Zur Rolle des RNA-Polymerase-II Elongators aus Saccharomyces cerevisiae für die Wirkung des Kluyveromyces lactis Toxins.

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1 Zur Rolle des RNA-Polymerase-II Elongators aus Saccharomyces cerevisiae für die Wirkung des Kluyveromyces lactis Toxins Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Herrn Dipl.-Biol. Frank Frohloff geb. am in Berlin Gutachterin bzw. Gutachter: 1. Prof. Dr. M. Bölker, Philipps-Universität Marburg 2. PD. Dr. habil. R. Schaffrath, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Halle (Saale), den urn:nbn:de:gbv: [

2 Seite I Veröffentlichungen 1 II Kongresse 1 III Abstracts 2 IV Poster 2 1 Einführung Einleitung Lineare Plasmide in Hefen Genomorganisation der K. lactis Killerplasmide Replikation der K. lactis Killerplasmide k1 und k Genexpression der K. lactis Killerplasmide k1 und k Das k1 Killerplasmid kodierte Zymocin Der Zymocin vermittelte Zellzyklusarrest Zymocin-Bindung und γ-toxintranslokation in die Zielzelle Immunität & Resistenz gegen das K. lactis Zymocin Zielstellung der Promotionsarbeit 16 2 Material & Methoden Material Bezugsquellen Chemikalien Verbrauchsmaterialien Geräte Puffer Kits Proteine Protein-Marker Enzyme Antikörper Nukleinsäuren Genbank DNA-Marker Vektoren & Plasmide Oligonukleotide Primer Kulturmedien & Kulturplatten E. coli Wachstumsmedien Hefe Wachstumsmedien Mikroorganismen Bakterienstämme Hefestämme Kluyveromyces lactis Stämme Saccharomyces cerevisiae Stämme Methoden Wachstum der Bakterien Anlegen von Bakterien-Dauerkulturen Bakterien-Transformation durch Elektroporation Wachstum der Hefezellen (S. cerevisiae) 31 I

3 Anlegen von Hefe-Dauerkulturen Hefe-Transformation durch Lithium-Acetat Hefe-Transformation durch Elektroporation Phänotypische Analysen Killertoxin-Eklipse-Assay Endotoxin-Assay Weitere Phänotypische Analysen β-galaktosidase exprimierenden Hefen = LacZ-Assay Kreuzen der Hefezellen DNA-Methoden Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Isolierung Chromosomaler DNA aus Hefezellen Reinigung & Konzentrierung von Nukleinsäuren Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (PCA) Extraktion Ethanol-Präzipitierung Konzentrationsbestimmung mit dem Spektralphotometer Analytische & präparative Gelelktrophorese von DNA Enzymatische Reaktionen an der DNA Restriktionsverdau von DNA Klonierung von DNA Dephosphorylierung von DNA Ligation von DNA TOPO TM TA Cloning Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Primer PCR zur Amplifizierung eines ORFs aus dem Hefegenom Anfügen von Adenin am 3 -Ende eines linearen DNA-Stranges PCR vermittelte Gendisruption in Hefezellen Lokalisation der mtn3 Insertion im Hefegenom Ligierung der Anchor-Bubble Primer Die Vektorette PCR an der Hefe DNA Sequenzierung mit dem ABI Analyse & Vergleich der Sequenzdaten Protein-Methoden Protein-Extraktion aus Hefezellen Proteinbestimmung nach Bradford Elektrophoretische Auftrennung von Proteinen (SDS-Page) Immunologischer Nachweis von Proteinen (Western-Blot) In vivo Epitop-Tagging der Hefezellen Co-Immunpräzipitation Kopplung der Antikörper an die Protein A-Sepharose (PAS) Co-Immunpäzipitation der Proteinextrakte Immunlokalisation von Proteinen in der Hefezelle 44 3 Ergebnisse Identifizierung der TOT Gene durch mtn3-mutagenese Lokalisierung der mtn3 Insertion im Hefegenom Analyse der tot1-5 Phänotypen Disruption der TOT6/ELP6 und TOT7/ELP4 Gene Analyse der tot6 /elp6 und tot7 /elp4 Phänotypen Homologe Totp Proteine 59 II

4 3.5 Überexpression der TOT Gene Phänotypische Analyse erhöhter TOT4 Gendosis Die HAT-Aktivität des Tot3p Proteins Einfluß der HAT-Aktivität von Tot3p auf die tot-phänotypen N-terminale Histon H3 und H4 Mutationen Nachweis der Totp Proteine Immunlokalisation der Totp Proteine in der Hefezelle Co-Immunpräzipitation der Totp Proteine Die Interaktion der Totp Proteine im Elongator-Komplex Die Deletion von TOT1 und TOT Die Deletion von TOT Die Deletion & erhöhte TOT4 Gendosis beim Elongatoraufbau Die Deletion von TOT1, TOT2, TOT3, TOT6 und TOT C-Terminale Verkürzungen von TOT C-Terminale Verkürzungen von TOT Diskussion Identifikation der TOT Gene & Analyse der Phänotypen Disruption der TOT6 und TOT7 Gene Homologe Totp Proteine in anderen Organismen Die Histonacetyltransferasen (HATs) der Hefezelle Die HAT-Aktivität von Tot3p N-terminale Histon H3 und H4 Mutationen Erhöhte Gendosis der TOT Gene Nachweis und Co-Immunpräzipitation der Totp Proteine Immunlokalisation der Tot1-4p Proteine in der Hefezelle Die Interaktion der Tot1p-6p Proteine im Elongator-Komplex Das Elongator-Modell Das Arbeitsmodell der Zymocin-Wirkung Zusammenfassung Anhang Alignments der Totp Proteine & TOT Daten Tot1p Alignment & TOT1 Daten Tot2p Alignment & TOT2 Daten Tot3p Alignment & TOT3 Daten Tot4p Alignment & TOT4 Daten Tot5p Alignment & TOT5 Daten TOT6 Daten Tot7p Alignment & TOT7 Daten Abkürzungen Buchstaben-Codes der Aminosäuren Abkürzungen der Basen-Wobbles Literatur Danksagung Curriculum Vitae Erklärung 140 III

5 Veröffentlichungen I Veröffentlichungen Frohloff F, Fichtner L, Jablonowski D, Breunig KD and Schaffrath R (2001): Saccharomyces cerevisiae Elongator mutations confer resistance to the Kluyveromyces lactis zymocin. EMBO J 20: Jablonowski D, Frohloff F, Fichtner L, Stark MJR and Schaffrath R (2001b): Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol 42: Fichtner L, Frohloff F, Bürkner K, Larsen M, Breunig KD and Schaffrath R (2002a): Molecular analysis of KTI12/TOT4, a Saccharomyces cerevisiae gene required for Kluyveromyces lactis zymocin action. Mol Microbiol 43: Fichtner L, Frohloff F, Jablonowski D, Stark MJR and Schaffrath R (2002b): Protein interactions within Saccharomyces cerevisiae Elongator, a complex essential for Kluyveromyces lactis zymocicity. Mol Microbiol 45: Frohloff F, Jablonowski D, Fichtner L, Schaffrath R (2003): Subunit Communications Crucial for the Functional Integrity of the Yeast RNA Polymerase II Elongator (gamma -Toxin Target (TOT)) Complex. J Biol Chem 10: 278(2): Fichtner L, Jablonowski D, Frohloff F and Schaffrath R: Phenotypic Analysis of the Kluyveromyces lactis Killer Phenomenon. Chapter 28, in Non-Conventional Yeast in Genetics, Biochemistry and Biotechnology: Practical Protocols. K Wolf, K Breunig, G Barth eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 2003 Jablonowski D, Fichtner L, Frohloff F and Schaffrath R: Chitin-Binding Capability of the Zymocin Complex from Kluyveromyces lactis. Chapter 30, in Non-Conventional Yeast in Genetics, Biochemistry and Biotechnology: Practical Protocols. K Wolf; K Breunig, G Barth eds., Springer Lab Manual, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 2003 II Kongresse An folgenden Kongressen wurden während dieser Studie teilgenommen: Cell Cycle Genetics. Gesellschaft für Genetik, GfG-Workshop, Leucorea-Stiftung, Lutherstadt Wittenberg April 2000 Gene Transcription in Yeast. Euroconference on Signal Transduction, Transcriptional Regulation and Chromatin Structure. Euresco Conference of the European Science Foundation. Albufeira, Portugal, June Gene, Chromosomes, Genomes. Anual Meeting of the German Genetics Society (GfG). Martin-Luther-Universität Halle October

6 Veröffentlichungen III Abstracts Frohloff F, Fichtner L, Jablonowski D, Breunig K D and Schaffrath R: The Cell Cycle Toxin from Kluyveromyces lactis. Gesellschaft für Genetik, GfG-Workshop Cell Cycle Genetics. Leucorea-Stiftung, Lutherstadt Wittenberg, Germany April 2000 Frohloff F, Fichtner L, Jablonowski D, Breunig KD and Schaffrath R: Yeast Elongator-Associated RNA Polymerase II: the Kluyveromyces lactis Toxin-Target? Euresco Conference of the European Science Foundation. Albufeira, Portugal, June Jablonowski D, Frohloff F, Fichtner L, Breunig KD and Schaffrath R: The Kluyveromyces lactis Zymocin Mode of Action Pathway. International Symposium on Yeast 2000, Papendal, Arnhem, Netherlands, 27. August 01. September Jablonowski D, Fichtner L, Frohloff F and Schaffrath R: Kluyveromyces lactis Zymocin Action is linked to RNA Polymerase II Function Via Elongator. Anual Meeting of the German Genetics Society (GfG). Martin-Luther-Universität Halle October 2001 IV Poster Frohloff F, Fichtner L, Jablonowski D, Breunig KD and Schaffrath R: Yeast Elongator-Associated RNA Polymerase II: the Kluyveromyces lactis Toxin-Target? Fichtner L, Frohloff F, Jablonowski D, Breunig KD, Schaffrath R: The Kluyveromyces lactis Zymocin Mode of Action. International Symposium on Yeast 2000, Papendal, Arnhem, Netherlands, 27. August 01. September Fichtner L, Frohloff F, Jablonowski D and Schaffrath R: Kluyveromyces lactis Zymocin Action is linked to RNA Polymerase II Function Via Elongator. Jablonowski D, Fichtner L, Frohloff F and Schaffrath R: Kluyveromyces lactis Zymocin may Target RNA Polymerase II of Saccharomyces cerevisiae Via Elongator. 2