Aus dem Fachbereich Medizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Blutspendedienst des Deutschen Roten Kreuzes Institut für Transfusionsmedizin und Immunhämatologie Direktor: Professor Dr. med. Dr. h.c. Erhard Seifried Untersuchungen zum Einfluss von NOD2/CARD15 Varianten auf den klinischen Verlauf nach allogener Blutstammzelltransplantation Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin des Fachbereiches Medizin der Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main vorgelegt von Elena Widmann aus Stuttgart Frankfurt am Main, 2015 http://d-nb.info/1077052685
Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 1.1 Stammzelltransplantation 1 1.1.1 Stammzellquellen 2 1.1.2 Autologe Stammzelltransplantation 4 1.1.3 Allogene Stammzelltransplantation 4 1.1.4 Syngene Stammzelltransplantation 5 1.2 Kriterien zur Auswahl des Spenders 5 1.2.1 HLA-Typisierung 6 1.2.2 Haploidentische Stammzelltransplantation 9 1.2.3 Minorhistokompatibilitätsantigene (mhag) 9 1.2.4 Killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) 10 1.3 Konditionierung des Patienten 10 1.3.1 Myeloabiative Konditionierung 11 1.3.2 Non-myeloablative Konditionierung 11 1.4 Komplikationen der Stammzelltransplantation 12 1.4.1 Therapieassoziierte Komplikationen 12 1.4.2 Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD) 13 1.4.2.1 Graft-versus-Leukemia Effekt 14 1.4.2.2 Akute GvHD (agvhd) 15 1.4.2.3 Pathophysiologie der agvhd 16 1.4.2.4 Chronische GvHD (cgvhd) 18 1.4.2.5 Präventionsmaßnamen zur Verhinderung einer GvHD 18 1.4.2.6 Risikofaktoren für die Entwicklung einer GvHD 19 1.5 NOD2/CARD15 20 1.5.1 Aufbau und Funktion von NOD2/CARD15 22 1.5.2 NOD2/CARD15 Signalwege und Interaktionspartner 23 1.5.3 Single Nucleotide Polymorphismen innerhalb NOD2/CARD15 24 1.5.4 Auswirkung der NOD2/CARD15 Polymorphismen 26 1.5.4.1 NOD2/CARD15 Polymorphismen in der allogenen Stammzelltransplantation 27 1.6 Zielsetzung der Arbeit und Methodisches Vorgehen 28 2 Materialien, Methoden und Patientenkollektiv 30 2.1 Materialien 30 2.1.1 Geräte 30 2.1.2 Verbrauchmaterialien 31 2.1.3 Nukleinsäuren, Oligonukleotide, Enzyme 31
2.1.4 Chemikalien & Reagenzien 32 2.1.5 Puffer und Lösungen 32 2.1.6 Software 33 2.2 Methoden 33 2.2.1 Isolierung genomischer DNA aus Leukozyten 33 2.2.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 34 2.2.3 Sequenzierung zur Typisierung der NOD2/CARD15 Polymorphismen... 35 2.2.3.1 Amplifikations-PCR 36 2.2.3.2 Gelelektrophorese 36 2.2.3.3 Sequenzierungs-PCR 37 2.2.3.4 Aufreinigung der Proben 39 2.2.3.5 Auswertung der Sequenzierung 39 2.2.4 Real-Time PCR zur Typisierung der NOD2/CARD15 Polymorphismen... 39 2.2.4.1 Sonden- und Primerdesign für die Real-Time PCR 42 2.2.4.2 Reaktionsansatz und PCR Programm 45 2.2.4.3 Auswertung der Real-Time PCR 46 2.3 Patientenkollektiv 47 2.3.1 Ein- und Ausschlusskriterien 48 2.4 Definition der Endpunkte 49 2.5 Statistische Analyse 49 3 Ergebnisse 51 3.1 Etablierung einer NOD2/CARD15 Sequenzierungsmethode 51 3.1.1 NOD2/CARD15 Primersequenzen für Sequenzierung 51 3.1.2 Darstellung der Sequenzen und der Sequenzierprimer 52 3.1.2.1 SNP8 von NOD2/CARD15 52 3.1.2.2 SNP12 von NOD2/CARD15 54 3.1.2.3 SNP13 von NOD2/CARD15 55 3.1.3 Optimierung der Sequenzierungsergebnisse 56 3.2 Real-Time PCR basierte Untersuchung der NOD2/CARD15 Polymorphismen 56 3.2.1 Vergleich Real-Time PCR mit Sequenzierungsergebnissen 57 3.2.1.1 Vergleich Real-Time PCR mit Sequenzierungsergebnissen bei gesunden Probanden (Hauspanel) 57 3.2.1.2 Vergleich Real-Time PCR mit Sequenzierungsergebnissen in dem Patienten- und Spenderkollektiv 58 3.2.2 Auswertung der Real-Time PCR Ergebnisse des Patienten- und Spenderkollektivs 59
3.2.2.1 Genotypfrequenz der NOD2/CARD15 Polymorphismen 59 3.2.2.2 Allelfrequenz der NOD2/CARD15 Polymorphismen 60 3.2.2.3 Genotyp-Kombinationen der Spender- und Patientenpaare 61 3.3 Klinische Studienauswertung 62 3.3.1 Outcome im Gesamtkollektiv in Abhängigkeit von NOD2/CARD15 Varianten 64 3.3.2 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Gesamtüberleben (OAS) 66 3.3.2.1 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Überleben in Abhängigkeit der Transplantatherkunft (FRD oder MUD) 69 3.3.2.2 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Oberleben in Abhängigkeit der Grunderkrankung 71 3.3.3 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Auftreten einer Transplantations-assoziierten Mortalität (TRM) 72 3.3.3.1 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Auftreten einer TRM in Abhängigkeit der Transplantatherkunft (FRD oder MUD) 74 3.3.3.2 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Auftreten einer TRM in Abhängigkeit der Grunderkrankung 75 3.3.4 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf die Entwicklung einer agvhd 76 3.3.4.1 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf den Schweregrad einer agvhd 76 3.3.5 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Auftreten pulmonaler Komplikationen 78 3.3.6 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Auftreten eines Rezidivs 79 3.3.6.1 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Auftreten eines Rezidivs in Abhängigkeit der Transplantatherkunft (FRD oder MUD) 82 3.3.6.2 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das Auftreten eines Rezidivs in Abhängigkeit der Grunderkrankung 84 Diskussion 85 4.1 Methodenvergleich Real-Time PCR und Sequenzierung 85 4.2 Variabilität der NOD2/CARD15 Polymorphismen in Bevölkerungsgruppen 86 4.3 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf den klinischen Verlauf nach allogener Stammzelltransplantation 88 4.3.1 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf das mediane Überleben und die TRM 88
4.3.2 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf die Entwicklung eines Rezidivs 91 4.3.3 Einfluss der NOD2/CARD15 Polymorphismen auf die Entwicklung einer agvhd 93 4.3.4 Einfluss von NOD2/CARD15 Polymorphismen auf die Entwicklung pulmonaler und infektiöser Komplikationen 96 4.4 Kofaktoren, die einen Einfluss auf die klinische Manifestation der NOD2/CARD 15 Polymorphismen haben 98 4.4.1 Polymorphismenhäufigkett. 98 4.4.2 Grunderitrankung 99 4.4.3 Konditionierung 99 4.4.4 Darmdekontamination 100 4.4.5 Ausmaß und Methode der T-Zell Depletion 101 4.4.6 Donortyp 102 4.5 Pathophysiologische Überlegungen, wie NOD2/CARD15 Polymorphismen das Outcome von allogenen Stammzelltransplantationen beeinflussen 103 4.6 Bedeutung für die Transpiantationsmedizin 104 5 Zusammenfassung 105 6 Abstract 107 7 Literaturverzeichnis 108 8 Anhang 127 8.1 Tabellenverzeichnis 127 8.2 Abbildungsverzeichnis 129 8.3 Abkürzungsverzeichnis 131 8.4 Danksagung 134 8.5 Ehrenwörtliche Erklärung 135 8.6 Curriculum Vitae 136