Inhaltsverzeichnis. Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen. 1 Einleitung 1. 2 Material und Methoden 4. Inhaltsverzeichnis

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1 I Inhaltsverzeichnis I Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen IV 1 Einleitung 1 2 Material und Methoden Organismen und Plasmide Expressionsvektoren Kultivierungsbedingungen Nährmedien, Antibiotika und Schwermetalle Zellanzucht Stammhaltung Molekularbiologische Techniken DNA-Präparationsmethoden Plasmid-Mikropräparation zur Bestimmung der Plasmidgröße Plasmidminipräparation Präparative Plasmidisolierg Plasmidpräparation mit Qiaprep Spin Plasmid Kit Präparative Plasmidisolierung für Sequenzierungen Agarose-Gelelektrophorese DNA-Konzentrationsbestimmung DNA-Standardmolekulargewichtsmarker Spaltung der DNA mittels Restriktionsendonucleasen Mikrodialyse Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Dephosphorylierung von DNA-Fragmernten Ligation von DNA-Fragmenten Transformation Polymerase-Kettenreaktion Synthese der Primer DNA-Amplifikation mittels PCR Sequenzierung von DNA Primer Sequenzierung mit unmarkierten Primern und Fluorescein-15-dATP Sequenzgel und Auswertung der Daten Enzymmessung Bestimmung der enzymatischen Aktivität des CzcA-LacZ-Fusionproteins Proteinchemische Methoden Induktion der Genexpression Zellernte und Gesamtzellaufschluß Membranpräparation Membransolubilisierung Solubilisierung mit Digitonin Solubilisation mit n-dodecylmaltosid 22

2 II Umpuffern und Einengen von Proteinlösungen Säulenchromatographie Geräte Gelpermeationschromatographie an Sephacryl s Substrataffinitätschromatographie an APTG Chromatographie an Hydroxylapatit Chromatographie an Nickel-Chelat-Sepharose Gelpermeationschromatographie an Superose 6HR Strep-tag Reinigung Proteinbestimmung Proteinbestimmung von Membranproteinen Chloroform-Methanol-Fällung Elektrophoretische Methoden SDS-Page nach Laemmli Coomassie-Färbung Elektrophoretischer Transfer von Proteinen auf eine Membran Antikörpernachweis N-terminale Aminosäuresequenzierung Rekonstitutionsexperimente Herstellung von Liposomen Herstellung von Proteoliposomen nach Racker Herstellung von Proteoliposomen nach Jung Nachweis eines künstlichen ph-gradienten durch Aufnahmeexperimente mit radioaktiven Metallen Bestimmung der Größe von Liposomen/Proteoliposomen Chemikalien, Säulenmaterial und Enzyme 35 3 Experimente und Ergebnisse Reinigung des CzcA-LacZ-Fusionsprotein über Gefiltration an Sepharose S-300 und Affinitätschromatographie anaptg Gelpermeationschromatographie an Sephacryl S Substrataffinitätschromatographie an APTG Chromatographie an Hydroxylapatit, Nickel-Chelat-Sepharose und Superose 6HR Chromatographie an Hydroxylapatit Chromatographie an Nickel-Chelat-Sepharose Gelpermeationschromatographie an Superose 6HR Klonierung von czca bzw. czca-fragmenten in unterschiedliche Expressionsvektoren Überexpression des CzcA-Proteins und dessen Nachweis mittels Westernblot Reinigung des CzcA-Strep-tag-Fusionsprotein Das CzcA-Strep-tag-Fusionsprotein wurde geblottet und die Aminosäuresequenz N-terminal bestimmt 47

3 III 3.6 Das CzcA-Strep-tag-Fusionsprotein diente der Generierung von Antikörpern Das native CzcA-Protein aus Ralstonia spec. CH34 wird mittels des CzcA- Antikörpers detektiert Rekonstitutionsexperimente Herstellung von Proteoliposomen Bestimmung der Liposomen und Proteoliposomen Durchmesser mittels Photonen Korrelations Spectroskopie Aufnahmemessung mit radioaktiven Metallen 51 4 Diskussion 59 5 Zusammenfassung 76 6 Literaturverzeichnis 77

4 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen IV Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen A aa Abb. Amp APS Arg Asn Asp ATP ATPase bidest. bp C CDF Cys Da DMF DMSO DNA DNase dntp E.coli EDTA G Gln Glu h His HMW IPTG Km kv LB M MFP mg MIC min ml MW N NADH OD ONPG PAA PAGE PCR PEG PMSF Adenin Aminosäure Abbildung Ampicillin Ammoniumpersulfat Arginin Asparagin Asparaginsäure Adenosintriphosphat Adenosintriphosphatase doppelt destilliert Basenpaare Cytosin cation diffusion facilitator protein Cystein Dalton Dimethylformamid Dimethylsulfoxid Dexoxyribonukleinsäure Dexoxyribonuklease Desoxynukleotid-5 -triphosphat Escherichia coli Ethylendiamintetraacetat Guanin Glutamin Glutaminsäure Stunde Histidin high-molecular-weight marker Isopropyl-β-D-thiogalactosid Kanamycin Kilovolt Luria-Bertani-Medium Molarität membran fusion protein Milligramm Minimale Inhibitor-Konzentration Minute Milliliter Molekulargewicht Normalität Nicotinamidadenindinucleotid (reduziert) Optische Dichte o-nitrophenylgalactopyranosid Poyacrylamid Polyacrylamidgelelektrophores Polymerasekettenreaktion Polyethylenglycol Phenylmethylsulfonylfluorid

5 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen V psi pounds per square inch PVDF Polyvinylidendifluorid RND resistance nodulation cell division rpm Umdrehungen pro Minute RT Raumtemperatur s. siehe S. aureus Staphylococcus aureus S. cerivisae Saccharomyces cerevisiae SDS Natriumdodecylsulfat sec. Sekunde t Zeit T Thymin TAE Tris-Hydroxymethylaminomethan / Acetat / Ethylendiamintetraacetat TE Tris-Hydroxymethylaminomethan / Ethylendiamintetraacetat TBE Tris-Hydroxymethylaminomethan / Borat / Ethylendiamintetraacetat TCA Trichloressigsäure TEMED N,N,N,N -Tetramethylendiamin Tet Tetracyclin Tris Tris-Hydroxymethylaminomethan U Units UV ultraviolet Vol. Volumen v/v Volumen pro Volumen w/v Masse pro Volumen VIS visible X-Gal 5-chloro-4-bromo-3-indolyl-β-galactopyranosid x g -fache Erdbeschleunigung % C Gewichtsprozente (w/w) N,N-Methylenbisacrylamid an % T % T Gewichtsprozente (w/v) Acrylamid und N,N-Methylenbisacrylamid an der Lösung