Molekulare Diagnostik Hans Nitschko
Nachweis viraler Erreger durch molekularbiologische Methoden Antikörpernachweise Nachweis antigenspezifischer T-Zellen Neutralisationsteste Nachweis Therapie-resistenter Viruspopulationen Infektionsketten
Nachweismethoden Indirekte (Serologische) Nachweismethoden ELISA µ-capture ELISA Immunfluoreszenztest (IFT) Komplementbindungsreaktion (KBR) Hämagglutinationshemmtest (HHT) Western Blot (WB) Neutralisationstest (NT)) Direkte Nachweismethoden Polymerase Ketten Reaktion (PCR) Quantitative PCR Antigennachweis (ELISA) Antigennachweis (Schnelltest) Virusisolierung Antigennachweis nach Virusinfektion in der Zellkultur Sequenzierung Elektronenmikroskopie
ELISA
ELISA Testprinzip 1. Antigen-beschichtete Mikrotiterplatte ELISA1
ELISA Testprinzip 2. Seruminkubation ELISA2
ELISA Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper ELISA3
ELISA Testprinzip 4. Substratinkubation ELISA4
AntigenNachweis Antigen Nachweis
Antigen-Schnelltest Testprinzip 1. Mit Antikörper beschichtetes Röhrchen Antigen-ELISA1
Antigen-Schnelltest Testprinzip 2. Inkubation mit Patientenmaterial Antigen-ELISA2
Antigen-Schnelltest Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antikörper Antigen-ELISA3
Antigen-Schnelltest Testprinzip 4. Substratinkubation Antigen-ELISA4
ELISA Mikrotiterplatte
µ-capture ELISA Testprinzip 1. Anti-IgM beschichtete Mikrotiterplatte µ Capture1
µ-capture ELISA Testprinzip 2. Seruminkubation µ Capture2
µ-capture ELISA Testprinzip 3. Inkubation mit Peroxidase-konjugiertem Antigen µ Capture3
µ-capture ELISA Testprinzip 4. Substratinkubation µ Capture4
PCR, RT- PCR, q-pcr
TaqMan 5 -nuclease assay -principle Pol R Q Pol R Q Amplification R R Pol Q Pol Q HBV-polymerase gene human DNA, different targets
HN April 2001 Sensitivity of HBV-TaqMan
Precision of assay 4000, 2000, 1000, 500 Geq. / ml 2-fold replicat es HN April 2001
HN April 2001 Linearity of HBV-TaqMan
Sequenzierung
Sequenzierung LMU Bestimmung der Basenabfolge in einer Nukleinsäure = GOLDSTANDARD Einsatzfelder: Genotypisierung Resistenzbestimmung Infektionsketten Verifizierung von PCR-Produkten Detektion von Mutanten SNP (single nucleotide polymorphism)...
Sequenzierung Ablauf Seq.Ablauf PCR 1 2 3 Sequenzierreaktion Elektrophorese Auswertung
Sequenzierung Testprinzip ds DNA 5 GCATATGTCAGTCCAG 3 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 Sequ. Testprinzip primer annealing 5 GCAT 3 3 CGTATACAGTCAGGTC 5 excess datp, dttp, dctp, dgtp ddatp Taq ddttp Taq ddctp Taq ddgtp Taq 5 GCATA 5 GCATAT 5 GCATATGTC 5 GCATATG 5 GCATATGTCA 5 GCATATGT 5 GCATATGTCAGTC 5 GCATATGTCAG 5 GCATATGTCAGTCCA 5 GCATATGTCAGT 5 GCATATGTCAGTCC 5 GCATATGTCAGTCCAG electrophoresis
Sequenzierung LMU Halbe PCR 30-fache Amplifikation DNA Puffer cycle sequencing HN Feb 2004
Sequenzierung LMU Methodik Auftrennung der Extensionsprodukte nach Länge Primer (Probleme: 70% DNA, 10% Inhib., 10% Primer, 10% Cycling u.a.)
Sequenzierung LMU Plattenformat (line tracking) HN Feb 2004
Sequenzierung LMU Elektropherogramm HN Feb 2004
ABI 377A LMU Platten - Sequenziergerät Laserebene HN Feb 2004
ABI 377A LMU Platten - Sequenziergerät HN Feb 2004
Beckman Coulter LMU CEQ8000 8 Kapillaren, 100 Basen/10 min Erste Peaks nach 20 min HN Feb 2004 2 Mikrotiterplatten
Kapillar- Sequenzierung Gele gießen entfällt Kein manueller Probenauftrag Kein line tracking Kein cross talk Keine Platten- Reinigung Variabler Volumeneinsatz während des Laufs Hoher Durchsatz LMU
Kapillar- Sequenzierung II LMU HN Feb 2004
Sequenzierung LMU Proben- Einzug (im nl- Maßstab) durch Anlegen von Spannug HN Feb 2004
HBV-Genom LMU Zirkuläre DNA 4 Gene: S surface P polymerase C core X x-gen HN Feb 2004
Lamivudine Therapie 1. HBV Sequenz 1.3.1999 2. HBV Sequenz 1.11.2000
HBV Sequenz ierung HBV Sequenzen eines Patienten unter LamivudinTherapie
Sequenzierung Polymorphismus an Position 552 der HBV-Polymerase Übergang von Wildtyp M zu resistenter Mutante I sense antisense ATG = Met (M), ATT = Ile (I) HN April 2001
Sequenzierung Auswertung HBV Auswertung Blutentnahme 1.3.1998 (vor Lamivudin) 1.11.2001 (unter Lamivudin) Aminosäure (Position 552) Nukleinsäure-Triplet Resistenzmutation (ja/nein)? M ATG nein I ATT ja; 400-fach
Sequenzierung LMU HN Feb 2004
Sequenz: HBsAG-conformation HBs3 HBs4 105 130 HBs1 C 110 C 124 C C C HBs2 C 139 C C N G 145 G>R (vaccine escape) HBs5 115 156 HN April 2001 98
Sequenz: HBsAG-vaccine escape 130 C 124 C C C 139 C N G 145 105 110 115 156 HN April 2001 98 mutations associated with vaccine failure
Sequenz: HBsAG-diagnostic failure mutations Diagnostic failures 130 C C 124 C C 139 C N G 145 C 105 110 115 156 HN April 2001 98 4 of 5: no obvious aa changes
Sequenzierung HBV LMU HN Jun 2010
Sequenzierung HBV LMU HN Jun 2010
Sequenzierung HIV LMU PR RT HN Feb 2004
Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010
Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010
Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010
Sequenzierung HIV LMU HN Jun 2010
Immunfluoreszenz Test Immunfluoreszenz Test
RFLP Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus
RFLP Analyse
HCV-RFLP DrdI BsmaI BsrI Sau3A HinfI Schnell & billig Ø Ø Ø Ø Ø?
Western Blot Analyse
FACS Analyse Fluorescence activated cell sorting
Renal transplant recipients II LMU Clinically asymptomatic: O Mononucleosis like symptoms: