren" 2 2.1.2 Die Toll- ähnlichen Rezeptoren (toll- like receptors; TLRs) 3 2.1.3 Die Nod Like Rezeptor Familie (NLRs) 3 2.1.4 Das Absent In Melanoma 2 Inflammasom (AIM2) 5 2.1.5 Die lnterleukin-1 Familie 6 2.1.6 Regulation der Assemblierung des NLRP3 Inflammasomproteinkomplexes und der daraus folgenden Caspase-1 Aktivierung und IL-1 ß Produktion in Makrophagen 7 2.1.7 Liganden des NLRP3 Inflammasoms bei verschiedenen inflammatorischen Erkrankungen 8 2.1.8 Die Rolle der Mitochondrien in der NLRP3 Inflammasom- Aktivierung... 9 2.1.8.1 Hypothese zur Rolle der Mitochondrien von apoptotischen AEC Typ I Zellen in der Lungenfibrose auf die NLRP3 Aktivierung 9 2.1.9 Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms über Cathepsin B 10 2.1.10 Die Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms über Hyaluronsäure 11 2.2 Die MicroRNAs 12 2.2.1 Regulation des NLRP3 Inflammasoms durch microrna-223 (mir-223).. 12 2.3 Die diffusen Lungenparenchymerkrankungen 13 2.3.1 Die idiopathische pulmonale Fibrose 13 2.3.2 Pathogenese der IPF 14 2.3.3 Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) 15 2.3.4 Die M1 und M2 Alveolarmakrophagen 15 2.3.5 Das Bleomycin- Lungenfibrosemausmodell 16 2.3.6 Bedeutung des NLRP3 Inflammasom im BLM Lungenfibrose Mausmodell 17 2.4 Die Sarkoidose 17 2.4.1 Das TDM- Mausmodell 19 2.5 Zielsetzung 19 3 Material und Methoden 20 3.1 Material 20 3.1.1 Allgemeines Equipment 20 3.1.2 Software 23 3.1.3 Verbrauchsmaterial 23 3.1.4 Chemikalien, Reagenzien und Kulturmedien 24 3.1.5 Puffer und Lösungen 27 3.1.5.1 Western Blot 27 3.1.5.2 ELISA 28 3.1.6 Kits, Mastermix 28 3.1.7 Antikörper 29 3.1.8 Größenmarker 29 3.1.9 Stimulanzien und Inhibitoren 30 3.1.10 Primer 30
IV 3.1.11 Enzyme 31 3.1.12 Experimente mit dem TDM- Mausmodell 31 3.2 Methoden 32 3.2.1 Zelluläre Methoden 32 3.2.1.1 Broncho Alveoläre Lavagen (BAL) 32 3.2.1.1.1 Auswahl der Probanden 32 3.2.1.1.2 Durchführung der Bronchoskopie mit Lavage 32 3.2.1.2 Aufarbeitung der Broncho Alveolären Lavage (BAL) 32 3.2.1.3 Zellzählung in Türklösung 32 3.2.1.4 Zellkultur und Gewinnung von Überständen 33 3.2.1.5 Zellstimulationsprotokolle 33 3.2.1.5.1 Definition des Inflammasom Stimulationsprotokoll 33 3.2.1.5.2 Stimulationen von Alveolarmakrophagen mit 10Gy bestrahlten apoptotischen A549 Zellen 34 3.2.1.5.3 Analyse des Einflusses von apoptotischen A549 Zellen, NADPH Oxidase- und Cathepsin Inhibitoren auf die NLRP3 mrna Expression in Alveolarmakrophagen 35 3.2.1.5.4 Untersuchung des Einflusses von konditioniertem Medium von 10 Gy bestrahlten apoptotischen A549 Zellen auf die Inflammasom- Aktivierbarkeit von AM 35 3.2.1.5.4.1 Herstellung von bestrahltem konditioniertem A549 Medium und Stimulation der BAL Zellen 35 3.2.1.5.5 Untersuchung der Rolle von Hyaluronsäure auf die NLRP3 Aktivierung in Alveolarmakrophagen 36 3.2.1.5.5.1 Verdau der Hyaluronsäure mittels der Hyaluronidase 36 3.2.2 Real Time PCR (Polymerase chain reaction) 36 3.2.2.1 RNA-Isolation mit Trizol 36 3.2.2.1.1 Reverse-Transkription; Umschreiben der RNA in cdna 37 3.2.2.1.1.1 Reaktionsansatz für die Reverse Transkription einer Probe... 37 3.2.2.1.2 Bestimmung der relativen Expressionsrate von NLRP3 und mirna223 mittels Real-Time PCR 37 3.2.2.1.2.1 Bestandteile des Reaktionsansatzes für die Real-Time PCR am icycler/biorad 38 3.2.2.2 Auswertung der Real-time PCR 38 3.2.3 Micro RNA-Isolation (mirna) 38 3.2.4 Reverse-Transkription der Micro RNA mit RT Megaplex Primer Human Pool A 39 3.2.4.1 Reaktionsansatz für die Reverse Transkription einer Probe 39 3.2.5 MiRNA Real-Time PCR mittels des Low Density Taq Man Arrays 40 3.2.6 Real-Time PCR mit spezifischen Primern für mirna-223 und NLRP3 nach dem Protokoll von Franz Bauernfeind 40 3.2.6.1 Anfügung eines Poly- A- Schwanzes an die isolierte mirna 40 3.2.6.2 Reverse-Transkription der mirna 41 3.2.6.3 Relative Quantifizierung von mirna-223 und NLRP3 mittels Real- Time PCR im Light Cycler /Roche 41 3.2.6.3.1 Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die PCR im Light Cycler /Roche 42 3.2.7 Enzyme Linked-Immunosorbent Assay (ELISA) 42 3.2.7.1 Hintergrund des capture ELISA 42 3.2.7.1.1 Sandwich ELISA Protokoll 42 3.2.8 Proteinanalyse mittels SDS Gelelektrophorese 43
V 3.2.8.1 Proteinfällung aus Inflammasom stimulierten BAL- Zellkulturüberständen 43 3.2.8.2 Auftrennung der Proteine mittels SDS-Gelelektrophorese 44 3.2.8.3 Western Blot 44 3.2.8.3.1 Blocking Schritt 44 3.2.8.3.2 Immundetektion von Proteinen bei der Western Blot Methode... 44 3.2.8.3.2.1 Die ECL Methode 44 3.2.8.3.2.2 Die Odyssey Methode 45 3.2.9 Untersuchung der inflammasom- Aktivität auf der Ebene der IL-1 ß Zytokinproduktion von BAL Zellen der mirna-223 KO und WT Mäusen im TDM- Mausmodell 45 3.2.10 Vergleich der Granulombildung in der Lunge des TDM- Mausmodells bei mirna-223 KO Mäusen und WT Mäusen mittels Hämatoxilin Eosin gefärbten Histologieschnitten 46 3.2.11 Western Blot Analyse der Caspase-1 und Caspase-1p10 Proteinexpression in Lungenhomogenat der WT und mirna-223 KO Mäuse im TDM- Mausmodell 46 3.2.11.1 Proteinisolation aus Mäuselunge 46 3.2.12 Statistische Analysen 47 Resultate 48 4.1 Studienpopulation 48 4.2 Untersuchungen zur Rolle des NLRP3 Inflammasoms bei der idiopathischen pulmonalen Fibrose 49 4.2.1 Die Stimulation mit LPS+ATP und LPS+Nigericin aktiviert das NLRP3 Inflammasom in AM gesunder Probanden 49 4.2.2 Die Aktivierbarkeit des NLRP3 Inflammasoms ist bei AM von IPF- Patienten signifikant erhöht 51 4.2.3 Die IL-1ß Produktion ist nach NLRP3 Inflammasom Stimulation am höchsten bei AM von Patienten mit einer akuten Exazerbation im Rahmen der IPF und bei AM von ARDS- Patienten 52 4.2.4 Die relative NLRP3 Expression und intrazelluläre pro-il-1ß Protein Expression unterscheidet sich nicht bei AM von IPF- Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden 54 4.2.5 Gesteigerte NLRP3 Inflammasom-Aktivität in AM durch den Kontakt zu bestrahlten, apoptotischen Alveolarepithelzellen 56 4.2.6 Der Zellkontakt von AM zu apoptotischen A549 Zellen triggert die relative NLRP3 Expression via ROS" und Cathepsin B" 58 4.2.7 Konditioniertes Medium bestrahlter apoptotischer Zellen und enzymatisch verdaute Hyaluronsäure triggert in AM signifikant die IL-1 ß Produktion 59 4.3 Untersuchung zur Rolle des NLRP3 Inflammasoms und der mirna-223 in AM von Sarkoidose- Patienten und im TDM- Mausmodell 60 4.3.1 Gesteigerte NLRP3 Inflammasom Aktivierbarkeit der AM von Patienten mit einer Sarkoidose im Vergleich zu AM von gesunden Probanden 60 4.3.2 Die intrazelluläre pro-il-1ß Protein Expression ist basal und nach Stimulation mit ATP, Nigericin, und LPS in AM von Sarkoidose- Patienten im Vergleich zu gesunden Probanden gesteigert 62 4.3.3 AM von Sarkoidose- Patienten besitzen eine signifikant gesteigerte IL-1 ß Produktion nach AIM2 Inflammasom Stimulation im Vergleich zu AM gesunder Probanden 63
VI 4.3.4 Verstärkte mirna Expression in gesorteten AM gesunder Probanden im Vergleich zu gesorteten Sarkoidose AM 64 4.3.5 Verringerte relative mirna-223 Expression und gesteigerte relative NLRP3 Expression in gesorteten AM von Sarkoidose- Patienten im Vergleich zu gesorteten AM gesunder Probanden 66 4.3.6 AM der mir-223 KO Mäuse haben eine gesteigerte IL-1 ß Produktion im Vergleich zu Wild Typ (WT) Mäuse im TDM- Mausmodell 67 4.3.7 Gesteigerte Granulombildung in der Lunge von mirna-223 KO Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen im TDM-Mausmodell 69 4.3.8 Erhöhte Caspase-1 Protein Expression in Lungenhomogenat von mirna-223 KO Mäusen im Vergleich zu WT Mäusen im TDM-Mausmodell... 70 5 Diskussion 71 5.1 Die Rolle des NLRP3 Inflammasoms bei der idiopathischen pulmonalen Fibrose 71 5.2 Gesteigerte Inflammasom- Aktivierbarkeit in AM von Sarkoidose-Patienten76 5.3 Im TDM- Mausmodell weisen mirna-223 KO Mäuse eine erhöhte NLRP3 Aktivität und pulmonale Granulomas auf 80 6 Ausblick 82 7 Literatur 83