1 Einleitung 1. 2 Material und Methoden 13. Inhaltsverzeichnis

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Sofia Schmid
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1 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Die Wirkung von Schwermetallen und Silizium auf Pflanzen Adaptationsmechanismen schwermetalltoleranter Pflanzen Grundlagen der analytischen Elektronenmikroskopie Röntgenmikroanalyse (EDXA) Elektronenenergieverlustspektroskopie (EELS) und elementspezifisches Abbildungsverfahren (ESI) Problemstellung und Ziel der Arbeit 11 2 Material und Methoden Verwendete Substanzen Pflanzenmaterial Pflanzen Keimlinge Hydroponische Pflanzen Schwermetallstress Allgemeine Methoden Bestimmung der Metallkonzentrationen im Boden mittels Atom-Absorptions-Spektroskopie (AAS) Messung der Chlorophyll-Fluoreszenz Lichtmikroskopische Methoden Extraktion löslicher phenolischer Verbindungen Gesamtphenolbestimmung UV/Vis-Spektren Proteinanalytische Methoden Proteinextraktion Proteinbestimmung Polyacrylamidgelektrophorese (SDS-PAGE) Coomassie-Färbung Silber-Färbung Affinitätschromatographie Westernblott Antikörper Färben der Membranen mit Ponceau S N-terminale Protein-Sequenzierung HPLC-Methoden Analyse phenolischer Verbindungen 22 I

2 Inhaltsverzeichnis Analyse von Thiolen mittels Derivatisierung mit Monobrombiman Elektronenmikroskopische Methoden Glutaraldehyd-Osmium-Fixierung und Einbettung Ultramikrotomie Kontrastierung der Ultradünnschnitte mit Bleicitrat Probenpräparation zur Elementanalyse Gefrierfixierung Gefriersubstituition EDX-Messungen ESI-Abbildungen und EEL-Spektren 27 3 Ergebnisse Standorte Morphologie der Blätter Ausscheidung von Schwermetallen Ausscheidung durch Salzdrüsen Speicherung von Schwermetallen in der Zellwand Verteilung von Cu und Zn in der Zellwand Speicherung von Schwermetallen im Cytoplasma Bindung von Schwermetallen an Proteine und Peptide Isolierung Cu-bindender Proteine Westernblot-Analyse schwermetallinduzierter Proteine Phytochelatine Speicherung von Schwermetallen in der Vakuole Bindung von Schwermetallen an phenolische Verbindungen Vorkommen phenolischer Verbindungen in Armeria Isolierung und Identifizierung der phenolischen Verbindungen Nachweis der Komplexierung von Schwermetallen Akkumulation phenolischer Verbindungen nach Belastung mit Schwermetallen Zn-Expositionsversuche mit Keimlingen Untersuchungen zur Aufnahme und Verteilung von Zn in Armeria Nachweis der Vitalität von Keimlingen nach Schwermetallbelastung 58 II

3 Inhaltsverzeichnis 3.8 Silizium in Armeria 59 4 Diskussion Kupfer Cu in der Zellwand Cu im Cytoplasma Komplexierung von Cu in der Vakuole Zink Silizium 78 5 Zusammenfassung 80 6 Literaturverzeichnis 83 III

4 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungen AAS Atomabsorptionsspektroskopie ATP Adenosintriphosphat BSA Rinderserumalbumin bzw. beziehungsweise C Grad Celsius ca. Circa cps counts per second d Tage d Schnittdicke DFT Dichte-Funktions-Theorie DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure E Energieverlust EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EDX energy dispersive X-ray microanalysis EELS electron energy loss spectroscopy EM Elektronenmikroskop ERL Epoxy Resin Low Viscosity ESI electron spectroscopic imaging ESI-MS Electrospray-Massenspektrometrie et al. und andere EXAFS extended X-ray absorption fine structure ev Elektronenvolt FG Frischgewicht g Erdbeschleunigung GA Glutaraldehyd G-Os Glutaraldehyd-Osmium GS Glutathion-Synthetase GSH Glutathion (reduziert) GST Glutathion-S-Transferase h Stunde(n) HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie HEPPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure HSP Hitzeschockprotein IV

5 Abkürzungsverzeichnis I Intensität I 0 ICP ICP-MS It kda λ lmw LSM ma mbrb Me MS MS MSA MT m/z PAGE PBS Intensität der ungestreuten und elastisch gestreuten Elektronen induktiv gekoppeltes Plasma induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie Intensität aller (gestreut und ungestreut) Elektronen Kilodalton mittlere freie Weglänge der inelastisch gestreuten Elektronen low molecular weight Laserscan Mikroskopie Milliampère Monobrombiman (3,7-Dimethyl-4-brommethyl-6-methyl-1,5-diazabicyclo- [3.3.0]-octa-3,6-dien-2,8-dion) Metall Massenspektometrie Murashige & Skoog Methasulfonsäure Metallothionein Masse/Ladungsquotient Polyacrylamidgel-Elektrophorese phosphate buffered saline PBST PBS + 0,1% Tween 20 PC Phytochelatin PFA Polyfluralkoxy ph negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PVDF Polyvinylidendifluorid PVPP Polyvinylpyrrolidon REM Rasterelektronenmikroskop RP reversed phase rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur SDS Natriumdodecylsulfat SE relative Standardabweichung TCA Trichloressigsäure TEM Transmissionselektronenmikroskop TG Trockengewicht TFA Trifluoressigsäure V

6 Abkürzungsverzeichnis Tris UV/Vis V v/v Vol. w/v XAS z.b. Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Ultravioletter bis sichtbarer Lichtwellenbereich Volt Volumen/Volumen Volumenanteile Gewicht/Volumen X-ray absorption spectroscopy zum Beispiel VI

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