Kontrolle des murinen Cytomegalovirus durch y6 T-Zellen Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Sabrina Seil aus Wolfenbüttel http://d-nb.info/1072043955
Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 1 2 Summary 2 3 Einleitung 3 3.1 Das Cytomegalovirus (CMV) 3 3.1.1 Klassifizierung und Morphologie 3 3.1.2 Epidemiologie, Pathogenese und klinische Relevanz 4 3.2 Die Immunantwort gegen CMV 6 3.2.1 Angeborene Immunität gegen CMV 6 3.2.2 Die adaptive zelluläre Immunantwort gegen CMV 8 3.2.3 Die adaptive humorale Immunantwort gegen CMV 9 3.3 y6t-zellen 10 3.3.1 y6 T-Zell-Entwicklung 13 3.3.2 Das y6 T-Zell-Rezeptor-Repertoire 14 3.3.3 Diversität des ystcr-repertoires 17 3.3.4 Der y6 T Zell-Rezeptor 18 3.3.5 Antigen-Erkennung 19 3.3.6 Effektorfunktionen von y6 T-Zellen 20 3.3.7 Immunosurveillance durch y6 T-Zellen 23 3.4 y6 T-Zellen und CMV 24 4 Fragestellung 26 5 Ergebnisse 27 5.1 Vordaten: Schutz durch y6 T-Zellen aus CDS'^JHT-Donoren 27 5.2 Schutz durch y6 T-Zellen aus TCRa^'-Donoren 27 5.3 Etablierung einer in i/ivo-cd4-/cd8-depletion 30 5.4 Schutz durch y6 T-Zellen aus naiven und infizierten C57BL/6-Donoren 33 5.5 Infektionsverlauf in TCRa^'-Mäusen 36 5.6 Sekundärinfektion von TCRa~'~-Mäusen 37 5.7 Verlauf einer MCMV-Infektion in TCRS'^-Mäusen 38 5.8 Numerische und phänotypische Veränderungen von y6 T-Zellen nach Infektion 40 5.8.1 Absolute y6 T-Zell-Zahlen in CDS'jHT-Mäusen nach MCMV-Infektion 40 I
5.8.2 Proliferation der y6 T-Zellen in CDS^'JHT-Mäusen nach MCMV-Infektion 42 5.8.3 Phänotypische Veränderungen der y6 T-Zellen nach MCMV-Infektion 44 5.9 Verlauf des Virustiters in CDS'^JHT- und C57BL/6-Mäusen 50 5.10 Stabilität des durch MCMV hervorgerufenen Phänotyps 52 5.10.1 Transfer-Experimente 53 5.10.2 Transfer von immunen CD8 + aß T-Zellen oder Immunserum 54 5.11 IL-33 als potentieller Aktivator der y6 T-Zellen 59 5.12 y6 T-Zell-Rezeptor-Repertoire 61 5.12.1 Durchflusszytometrische Analyse 62 5.12.2 Next Generation Sequencing (NGS) 63 5.13 Effektorfunktionen der yß T-Zellen gegen MCMV 79 5.13.1 IFN-y und IL-17 als potentielle Effektormoleküle 79 5.13.2 Perforin als potentielles Effektormolekül 85 6 Diskussion 88 6.1 Schutz durch y6 T-Zellen 88 6.2 Gedächtnisfunktion der y6 T-Zellen 89 6.3 Veränderungen der y6 T-Zell-Population nach MCMV-Infektion 92 6.4 Veränderungen des y6 T-Zell-Rezeptor-Repertoires 96 6.5 Rolle des TCR 97 6.6 Effektormechanismen 99 6.7 y6 T-Zellen als zelluläre Therapie 100 6.8 Zusammenfassung und Ausblick 102 7 Material 104 7.1 Chemikalien und Reagenzien 104 7.2 Zellkulturreagenzien 106 7.3 Plastik- und Verbrauchsmaterialien 106 7.4 Kits 108 7.5 Puffer, Lösungen und Medien 109 7.6 Biologische Materialien 111 7.6.1 Versuchstiere 111 7.6.2 Zelllinien 112 7.6.3 Viren 112 7.7 Antikörper für Durchflusszytometrie 112 7.8 In vivo applizierte Antikörper 114 II
7.9 Sonstige Antikörper 115 7.10 Konjugate 115 7.11 Oligonukleotide 116 7.12 Geräte 119 7.13 Software 120 8 Methoden 121 8.1 Zellkulturverfahren 121 8.1.1 Kultivierung adhärenter Zellen 121 8.1.2 Gewinnung von Croma 101-Zellkulturüberständen 121 8.2 Molekularbiologische Methoden 122 8.2.1 Isolierung von RNA 122 8.2.2 cdna-synthese 122 8.2.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 123 8.2.4 Next Generation Sequencing (NGS) 124 8.2.5 DNA-Gelelektrophorese 125 8.3 Proteinbiochemische Methoden 125 8.3.1 Herstellung von Zelllysaten 125 8.3.2 Quantitative Bestimmung von Proteinkonzentrationen 126 8.4 Virologische Methoden 126 8.4.1 In iz/fro-amplifikation und Aufreinigung von MCMV-Virionen 126 8.4.2 Bestimmung des Titers der MCMV-Präparationen 127 8.4.3 Bestimmung des Virustiters in Organen 128 8.5 Immunbiologische Methoden 129 8.5.1 Durchflusszytometrie von murinen Zellen aus Milz, Lymphknoten, Lunge und Leber..129 8.5.2 Durchflusszytometrie von murinem Vollblut 129 8.5.3 Färbung von Vy6 130 8.5.4 Intrazelluläre Cytokin-Färbung 130 8.5.5 Intrazelluläre Färbung von BrdU 131 8.5.6 Analysen zur Zellzahlbestimmung mittels Trucount Beads 131 8.5.7 FACS (Fluorescence-activated cell sorting) 132 8.5.8 Depletion von Zellen mit MACSiBead Particles 132 8.6 Tierexperimentelle Techniken 133 8.6.1 Infektion 133 8.6.2 In v/vo-applikation depletierender oder blockierender Antikörper 133 8.6.3 Blutentnahme 133
8.6.4 In v/vo-biolumineszenz-analyse 133 8.6.5 Adoptiver Zell- und Serumtransfer 134 8.7 Isolation und Aufreinigung muriner Zellen 134 8.7.1 Aufreinigung von murinen Milz-Zellen 134 8.7.2 Aufreinigung von murinen Lymphknoten-Zellen 135 8.7.3 Aufreinigung von murinen Leber- und Lungen-Zellen 135 9 Literaturverzeichnis 136 11 Abkürzungsverzeichnis 152 11.1 Abkürzungen 152 11.2 Einheiten 155 11.3 Vorsatzzeichen 155 11.4 Griechische Buchstaben 156 12 Danksagung 157 IV