In vivo Antigen-Beladung Antigen-präsentierender Zellen mit Hilfe von rekombinanten Fcy-Rezeptor-Antikörpern Der naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Christian H.K. Lehmann aus Neuhaus am Rennweg http://d-nb.info/1053435290
1 ZUSAMMENFASSUNG 15 2 SUMMARY 17 3 EINLEITUNG 19 3.1 Dendritische Zellen 19 3.1.1 Dendritische Zellen und die Balance zwischen Toleranz und Immunität 19 3.1.2 T-Zellaktivierung durch Dendritische Zellen 22 3.1.2.1 Die klassische Antigenprozessierung für die MHC-I-Präsentation 23 3.1.2.2 Die klassische Antigenprozessierung für die MHC-Il-Präsentation 23 3.1.2.3 Die Antigenprozessierung in Dendritischen Zellen 24 3.1.2.4 Kreuzpräsentation - MHC-I-Präsentation extrazellulärer Proteine 24 3.1.2.5 Autophagie - Prozessierung zytosolischer Proteine für die MHC-Il- Präsentation 25 3.1.2.6 Stimulation naiver T-Zeilen durch Dendritische Zellen 27 3.1.3 Weitere Mechanismen zur Steuerung der Immunantwort 27 3.1.4 Die Heterogenität Dendritischer Zellen und deren Entwicklung in der Maus 28 3.1.4.1 Subklassen Dendritischer Zellen 28 3.1.4.2 Die Entwicklung Dendritischer Zellen 30 3.2 Fcy-Rezeptoren 33 3.2.1 Fcy-Rezeptoren - Diversität und Funktionen 35 3.2.2 Fcy-Rezeptorexpressionsprofil 36 3.2.3 Dendritische Zellen und Fcy-Rezeptoren 37 3.3 Dendritische Zellen in der Medizin 38 3.3.1 Monozyten-gereifte Dendritische Zellen 39 3.3.2 Die in vivo Antigen-Beladung. 40 3.4 Zielsetzung 46 4 ERGEBNISSE 47 4.1 Fcy-Rezeptar-Expression auf DCs unter nicht inflammatorischen Bedingungen 47 4.1.1 Knochenmarks-gereifte Dendritische Zellen 47 4.1.2 Lymphoide Organe 49 4.1.2.1 Milz und Lymphknoten 49 4.1.2.2 Knochenmark und Thymus 55 4.1.3 Nicht Lymphoide Organe 58 4.1.3.1 Lunge 58 4.2 Klonierung und Expression chimärer Fcy-Rezeptor-Antikörper 61 4.2.1 S'-Rapid Amplification ofcdna ends (5'RACE) 61 4.2.2 Overlap-PCR 63 4.2.3 Antikörperproduktion und Bindungs-Test 64 4.3 In vivo Bindung, Endozytose von und DC-Aktivierung durch afcy- Rezeptor-Antikörper 66 4.3.1 In vivo Bindung der rekombinanten Fcy-Rezeptor-Antikörper 66 4.3.2 Endozytose von Chimären Fcy-Rezeptor-Antikörpern 68 XI
4.3.3 Die Aktivierung Dendritischer Zellen durch Chimäre Antikörperkonjugate 70 4.4 In vivo Antigen-Beladung mit afcy-rezeptor-antikörpern 73 4.4.1 CD4* und CD8* T-Zellantworten nach Fcy-Rezeptor-Antigen-Beladung 73 4.4.2 Rezeptorspezifität der Antigen-Beladung über FcyRIlB und FcyRIV 77 4.4.3 Antigen-Beladung nach Clodronat-Vesikel-Gabe 79 4.4.3.1 Clodronat-Vesikel depletiert Monozyten und CDllc*CDS* DCs 80 4.4.3.2 T-Zellantworten nach Clodronat-Vesikelgabe 84 4.4.4 Antigen-Beladung in CDllc-DTR-Mäusen nach Diphtherietoxin-Gabe 85 4.4.4.1 Diphtherie-Toxin depletiert CD 11c*** Zellen in CDllc-DTR-Mäusen 85 4.4.4.2 T-Zellantworten nach Diphterietoxin-Gabe 87 4.4.5 T-Zellantworten nach FcyRIlB-Antigen-Beladung in pdc-depletierten Tieren 4.4.5.1 apdca-1 depletiert pdcs in C57BU6-Mäusen 88 4.4.5.2 T-Zellantworten nach pdc-depletion 89 4.4.6 T-Zellantworten nach FcyRIlB-Antigen-Beladung in pmt-mäusen 91 4.4.6.1 T-Zellantworten in B-Zell-freien Tieren 91 4.4.7 Antigen-Beladung von FcyRIV in Zelltyp-spezifischen knock out-tieren 92 4.4.7.1 CDllc-Cre x FtyR/V* " *- und LysM-Cre x FcyRI\/ kua "-Mäuse 92 4.4.7.2 ctfcyriv-antigen-beladung in zelltypspezifischen knock out-mäusen 94 4.5 Ex vivo Analyse der verantwortlichen Zellpopulation 95 4.6 Antigen-Beladung Dendritischer Zellen unter inflammatorischen Bedingungen 96 4.6.1 In vivo Fcy-Rezeptor-Antigen-Beladung unter inflammatorischen Bedingungen 97 4.6.2 acd40-costimulation in Wildtyp- und Fcyx FcyRIlB'*'-Mäusen 100 4.6.3 Antigen-Beladung in Wildtyp- und FcyRUB, '-Tieren unter acd40- Costimulation 102 4.6.4 Antigen-Beladung in C57BU63- und pmt* -Tieren unter ocd40- Costimulation 105 4.6.5 Anedyse der fehlenden Reaktion auf acd40 in FcyRIlB^'-Mäusen 106 4.6.5.1 CD40-Expression in C57BU6J-, Fcy''- und FcyRIlB 1 '-Mäusen 107 4.6.5.2 In vivo Aktivierung von Immunzellen nach acd40-gabe 110 4.7 T-Zellantworten in naiven Mäusen 112 4.8 Ausblick 116 5 DISKUSSION 117 5.1 Fcy-Rezeptor Expression auf Dendritischen Zellen 117 5.2 Generierung neuer afcy-rezeptor-antigenbeladungsantikörper 121 5.3 In vivo Bindung, Endozytose von und Aktivierung durch afcy-rezeptor- Antikörper 124 5.4 In vivo Antigen-Beladung mit afcy-rezeptor-antikörper-antigen- Konjugaten 125 5.5 Ex vivo Analyse der Antigen-Präsentation durch verschiedene Zellpopulationen 132 5.6 In vivo Antigen-Beladung mit afcy-rezeptor-antikörpern unter Costimulation 135 5.7 Untersuchungen zur Rolle des FcyRIlB für die acd40-costimulation 137 XII '88
5.8 T-Zell-Antworten in naiven Mäusen 139 6 METHODEN 143 6.1 Zellkultur 143 6.1.1 Verwendete Zelllinien 143 6.1.2 Passagieren stabiler Zelllinien 143 6.1.3 Einfrieren und Auftauen von Dauerzellkulturen 144 6.1.4 Generation von DCs aus Knochenmarks-Monozyten 145 6.2 Klonierung 147 6.2.1 RNA-Präparation und Qualitätskontrolle 147 6.2.2 PCR 148 6.2.3 Agarose-Gelelektrophorese 150 6.2.4 Gelextraktion und PCR-Purification 150 6.2.5 RT-PCR und 5'RACE 151 6.2.6 Blunt- und TA-Klonierung von PCR-Produkten in Topoisomerasevektoren 154 6.2.7 Overtap-PC Rs 155 6.2.8 Restriktionsverdaus 156 6.2.9 Ligation 156 6.2.10 Primer-Annealing 157 6.2.11 Kompetente Bakterien 158 6.2.12 Transformation 159 6.2.13 Mini-Präparationen von Plasmid-DNA 159 6.2.14 Maxi-Präparation von Plasmid-DNA 160 6.2.15 Bestimmung von DNA-Konzentrationen 162 6.3 Antikörper-Produktion 162 6.3.1 Antikörperproduktion in ISF-1 (Zellkulturflasche/Einweg-Membran Bioreaktor) 162 6.3.2 Transiente CaCl rtransfektion zur Antikörperproduktion 163 6.3.3 Ammoniumsulfatfällung und Dialyse 165 6.3.4 Antikörperaufreinigung über Protein-G-Beads 166 6.3.5 SDS-Gelelektrophorese 167 6.3.6 Coomassie-Fäftoung 169 6.3.7 Antikörperkonzentrationsbestimmung (Bradford-Assay) 169 6.3.8 LPS-Removal. 170 6.3.9 Endotoxin-Test 171 6.3.10 Antikörpermarkierung 171 6.4 Experimente in Mäusen 173 6.4.1 Präparation von Einzelzellsuspensionen 174 6.4.2 FACS-Färbung 175 6.4.3 In vivo Antikörperbindung 176 6.4.4 Endozytose-Assay 177 6.4.5 Ex vivo Proliferations-Assay 178 6.4.6 MACS-Anreicherung und -Abreicherung 179 6.4.7 FACS-Sortierung 181 XIII
6.4.8 CFSE-Markierung 181 6.4.9 In vivo Proliferations-Assays 182 6.4.10 In vivo Zelldepletionen 183 6.4.10.1 Depletion durch Diphtenetoxin (DT) 183 6.4.10.2 ADCC 183 6.4.10.3 Clodronat-Vesikel 184 6.4.11 Restimulations-Assays 184 7 VERZEICHNISSE 187 7.1 Abkürzungsverzeichnis 187 7.2 Verwendete Antikörper 190 7.3 Literaturverzeichnis 198 7.4 Abbildungsverzeichnis 215 8 DANKSAGUNG 225 XIV