Molekulare Mechanismen der primären Umhüllung von Herpesviren

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1 Molekulare Mechanismen der primären Umhüllung von Herpesviren I N A U G U R A L D I S S E R T A T I O N zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald vorgelegt von Franziska Schuster geboren am in Neubrandenburg

2 Dekan: Prof. Dr. Klaus Fesser 1. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Thomas C. Mettenleiter 2. Gutachter: PD Dr. Susanne Bailer Tag der Promotion: II

3 Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht: Schuster F, Klupp BG, Granzow H, Mettenleiter TC Structural determinants for nuclear envelope localization and function of pseudorabies virus pul34. J. Virol. 86: III

4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Taxonomie und Nomenklatur der Herpesviren Aufbau der Herpesviren Genom und Genomorganisation Morphologie Das Kapsid Das Tegument Die Virushülle Replikationszyklus Adsorption Penetration Transport der Nukleokapside zum Zellkern Virale Genexpression und DNA-Replikation Morphogenese der Kapside und Verpackung der DNA Primäre Umhüllung und Freisetzung aus dem Kern Rolle zellulärer Proteine bei der Freisetzung aus dem Zellkern Tegumentierung, sekundäre Umhüllung und Freisetzung Ausbreitung von Zelle zu Zelle (cell-to-cell spread) Neurotropismus und Latenz Das Pseudorabies Virus Pathogenese Vakzinierung Aufbau und Dynamik der Kernmembran Im Rahmen der Arbeit untersuchte Genprodukte pul Kapsidproteine p97/vcp Zielstellung der Arbeit 30 IV

5 2 Material und Methoden Material Permanente Zelllinien Viren Bakterien Vektoren Enzyme Antiseren Größenstandards Primer Oligonukleotide und sirnas Kommerzielle Kits und Reagenzien Chemikalien Feststoffe Flüssigkeiten Lösungen Medien Lösungen und Puffer Verbrauchsmaterialien Geräte EDV Methoden Arbeiten mit Zellkultur Umsetzen von Zellen Transfektion von Zellen Konservierung von Zelllinien Arbeiten mit Viren Pseudorabies Viren Baculoviren Arbeiten mit Bakterien 58 V

6 Kultivierung von Bakterien Transformation kompetenter Bakterien Arbeiten mit DNA Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien Isolierung viraler DNA PCR Bestimmung der DNA-Konzentration Spaltung von DNA durch Endonukleasen Klenow Behandlung von überhängenden Enden Behandlung mit alkalischer Phosphatase Ligation Elektrophoretische Trennung von DNA Extraktion von DNA aus Agarosegelen Sequenzierung von DNA Arbeiten mit RNA Klonierung von Oligonukleotiden zur Synthese von shrna Design von sirna Arbeiten mit Proteinen Herstellung von Zelllysaten Fixierung von Zellen Indirekter Immunfluoreszenztest Konfokale Laserscanmikroskopie SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Identifizierung von Proteinen über Massenspektrometrie 71 3 Ergebnisse Studien zu funktionellen Domänen des UL34 Proteins Herstellung der UL34-Chimären Generierung der chimären Gene durch Fusions-PCR Klonierung der chimären Gene in den Expressionsvektor pcdna Generierung stabil exprimierender Zelllinien und Überprüfung der Expression Charakterisierung der chimären Proteine Intrazelluläre Lokalisierung der chimären Proteine 79 VI

7 Kolokalisierung der chimären Proteine mit pul Komplementierung von PrV- UL34 durch die pul34-chimären Plaquebildung von PrV- UL34 auf den exprimierenden Zelllinien Ultrastrukturelle Analysen der PrV-ΔUL34 infizierten Zelllinien Expression der PrV Kapsidproteine durch Baculovirusvektoren Herstellung der rekombinanten Baculoviren Überprüfung der Expression nach Transduktion Charakterisierung der Kapsidproteine Lokalisierung der Kapsidproteine in der Zelle nach Einzel-Transduktion Lokalisierung der Kapsidproteine in der Zelle nach Kotransduktion Diskussion Analysen zu funktionellen Domänen des UL34 Proteins pul34-lbrtm, pul34-emdtm und pul34-laptm pul34-lapct pul34-lapct pul34-lapnt Untersuchungen zu Expression und Kapsidmorphogenese durch rekombinante Baculoviren auf Säugerzellen Lokalisierung der Kapsidproteine nach Einzel- und Kotransduktion auf Säugerzellen Kapsidbildung nach Kotransduktion auf Säugerzellen Bedeutung von p97 bei der Replikation von PrV Zusammenfassung Abkürzungsverzeichnis Literatur Eidesstattliche Erklärung Lebenslauf 178 VII

8 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Taxonomie und Nomenklatur der Herpesviren Herpesviren gehören hinsichtlich ihrer Größe und Struktur mit zu den komplexesten Viren. Sie sind durch ein großes doppelsträngiges DNA Genom, das für mehr als 70 Proteine kodiert, gekennzeichnet. Die Herpesviren, von denen bereits mehr als 200 verschiedene Spezies beschrieben wurden, sind weltweit verbreitet und in der Lage sowohl in Vertebraten als auch Invertebraten erfolgreich zu replizieren. Dabei fällt ein Charakteristikum besonders auf: alle Herpesviren können ihren Wirt latent infizieren, so dass dieser nach einer erfolgreichen Primärinfektion lebenslang Träger des Virus bleibt (Pellett und Roizman, 2007). Die Ordnung der Herpesvirales wird aufgrund ihrer genetischen Unterschiede in drei Familien unterteilt. Die Familie der Herpesviridae umfasst alle Herpesviren, die in der Lage sind, Säugetiere, Reptilien und Vögel zu infizieren. Die Alloherpesviridae nutzen Fische, Frösche und Amphibien als Wirte. Hier spielt vor allem das Koi-Herpesvirus (CyHV-3) des Genus Ictalurivirus eine bedeutende Rolle. Die dritte Familie in der Ordnung der Herpesvirales bilden die Malacoherpesviridae. Hier ist als bisher einziger Vertreter im Genus Ostreavirus das Virus der pazifischen Auster zu nennen (Davison et al., 2009). Die Familie der Herpesviridae besteht aus drei Unterfamilien in die die Viren unter anderem nach ihrer Wirtsspezifität, Genomorganisation und ihren biologischen Eigenschaften eingeteilt werden (Roizmann et al., 1992). Die Alphaherpesvirinae zeichnen sich durch eine sehr schnelle Replikation und ein breites Wirtsspektrum aus. Viren dieser Unterfamilie sind in der Lage, eine latente Infektion in den sensorischen Ganglien des Wirts zu etablieren. Für den Menschen bedeutsame Viren sind die humanen Herpes-Simplex-Viren des Typs 1 und 2 (HSV-1, HSV-2), die zum Genus Simplexvirus gehören sowie das Varizella-Zoster-Virus (VZV) aus dem Genus Varicellovirus. Wichtige tierpathogene Erreger, die in der Landwirtschaft bedeutsam sind, sind das Virus der Marek schen Krankheit aus dem Genus Mardivirus, sowie Viren des Genus Iltovirus, dem das Virus der infektiösen Laryngotracheitis (ILTV) zuzuordnen ist (Minson et al., 2000; Roizmann und Pellett, 2001). In dem Genus Varicellovirus sind das Pseudorabies Virus (PrV oder SuHV-1), die bovinen Herpesviren 1 und 5 (BHV-1, BHV-5), und die equinen Herpesviren 1 und 4 (EHV-1, EHV-4; Roizmann et al., 1992) zu nennen. 1

9 Einleitung Die Betaherpesvirinae sind im Gegensatz zu den Alphaherpesvirinae durch einen langsameren Replikationszyklus gekennzeichnet. Infektionen können oft mit der Verschmelzung von Zellen zu mehrkernigen Riesenzellen (Cytomegalie) einhergehen. Ein weiteres Charakteristikum der Betaherpesvirinae ist die enge Wirtsspezifität sowie deren Fähigkeit, latente Infektionen in Geweben und verschiedenen Organen, wie Nieren oder sensorischen Drüsen, zu etablieren. Als wichtige Vertreter dieser Unterfamilie sind unter anderem die humanen Herpesviren 6 und 7 (HHV-6, HHV-7) des Genus Roseolovirus sowie das humane Cytomegalievirus (HCMV) des Genus Cytomegalovirus zu nennen. Das endothelitrope Virus des Elefanten (Genus Proboscivirus) kann gerade bei jungen oder schwachen Tieren letale Folgen haben. Charakteristisch für die Gammaherpesviren sind das enge Wirtsspektrum und deren Fähigkeit, fast ausschließlich B- und T-Lymphozyten produktiv zu infizieren. Dementsprechend etablieren sie eine latente Infektion in lymphoiden Organen. Nicht selten sind Infektionen mit der Ausbildung maligner Tumore wie Lymphomen assoziiert. Als wichtiges Genus ist das Lymphocryptovirus zu nennen zu dem das Virus der infektiösen Mononukleose des Menschen (Epstein-Barr-Virus, EBV) gehört. Das Kaposi-Sarkom-assoziierte-Herpesvirus (KSHV; HHV-8) sowie das bovine Herpesvirus 4 (BHV-4) repräsentieren das Genus Rhadinovius. Weitere Genera stellen die Macaviren und die Percaviren dar, in die die suiden Herpesviren 3, 4, und 5 (SuHV-3, SuHV-4, SuHV-5) sowie die equinen Herpesviren 2 und 5 (EHV-2, EHV- 5) taxonomisch einzuordnen sind. 2

10 Einleitung Abb. 1.1: Stammbaum der Ordnung der Herpesvirales. Die Ordnung Herpesvirales wird in die Familien Herpesviridae (1), Alloherpesviridae (2) und Malacoherpesviridae (3) unterteilt. Die Herpesviridae werden wiederum in die Unterfamilien Alphaherpesvirinae ( ), Betaherpesvirinae ( ) und Gammaherpesvirinae ( ) klassifiziert. Die Unterfamilien werden in verschiedene Genera aufgeteilt. Die Alphaherpesvirinae sind in die Genera Simplexvirus ( 1), Varicellovirus ( 2), Mardivirus ( 3) und Iltovirus ( 4) untergliedert, den Betaherpesvirinae sind die Genera Cytomegalovirus, Muromegalovirus ( 1), Roseolovirus ( 2) und Probiscivirus (nicht dargestellt) zugeordnet. Zu den Gammaherpesviren zählen die Genera Lymphocryptovirus ( 1), Rhadinovirus ( 2), Macavirus und Percavirus (nicht dargestellt). Ausgesuchte Spezies sind an den Enden des Stammbaums bezeichnet. Das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Pseudorabies Virus ist in der Familie der Herpesviridae (1), Unterfamilie der Alphaherpesvirinae ( ) im Genus Varicellovirus taxonomisch eingeordnet. (Schema nach Davison, 2002, S. 72, Elsevier Science B.V., confirmation number: ) 1.2 Aufbau der Herpesviren Genom und Genomorganisation Die Genome der Alphaherpesvirinae sind durch Bereiche, die einmalig im Genom vorkommen (unique) sowie durch Wiederholungen in einzelnen Regionen (repeats) charakterisiert. Da die Anordnung dieser Sequenzmuster in den einzelnen Spezies variiert, werden Genome der Herpesviren je nach Organisation dieser repeat und 3

11 Einleitung unique Sequenzen in die sechs verschiedenen Klassen A bis F eingeteilt (Roizman und Pellet, 2001). Das Genom des Pseudorabies Virus gehört in die Klasse D und ist durch zwei unique Sequenzen gekennzeichnet, die aufgrund ihrer Länge als unique short (U S ) und unique long (U L ) bezeichnet werden. Dabei wird nur die U S Region von internen und terminalen Wiederholungssequenzen flankiert (IRS, TRS; Ben- Porat und Kaplan, 1985). Die Bezeichnung der einzelnen Gene bei HSV erfolgt nach ihrer Lokalisation in der U S bzw. U L Region und wurde entsprechend für PrV übernommen. Das Genom des PrV umfasst etwa 143 Kilobasenpaare (kbp) und kodiert für 72 Gene (Klupp et al., 2004). Des Weiteren beinhaltet es im Vergleich zum HSV Genom eine große interne Inversion in der unique long Region, welche die Gene UL46 bis UL26.5 umfasst (Ben-Porat et al., 1983; Bras et al., 1999; Klupp et al., 2004). Im Genom befinden sich drei Startpunkte für die Replikation (origin of replication, ori), wobei sich einer in der unique long Region (OriL) befindet und zwei Kopien in den inverted repeats (OriS) lokalisiert sind (Fuchs et al., 2000; Wu et al., 1986). Abb. 1.2: Schema der Genomorganisation des PrV. Das Genom besteht aus einer langen Region (unique long, U L ) und einer kurzen Region (unique short, U S ). Die unique short Region wird von Sequenzwiederholungen (IR: internal repeat; TR: terminal repeat) flankiert. Durch Pfeilspitzen sind schematisch die Replikationsstartpunkte (ori) im Genom gekennzeichnet (Schema modifiziert nach Mettenleiter, 2000, S. 102) Morphologie In elektronenmikroskopischen Darstellungen sind die vier verschiedenen Komponenten, aus denen sich die Herpesviruspartikel zusammensetzen, deutlich erkennbar (siehe Abb. 1.3). Das Genom liegt als doppelsträngige DNA vor und bildet so einen elektronendichten Kern, welcher auch als Core bezeichnet wird (Furlong et al., 1972; Minson et al., 2000). Umschlossen wird dieser von einem ikosaedrischen Proteingerüst, dem Kapsid. Die Grundstruktur des Kapsids wird durch das 4

12 Einleitung Hauptkapsidprotein in 11 Pentonen (Ecken) und 150 Hexonen (Flächen) gebildet (Schrag et al., 1989). Dabei ist eine der Ecken des Ikosaeders durch das ringförmig angeordnete Portalprotein ausgestattet, durch das während der Reifung des Kapsids die virale DNA geschleust wird (Albright et al., 2011; Nellissery et al., 2007). Außerhalb des Kapsids befindet sich eine proteinreiche Matrix, das Tegument. Dieses wird aufgrund der Lokalisierung in eine innere und äußere Tegumentschicht eingeteilt. Dabei werden die Proteine, welche eng mit dem Kapsid assoziieren, als innere Tegumentproteine bezeichnet, während die Proteine der äußeren Tegumentschicht mit der Hüllmembran bzw. den darin eingelagerten viralen Glykoproteinen interagieren (Mettenleiter et al., 2006). Umschlossen wird das Virus schließlich von einer Lipidmembran. Sie stammt aus der Wirtszelle und hat in den Trans-Golgi-Netzwerk-Vesikeln ihren Ursprung (Gershon et al., 1994; Granzow et al., 2001; Turcotte et al., 2005; Whealy et al., 1991; Zhu et al., 1995). In die Hüllmembran sind virale, zum größten Teil glykosylierte Proteine eingelagert (Ginsberg 1988). Abb. 1.3: Morphologie der Herpesviren am Beispiel des Pseudorabies Virus. Der Aufbau des Virus ist im Ultradünnschnitt (rechts), sowie in einem vereinfachten Schema (links) dargestellt. Der elektronendichte Kern, sowie das Kapsid, das Tegument und die Hülle sind markiert. In der schematischen Darstellung sind ebenfalls virale Glykoproteine der Hüllmembran angedeutet. Elektronenmikroskopische Aufnahme von Dr. habil. H. Granzow, FLI, Insel Riems. Im Folgenden werden die Proteine der einzelnen Viruskomponenten detaillierter beschrieben, wobei vorwiegend auf die Untersuchungen zu HSV bzw. PrV 5

13 Einleitung eingegangen und auch die dort übliche Gen- bzw. Proteinbezeichnung verwendet wird Das Kapsid Die Kapside der Herpesviren haben einen Durchmesser von etwa 125 nm und bestehen aus fünf verschiedenen Proteinen (Roizman und Pellet, 2001). Das Hauptkapsidprotein bildet die 161 Kapsomere mit 150 Hexonen, welche aus 6 Kopien, sowie 11 Pentonen, die aus je 5 Kopien von pul19 bestehen. In der ikosaedrischen Struktur des Kapsids bilden die Hexone die Flächen und Kanten während die Ecken durch die Pentone geformt werden. Auf den Hexonen ist das pul19 mit dem kleinen Kapsidprotein pul35 assoziiert (Trus et al., 1995). Die Hexone und Pentone werden durch einen heterotrimeren Komplex aus den Triplexproteinen pul18 und pul38 verbunden, wobei ein Komplex aus einem Molekül des pul38 und zwei Molekülen des pul18 besteht (Newcomb et al., 1993; Trus et al., 1996; Zhou et al., 2000). Ein Penton des Kapsids ist durch einen ringförmigen Kanal ersetzt, der durch zwölf Moleküle des Portalproteins pul6 gebildet wird (Newcomb et al., 2001; Trus et al., 2004). Die Moleküle werden über Disulfidbrücken zusammengehalten (Albright et al., 2011), wobei der ringförmige Komplex der Ausschleusung des Gerüstproteins sowie der Verpackung des viralen Genoms in das Kapsid dient Das Tegument Die proteinreiche Matrix, die sich zwischen dem Kapsid und der Hüllmembran befindet und bei den Herpesviren als Tegument bezeichnet wird, erfüllt unterschiedliche Funktionen während der Infektion und der Virusmorphogenese. Das zunächst als amorphe Proteinschicht beschriebene Tegument erscheint als komplexes Protein-Protein-Netzwerk, das in zumindest zwei Schichten, eine innere, kapsidnahe und eine äußere, membranassoziierte Fraktion eingeteilt werden kann (Mettenleiter et al., 2009). Das alphaherpesvirusspezifische Tegumentprotein pul48 hat eine transkriptionsaktivierende Funktion beim Eintritt der Virionen in die Zelle und induziert die immediate early Transkripte (Batterson und Roizman, 1983; Campbell et al., 1984; 6

14 Einleitung Fuchs et al., 2002a; Misra et al., 1994; Moriuchi et al., 1993). Bei der Reifung der Virionen im Zytoplasma spielt das pul48 ebenfalls eine wichtige Rolle. Durch Interaktionen mit anderen Tegumentproteinen verbindet es vermutlich das innere und äußere Tegument (Kelly et al., 2009; Mettenleiter et al., 2009). Dennoch ist pul48 für die Replikation von PrV, MDV und VZV nicht essentiell (Cohen und Seidel, 1994; Dorange et al., 2002; Fuchs et al., 2003). Für die Varicelloviren BHV-1 und PrV konnte gezeigt werden, dass pul48 mit pul3.5 einen funktionellen Komplex bildet, der an der sekundären Umhüllung der Kapside beteiligt ist (Fuchs et al., 2007; Lam und Letchworth, 2000). Auch eine PrV Mutante, der gleichzeitig die Tegumentproteine pul49, pul48, pul47 und pul46 fehlen, ist noch, wenn auch eingeschränkt, replikationsfähig (Fuchs et al., 2003). Ein weiteres Tegumentprotein ist pul41, welches während des Replikationszyklus als virion host shutoff (vhs) Protein fungiert (Berthomme et al., 1993). Dabei agiert es als mrna-spezifische RNase und führt zur Degradation zellulärer und auch viraler mrna (Kwong und Frenkel, 1989; Kwong et al., 1988; Schek und Bachenheimer, 1985). Durch die Bindung von pul48 an pul41 wird schließlich dessen Funktion inhibiert und es kommt zur Akkumulation viraler mrnas in der Zelle (Schek und Bachenheimer, 1985; Smibert et al., 1994). Bei PrV und HSV ist pul41 bei der Replikation in Zellkultur nicht essentiell (Fenwick and Everett, 1990; Lin et al., 2010) Proteine des inneren Teguments, zu denen pul36, pul37 und pus3 gerechnet werden, sind eng mit dem Kapsid assoziiert (Granzow et al., 2005; Zhou et al., 1999). Eine besondere Rolle spielt das große Tegumentprotein pul36, das mit einer Masse von mehr als 300 kda das größte herpesvirale Protein darstellt. Dabei ist es das einzige essentielle Tegumentprotein bei PrV (Fuchs et al., 2004). pul37 vermittelt bei der Virusreifung den Kontakt der Nukleokapside zum Trans-Golgi-Netzwerk, wo diese schließlich sekundär behüllt werden (Pasdeloup et al., 2010). Bei pus3 handelt es sich um eine Serin/Threonin Kinase, die nur bei den Alphaherpesviren konserviert ist (Frame et al., 1987; McGeoch und Davison, 1986). Obwohl pus3 für die Replikation als nicht essentiell beschrieben wurde, spielt es eine wichtige Rolle bei der Freisetzung reifer Kapside aus dem Kernspalt (Klupp et al., 2001; Reynolds et al., 2002; Wagenaar et al., 1995). Drei weitere Tegumentproteine, pul11, pul16 und pul21, bilden wahrscheinlich einen tripartiten Komplex, in dem pul11 mit pul16 interagiert und pul16 wiederum mit pul21 komplexiert (Klupp et al., 2005a; Loomis et al., 2003; Yeh et al., 2008). 7

15 Einleitung Das membranassoziierte pul11 scheint dabei eine Rolle bei der Reifung der Virionen im Zytoplasma zu spielen (Kopp et al., 2003; Leege et al., 2009), wobei alle drei Proteine dieses Komplexes zwar bei den Herpesviren konserviert, aber für die Virionmorphogenese nicht essentiell sind (Baines und Roizman, 1991; 1992; Klupp et al., 2005a; Kopp et al., 2003). Die Funktionen von pul16 und pul21, deren Bindedomänen für die Komplexierung im HSV-1 gut untersucht sind (Harper et al., 2010; Meckes et al., 2010), sind noch ungeklärt, wobei auch ihnen eine Rolle bei der Virusreifung zugeschrieben wird (de Wind et al., 1992; Meckes und Wills, 2007; Oshima et al., 1998; Wagenaar et al., 2001). Während der Virusreifung werden auch zelluläre Proteine in das Tegument verpackt. Es konnten durch zahlreiche Analysen sowohl Zytoskelettproteine (Aktin, Myosin, Tubulin und Kofilin) als auch verschiedene Hitzeschockproteine (Hsp70 und Hsp90) und Clathrin als Bestandteile des Teguments in verschiedenen Herpesviren identifiziert werden (Bechtel et al., 2005; del Rio et al. 2005; Johannsen et al., 2004; Kattenhorn et al., 2004; Loret et al., 2008; Michael et al., 2006; Varnum et al., 2004) Die Virushülle Für Herpesviren sind zwölf glykosylierte Proteine (gb, gc, gd, ge, gg, gh, gi, gj, gk, gl, gm, gn) beschrieben, die in die Hüllmembran des Virus eingelagert werden. Die nicht glykosylierten Proteine pul20, pul43, und pus9 wurden ebenfalls in der Virushülle nachgewiesen (Brideau et al., 1998; Carter et al., 1996; Fuchs et al., 1997; Klupp et al., 2004; 2005c; Kramer et al., 2011; Ward et al., 1994). Viele der Hüll- Glykoproteine liegen als Komplexe vor. Neben den Heterodimeren ge/gi, gh/gl und gm/gn, liegt gb vermutlich als Trimer und gd als Homodimer vor (Heldwein et al., 2006; Hutchinson et al., 1992; Jöns et al., 1998; Johnson et al., 1988; Krummenacher et al., 2005; Lake et al., 1998; Mach et al., 2000; Yaswen et al., 1993; Zuckermann et al., 1988). Trotz der Vielzahl dieser Proteine konnte dennoch eine regelmäßige Anordnung der verschiedenen Proteine in der Virushülle nachgewiesen werden (Grünewald et al., 2003; Mettenleiter, 2000). Die Proteine der Hüllmembran spielen vorrangig beim Eindringen des Virus in die Wirtszelle eine Rolle. Da die Glykoproteine auf der Virushülle und auf der Oberfläche infizierter Zellen lokalisiert sind, spielen sie auch eine zentrale Rolle bei der Immunantwort der 8

16 Einleitung Zelle (Mettenleiter, 1996). Für die Adsorption und Penetration sind die Glykoproteine gc, das den ersten Kontakt zwischen Virus und Wirtszelle herstellt, gd, gb, gh und gl notwendig. Die Glykoproteine ge/gi und gm/gn spielen bei der direkten Zell- Zellausbreitung und/oder bei der Virusfreisetzung eine Rolle, während über die Funktion der Hüllproteine pul20, pul43 und pus9 bisher nur wenig bekannt ist (Baines et al., 2007; Brack et al., 1999; Dingwell et al., 1994; Dingwell und Johnson, 1998; Jöns et al., 1998; Klupp et al., 2000a; Mettenleiter et al., 1987) Replikationszyklus Durch ultrastrukturelle Analysen sowie molekularbiologische Untersuchungen konnte der herpesvirale Replikationszyklus aufgeklärt (Granzow et al., 2001; Pellett und Roizman, 2007) und in verschiedene Stadien eingeteilt werden. Der Ablauf der Replikation wird hier im Einzelnen dargestellt. Abb. 1.4: Schema des Replikationszyklus am Beispiel von PrV. Grafische Darstellung der einzelnen Schritte sowie dazu gehörige elektronenmikroskopische Aufnahmen. Nach 9

17 Einleitung Adsorption (1) und Penetration (2) gelangt das Nukleokapsid in die Zelle (3). Das Kapsid und ein Teil des Teguments werden entlang der Mikrotubuli zum Zellkern transportiert (4). Durch die Kernporen wird das virale Genom aus dem Kapsid in den Zellkern entlassen (5), wo Transkription, DNA-Replikation sowie der Zusammenbau der Kapside stattfinden (6,7). Virale DNA wird anschließend in die Kapside verpackt (8) und die Nukleokapside gelangen an die innere Kernmembran (9). Dort werden sie durch primäre Umhüllung und anschließende Fusion mit der äußeren Kernmembran aus dem Zellkern entlassen (10, 11). Während der weiteren Reifung der Partikel im Zytoplasma werden die Kapside tegumentiert und durch Vesikel des Trans-Golgi-Netzwerks sekundär behüllt (12). Durch vesikulären Transport gelangen die reifen Virionen an die Zelloberfläche (13) und werden nach Fusion der Vesikelmit der Zytoplasmamembran freigesetzt (14). Abkürzungen: M (Mitochondrium), MT (Mikrotubuli), NP (nuclear pore Kernpore), N (Nukleus), NM (nuclear membrane Kernmembran), RER (raues endoplasmatisches Retikulum), TGN (Trans-Golgi-Netzwerk), G (Golgi-Apparat). Schema modifiziert nach Mettenleiter, Elektronenmikroskopische Aufnahmen: Dr. habil. H. Granzow, grafische Bearbeitung: M. Jörn, FLI, Insel Riems Adsorption Bei den Alphaherpesviren ist die erste Phase der Adsorption die Bindung des viralen gc an Heparansulfatproteoglykane (HSPG) der Zielzelle. Dieser Prozess ist reversibel und bringt das Virus auf einen Abstand von ca. 12 bis 14 nm an die Wirtszelle (Granzow et al., 1997). Die darauf folgende Interaktion von gd mit spezifischen zellulären Rezeptoren dient der Annäherung des Virus auf 6 bis 8 nm und stabilisiert die Bindung an die Wirtszelle (zusammengefasst in Spear et al., 2000). Zunächst wurde ein Protein der Tumornekrosefaktoren-Rezeptoren Superfamilie als spezifischer Rezeptor identifiziert und als Herpesvirus entry mediator (HVEM) bezeichnet (Montgomery et al., 1996). Später wurde dieser, nach Identifizierung weiterer Rezeptoren, in HveA (Herpesvirus entry protein A) umbenannt (Warner et al., 1998). Weitere zelluläre Rezeptoren werden durch die Zelladhäsionsproteine der Immunglobulin-Superfamilie vertreten, zu denen Nektin-1 (HveB) und Nektin-2 (HveC) gehören. Nektin-1 und Nektin-2 werden dabei auch von PrV genutzt (Geraghty et al., 1998; Mendelsohn et al., 1989; Warner et al., 1998). 3- OS-Heparansulfate scheinen als weitere Faktoren bei HSV-1 für den Prozess des Eindringens in die Zelle ebenfalls eine wichtige Rolle zu spielen, allerdings sind 10

18 Einleitung einige Isoformen der 3-O-Sulfotransferasen hauptsächlich im PNS und/oder ZNS lokalisiert, was eine Rolle bei der Ausbreitung im ZNS vermuten lässt (Lawrence et al., 2007; O Donnell et al., 2010; 2006; Shukla et al., 1999; Yabe et al., 2005) Penetration Für den Eintritt in die Wirtzelle muss es zur Fusion der Virusmembran mit der Zellmembran kommen, so dass das Kapsid und die Tegumentproteine in die Zelle gelangen. Dabei spielt das gd bei den Alphaherpesviren ebenfalls eine Rolle. Neben seiner Eigenschaft, zelluläre Rezeptoren zu binden, leitet es die Fusion durch eine funktionelle Domäne im C-Terminus, die als pro-fusion-domain bezeichnet wird, ein (Cocchi et al., 2004). So kommt es nach Bindung von gd an zelluläre Rezeptoren zu einer Konformationsänderung, die die pro-fusion-domain exponiert und eine Interaktion entweder mit dem gh/gl Komplex und/oder gb ermöglicht. Durch die Interaktion mit gd und/oder gh/gl werden im gb die fusion-loops exponiert, die für die Membranfusion essentiell sind (Hannah et al., 2007; 2009). Die genauen molekularen Mechanismen der herpesviralen Membranfusionsprozesse sind noch nicht vollständig aufgeklärt und Gegenstand intensiver Forschung Transport der Nukleokapside zum Zellkern Nach der Fusion gelangen sowohl das Kapsid als auch die Tegumentproteine in die Zelle. Während sich ein großer Teil des Teguments nach der Penetration vom Kapsid löst, verbleiben zumindest pul36, pul37 und pus3 als innere Tegumentschicht am Kapsid (Granzow et al., 2005; Luxton et al., 2005; Morisson et al., 1998). Der anschließende Transport des Kapsids zum Zellkern erfolgt durch Interaktion mit den Mikrotubuli (Mabit et al., 2002; Marozin et al., 2004; Sodeik et al., 1997) und ist durch die Interaktion des Dynein mit dem inneren Tegument begründet (Radtke et al., 2010; Wolfstein et al., 2006). Dennoch konnte der genaue Interaktionspartner bis jetzt nicht identifiziert werden. Es gibt allerdings auch Hinweise, dass neben den inneren Tegumentproteinen auch die Kapsidproteine selbst am Transport beteiligt sein könnten. Eine Domäne im kleinen Kapsidprotein pul35 bindet Dynein (Apcarian 11

19 Einleitung et al., 2010), allerdings werden auch Kapside pul35 negativer Virionen zum Zellkern transportiert (Antinone et al., 2006; Döhner et al., 2006). Auch das Kapsid-assoziierte pul25 scheint mit den Mikrotubuli zu interagieren (Guo et al., 2008; Kaelin et al., 2000). Nach dem Transport zum Zellkern binden die Kapside an die Kernporen und entlassen das virale Genom durch die Kernporen in den Zellkern, wobei dieses zirkularisiert und leere Kapside an den Kernporen zurückbleiben (Garber et al., 1993; Granzow et al., 1997; Strang und Stow, 2005). Für diesen Prozess notwendige zelluläre Proteine sind das Importin ß und mehrere Proteine des Kernporenkomplexes (Copeland et al., 2009; Ojala et al., 2000). Virale Proteine, die die Freisetzung der viralen DNA bewirken sind vermutlich pul36 und pul25 (Jovasevic et al., 2008; Preston et al., 2008; Rode et al., 2011) Virale Genexpression und DNA-Replikation Die Expression der viralen Gene ist kaskadenartig organisiert. Da sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Virus-Replikation gebildet werden, werden diese in sehr frühe Gene (immediate early, IE), gefolgt von frühen (early, E) und späten (late, L) Genen eingeteilt. Die Expression der sehr frühen Gene wird durch das Tegumentprotein pul48 aktiviert (Batterson und Roizman, 1983). Als sehr frühes Gen ist bei PrV das IE180 zu nennen, dessen Transkript schon etwa 30 Minuten nach Infektion in der Zelle nachweisbar ist (Feldman et al., 1979; Ihara et al., 1983). Es dient unter anderem als Transaktivator für die frühen Gene und akkumuliert im Zellkern wo es in der Lage ist, DNA zu binden (Chlan et al., 1987; Taharaguchi et al., 1995; Wu und Wilcox, 1991). Des Weiteren aktiviert es die Genexpression von US4, UL12, UL22, UL23 und UL41 (Chang et al., 2004; Ou et al., 2002; Taharaguchi et al., 1994). Einen weiteren Transaktivator stellt das early protein 0 (EP0) dar (Ono et al., 1998). Es aktiviert die Transkription anderer früher und später Gene und scheint durch seinen Einfluss auf das IE180 indirekt die Expression der sehr frühen Gene zu hemmen (Chang et al., 2004; Tombácz et al., 2012). EP0 scheint ebenfalls die Bildung sogenannter replication centers zu induzieren (Everett, 2006; Everett et al., 2010). Dabei handelt es sich um Bereiche im Zellkern, in denen die DNA-Replikation 12

20 Einleitung stattfindet. Die Größe und Menge dieser steht in direktem Zusammenhang mit der Anzahl der viralen Genome im Zellkern (Kobiler et al., 2011). Die Replikation der viralen DNA wird durch die frühen Genprodukte initiiert (Quinlan et al., 1984) und erfolgt zunächst in einem Theta-Modus der später in einen rolling-circle- Mechanismus übergeht wodurch lange, konkatemere Moleküle entstehen (Ben- Porat, 1981) Morphogenese der Kapside und Verpackung der DNA Die Morphogenese der Kapside erfolgt im Zellkern durch autokatalytische Prozesse. Die dafür notwendigen Proteine sind pul19, pul18, pul38 sowie pul26 und pul26.5. Das kleine Kapsidprotein pul35 ist bei den Alphaherpesviren nicht essentiell und befindet sich auf den Hexonen (Booy et al., 1996; Tatman et al., 1994; Thomsen et al., 1994). Im Zellkern selbst gibt es spezifische Bereiche, die als Assemblons bezeichnet werden und in denen die Morphogenese der Kapside und die DNA-Verpackung stattfinden (Ward et al., 1996). Die Bildung von Kapsiden konnte bereits im zellfreien System (Newcomb et al., 1996), als auch durch Expression der notwendigen Kapsidproteine mithilfe rekombinanter Baculoviren erreicht werden (Henson et al., 2009; Kut und Rasschaert, 2004; Perkins et al., 2008; Tatman et al., 1994). Kapside werden mit und um die Gerüststruktur aufgebaut. Diese besteht aus dem Gerüstprotein pul26.5, welches den C-terminalen Teil des pul26 darstellt und in reifen Virionen nicht nachweisbar ist. Durch das Portalprotein, welches an einer der Ecken als ringförmige Struktur vorliegt, wird das Gerüstprotein nach Spaltung durch die Protease pul26 aus dem Kapsid geschleust. Parallel dazu erfolgt die Verpackung der viralen DNA in das Kapsid. Dieser Prozess scheint ebenfalls eine Rolle bei der Stabilisierung der Kapsidstruktur zu spielen. So zeigten Untersuchungen an HSV-1, dass die Ausschleusung des Gerüsts und die Einschleusung der viralen DNA eine Verstärkung der Kapsidstruktur bewirkt (Roos et al., 2009). Die Spaltung und Verpackung der DNA in die Kapside erfolgt ATP-abhängig durch die Terminase, einem Proteinkomplex bestehend aus pul15, pul33 und pul28 (Beard et al., 2002; Koslowski et al., 1999). 13

21 Einleitung Vergleichende Untersuchungen zeigten, dass pul15 Walker A und B Motive enthält, die mit der Terminase von Bakteriophagen vergleichbar sind (Mitchell et al., 2002; Yu und Weller, 1998). Daher wird vermutet, dass pul15 in der Lage ist, ATP zu hydrolysieren. Die Terminase-Untereinheit pul28, die mit pul15 interagiert (Abbotts et al., 2000; Koslowski et al., 1997; 1999), bindet die virale DNA an den Erkennungssequenzen pac1 und pac2. Dadurch wird sichergestellt, dass jeweils nur ein Genom pro Kapsid verpackt wird (Adelmann et al., 2001; Deiss et al., 1986; Harper et al., 1986; Wu et al., 1986). pul28 interagiert mit pul33 (Yang und Baines, 2006), welches vermutlich die korrekte Lokalisierung des Terminase-Komplexes an der DNA vermittelt (Beard et al., 2002; Beilstein et al., 2009). Dennoch ist dessen genaue Funktion bisher nicht bekannt. Ebenfalls unbekannt ist die genaue Funktion von pul17 und pul32 die ebenfalls für die Verpackung der viralen DNA essentiell sind (Fuchs et al., 2009; Klupp et al., 2005; Salmon et al., 1998), während pul25 an einem späteren Schritt der Kapsidreifung beteiligt ist (Cockrell et al., 2009; Klupp et al., 2006; Kuhn et al., 2008; Stow, 2001). In Abwesenheit von pul25 kommt es zu einer Akkumulation von Kapsiden in der Nähe der Kernmembran. Daher wird vermutet, dass pul25 eine Art Marker für reife Kapside darstellt, die aus dem Kern transportiert werden können (Klupp et al., 2006; Kuhn et al., 2008). Das pul25 bildet außerdem zusammen pul17 einen Proteinkomplex, der als C- Kapsid spezifische Komponente (C-capsid specific component CCSC) bezeichnet wird und zwischen den Pentonen und Hexonen lokalisiert ist (Ali et al., 1996; Thurlow et al., 2006; Trus et al., 2007). Dieser pul17/pul25 Komplex wurde zunächst nur auf reifen Kapsiden detektiert, konnte aber inzwischen auch auf A und B Kapsiden nachgewiesen werden und wurde daher in CVSC (Capsid vertex-specific component) umbenannt (Toropova et al., 2011). Durch verschiedene Stadien der Reifung lassen sich unterschiedliche Kapsidformen ableiten, die als A-, B- und C-Kapside bezeichnet werden. C-Typ Kapside bezeichnen dabei reife Kapside, mit DNA und ohne Gerüstprotein. B-Typ Kapside bilden die Vorstufe der reifen Kapside oder sind möglicherweise dead end Produkte. Sie sind durch das Fehlen der DNA gekennzeichnet und enthalten aber das Gerüstprotein erkennbar als ringförmige Innenstruktur. A-Typ Kapsiden fehlt sowohl das Gerüstprotein als auch die DNA. Diese entstehen vermutlich durch 14

22 Einleitung fehlgeschlagene DNA-Verpackungsversuche (Gibson und Roizman, 1972; Perdue et al., 1976) Primäre Umhüllung und Freisetzung aus dem Kern Nach der Reifung der Kapside erfolgt deren Freisetzung aus dem Zellkern. Dafür werden sie zunächst von der inneren Kernmembran primär umhüllt und gelangen so in den Kernspalt. Für diesen Prozess ist ein viraler Proteinkomplex notwendig der aus pul34 und pul31 besteht (nuclear egress complex NEC; Johnson und Baines, 2011; Mettenleiter, 2002; Mettenleiter, 2006; Mettenleiter et al., 2006). Bei pul34 handelt es sich um ein Typ-II-Membranprotein, welches in die Kernmembran lokalisiert (Klupp et al., 2000; Purves et al., 1992; Roller et al., 2000). Die Lokalisierung von pul34 scheint zudem durch virale Kinasen (pul13 und pus3) beeinflusst zu werden (Kato et al., 2006; Klupp et al., 2000; Ryckman und Roller, 2004), wobei pul34 durch pus3 phosphoryliert wird (Purves et al., 1991; 1992; Ryckman und Roller, 2004). Für PrV konnte allerdings gezeigt werden, dass pus3 zumindest nicht die einzige Kinase ist, die pul34 phosphoryliert (Klupp et al., 2001). Für PrV, HSV-1 und HCMV konnte gezeigt werden, dass die Interaktionsdomäne für pul31 im N-Terminus des Proteins lokalisiert ist (Bubeck et al., 2004; Fuchs et al., 2002; Liang und Baines, 2005; Milbradt et al., 2012). Der pul34-interaktionspartner pul31 ist ein lösliches Protein, welches im Zellkern lokalisiert (Chang und Roizman, 1993; Fuchs et al., 2002; Klupp et al., 2007; Zhu et al., 1999) und durch die Interaktion mit pul34 an den Kernrand rekrutiert wird (Klupp et al., 2000; 2007). In Abwesenheit des pul31 Homologs BFLF2 von EBV scheint die Verpackung der DNA in die Kapside gestört, was vermuten lässt, dass BFLF2 auch an diesem Prozess beteiligt sein könnte (Granato et al., 2008). Durch den NEC werden zelluläre (Proteinkinase C) und virale Kinasen (pus3 bei den Alphaherpesviren) rekrutiert, die die Lamina phosphorylieren und sie damit teilweise auflösen (Bjerke und Roller, 2006; Mettenleiter, 2002; Milbradt et al., 2007; Mou et al., 2008; Muranyi et al., 2002; Park und Baines, 2006; Scott und O Hare, 2001). Durch die lokale Auflösungen der Kernlamina wird der direkte Kontakt der Kapside mit der inneren Kernmembran und dem NEC ermöglicht (Mettenleiter, 2002; Reynolds et al., 2004; Scott und O Hare, 2001). Bei HSV-1 konnte gezeigt werden, 15

23 Einleitung dass pul31 mit dem pul17/pul25 Komplex interagiert, was vermuten lässt, dass reife Kapside durch diese Interaktion an den Kernrand gelangen (Yang und Baines, 2011). Der Transport von Kapsiden innerhalb des Zellkerns scheint über Aktinfilamente und Myosin V zu erfolgen (Feierbach et al., 2006; Forest et al., 2005). pul31 und pul34 allein sind ausreichend um vesikuläre Strukturen von der inneren Kernmembran abzuschnüren, die hinsichtlich ihrer Struktur und Größe mit primären Hüllen vergleichbar sind (Desai et al., 2012; Klupp et al., 2007). Möglicherweise reguliert pus3 durch Phosphorylierung von pul31 die primäre Umhüllung sowie die Fusion der primären Hüllen mit der äußeren Kernmembran (Mou et al., 2009). Abb. 1.5: Schematische Darstellung der primären Umhüllung. Durch zelluläre und virale Kinasen kommt es an der inneren Kernmembran zur Phosphorylierung der Kernlamina. Die teilweise Auflösung der Lamina ermöglicht es den Kapsiden in räumliche Nähe zur inneren Kernmembran zu gelangen. In die innere Kernmembran ist das Typ-II-Membranprotein pul34 eingelagert, welches pul31 durch Interaktion an die innere Kernmembran rekrutiert. Durch einen Knospungsprozess kommt es zur primären Umhüllung reifer Nukleokapside durch die innere Kernmembran. 16

24 Einleitung Abkürzungen: NUC (Nukleus), CYT (Zytoplasma), PKC (Protein Kinase C), Schema nach Mettenleiter, Nachdem reife Nukleokapside primär umhüllt im Kernspalt vorliegen, kommt es zur Membranfusion zwischen der primären Hülle und der äußeren Kernmembran. Bisher ist allerdings nicht klar, welche Proteine an diesem Prozess beteiligt sind. Da der Eintritt des Virus in die Wirtszelle ebenfalls durch Membranfusion erfolgt, wurde vermutet, dass ähnliche Proteine an Freisetzung aus dem Kernspalt beteiligt sein könnten. Einen Hinweis darauf gab der Nachweis viraler Glykoproteine in der Kernmembran. Transfektion von HSV-1 gb führte zu dessen Lokalisation in der Kernmembran, aber auch während der Infektion konnten gb und gd in der Kernmembran nachgewiesen werden (Ali et al., 1987; Stannard et al., 1996). Eine ähnliche Lokalisierung konnte für gm von HSV-1 beschrieben werden (Baines et al., 2007; Zhang et al., 2009). Untersuchungen an den viralen Glykoproteinen gb (bei PrV) und gk (bei HSV-1) zeigten, dass primär behüllte Virionen in deren Abwesenheit im Kernspalt akkumulieren (Foster und Kousoulas, 1999; Peeters et al., 1992). Des Weiteren wurden bei HSV-1 gb und gh ebenfalls als notwendig für die Freisetzung der Kapside aus dem Kernspalt beschrieben (Farnsworth et al., 2007; Wright et al., 2009) wobei gb durch pus3 phosphoryliert wird (Kato et al., 2009). Ein Fehlen dieser Phosphorylierungsdomäne führt bei einer gh-deletionsmutante ebenfalls zu einem Defekt in der Membranfusion zwischen äußerer Kernmembran und primärer Virushülle (Wisner et al., 2009), während eine gb/gd Doppelmutante keine Beeinträchtigung beim nuclear egress zeigte (Johnson et al., 2011). Hinweise, dass virale Glykoproteine an der Fusion von äußerer Kernmembran mit primärer Virushülle beteiligt sind, konnten für PrV nicht bestätigt werden. So wurden weder Glykoproteine in der Kernmembran nachgewiesen, noch zeigten Deletionsmutanten der HSV-1 homologen Proteine eine Beeinträchtigung im nuclear egress. Hier scheint es sich beim Viruseintritt und der Freisetzung aus dem Zellkern um voneinander völlig unabhängige Prozesse zu handeln (Klupp et al., 2008). Es wird vermutet, dass zelluläre Proteine an der Freisetzung der Kapside aus dem Zellkern beteiligt sind. So scheinen die durch Koexpression von pul34 und pul31 gebildeten Membranvesikel ebenfalls, wenn auch schlecht, mit der äußeren Kernmembran zu fusionieren (Klupp et al., 2007). 17

25 Einleitung Rolle zellulärer Proteine bei der Freisetzung aus dem Zellkern Die Kernhülle besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran, die an den Kernporen miteinander verbunden sind. Während die äußere Kernmembran mit der ER Membran ein Kontinuum bildet und auch ähnliche Proteine beherbergt, konnten bereits mehr als 100 integrale Membranproteine nachgewiesen werden, die spezifisch für die innere Kernmembran sind (Schirmer et al., 2003). Die Proteine der inneren Kernmembran binden dabei hauptsächlich DNA und/oder Lamine. Durch die während der Infektion hervorgerufene partielle Auflösung der Lamina und der Umorganisation des zellulären Chromatins könnte es deshalb auch zu einer Beeinflussung der Proteine der inneren Kernmembran kommen. Allerdings sind diese bisher wenig untersucht. Das INM-spezifische Typ-II-Membranprotein Emerin interagiert in vitro mit Lamin A und Lamin C. Dabei scheint die Lokalisierung von Emerin durch die Lamine bedingt zu sein (Vaughan et al., 2001). Fehlt Emerin in der Zelle, ist die Stabilität der Zellkerne stark beeinträchtigt (Rowat et al., 2006), wobei Lamin C von der inneren Kernmembran diffundiert (Markiewicz et al., 2002). Die Phosphorylierung von Proteinen der inneren Kernmembran spielt eine zentrale Rolle bei der Regulierung sowie im Zellzyklus (Hirano et al., 2005; Otto et al., 2001; Tifft et al., 2009). Sowohl für Lentiviren als auch für HSV-1 konnte gezeigt werden, dass Emerin während der Infektion phosphoryliert wird (Bukong et al., 2010; Leach et al., 2007; Morris et al., 2007) und somit die partielle Auflösung der Lamina indirekt bewirkt werden könnte. Der Lamin-B-Rezeptor (LBR) ist ein integrales Membranprotein der inneren Kernmembran und scheint ebenfalls durch Phosphorylierungen reguliert zu werden (Appelbaum et al., 1990). LBR bindet neben DNA hauptsächlich Lamin B (zusammengefasst in Olins et al., 2010; Ye und Worman, 1994) und scheint für die Stabilität des Zellkerns nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. So konnte für HSV- 1 gezeigt werden, dass LBR keine Rolle im Infektionszyklus spielt. Zwar kommt es zu einer Veränderung der Bindung zwischen LBR und Lamin B, dies scheint jedoch nur ein Nebeneffekt bei der Auflösung der Lamina zu sein. Es wird vermutet, dass der LBR-Lamin-B Komplex zusammen von der Kernmembran gelöst wird (Scott und O Hare, 2001). 18

26 Einleitung Im Gegensatz zur primären Umhüllung der Nukleokapside im Zellkern ist der Prozess der Fusion mit der äußeren Kernmembran bisher wenig aufgeklärt und es wird in Betracht gezogen, dass zelluläre Proteine an diesem Vorgang beteiligt sind (Klupp et al., 2007). Kürzlich wurde postuliert, dass auch große zelluläre RNP Komplexe in einem dem nuclear egress der Herpesviren vergleichbaren Prozess, nämlich über Knospung an der inneren Kernmembran und anschließender Fusion mit der äußeren Kernmembran, ins Zytoplasma geschleust werden (Speese et al., 2012). So konnte auch hier demonstriert werden, dass die Proteinkinase C (PKC) die Lamina (Lamin C) phosphoryliert und damit zur partiellen Auflösung führt (Speese et al., 2012). Die zellulären Proteine, die hier am budding und an der Fusion beteiligt sind, sind jedoch auch hier noch unbekannt. Torsin A, eine AAA+ATPase (ATPase associated with a variety of cellular activities), die im ER lokalisiert ist, ist bei zellulären Prozessen an der Auflösung von Vesikeln beteiligt (Goodchild et al., 2005; Granata et al., 2008) und könnte möglicherweise an der Fusion mit der äußeren Kernmembran beteiligt sein. Untersuchungen bei HSV-1, bei denen Torsin A in der Zelle überexprimiert wurde, zeigten, dass dies tatsächlich Auswirkungen auf die Freisetzung aus dem Kernspalt hat und die Titer etwa 5-fach reduziert waren (Maric et al., 2011). VCP (Valosin-containing protein) ist ebenfalls eine AAA+ATPase die im ER vorhanden ist und dort eine Rolle bei Transport und Fusion von Vesikeln spielen könnte (Acharya et al., 1995; Hetzer et al., 2001; Lilley und Ploegh, 2005; Uchiyama et al., 2002; zusammengefasst in Vij, 2008). Eine Beteiligung bei der Freisetzung der primären Herpesvirionen aus dem Kern wurde bisher noch nicht untersucht, war aber Gegenstand dieser Arbeit Tegumentierung, sekundäre Umhüllung und Freisetzung Nach der Freisetzung der reifen Nukleokapside aus dem Zellkern werden diesen Tegumentproteine angelagert und sie erhalten ihre sekundäre Hülle. Durch Kryo- Elektronenmikroskopie von HSV-1 konnte gezeigt werden, dass die innere Tegumentschicht ikosaedrisch um das Kapsid aufgebaut ist (Zhou et al., 1999). Den 19

27 Einleitung innersten Teil des Teguments bildet das pul36, welches entweder indirekt über pul25 oder direkt mit über das Hauptkapsidprotein mit dem Kapsid interagiert (Cardone et al., 2012; Coller et al., 2007; Lee et al., 2006; Mettenleiter et al., 2009; Zhou et al., 1999). Die zweite Lage des inneren Teguments bildet pul37, welches mit pul36 interagiert (Bechtel und Shenk, 2002; Fuchs et al., 2004; Klupp et al., 2001a; 2002; Mijatov et al., 2007; Vittone et al., 2005). Während pul37 bei HSV-1 essentiell ist, wird es für PrV nicht unbedingt für die Virusmorphogenese benötigt (Desai et al., 2001; Klupp et al., 2001a; Leege et al., 2009a). Auch die virale Kinase pus3 ist bei den Alphaherpesviren ein Teil des inneren Teguments. Es ist bei PrV das einzige Tegumentprotein das sowohl in primären als auch in reifen Virionen nachgewiesen werden konnte, wobei nicht geklärt ist, ob es während des Austritts mit dem Kapsid assoziiert bleibt oder erneut im Zytoplasma aufgelagert wird (Granzow et al., 2004; Reynolds et al., 2002). Während die Struktur des inneren Teguments geordnet ist, kann die Zusammensetzung der Proteine des äußeren Teguments stark variieren (Clarke et al., 2007; Mettenleiter et al., 2009). Dennoch bestehen Interaktionen zwischen Tegumentproteinen, die somit ein komplexes Proteinnetzwerk darstellen. Proteine des äußeren Teguments sind auch in der Lage mit den zytoplasmatischen Domänen der viralen Glykoproteinen zu interagieren. Diese liegen in Vesikeln vor, die die späteren Virushüllen bilden und aus dem Trans- Golgi-Netzwerk stammen. Bei HSV-1 interagieren die C-Termini von ge, gi, gh und gd mit Tegumentproteinen und scheinen so die sekundäre Umhüllung tegumentierter Nukleokapside zu vermitteln (Farnsworth et al., 2007; Murphy et al., 2008; O Regan et al., 2010; Stylianou et al., 2009). Für PrV konnte gezeigt werden, dass pul49 mit ge und gm interagiert (Brack et al., 1999; Chi et al., 2005; Fuchs et al., 2002b). Fehlen gleichzeitig die Glykoproteine ge und gm, bzw. der zytoplasmatische Teil von ge und gm kommt es zu einem drastischen Defekt in der sekundären Umhüllung (Brack et al., 1999; 2000; Leege et al., 2009). Ein ähnlicher Defekt konnte bei Fehlen der Proteine gm, gd und ge sowohl für PrV als auch für HSV-1 beschrieben werden (Brack et al., 2000; Farnsworth et al., 2007). Auch pul11 und pul51 sind an der Morphogenese von Herpesviren beteiligt (Baines und Roizman, 1992; Klupp et al., 2005b; Kopp et al., 2003, MacLean et al., 1992; Mettenleiter et al., 2009). Virusmutanten denen gleichzeitig gm und pul11 fehlen, zeigten einen drastischen Defekt bei der sekundären Umhüllung und es bildeten sich große Akkumulationen tegumentierter Kapside in der Zelle (Kopp et al., 2004; Leege et al., 2009) 20

28 Einleitung Nach der sekundären Umhüllung werden die reifen Virionen in den Transportvesikeln an die Zelloberfläche transportiert, wo sie schließlich nach Fusion der Vesikelmembran mit der Plasmamembran entlassen werden (Harley et al., 2001; Mettenleiter, 2002; Mettenleiter et al., 2009). Über diesen Prozess ist bisher wenig bekannt, wobei vermutlich der sekretorische Transportmechanismus der Zelle genutzt wird. Dennoch gibt es Hinweise, dass gk und pul20 daran beteiligt sind. Beide Proteine interagieren dabei miteinander und sind an Transportprozessen an die Zelloberfläche beteiligt (Foster et al., 2003; 2004; 2008). Zusätzlich scheint pul20 an der Membranfusion beteiligt zu sein (Foster et al., 2004a; Melancon et al., 2007) Ausbreitung von Zelle zu Zelle (cell-to-cell spread) Durch die direkte Ausbreitung von Zelle zu Zelle ist es Herpesviren möglich, umliegende Zellen zu infizieren. Wie auch beim Eintritt in die Zelle sind für die direkte Ausbreitung von Zelle zu Zelle gb und gh/gl notwendig. Bei PrV ist gd für die Ausbreitung von Zelle zu Zelle nicht notwendig, während es bei HSV-1 essentiell ist (Mulder et al., 1996; Turner et al., 1998). Der genaue Mechanismus des cell-to-cell spreads ist allerdings noch nicht geklärt Neurotropismus und Latenz Die Neuroinvasion von Herpesviren wurde schon früh in infizierten Kaninchen untersucht (Goodpasture, 1925; Goodpasture und Teague, 1923), während neuere Untersuchungen sich mehr auf das Mausmodell beziehen (Enquist et al., 1998; Field und Hill, 1975; Osorio und Rock, 1992). Während einer Herpesvirus-Infektion kommt es nach einer initialen Vermehrung in den Epithelzellen zunächst zu einer Infektion der sensiblen Nervenenden, von wo aus der retrograde Transport in die Zellkörper stattfindet (Babic et al., 1993; Enquist, 2002). In den sensorischen Ganglien kann dann eine produktive Infektion mit lytischer Vermehrung stattfinden oder eine Latenz etabliert werden. Die Ausbreitung der Herpesviren im Nervensystem findet durch den anterograden axonalen Transport bis zu den Synapsen statt. Hier konnte gezeigt werden, dass PrV und vermutlich 21

29 Einleitung auch HSV-1 behüllt anterograd transportiert werden (Maresch et al., 2010; Negatsch et al., 2010). PrV ist in der Lage, die Zellkörper der Trigeminal-Ganglien latent zu infizieren (Gutekunst et al., 1980). Während der Latenz wird die lytische Vermehrung der Herpesviren unterdrückt und es kommt nur zur Expression Latenz-assoziierter- Transkripte (LAT) (Perng und Jones, 2010; Priola et al., 1990; Priola und Stevens, 1991). Für deren Expression wurden bisher die Promotoren LAP1 und LAP2 (Latency-active promotor) beschrieben (Cheung und Smith, 1999; Jin und Scherba, 1999; Jin et al., 2000). LAT bezeichnet ein Transkript, welches bei HSV kb groß ist und mit einer Cap Struktur sowie einem Poly-A-Schwanz versehen ist (Stevens et al., 1987). Durch Spleißvorgänge wird es in ein 2.0 kb großes, stabiles Intron und ein 6.3 kb großes instabiles Produkt gespalten. Dessen Funktion scheint durch die Ausbildung regulatorischer mirnas an der Aufrechterhaltung und Stabilisierung der Latenz beteiligt zu sein (Umbach et al., 2008). So wird beispielsweise ICP0 reguliert, ein transkriptioneller Aktivator, der bei PrV als EP0 bekannt ist (Cai et al., 1993; Everett, 2000; Halford et al., 2001). Auch die Expression von ICP4 wird gehemmt (Umbach et al., 2008). Allerdings sind die Mechanismen der Etablierung und Aufrechterhaltung der Latenz sowie die Reaktivierung noch nicht vollständig aufgeklärt. 1.3 Das Pseudorabies Virus Pathogenese Das Pseudorabies Virus (PrV) ist der Erreger der Aujeszkyschen Krankheit des Schweins. Namensgeber ist der ungarische Tierarzt Aladár Aujeszky, der die Erkrankung im Jahre 1902 erstmals beschrieb (Aujeszky, 1902). Die Infektion mit PrV erfolgt meist auf oronasalem Weg. Dabei kommt es zu einer ersten Virusvermehrung in den Schleimhäuten des Nasen- und Rachenraums (Masić et al., 1965), die die Infektion der sensorischen Nerven nach sich zieht. Dabei werden zunächst die kranialen Nerven 1, 5 und 9 infiziert. Die Ausbildung der Latenz erfolgt bei PrV in Ganglien, Tonsillen und im Bulbus olfactorius (Maes et al., 1997). PrV hat ein sehr breites Wirtsspektrum und es war Aujeszky möglich, den Erreger aus einem Rind und verschiedenen Haustieren zu isolieren. Dagegen sind höhere 22

30 Einleitung Primaten und Einhufer für eine Infektion nicht empfänglich (Mettenleiter, 1994). Charakteristisch für die Infektion bei verschiedenen Tierarten ist das sogenannte mad-itch Syndrom welches sich durch heftiges Kratzen bemerkbar macht (Hanson, 1954). Weiterhin sind auch Symptome, die der Tollwut sehr ähnlich sind, bei Haustieren beobachtet worden. Daher wird die Erkrankung auch als Pseudowut (englisch Pseudorabies) bezeichnet. Eine Infektion von Hunden und Katzen aber auch kleiner Säuger wie Mäusen und Ratten führt in der Regel schnell zum Tod. Die Erkrankung des Schweins als natürlicher Wirt ist allerdings von wirtschaftlicher Bedeutung und kann sich auf unterschiedliche Art und Weise manifestieren. Dabei spielt vor allem das Alter der Tiere eine wichtige Rolle. Die Infektion von Saugferkeln verläuft meist tödlich, was in Zuchtbeständen hohe Verluste nach sich ziehen kann. Erste Anzeichen der Erkrankung sind dabei meist unspezifisch und äußern sich durch Teilnahmslosigkeit und Fieber. Dem folgen in der Regel charakteristische zentralnervöse Störungen die sich durch Zittern, Ataxien und erhöhten Speichelfluss auszeichnen. Die Infektion der sensorischen Ganglien führt schließlich zu einer Lähmung der Hintergliedmaßen und zum Tod des Tieres etwa 36 Stunden nach Auftreten der ersten neurologischen Symptome (Brittle et al., 2004). Mit zunehmendem Alter sinkt die Sterblichkeitsrate der Ferkel, dennoch kann die Infektion durch respiratorische Symptome (Kluge et al., 1999) zu starken Gewichtsverlusten und damit einhergehenden großen Verlusten in der Fleischproduktion führen. Bei adulten Tieren löst die Infektion schwache respiratorische Symptome aus, eine Erkrankung kann allerdings auch inapparent verlaufen. Die Infektion von trächtigen Sauen im ersten Trimester führt sehr häufig zu Aborten (Kluge et al., 1999). Eine durch PrV etablierte latente Infektion erwachsener Tiere kann durch Stress reaktiviert werden und zu einer schnellen Ausbreitung des Virus in Zucht- und Mastbetrieben führen. Durch seine große Bedeutung in der Nutztierhaltung sowie die nahe Verwandtschaft zu HSV-1 ist PrV in der Forschung von besonderer Bedeutung. Es zeichnet sich durch effiziente Infektion verschiedenster Zellkulturen und vor allem schnelle Replikation aus. Auch die gute genetische Manipulierbarkeit eignet sich besonders für die molekularbiologische Charakterisierung. Da das Virus nicht humanpathogen ist, kann es unter Beachtung der nötigen Sicherheitsvorschriften ohne größere 23

31 Einleitung Risiken untersucht werden und so als Modell für die anderen Vertreter der Herpesviren dienen (Mettenleiter, 2008) Vakzinierung Durch die starke Verbreitung des PrV in großen Teilen der Welt war der wirtschaftliche Verlust enorm. Die Etablierung eines Impfstoffes war daher unerlässlich. Um infizierte Tiere von geimpften unterscheiden zu können, wurden Markervakzinen genutzt, die schließlich zur Eradikation des Virus in Deutschland und den USA führten (Kluge et al., 1999; Müller et al., 2003). 1.4 Aufbau und Dynamik der Kernmembran Die Kernmembran trennt den Zellkern vom Zytoplasma und die darin enthaltenen Organellen voneinander. Auf ihrer Innenseite der befindet sich die Kernlamina, ein dichtes Netzwerk von Intermediärfilamenten, hauptsächlich Laminen, welche Stabilitätsfunktionen erfüllt und durch Proteine der inneren Kernmembran gebunden wird. Der Lamin-B-Rezeptor verfügt als integrales Membranprotein über acht Transmembrandomänen, während der N- und C-Terminus in das Nukleoplasma hineinragen und mit Lamin B sowie Heterochromatin interagiert (Holmer et al., 1998; Schuler et al., 1994; Simos und Georgatos, 1992; Ye und Worman, 1994). Ein weiteres integrales Membranprotein ist Nurim. Nurim verfügt nicht über einen hydrophilen N-Terminus und scheint durch mehrere Transmembrandomänen ungewöhnlich stark mit der inneren Kernmembran assoziiert zu sein. Interaktionspartner sind bisher nicht bekannt, es wird allerdings vermutet, dass Nurim enzymatische Funktionen erfüllt (Hofemeister und O Hare, 2005; Rolls et al., 1999). Typ-II-Membranproteine sind durch ihren C-Terminus in der inneren Kernmembran verankert und ragen mit dem N-Terminus in das Nukleoplasma. Einige dieser gehören in die Familie der LEM-Proteine (Lamina assoziiertes Polypeptid (Lap), Emerin, Man1) und sind durch die konservierte Domäne gekennzeichnet (Lin et al., 2000; Schirmer und Gerace, 2005). Beispiele hierfür sind Lap1, Lap2 und Emerin. Lap1 kann in drei Isoformen unterteilt werden, wobei zwei von ihnen in der Lage 24

32 Einleitung sind, Lamin A/C sowie Lamin B zu binden (Foisner und Gerace, 1993; Senior und Gerace, 1988). Lap2 wird ebenfalls in verschiedene Isoformen unterteilt, von denen bisher sechs bekannt sind. Wie bei Lap1 werden auch diese durch Spleißprozesse gebildet. Lap2 ist die einzige Isoform, die keine Transmembrandomäne besitzt und frei im Nukleoplasma vorliegt (Berger et al., 1996; Furukawa et al., 1995; Harris et al., 1995). Alle Lap2 Isoformen interagieren durch N-terminale Domänen mit der Lamina sowie Chromatin (Furukawa et al., 1998). Durch Strukturanalysen konnten für Lap2 bereits eine Vielzahl von Domänen beschrieben werden. So bindet es Lamin B sowie BAF (barrier to autointegration factor), welches ein DNA-assoziiertes Protein darstellt (Furukwa 1999; Furukawa et al., 1998; Furukawa und Kondo, 1998). Emerin scheint sowohl mit Lamin B als auch mit Lamin A/C zu interagieren (Clements et al., 2000; Fairley et al., 1999) und bindet auch Nesprin-2 (Schirmer und Foisner, 2007; Zhang et al., 2005). Nesprine stellen die Verbindung zwischen dem Zellkern und dem Zytoskelett der Zelle dar. Die bisher identifizierten Isoformen werden in zwei Gruppen eingeteilt, wobei Nesprin 1 und 2 in die äußere Kernmembran lokalisieren (Libotte et al., 2005; Zhang et al., 2005). Nesprin 1 kann dabei auf zytoplasmatischer Ebene Aktin binden, wobei Nesprin 2 über die Bindung mit Plektin mit zellulären Intermediärfilamenten interagiert (Crisp et al., 2006; Schirmer und Foisner, 2007; Wilhelmsen et al., 2005). Nesprine der inneren Kernmembran sind Nesprin 3 und Nesprin 4 (Roux et al., 2009; Wilhelmsen et al., 2005). Nesprine verfügen über eine KASH-Domäne (Klarsicht, Anc-1, syne homology) über die sie im Kernspalt mit Proteinen der SUN-Familie (Sad1-UNC homology domain) interagieren (Schirmer und Foisner, 2007; Starr und Fischer, 2005; Wilhelmsen et al., 2005). SUN1 und SUN2 sind Proteine der inneren Kernmembran (Hodzic et al., 2004; Padmakumar et al., 2005). Die SUN-Domäne ragt dabei in den periplasmatischen Raum um so die Interaktion mit den Nesprinen zu gewährleisten (Schirmer und Foisner, 2007). Auf der Kernseite interagieren SUN1 und SUN2 mit Lamin A sowie Emerin (Haque et al., 2006; 2010). Der SUN-Nesprin Proteinkomplex wird als LINC (linker of nucleus and cytoskeleton) bezeichnet und verbindet so den Kern (über die Lamina) mit dem Zytoskelett der Zelle (Crisp et al., 2006; Haque et al., 2006; Méjat und Misteli, 2010). 25

33 Einleitung 1.5 Im Rahmen der Arbeit untersuchte Genprodukte pul34 Die primäre Umhüllung reifer Nukleokapside erfolgt durch den nuclear egress complex (NEC), welcher in der Familie der Herpesviridae konserviert ist (Mettenleiter, 2006). Der Proteinkomplex besteht aus pul31 und dem Typ-II-Membranprotein pul34. Das im Rahmen der Arbeit untersuchte PrV pul34 besteht aus 262 Aminosäuren und besitzt eine C-terminale Transmembrandomäne, welche zwischen den Aminosäuren 245 und 261 vorausgesagt wird. Dabei ragt lediglich eine Aminosäure in den periplasmatischen Raum (Klupp et al., 2000; Horton und Nakai, 1997, PSort II). Das Protein lokalisiert sowohl in infizierten als auch transfizierten Zellen in die Kernmembran (Klupp et al., 2000). Der hydrophile Teil von pul34 befindet sich im Kernplasma und interagiert dort mit dem löslichen pul31 (Reynolds et al., 2001; Muranyi et al., 2002; Lake und Hutt-Fletcher, 2004; Fuchs et al., 2002). Beide Proteine bilden einen Komplex, der für die Freisetzung reifer Nukleokapside notwendig ist (Reynolds et al., 2002; Fuchs et al., 2002; Farina et al., 2005; Granato et al., 2008; Klupp et al., 2000; Neubauer et al., 2002; Popa et al., 2010; Roller et al., 2000). Da pul34 kein Kernlokalisierungssignal besitzt, wurde vermutet, dass die Lokalisierung durch Interaktion mit zellulären Proteinen erfolgt. Untersuchungen an dem Homolog von HSV-1 konnten zwar eine Interaktion zwischen Lamin A und B1 mit pul34 nachweisen, allerdings scheint die Deletion der entsprechenden zellulären Proteine keinen wesentlichen Einfluss auf die Verteilung von pul34 zu haben (Mou et al., 2008). Während der Infektion wird pul34 phosphoryliert, wobei angenommen wurde, dass dies durch die pus3 Kinase erfolgt (Purves et al., 1991; 1992; Reynolds et al., 2002). Untersuchungen an PrV und HSV-1 widerlegten jedoch, dass die Phosphorylierung ausschließlich durch pus3 erfolgt (Ryckman und Roller, 2004; Klupp et al., 2001). Bei HSV-1 scheint sie außerdem Zelltyp-spezifisch zu sein (Ryckman und Roller, 2004). Die Struktur von pul34 ist bisher noch nicht aufgeklärt. Vergleichende Sequenzuntersuchungen zeigten jedoch, dass der N-terminus recht gut konserviert ist, während der C-terminale Teil mit der Transmembranregion stark variiert (Milbradt 26

34 Einleitung et al. 2012; Haugo et al., 2011). Die Interaktionsdomäne für pul31 wurde in verschiedenen pul34 Homologen lokalisiert. Bei PrV konnte dieser Bereich durch Yeast-2-Hybrid Analysen auf den N-Terminus bis zur Aminosäure 162 eingegrenzt werden (Fuchs et al., 2002), während er bei MCMV die ersten 178 Aminosäuren umfasst (Bubeck et al., 2004). Bei HSV-1 liegt die Interaktionsdomäne zwischen den Aminosäuren 137 und 181 (Liang und Baines, 2005). Eine weitere wichtige Funktion scheint bei HSV-1 Thyrosin an Position 68 zu haben. Eine Punktmutation zeigte einen starken Funktionsverlust der Freisetzung reifer Kapside aus dem Kern sowie starke Veränderungen in der Lamina (Haugo et al., 2011). Auch bei MCMV und HCMV konnte das Homolog (Y57) sowie Gluatmin an Position 56 als wichtig für die Funktion beschrieben werden (Bubeck et al., 2004; Milbradt et al., 2012) Kapsidproteine Für den Zusammenbau eines Herpesviruskapsids sind bei HSV-1 fünf Proteine essentiell: pul19, pul38, pul18, pul26 und pul26.5 (Newcomb et al., 1996). Strukturelle Analysen, die sich auf die homologen Proteine von HSV-1 beziehen, konnten bereits Aufschluss über Interaktionsdomänen in den Kapsidproteinen geben. Das Hauptkapsidprotein, welches während der Morphogenese oligomerisiert, bildet dabei die Pentone und Hexone aus (Bowman et al., 2003; Newcomb et al., 1993; Zhou et al., 1994; 2000). Im Protein befinden sich dazu sieben parallel laufende -Helices, die die Mittelpunkte der Hexone und Pentone bilden (Bowman et al., 2003; Zhou et al., 2000). Für die Verbindung der Hexamere und Pentamere ist die Interaktion von pul19 mit dem Triplexprotein pul38 notwendig (Adamson et al., 2006; Desai und Person, 1996). Die Triplexe bestehen aus einem Dimer aus pul18 und einem Molekül pul38 (Newcomb et al., 1993; Spencer et al., 1998; Wang et al., 2011). Das Dimer pul18 scheint dabei nicht mit dem Hauptkapsidprotein zu interagieren (Nicholson et al., 1994). Für pul18 konnten bereits funktionelle Domänen identifiziert werden. Sowohl für HSV-1 als auch EBV wurde die Dimerisierungsdomäne sowie die Interaktionsdomäne für pul38 bestimmt (Wang et al., 2011; Adamson et al., 2006; Desai und Person, 1996). Während der Morphogenese binden erst vollständig oligomerisierte Triplexe an das Kapsid (Spencer et al., 1998). Dabei scheint die Kernlokalisierungsdomäne von pul38 für 27

35 Einleitung die Lokalisierung des Komplexes in den Zellkern notwendig zu sein (Adamson et al., 2006). Die Produkte der überlappenden Gene UL26 und UL26.5 bilden das Gerüst des Kapsids (Holland et al., 1984; Liu und Roizman, 1991; Rixon et al., 1988). Homologe der für HSV-1 beschriebenen Proteine sind auch bei PrV zu finden (Dezélée et al., 1996). Beide Proteine verfügen über identische C-Termini, in denen Domänen für die Oligomerisierung lokalisiert sind (Desai und Person, 1996; Pelletier et al., 1997; Preston und McDougall, 2002). Eine weitere Domäne dient der Interaktion mit dem Hauptkapsidprotein pul19, welche für HSV-1 und HCMV beschrieben ist (Hong et al., 1996; Oien et al., 1997). Im N-Terminus von pul26 befindet sich eine Protease- Domäne, die sich selbst spaltet und für den Abbau des Gerüstproteins während der Kapsidreifung verantwortlich ist (Liu und Roizman, 1991a; 1992; 1993). Das kleine Kapsidprotein pul35 liegt auf Hexonen des Kapsids und ist bei PrV und HSV-1 nicht essentiell für die Virusreplikation (Desai et al., 1998; Krautwald et al., 2008). Im Gegensatz dazu ist es für die Kapsidmorphogenese bei CMV, EBV und KSHV notwendig (Borst et al., 2001; Henson et al., 2009; Perkins et al., 2008; Rupp et al., 2005). Mit dem Kapsid assoziiert liegt der pul25/pul17 Komplex vor. Dabei interagiert pul25 mit den Triplexen des Kapsids (Cockrell et al., 2011; Conway et al., 2010), während pul17 mit pul25 interagiert (Toropova et al., 2011). Es wird vermutet, dass dieser Proteinkomplex als Marker für die Freisetzung von reifen Herpesviruskapsiden aus dem Zellkern dient (Trus et al., 2007) p97/vcp Beim Valosin-containing-Protein (VCP oder p97) handelt es sich um eine AAA+ATPase (ATPase associated with diverse activities), die in der Zelle durch Anlagerung verschiedener Adapterproteine unterschiedliche Funktionen erfüllt. Von besonderem Interesse ist die Assoziation von p97 mit dem Adapterprotein p47. Dieses bindet den N-Terminus von p97 und bildet so einen Komplex, der als Chaperon die Fusion benachbarter Membranen vermittelt (Dreveny et al., 2004). Zusätzlich konnte gezeigt werten, dass p97-p47 die Interaktion mit Syntaxin 5 vermittelt und an der Ausbildung der Kernhülle nach der Mitose beteiligt ist (Kondo et al., 1997; Roy et al., 2000; Hetzer et al., 2001). Die Funktion dieses Komplexes ist von der Phosphorylierung von p47 durch CDC2 abhängig (Kano et al., 2004; 2005). 28

36 Einleitung Regulation durch Phosphorylierung konnte aber auch bei p97 nachgewiesen werden. Diese erfolgt durch AKT (activated-serine-threonine-protein-kinase) und ist als notwendig für dessen Funktion beschrieben worden (Livingstone et al., 2005; Vandermoere et al., 2006). 29

37 Einleitung 1.6 Zielstellung der Arbeit Für die vorliegenden Arbeit sollten drei Schwerpunkte bearbeitet werden. Im ersten Projekt sollte das Typ-II-Membranprotein pul34 hinsichtlich seiner funktionellen Domänen untersucht werden. Dabei sollte zunächst erfasst werden, ob die Transmembrandomäne von pul34 virusspezifische Eigenschaften besitzt. Dazu sollten chimäre Proteine hergestellt werden, bei denen die Transmembrandomäne des pul34 gegen die verschiedener zellulärer Proteine der inneren Kernmembran (LBR, Emerin, Lap2ß) ausgetauscht ist. Weitere Untersuchungen sollten Aufschluss darüber geben, wo sich zusätzliche funktionelle Domänen im pul34 befinden. Dafür sollten wiederum chimäre Proteine hergestellt werden, in denen größere Bereiche von pul34 gegen Lap2ß ausgetauscht wurden. Die chimären Proteine sollten dann hinsichtlich ihrer Lokalisierung, Interaktion mit dem pul34 Komplexpartner pul31, sowie auf funktionelle Komplementierung untersucht werden. Um den molekularen Mechanismus des nucelar egress und die daran beteiligten viralen Protein zu charakterisieren, sollte versucht werden, Kapside unabhängig einer PrV Infektion durch Expression der Kapsidproteine über rekombinante Baculovirusvektoren zu generieren. Dass die Kapsidmorphogenese in vitro nachgestellt werden kann, konnte bereits durch Infektion von Insektenzellen bei verschiedenen Herpesviren gezeigt werden (Henson et al., 2009; Perkins et al., 2008; Tatman et al., 1994; Kut und Rasschaert, 2004). Weiterführende Experimente sollten zeigen, ob pul17 und/ oder pul25 für die Freisetzung der Kapside notwendig sind und ob bei gleichzeitiger Expression des NEC diese Kapside aus dem Kern ausgeschleust werden können. Im dritten Projekt sollte erfasst werden, ob das zelluläre Protein p97 an der Freisetzung von PrV-Kapsiden beteiligt ist. Bei diesem Protein handelt es sich um eine AAA+ATPase, die an Membranfusionen beteiligt ist (Dreveny et al., 2004) und während der PrV Infektion hochreguliert wird (Skiba et al., 2008). Die Expression von p97 sollte durch sirna spezifisch gehemmt und nach Infektion mit PrV gezeigt werden, ob ein Einfluss auf die Replikationsfähigkeit des Virus nachweisbar ist. 30

38 Material 2 Material und Methoden 2.1 Material Permanente Zelllinien Tabelle 2.1: Permanente Zelllinien Name Beschreibung Herkunft NRK-49F Ratte, Nierenfibroblast Zellbank, FLI Riems NRK-52E Ratte, Nierenepithel Zellbank, FLI Riems RE-R Ratte, Embryo Zellbank, FLI Riems RK13 Kaninchen, Nierenzelle, Zellbank, FLI Riems PSEK Schwein, Nierenzelle, Zellbank, FLI Riems High V Trichoplusia ni,ovarien Zellbank, FLI Riems Sf9 Spodoptera frugiperda, Ovarien Zellbank, FLI Riems Viren Tabelle 2.2: Viren Name Beschreibung Referenz PrV-Ka PrV-ΔUL34gfp Pseudorabies Virus, Stamm Kaplan Pseudorabies Virus mit Deletion im UL34 Gen, GFP positiv Kaplan und Vatter, 1959 Klupp et al., Bakterien Tabelle 2.3: Bakterien Name Referenz E. coli DH5 Hanahan,

39 Material Vektoren Tabelle 2.4: Vektoren Name Beschreibung Referenz pbluescript SK+ Klonierungsvektor Stratagene pbacmamhie/mie1 pcdna3 pegfp-h1pb pegfp-lap2ß plbr1tm-gfp pnp07 Expressionsvektor für Insekten- und Säugerzellen Expressionsvektor für Säugerzellen mit CMV-Promotor Expressionsvektor für shrna Expressionsvektor für Lap2ß aus der Ratte Expressionsvektor für GFP markierten humanen LBR bis zur ersten TM Expressionsvektor für GFP markiertes humanes Emerin Keil et al., 2009 Invitrogen Dr. Fuchs, FLI, Insel Riems Beaudouin et al., 2002 Ellenberg et al., 1997 Prof. P. F. O Hare, Imperial College, London, England psuper Expressionsvektor für shrna Oligoengine Enzyme Tabelle 2.5: Enzyme Restriktionsendonuklease Konzentration Schnittstelle Hersteller BamHI-HF U/ml G GATCC BglII U/ml A GATCT EcoRI-HF U/ml G AATTC HindIII U/ml A AGCTT KpnI U/ml GGTAC C New England Biolabs New England Biolabs New England Biolabs New England Biolabs New England Biolabs 32

40 Material Restriktionsendonuklease Konzentration Schnittstelle Hersteller NotI-HF U/ml GC GGCCGC PvuII U/ml CAG CTG SacI U/ml GAGCT C SmaI U/ml CCC GGG XbaI U/ml T CTAGA New England Biolabs New England Biolabs New England Biolabs New England Biolabs New England Biolabs Weitere Enzyme Konzentration Hersteller Platinum Pfx Polymerase 2.5 U/µl Invitrogen DNA-Polymerase I, Large (Klenow) Fragment 5000 U/ml New England Biolabs T4 DNA-Ligase 1 U/µl Roche Phosphatase, alkaline 1 U/µl Roche Pronase 5 mg/ml Roche Antiseren Tabelle 2.6: Antiseren Erstantiseren Verdünnung für Immunfluoreszenz Verdünnung für Western Blot Referenz -UL17 (Kaninchen) 1: 200 1: Klupp et al., UL18 (Kaninchen) 1: 500 1: Klupp et al., unpub. -UL19 (Kaninchen) 1: : Klupp et al., UL25 (Kaninchen) 1: 500 1: Klupp et al., UL26 (Kaninchen) 1: 500 1: Klupp et al., unpub. -UL26.5 (Kaninchen) 1: : Klupp et al., unpub. -UL31 (Kaninchen) 1 : Fuchs et al.,

41 Material Erstantiseren Verdünnung für Immunfluoreszenz Verdünnung für Western Blot Referenz -UL34 (Maus) 1 : Klupp et al., UL34 (Kaninchen) 1 : 500 1: Klupp et al., UL35 (Kaninchen) 1 : : Krautwald et al., UL38 (Kaninchen) 1 : : Klupp et al., unpub. Sekundärantiseren Konjugation Verdünnung Hersteller -Kaninchen IgG (Ziege) Peroxidase 1: 1000 Dianova -Kaninchen IgG (Ziege) -Kaninchen IgG (Ziege) -Maus IgG (Ziege) -Kaninchen IgG (Ziege) Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 555 Alexa Fluor 488 Alexa Fluor 488 1: 1000 Invitrogen 1: 1000 Invitrogen 1: 1000 Invitrogen 1: 1000 Invitrogen Größenstandards Tabelle 2.7: Größenstandards Name Hersteller 1 kb ladder Invitrogen Protein ladder prestained Invitrogen Primer Tabelle 2.8: Primer Name Sequenz 5 3 Lokalisierung in pegfp-lap2ß Lokalisierung in PrV-Ka UL34for CACAAAGCTTACCATGAGCGGCAC CCT*

42 Material Name Sequenz 5 3 Lokalisierung in pegfp-lap2ß Lokalisierung in PrV-Ka UL34rev CACAGGATCCGCCGCCTTTAACGC ATGTTCAG* Lap2ßfor Lap2ßrev CACAAAGCTTGGGACGAGATGCCG GAGTTC* CACAGAATTCGAGATCGAGTCGGA TGTGCC* UL34- LapTMfor CGGCGCCTCGCCGGCTACTGGAT AAAAATGCTGCTGTTTG UL34- LapTMrev CAAACAGCAGCATTTTTATCCAGTA GCCGGCGAGGCGCCG UL34- LapCT50for CGCCCGTGCCCGGGCACGCGCCG CTCGAGCTCAGTGACTT UL34- LapCT50rev AAGTCACTGAGCTCGAGCGGCGC GTGCCCGGGCACGGGCG UL34- LapCT100for GGCCCCGACGACGCCTCGAGGTT GACTGGAAATTTCAAGC UL34- LapCT100rev GCTTCAAATTTCCAGTCAACCTCGA GGCGTCGTCGGGGCC UL34- LapNTfor CTGTTGAAGCTGAGGGAACAGCAC AACAACGTGATCCTGGCC UL34- LapNTrev GGCCAGGATCACGTTGTTGTGCTG TTCCCTCAGCTTCAACAG Name Sequenz 5 3 Lokalisierung in plbr1 TM- GFP Lokalisierung in PrV-Ka UL34- LBRTMfor CGGCGCCTCGCCGGCTACGGTGT GTTTCTCATCATGTTTG UL34- LBRTMrev CAAACATGATGAGAAACACACCGT AGCCGGCGAGGCGCCG LBRrev CACAGAATTCTTATGGATCTTTCTG TTTAC*

43 Material Name Sequenz 5 3 Lokalisierung in pnp07 Lokalisierung in PrV-Ka UL34- EMDTMfor CGGCGCCTCGCCGGCTACTGGGG CCAGCTGCTGCTTTTCC UL34- EMDTMrev GGAAAAGCAGCAGCTGGCCCCAG TAGCCGGCGAGGCGCCG EMDrev CACAGAATTCTTAGAAGGGGTTGC CTTC* * Die Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme sind unterstrichen Oligonukleotide und sirnas Tabelle 2.9: Oligonukleotide und sirnas Name Sequenz 5 3 Lokalisierung in R. norwegicus p97 mrna Referenz p97-rattefor GATCCCCGTAGGCTATGATGACAT CGTTCAAGAGACGATGTCATCATA GCCTACTTTTTGGAAA* Alzayady et al., 2005 p97-ratterev AGCTTTTCCAAAAAGTAGGCTATGA TGACATCGTCTCTTGAACGATGTC ATCATAGCCTACGGG* Alzayady et al., 2005 Name Sequenz 5 3 Lokalisierung in O. cuniculus p97 mrna Referenz p97-58 AAGAACCGTCCCAATCGGTTA diese Arbeit p AAGGCATCACTGGCAATCTCT diese Arbeit p AAGCTTATCGACCCATTCGGA diese Arbeit * Die p97 spezifischen Sequenzen sind unterstrichen Kommerzielle Kits und Reagenzien Tabelle 2.10: Kommerzielle Kits und Reagenzien Name Hersteller Big Dye Terminator DharmaFECT Applied Biosystems Dhamarcon 36

44 Material Name Fugene HD Lipofectamine TM 2000 QIAfilter TM DNA-Midi Kit QIAfilter TM DNA-Maxi Kit Hersteller Roche Invitrogen Qiagen Qiagen Chemikalien Feststoffe Tabelle 2.11: Chemische Feststoffe Name Acrylamid Agar Agarose Ammoniumperoxidosulfat Bisacrylamid Bromphenolblau Casein Hydrolysat Citronensäure Coomassie-Brilliantblau D(+) - Saccharose DABCO (1,4-Diazabicyclo(2,2,2)-octan) EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) EGTA (Ethylenglycol-bis(ß-aminoethylether)- N,N,N',N'-tetraessigsäure) Ethidiumbromid Glucose Glycin Hefeextrakt Hersteller Roth MP Biomedicals Invitrogen Serva Roth Serva Oxoid Roth Serva Roth Merck Roth Roth Serva Roth Roth ICN Biomedicals 37

45 Material Name Hexaminkobalt(III)chlorid IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) Kaliumchlorid Kristallviolett L-Glutamin LMP Agarose Magermilchpulver MEM (Eagle s Minimum Essential Medium) Methylcellulose Natriumacetat Trihydrat Natriumchlorid Natriumdihydrogenphosphat Natriumhydroxid N-Lauroylsarkosinat Paraformaldehyd SDS (Natriumdodecylsulfat) Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-Dgalactopyranosid) Hersteller Sigma Roth Merck Merck Gibco BRL Hobbybäcker-Versand Gibco Sigma Roth Roth Roth Roth Fluka Serva Roth Invitrogen Roth Flüssigkeiten Tabelle 2.12: Flüssige Chemikalien Name Aceton Buttersäure DMSO (Dimethylsulfoxid) Hersteller Roth Roth Merck 38

46 Material Name Ethanol, 96% (vergällt) Ethanol, 99% Formaldehyd, 37% Glycerin MES (2-N-Morpholinethansulfonsäure) Phenol Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (25:24:1) 2-Propanol Salzsäure TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylendiamin) Triton X-100 Tween 20 Hersteller Roth Roth Roth Roth Sigma Roth Roth Roth Roth Sigma Serva Sigma Lösungen Medien Insect express Sf9-S2 PAA Medium ZB5/ Medium ZB5B MEM Hanks % MEM Earle % NaHCO % Natriumpyruvat % NEAS (nicht essentielle Aminosäuren) 1 % FKS 10 %/ 5 % ph 7.2; 2.5 % CO 2 39

47 Material Medium ZB15 Grace s Insect powder medium (Serva) % 50x Lactalbumin Hydrolysat (Gibco) 2 % 50x Hefeextrakt (Gibco) 2 % NaHCO % FKS 10 % ph 6.6; ca. 400 mosmol ATV NaCl 0.8 % KCl 0.04 % Dextrose 0.1 % NaHCO % Trypsin 0.05 % EDTA 0.02 % ph Methocel MEM (autoklavierbar) 0.94 % Methylcellulose 2.5 % Autoklavieren, Lösen NaHCO % in PBS 200 mm Glutamax 1 % in PBS Agarose-Overlay 2% LMP Agarose (45 C temperiert) 50 % 2x Medium % FCS 50 % 40

48 Material Lösungen und Puffer Tabelle 2.13: Zusammensetzung von Lösungen und Puffern Name Chemikalie Konzentration Acrylamidlösung für SDS-PAGE Acrylamid 30 % Bisacrylamid 1 % Annealingpuffer für Oligonukleotide NaCl HEPES, ph mm 50 mm Ammoniumpersulfatlösung Ammoniumpersulfat 10 % 2x Capsid-Lysispuffer NaCl 1M Tris-HCl, ph 7.5 EDTA 40 mm 2 mm Triton X % CBS, ph 3.0 Citronensäure 40 mm KCl NaCl 10 mm 135 mm CIP-Mix Tris 50 mm EDTA, ph mm Coomassie-Färbelösung Coomassie Brilliantblau 0.25 % Methanol 50 % Essigsäure 10 % 41

49 Material Name Chemikalie Konzentration Denaturierungslösung für DNA- Minipräparation NaOH 0.2 N SDS 1 % DNA-Probenpuffer Saccharose 60 % Bromphenolblau 0.1 % EGTA-Stammlösung EGTA 100 mm Elektrophorese Puffer ph Tris Natriumacetat EDTA-Na 3 40 mm 5 mm 1 mm Fixierlösung für Proteingele Methanol 5 % Eisessig 7.5 % Fluoreszenzerhaltungspuffer DABCO 2.5 % PBS 7.5 % Glycerol 90 % Propidiumiodid (zur Kernfärbung) 0.1 % Formalinfixierlösung Formaldehyd 5 % 42

50 Material Name Chemikalie Konzentration Glucose-EDTA Lösung für DNA- Minipräparation Glucose EDTA, ph 8.0 Tris-HCl, ph mm 10 mm 25 mm Glycerolschocklösung 2x HBS 50 % Glycerol 15 % 2x HBS, ph 7.13 HEPES 50 mm Na 2 HPO 4 NaCl 1.5 mm 280 mm IPTG-Stammlösung IPTG 20 mm Kristallviolett Färbelösung Kristallviolett 1 % Ethanol 50 % Laufpuffer für Proteingele Tris 25 mm Glycin 192 mm SDS 0.1 % Neutralisationslösung für DNA- Minipräparation, ph 4.8 Natriumacetat 3 M Paraformaldehydlösung (PFA) Paraformaldehyd 3 % (Triton X %) Lösen in PBS bei 65 C 43

51 Material Name Chemikalie Konzentration PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) NaCl KCl Na 2 HPO 4 x2h 2 O KH 2 PO mm 2.7 mm 64.6 mm 14.7 mm Pronase-Stammlösung Pronase 0.5 % Lösen in 5x Pronasepuffer, Inkubation 1h, 37 C 20x Pronasepuffer NaCl 2 M Tris-HCl, ph M Protein-Probenpuffer nach Laemmli Tris-HCl, ph mm SDS 4 % Glycerol 20 % -Mercaptoethanol 10 % Sarkosylpuffer Tris-HCl, ph mm EDTA, ph mm N-Lauroylsarkosinat 3 % Sucroselösung Saccharose 25 % Lösen in PBS 44

52 Material Name Chemikalie Konzentration TAE-Puffer Tris-HCl 0.2 M Natriumacetat EDTA 25 mm 0.01 mm TBS-T (Tris-gepufferte Salzlösung) NaCl 15 mm Tris-HCl, ph mm Tween % TE-Puffer Tris-HCl, ph mm EDTA 1 mm TEN Tris-HCl, ph mm EDTA NaCl 1 mm 150 mm Transferpuffer Tris 25 mm Glycin 192 mm SDS 0.1 % Methanol 10 % Verbrauchsmaterialien Tabelle 2.14: Verbrauchsmaterialen Name Cryoröhrchen, 1 ml Außengewinde Deckgläser, 18x18 cm Hersteller Greiner Menzel Gläser 45

53 Material Name Einweg Kanüle, 100 mm Einweg-Skalpellklinge Einweg-Spritze 10 ml Filterpapier Handschuhe; Nitril, Latex Kapillarspitzen Mikrofuge Tube, 1.5 ml Mikrotiterplatten Nitrocellulose Transfermembran Objektträger Petrischale mit Nocken Pipettenspitzen 10µl, 200µl, 1000µl Pipettenspitzen mit Filter, 10 µl, 200 µl Reagiergefäß für PCR 0.2 ml Reagiergefäß, 1.5 ml, 2.0 ml Sterilfilter Stericup Sterilfilter Millex, 45 µm Stretchfolie Ultrazentrifugenröhrchen, 38.5 ml, 17 ml Zellkulturflaschen 25cm 2, 75cm 2, 162cm 2 Zellkulturplatten, 6-well, 24-well, 48-well Zellkulturschalen, 10 cm Zellschaber Zentrifugenröhrchen 15 ml, 50 ml Hersteller TSK Paramount Surgimed LTD. Omnifix Whatman Hansa-Medical Biozym Beckman Corning Whatman Marienfeld Sarstedt Greiner, Sarstedt, Roth Biozym, Starlab Eppendorf Sarstedt Millipore Millipore Parafilm Beckman Corning Corning Corning Sarstedt Sarstedt 46

54 Material Geräte Tabelle 2.15: Laborgeräte Name Agarosegelkammer, groß Agarosegelkammer, klein Automatikpipette Bakterieninkubator Bakterienschüttler Blot-Apparatur für Nasstransfer Brutschrank für Zellkultur Chemiluminator Cryo-Freezing Container Feinwaage Fluoreszenzmikroskop Gefrierschrank -20 C Gefriertruhe -70 C Geldokumentationsgerät für Agarose-Gele Heizblock Impföse Kleinschüttler, Vortex Hersteller FLI Eigenbau Gibco Eppendorf, Gilson Heraeus Thermo Scientific Biorad Labotect, Sanyo Biorad Nalgene Sartorius Nikon Liebherr New Brunswick Scientific Herolab Eppendorf, Bachofer FLI Scientific Industries Konfokales Laserscanmikroskop Zeiss LSM 510 Kühlschrank Lichtmikroskop Magnetrührer Megafuge Mikrowelle Nanodrop Liebherr Nikon TMS Ikamag, IKA Labortechnik Heraeus Privileg Peqlab 47

55 Material Name PCR-Gerät Pipettierhilfe Proteingelkammer Rotor SW32 Rotor SW40 Schüttelinkubator Sterilwerkbank Stromversorgungsgerät Tischzentrifuge Transilluminator Ultraschallgerät Ultrazentrifuge Umwälzpumpe für Elektrophoresekammer Waage Wasserbad Wipp-Schüttler Zentrifuge für Zellkulturplatten Hersteller Biorad, MWG Eppendorf, Lab Laborfachhandel Biorad Beckman Beckman Heidorf ThermoScientific, Berner, Heraeus Biorad, Gibco Eppendorf Serva Bandelin Beckman Trixi Vibra Köttermann Edmund Bühler Hettich EDV Tabelle 2.16: Eingesetzte EDV Name Chromas Lite, 2.01 GCG ImageJ Office 2008 Primer Designer 2.0 Hersteller/ Homepage Technelysium Pty Ltd Genetics Computer Inc. Rsb.info.nih.gov/ij/ Microsoft Corporation Scientific & Educational Software 48

56 Material Name Psort II sirna-design Programm Compute pi/mw tool Zeiss LSM Image Browser Hersteller/ Homepage sirna_finder.html Carl Zeiss MicroImaging GmbH 49

57 Methoden 2.2 Methoden Arbeiten mit Zellkultur Umsetzen von Zellen Säugerzellen Die Säugerzellen wurden im Brutschrank bei 37 C und 5 % CO 2 in feuchter Atmosphäre kultiviert. Sie bilden einen Zellrasen, der mithilfe von ATV (Trypsin) abgelöst werden kann. Dazu wurde zunächst das Medium aus den Zellkulturflaschen entfernt und die Zellen mit ATV überschichtet. Nach einer Inkubationszeit von etwa 10 min bei 37 C im Brutschrank konnten die abgelösten Zellen in der ATV-Lösung resuspendiert werden. Nach Bedarf wurden diese nun zur weiteren Verwendung in geeignete Gewebekulturgefäße ausgesät. Die Umsatzrate entsprach bei den Säugerzellen 1:5. Insektenzellen Die Kultivierung der Insektenzellen erfolgte im Brutschrank bei 27 C und 5 % CO 2. Sie bilden weniger adhärente Zellrasen aus, so dass sie einfach vom Flaschenboden abgeklopft bzw. abgespült werden konnten. Sf9 Zellen wurden dabei im Medium ZB15 kultiviert und High V Zellen im Medium Insect express (PAA). Die Zellen wurden in Raten von 1:4 bis 1:6 umgesetzt Transfektion von Zellen Transfektion Für die transiente Transfektion wurden RK13-Zellen in Zellkulturplatten bis zu einer Konfluenz von ca. 70 % ausgesät. Für eine spätere Untersuchung transfizierter Zellen am konfokalen Laserscanmikroskop wurden die Zellen auf sterilen Deckgläsern in 6-well Platten kultiviert. Für die Transfektion von Plasmiden wurde die Methode der Calciumphosphat- Kopräzipitation genutzt. Hierbei wird die DNA mithilfe von Calciumphosphat auf die Zellen gefällt und dadurch leichter aufgenommen. 50

58 Methoden Zunächst wurde dafür 1 µg des gewünschten Plasmids mit 10 mm Tris-HCl, ph 7.4 verdünnt und anschließend mit 2 M CaCl 2 Lösung versetzt. Nach Zugabe von 2xHBS Lösung wurde der Transfektionsansatz für ca. 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. In dieser Zeit bildete sich ein weißer Niederschlag aus. Nach einem Mediumwechsel wurde der Ansatz anschließend gleichmäßig auf die Zellen getropft. Die Zellen wurden nun für 3-4 Stunden im Brutschrank bei 37 C inkubiert. Um die Effizienz der Transfektion zu erhöhen, wurde ein Glycerolschock mit einer 15 % Glycerollösung in 1xHBS durchgeführt. Dazu wurden die Zellen nach einmaligem Waschen mit PBS für 2 min mit der Schocklösung behandelt, welche anschließend durch 2maliges Waschen mit PBS gründlich entfernt wurde. Nach Zugabe von frischem Medium wurden die Zellen über Nacht im Brutschrank inkubiert und am nächsten Tag einem erneuten Mediumwechsel unterzogen. Transfektion zur Herstellung stabiler Zelllinien Für die Herstellung stabiler Zelllinien wurde die Transfektion der gewünschten Plasmide in einer 6-well Platte vorgenommen. Es wurden zwei parallele Ansätze angefertigt, von denen einer in der indirekten Immunfluoreszenz zur Überprüfung der Transfektion genutzt wurde. Nach einer Inkubationszeit von 2-3 Tagen im Brutschrank bei 37 C wurden die Zellen abtrypsiniert. Nach Ablösung der Zellen wurden diese gründlich resuspendiert und auf zwei 10cm Gewebekulturschalen verteilt. Zur Selektion transfizierter Zellen wurde dem Medium G418 in einer Endkonzentration von 500µl/ml zugesetzt. Nach einer Inkubationszeit von 10 bis 14 Tagen wurden Zellkolonien sichtbar, die bei ausreichender Größe gepickt wurden. Dazu wurde in einer Mikrotiterplatte je 100 µl Medium ZB5 + G418 pro well vorgelegt. Die Gewebekulturschalen wurden mit PBS gewaschen und die Zellklone mit einer Pipettenspitze vorsichtig vom Schalenboden aufgenommen. Jeder Zellklon wurde in je ein Well überführt und gut resuspendiert. Nach ca. einer Woche Inkubation im Brutschrank bei 37 C waren diese größtenteils zu einem konfluenten Zellrasen herangewachsen, der dann mit je 50 µl ATV pro well trypsiniert wurde. 25 µl davon wurden in eine neue Mikrotiterplatte übertragen. Die Replikaplatte konnte nach 24 bis 48 Stunden Inkubation mit Ethanol fixiert werden (siehe ). Darauf erfolgte ein indirekter Immunfluoreszenztest, bei dem untersucht wurde, welche Zellklone das gewünschte Protein exprimierten. 51

59 Methoden Positive Zellklone wurden markiert und vorsichtig in größere Gewebekulturgefäße überführt. Gut exprimierende Zellklone konnten nun in Zellkulturflaschen überführt und zur Lagerung bei -70 C (siehe ) bzw. zur Kryokonservierung in die Zellbank des FLI gegeben werden Konservierung von Zelllinien Um Zelllinien länger zu lagern, wurde eine Zellkulturflasche im T75 Format zunächst mit ATV trypsiniert und die abgelösten Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Die Zellen wurden anschließend sedimentiert (10 min, 2000 rpm, RT) und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde dann in 3 ml Medium ZB5 resuspendiert und vorsichtig mit 300 µl DMSO versetzt. Nach dem Aufteilen des Gemisches auf zwei Cryo-Röhrchen konnten diese im Cryo-Freezing Container eingefroren werden. Dieser sorgte durch Abkühlen von 1 C pro Minute auf -70 C für ein schonendes Einfrieren der Zellen Arbeiten mit Viren Pseudorabies Viren Virusanzucht Die Anzucht von Virus in größeren Mengen fand in Flaschen im T75 Format statt. Für PrV-Kaplan wurden PSEK Zellen und für die PrV- UL34 Deletionsmutante die komplementierende Zelllinie RK13-UL34 verwendet. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz kultiviert und anschließend mit dem entsprechenden Virus infiziert. Die Inkubation der infizierten Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37 C. Nach vollständiger Infektion aller Zellen konnten diese zum Aufschluss der Zellen bei -70 C eingefroren werden. Dies diente der Freisetzung infektiöser Partikel aus dem Zytoplasma. Nach dem Auftauen wurde die Virus-Zell- Suspension in 15 ml Zentrifugenröhrchen überführt. Durch Zentrifugation (10 min, 4000 rpm, 4 C) wurden die Zelltrümmer aus dem virushaltigen Überstand entfernt, der anschließend in 1 ml Aliquots abgefüllt wurde. Die Lagerung der Viren erfolgte bei -70 C. 52

60 Methoden Ein-Schritt-Wachstumskinetik In der Ein-Schritt-Wachstumskinetik wurden Zellen synchron infiziert und das Replikationsverhalten von verschiedenen Viren auf unterschiedlichen Zelllinien untersucht. Dazu wurden Zellen auf Zellkulturplatten im 48-well Format konfluent ausgesät und am nächsten Tag für 20 min auf Eis gekühlt. Virus wurde in Medium ZB5B verdünnt und ebenfalls im Eisbad vorgekühlt. Die Infektion erfolgte anschließend auf Eis mit einer MOI von mindestens 3. Während der Inkubationsphase von einer Stunde auf Eis können die Viren an die Zellen binden, jedoch noch nicht in die Zellen eindringen. Es folgte ein Mediumwechsel mit vorgewärmtem Medium ZB5B und Inkubation im Brutschrank bei 37 C. In dieser Zeit konnten nun die gebundenen Viren in die Zellen eindringen. Nicht penetriertes Virus wurde nach einer Stunde bei 37 C durch eine Behandlung mit CBS Lösung mit einem ph-wert von 3 inaktiviert. Dazu wurden die Zellen zunächst einmal mit PBS gewaschen und anschließend 2 min mit CBS Lösung inkubiert. Zweimaliges Waschen mit PBS bewirkte das vollständige Entfernen der Lösung. Abschließend wurde wieder warmes Medium ZB5B zu den Zellen gegeben. Danach erfolgte die Abnahme des ersten Zeitwertes. Weitere Zeitwerte wurden nach 4, 8, 12, 24 und 36 Stunden genommen. Diese wurden durch Abkratzen der Zellen vom Kulturschalenboden geerntet und anschließend mit dem Überstand in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß überführt. Alle Zeitwerte wurden bis zur Titerbestimmung bei -70 C gelagert. Plaquetest Für den Plaquetest wurden Zellen in geeigneten Gewebekulturgefäßen angezüchtet und infiziert. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde im Brutschrank bei 37 C wurde das Medium durch ¼ Methocelmedium ersetzt, welches die freie Virusausbreitung im Medium unterbindet. Die infizierten Zellen verblieben nun für 2 Tage im Brutschrank bei 37 C und konnten anschließend mithilfe einer 5 % igen Formalinlösung fixiert werden, die direkt in den Überstand auf die Zellen gegeben wurde. Gleichzeitig erfolgte durch die Fixierung die Inaktivierung von Virus in der Kultur. Im Anschluss an die 20minütige Fixierung konnte der Überstand von den Zellen abgekippt werden. Reste von Medium und Fixierlösung wurden durch Spülen der Zellen unter fließendem Wasser entfernt. Zur Färbung der Zellen wurde nun 53

61 Methoden Kristallviolett-Färbelösung auf die Zellen gegeben, die ebenfalls nach kurzer Einwirkzeit von den Zellen gespült werden konnte. Auf der Gewebekulturschale war nun der gefärbte Zellrasen zu sehen in dem durch die Infektion Plaques (erkennbar als ungefärbte Löcher im Zellrasen) erkennbar waren. Titerbestimmung Mithilfe des Plaquetestes ist es möglich, die Anzahl infektiöser Einheiten in einer Virussuspension zu ermitteln. Dazu wurden RK13 Zellen mit seriellen 1:10 Verdünnungen der Probe infiziert und ein Plaquetest durchgeführt. Nach Fixierung und Färbung der Zellen wurden anschließend in 2-3 geeigneten Verdünnungsstufen die Plaques gezählt. Unter Berücksichtigung der Menge des Inokulums und der Verdünnungsstufe wurde anschließend die Menge der infektiösen Einheiten pro Milliliter bestimmt. Plaquegrößenbestimmung Zur Charakterisierung von Viren oder Zelllinien werden unter anderem auch Plaquegrößen bestimmt. Dazu wurden pro Virus bzw. Zelllinie 50 Plaquedurchmesser unter dem Mikroskop gemessen. Die Messung wurde in drei unabhängigen Experimenten wiederholt und die Mittelwerte gebildet. Reinigung von Virus-Kapsiden Aus infizierten und transduzierten Zellen wurden PrV-Kapside gereinigt. Dazu wurden die Zellen nach Infektion bzw. Transduktion auf einer 10 cm Gewebekulturschale mithilfe eines Zellschabers abgelöst und im Medium resuspendiert. Anschließend erfolgte die Sedimentierung der Zellen durch Zentrifugation (10 min, 4000 rpm, 4 C). Das erhaltene Zellpellet wurde darauf in 2x Capsid-Lysis Puffer resuspendiert und die Zellen durch 3-maliges Einfrieren und Auftauen der Probe bei -70 C bzw. -20 C lysiert. Danach schloss sich der weitere Aufschluss durch Ultraschall (400 W, 10 s, 2 Zyklen) an. Die Zelltrümmer wurden abschließend durch Zentrifugation (5 min, 4000 rpm, 4 C) vom Überstand getrennt und dieser auf einem 30 % igen Sucrosekissen ultrazentrifugiert (1h, 25,000 rpm, 4 C). Nach vorsichtigem Lösen des Pellets erfolgte ein Auffüllen mit PBS und 54

62 Methoden erneute Ultrazentrifugation (1h, 25,000 rpm, 4 C) um die Sucrose zu entfernen. Das erhaltene Pellet wurde in PBS aufgenommen und für weitere Analysen verwendet Baculoviren Infektion und Konzentrierung von Baculoviren Baculoviren wurden in SF9 Zellen vermehrt. Dazu wurden Zellen von 1 ⅓ Zellkulturflaschen im T75 Format in 70 ml Medium ZB15 resuspendiert und anschließend mit einer MOI von 0.1 (entspricht ca. 1.3 x 10 6 pfu/ml) infiziert. Die infizierten Zellen wurden anschließend auf zwei Zellkulturflaschen im T162 Format aufgeteilt und für 6 bis 8 Tage im Brutschrank bei 27 C inkubiert. Zur Konzentrierung wurden die vollständig infizierten Zellen zusammen mit dem Medium in 50 ml Zentrifugenröhrchen überführt und die Zelltrümmer sedimentiert (20 min, 4000 rpm, 4 C). Die Überstände wurden durch ein 25 % iges Sucrosekissen zentrifugiert (90 min, 25,000 rpm, 4 C), die pelletierten Viren in PBS + aufgenommen und in 200 µl Aliquots bei -70 C gelagert. Herstellung rekombinanter Baculoviren Rekombinante Baculoviren als Expressionssystem haben den Vorteil hoher Expressionsraten sowie guter Transduktions-Effizienzen. Sie sind nicht in Lage in Säugerzellen zu replizieren, können jedoch in diese eindringen und die Genexpression starten. Für die Herstellung rekombinanter Baculoviren wurde nach den Angaben des Herstellers vorgegangen (Invitrogen). Zunächst wurde das gewünschte Gen in den Vektor pbacmamhie/mie1 kloniert und eine Plasmid-DNA Maxipräparation angefertigt. Die Überprüfung der Expression des Gens konnte mithilfe von Transfektion und indirekter Immunfluoreszenz erfolgen. Anschließend konnte die Plasmid-DNA mit dem BAC des Baculovirus rekombiniert werden. Dazu erfolgte die Transfektion der Plasmide in kompetente Baculo-Bac DNA enthaltende DH10 Bakterien. Hierbei wurden 100 µl der kompetenten Bakterien mit 1.5 µg der Plasmid-DNA versetzt. Es folgten verschiedene Inkubationen (Eisbad, 20 min; 42 C, 2 min; Eisbad, 5 min). Nach Zugabe von 900 µl SOC Medium wurden die Bakterien für 4 h bei 37 C und 300 rpm geschüttelt. Aus diesen wurde anschließend 55

63 Methoden eine Verdünnungsreihe in 1 ml SOC Medium bis 10-3 hergestellt und diese über Nacht weiter bei 37 C und 300 rpm inkubiert. Erneut wurde eine Verdünnungsreihe aus der 10-3 Verdünnung in 500 µl SOC Medium bis zur Stufe 10-5 hergestellt. Dies diente dazu, eine übersichtlichere Anzahl an Bakterienkolonien zu erhalten. Während einer zweistündigen Inkubationszeit (37 C, 300 rpm) wurden LB-Agar Platten mit Antibiotika (Kanamycin: 50 µg/ml, Tetracyclin: 10 µg/ml, Gentamycin: 7 µg/ml) für blau/weiß Selektion mit je 40 µl IPTG (100 mm) und X-Gal (40 mg/ml) behandelt (Mischen der beiden Lösungen und Ausplattieren). Nach dem Trocknen der Platten wurden je 200 µl der 10-3, 10-4 und 10-5 Verdünnung ausplattiert. Die Inkubation erfolgte über 24 h im Brutschrank und anschließend 24 h bei RT im Dunkeln. Für die Isolierung der rekombinanten Bacmid-DNA wurden vier bis sechs weiße Kolonien der Platten in je 2 ml LB mit Antibiotika (Kanamycin: 50 µg/ml, Tetracyclin: 10 µg/ml, Gentamycin: 7 µg/ml) gepickt und über Nacht geschüttelt. Die Plasmid- DNA wurde präpariert (siehe DNA-Minipräparation) und die gefällte DNA in 40 µl TE + RNase A (10 µg/ml) gelöst. Nach RNAse Verdau (30 min, 37 C) wurde die DNA Konzentration einer 1:100 Verdünnung gemessen (OD 260 nm/ OD 280 nm). DNA Präparationen, deren Quotient nach der Messung zwischen 1.6 und 1.8 liegen und die damit eine gute Qualität haben sollten, wurden für die Transfektion in High V Zellen eingesetzt. Dazu wurden diese zunächst in 6-well Platten ausgesät und für ca. 1h im Brutschrank bei 27 C inkubiert. Im Transfektionsansatz wurden 5 µg der Bacmid-DNA auf 100 µl mit A. tridest aufgefüllt und mit 6 µl Fugene HD (Roche) versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 40 min bei Raumtemperatur wurde das Transfektionsgemisch mit 900 µl Insect express Medium gemischt und gleichmäßig auf die Zellen getropft. Darauf folgte eine weitere Inkubation bei 27 C im Brutschrank für ca. 5 Stunden, nach der ein Mediumwechsel folgte. Nach etwa 3 Tagen wurden die Baculoviren auf den Zellen durch Autofluoreszenz des exprimierten GFP-Proteins sichtbar. Der Überstand der High V Zellen wurde nun für die Plaquereinigung verwendet. Die Plaquereinigung wurde auf Sf9 Zellen durchgeführt, die zunächst in einer 6-well Platte konfluent ausgesät wurden. Nach einer Anheftungszeit von ca. 20 bis 30 min im Brutschrank bei 27 C wurde der Transfektionsüberstand in den Verdünnungsstufen von 10 0 bis 10-2 auf die Zellen gegeben und die infizierten Zellen für 1 bis 2 Stunden im Brutschrank bei 27 C inkubiert. Für den anschließenden Agarose-Overlay wurde der Überstand von den Zellen gesaugt, die Agarose-Overlay 56

64 Methoden Lösungen zügig vermischt und vorsichtig auf die Zellen gegeben. Nachdem der Overlay bei Raumtemperatur ausgehärtet war, wurden die Zellen für drei Tage im Brutschrank bei 27 C inkubiert. Auf den Zellen entstandene Plaques konnten nun unter dem Fluoreszenzmikroskop angezeichnet werden. Zum Picken der Plaques wurde jeweils 1 ml Medium ZB15 in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß vorgelegt, in die die gepickten Plaques pipettiert wurden. Anschließend wurden die Reaktionsgefäße mit den Plaques für 30 min bei RT auf dem Schüttler inkubiert, so dass die enthaltenen Viren im Medium suspendiert wurden. Die Virusanzucht erfolgte anschließend in Sf9 Zellen in einer Zellkulturflasche im T25 Format. Dazu wurde der gesamte Ansatz zum Medium mit den Zellen in die Flasche gegeben. Nach vollständiger Infektion aller Zellen (5 bis 7 Tage im Brutschrank bei 27 C) wurde der Überstand mit den Zellen geerntet und in 2 ml Reaktionsgefäßen bei -70 C gelagert. Aus der Plaquereinigung wurde für die Anzucht von Virus- Konzentrat der TCID 50 bestimmt. Dafür wurden die Viren in einer absteigenden Verdünnungsreihe von 10-1 bis 10-8 verdünnt und in 6 Parallelen zu je 100 µl auf eine Mikrotiterplatte pipettiert. Nach Zugabe von 25 µl Zellsuspension pro Well folgte eine Inkubation von 3 Tagen im Brutschrank bei 27 C. Zur Auswertung wurden nun die infizierten Wells gezählt. Folgende Formel zur Bestimmung des TCID 50 wurde genutzt: TCID50 = D (n/p + 0.5) x 1/Probenvolumen in ml D Verdünnungsfaktor n Anzahl positiver Wells p Anzahl der Parallelwerte Die plaquegereinigten Viren wurden anschließend zur Anzucht verwendet. Transduktion von Säugerzellen Zur Expression der gewünschten Proteine wurden die rekombinanten Baculoviren in RK13 Zellen transduziert. Die Zellen wurden dazu in Zellkulturplatten im 24-well Format zu einer Konfluenz von ca. 80 % ausgesät. Nach dem Waschen mit PBS + wurden die Baculoviren auf die Zellen gegeben. Die Transduktion der Viren erfolgte mit einer MOI von 10 verdünnt in PBS + auf ein Gesamtvolumen von 350 µl. Durch Schütteln der Zellkulturplatte bei 300 rpm und C für 30 min war eine gute 57

65 Methoden Verteilung der Viren auf den Zellen gewährleistet. Anschließend wurden diese zusätzlich auf die Zellen zentrifugiert (1h, 600 g, 26 C). Der Überstand wurde dann abgesaugt und durch Medium ZB5 + 5 mm Butyrat ersetzt. Nach einer Inkubationszeit von 16 h im Brutschrank bei 37 C erfolgte ein Mediumaustausch gegen Medium ZB Arbeiten mit Bakterien Kultivierung von Bakterien Die Vermehrung von Bakterien erfolgte in LB Medium, welches mit entsprechenden Antibiotika versetzt wurde. Für eine kurzfristige Lagerung der Bakterien wurden diese auf LB Agarplatten mit Antibiotikum ausgestrichen. Für Flüssigkulturen wurde ein Reagenzglas mit 2 ml LB-Medium und Antibiotikum mit jeweils einer Bakterienkolonie beimpft. Plasmid-Midi-, bzw. Maxipräparationen erfolgten in 50 ml bzw. 100 ml LB- Medium welche aus einer Vorkultur beimpft wurden. Die Anzucht erfolgte über Nacht entweder im Brutschrank oder im Schüttelinkubator bei 200 rpm und 37 C Transformation kompetenter Bakterien Zur Vermehrung von Plasmiden wurden diese in Bakterien transformiert. Die dazu notwendigen kompetenten Bakterien (E. coli DH5 ) lagerten bei -70 C und wurden auf Eis aufgetaut. Anschließend erfolgte die Zugabe der DNA. Während einer Inkubationszeit von 20 bis 30 min im Eisbad und dem anschließenden Hitzeschock für 2 min bei 42 C erfolgte die Aufnahme der DNA in die Bakterien. Nach einem kurzen Abkühlen der Bakterien auf dem Eisbad wurde LB-Medium zugesetzt und für eine Stunde bei 37 C im Heizblock inkubiert. Danach wurden die Bakterien auf LB- Agar Platten mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert. Nach Inkubation über Nacht im Brutschrank bei 37 C waren Bakterienkolonien sichtbar. 58

66 Methoden Arbeiten mit DNA Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien DNA-Minipräparation Aus einer Über-Nacht Kultur mit 2 ml LB-Medium und entsprechendem Antibiotikum, das mit einer Bakterienkolonie beimpft wurde, wurden 1.5 ml der Bakteriensuspension in ein 1.5 ml Reaktionsgefäß abgefüllt. Die Bakterien wurden sedimentiert (13,200 rpm, RT, 2 min) und das Pellet in 200 µl Glucose-EDTA Lösung aufgenommen. Durch Zugabe von 200 µl Lösung 2 (1 % SDS, 0.2N NaOH) wurden die Zellen lysiert. Anschließende Neutralisation mit 300 µl 3M Natriumacetat, ph 4.8 für 10 min im Eisbad bewirkte eine Renaturierung der Plasmid-DNA, nicht aber der chromosomalen DNA. Durch Zentrifugation (13,200 rpm, RT, 10 min) wurden Zelltrümmer und die chromosomale DNA aus der Plasmidlösung entfernt und die Plasmid-DNA konnte durch Zugabe von 450 µl Isopropanol gefällt und pelletiert werden (13,200 rpm, RT, 15 min). Zur Reinigung der DNA von Salzen wurde das Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen, erneut zentrifugiert (13,200 rpm, RT, 5 min) und getrocknet. Die DNA wurde in 50 µl in A. tridest mit 0.05 mg/ml RNase A resuspendiert. DNA-Midi- und Maxipräparation Die Präparation von Plasmiden in größeren Mengen erfolgte mithilfe des QIAfilter DNA-Midi- bzw. Maxi-Kits nach Herstellerangaben Isolierung viraler DNA Infizierte Zellsuspensionen wurden zentrifugiert (5min, 4000rpm), das Pellet in 1 ml TEN resuspendiert und mit 500 µl Sarkosylpuffer versetzt. Nach 15 min Inkubation bei 65 C wurden 10 µl einer 5 mg/ml RNase A Lösung dazu pipettiert. Der RNase Verdau erfolgte für 30 min bei 37 C. Proteine wurden durch Zugabe von 400 µl Pronase und Inkubation bei 45 C für mindestens 2 h verdaut. Der Ansatz wurde anschließend mit dem gleichen Volumen Phenol versetzt. Eine Phasentrennung erfolgte durch Zentrifugation (13,000 rpm, RT, 4 min). Die wässrige, obere Phase, welche die DNA enthält, wurde mit dem gleichen Volumen Phenol-Chloroform 59

67 Methoden versetzt und abermals zentrifugiert (13,000 rpm, RT, 4 min). Phenolreste wurden anschließend durch Zugabe des gleichen Volumens TE-gesättigtem Ether entfernt (13,000 rpm, RT, 4 min). Die obere Etherphase wurde verworfen. Die Fällung der DNA erfolgte durch Zugabe von 1/10 Volumen Natriumacetat (3 M, ph 5.2) und mindestens 2.5 Volumen Ethanol (96-99 %, -20 C). Nach Fällung bei -20 C (über Nacht) oder -70 C (30 min) wurde die DNA abzentrifugiert (13,000 rpm, 4 C, 30 min) und mit 70 % Ethanol gewaschen (13,2000 rpm, 4 C, 5 min). Das getrocknete Pellet wurde in ca. 300 µl Tris HCl, ph 8.5 resuspendiert und die DNA konnte bei -20 C gelagert werden PCR Amplifikation von DNA-Fragmenten Die Amplifikation von DNA Fragmenten erfolgte in Ansätzen zu je 25 µl. Pro Ansatz wurde ein einheitliches Pipettierschema angewandt. Tabelle 2.17: Pipettierschema zur Amplifikation von DNA Reagenz Konzentration Menge pro PCR-Ansatz High Fidelity Puffer 10 x 2.5 µl Enhancer 10 x 2.5 µl Template 100 ng 0.5 µl Primer forward 1 µg/µl 0.75 µl Primer reverse 1 µg/µl 0.75 µl dntps 10 mm 0.75 µl Magnesiumsulfat 50 mm 0.5 µl A. tridest 16.5 µl Platinum Pfx Polymerase 2.5 U/µl 0.25 µl 60

68 Methoden Der Ablauf der Amplifikation erfolgte ebenfalls einheitlich: Tabelle 2.18: Parameter zur Durchführung der PCR Schritt Temperatur Zeit Zyklenanzahl Denaturierung 94 C 2 min 1 Denaturierung 94 C 2 min Annealing 55 C 1 min Elongation 72 C 1 min Elongation 72 C 4 min 1 Fusions-PCR Zur Herstellung chimärer Gene wurde das System der Fusions-PCR genutzt. Dazu wurden Primer erstellt, die im gewünschten Bereich der Fusion überlappen (Primer 2 und 3). In einem ersten Amplifikationsschritt wurden so zwei Produkte gebildet, die an ihren Enden komplementär zueinander sind (A und B). In der darauf folgenden Fusions-PCR wurden nun beide PCR-Produkte aus der ersten PCR (PCR 1) als Template eingesetzt und mithilfe eines vorwärts- und rückwärtsgerichteten Primers (Primer 1 und 4) ein fusioniertes Amplifikat erstellt. Amplifikation der einzelnen Gene mit überhängenden komplementären Enden Amplifikation mit Templates A und B aus PCR1 61

69 Methoden Abb. 2.1: Schema der Fusions-PCR. Durch die Gliederung der PCR in mehrere Teilschritte war es möglich, eine Genfusion herbeizuführen. Dazu wurden überlappende Primer (Primer 2 und 3) generiert, die in der PCR 1 überhängende komplementäre Enden schufen. Die beiden Amplifikate A und B aus der PCR 1 wurden anschließend als Template für die PCR 2 eingesetzt. Nach der Denaturierung interagieren die komplementären Enden der beiden Amplifikate, können als Primer für die Verlängerung der Teilstücke dienen, das dann wiederum durch Nutzung der Primer 1 und 4 vermehrt werden kann Bestimmung der DNA-Konzentration Um die Konzentration von Nukleinsäuren in einer Probe zu bestimmen wurde das Nanodrop-Spektrophotometer genutzt. Dazu wurden 2 µl der Probe für die Messung eingesetzt. Als Leerwert diente der Puffer, der auch zum Lösen der DNA genutzt wurde. Das Nanodrop-Spektrophotometer misst in den Schichtdicken von 1 mm und 0.2 mm. Die Reinheit der DNA wurde zusätzlich durch den Quotient aus den Extinktionen bei 260 und 280 nm bestimmt. Dieser sollte zwischen 1.6 und 1.8 liegen Spaltung von DNA durch Endonukleasen Zur Analyse und/ oder Weiterbearbeitung wurde die DNA enzymatisch mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen gespalten. Analytische Spaltungen wurden dazu in einem 20 µl Ansatz durchgeführt, während präparative Spaltungen in 50 µl Ansätzen erfolgten Klenow Behandlung von überhängenden Enden Nach endonukleolytischer Spaltung von DNA entstandene überhängende Enden können durch die Polymerase I (Large Fragment Klenow ) optional aufgefüllt oder abgebaut werden. Durch deren Exonuklease-Funktion ist es möglich, 3 -überhängende Enden abzubauen. Die Polymerase-Funktion des Enzyms ermöglicht es außerdem, überhängende 5 -Enden aufzufüllen. Dazu ist es notwendig, zum Ansatz dntps hinzuzufügen. 62

70 Methoden Tabelle 2.19: Pipettierschema zur Klenow-Behandlung von DNA Reagenz Menge DNA in A. tridest 25 µl 1 mm dntps 1 µl NEB Puffer 2 3 µl Klenow Polymerase 1 µl Nach einer Inkubationszeit von 30 min bei Raumtemperatur erfolgte die Inaktivierung des Enzyms bei 75 C Behandlung mit alkalischer Phosphatase Um nach einer enzymatischen Spaltung die DNA zu dephosphorylieren, wurde diese mit alkalischer Phosphatase behandelt. Dies verhindert eine Religation von Plasmiden. Dazu wurde der Spaltansatz mithilfe des CIP-Mix Puffers auf 270 µl aufgefüllt und anschließend mit 1 µl des Enzyms versetzt. Je nach Vorliegen der Enden wurde nun anders verfahren: Tabelle 2.20: Behandlung mit alkalischer Phosphatase Überhängende Enden Glatte Enden 30 min, 37 C 30 min, 56 C Zugabe von 1 µl Enzym 30 min, 56 C 30 min, 56 C Die Inaktivierung des Enzyms erfolgte anschließend durch Zugabe von 30 µl 100 mm EGTA und Inkubation des Ansatzes bei 65 C für 10 min. Für die Vorbereitung einer blunt end Ligation wurde der Ansatz zusätzlich phenolisiert Ligation Durch die Ligation werden DNA-Enden zusammengefügt. Dazu wurde bei einer sticky end Ligation, welche durch überhängende DNA-Enden charakterisiert ist, 63

71 Methoden anders verfahren als bei einer blunt end Ligation. Vor der blunt end Ligation konnte optional ein Phenolisierungsschritt erfolgen, bei dem Vektor und Insert zusammen gefällt wurden. Tabelle 2.21: Pipettierschema zur Ligation Sticky end Ligation Blunt end Ligation 20 µl A. tridest 20 µl Insert 39.5 µl DNA in A. tridest 5 µl Vektor 2.5 µl BSA 5 µl 10 x Ligasepuffer 5 µl 10 x Ligasepuffer 1 µl Ligase 3 µl Ligase Inkubation über Nacht bei 16 C 10 min 37 C 1 h RT über Nacht 4 C Elektrophoretische Trennung von DNA Die Größenbestimmung von DNA-Fragmenten erfolgte durch deren elektrophoretische Auftrennung in einem Agarose-Gel. Je nach Größe der Fragmente wurde die Agarose in einer Konzentration von 0.8 % (zum Beispiel für Plasmide oder Virus-DNA) bis zu 2 % (für kleine Fragmente von ~500 bp) eingesetzt. Die DNA wurde entweder in Minigelapparaturen für ca. 1 h bei 100 V oder über Nacht in großen Gelkammern bei 40 bis 50 V, abhängig von der Größe der zu erwartenden Fragmente, aufgetrennt. Vor dem Auftragen wurde die DNA mit DNA- Probenpuffer versetzt. Als Größenstandard diente die 1 kb ladder. Nach dem Lauf wurde die DNA mit dem interkalierenden Farbstoff Ethidiumbromid in einer Konzentration von 0.2 µg/µl gefärbt. Anschließend konnte die DNA unter UV- Licht durch Anregung des Ethidiumbromids sichtbar gemacht werden Extraktion von DNA aus Agarosegelen Die Extraktion von DNA aus Agarosegelen wurde mithilfe von Phenol vorgenommen. Dazu wurde die entsprechende DNA Bande mit einem Skalpell ausgeschnitten, das 64

72 Methoden Gelstück zunächst zerkleinert und mit dem gleichen Volumen Phenol versetzt. Dabei entsprechen 100 mg Gel etwa 100 µl Phenol. Nach gutem Durchmischen wurde das Phenol-Agarosegel Gemisch in flüssigem Stickstoff für etwa 30 Sekunden eingefroren und sofort zentrifugiert (25 min, 13,000 rpm, RT). Anschließend wurde die obere wässrige Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit der gleichen Menge Chloroform-Isoamylalkohol versetzt, gemischt und zentrifugiert (2 min, 13,000 rpm, RT). Nun erfolgte erneut die Überführung der oberen wässrigen Phase in ein neues Reaktionsgefäß. Die DNA wurde durch Zugabe von 3 Volumen Ethanol und 0.1 Volumen Natriumacetat (3 M, ph 5.2) für 30 min bei -70 C oder über Nacht bei -20 C gefällt. Die durch anschließende Zentrifugation pelletierte DNA (15 min, 13,000 rpm, RT) wurde nach dem Waschen mit 70 % Ethanol (5 min, 13,000 rpm, RT) getrocknet und in einem entsprechenden Volumen A. tridest gelöst Sequenzierung von DNA Zur Überprüfung von PCR Reaktionen und Klonierungen wurden die DNA- Sequenzen überprüft. Hierfür wurde das BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit verwendet. Folgendes Pipettierschema und Temperaturparameter kamen zur Anwendung: Tabelle 2.22: Pipettierschema zur Sequenzierung von DNA Reagenz Menge A. tridest 2-4 µl 5x Sequenzierungspuffer 1 µl BigDye 2 µl Primer (5 pmol) 1 µl DNA 2-4 µl ( ng) 65

73 Methoden Tabelle 2.23: Parameter zur Durchführung der Sequenzierung Schritt Temperatur Zeit Zyklenanzahl Denaturierung 96 C 1 min 1 Denaturierung 96 C 15 sec Annealing 55 C 15 sec 30 Elongation 60 C 15 sec Elongation 60 C 3 min 1 Die Anschließende Reinigung der Proben erfolgte mithilfe von kommerziellen Säulen (Sigma Spin TM Post-Reaction Clean Up Columns) nach Herstellerangaben. Aus der Probe wurden 10 µl mit 10 µl HiDi-Formamid versetzt und diese anschließend durch das Sequenzierlabor des FLI, Insel Riems analysiert. Die Auswertung des Sequenzchromatogramms erfolgte mithilfe des Programms Chromas Lite Arbeiten mit RNA Klonierung von Oligonukleotiden zur Synthese von shrna Für die Hemmung der Expression des zellulären Proteins p97 in Rattenzellen wurde shrna eingesetzt. Zur Synthese dieser wurden Oligonukleotide entsprechend des Protokolls des Herstellers in den Vektor psuper kloniert. Dieser Vektor enthält einen Polymerase-III H1 RNA Promotor der die Expression der shrna steuert. Die RNA aus dem klonierten Oligonukleotid bildet eine stem-loop Struktur aus, die nach Spaltung durch den zellulären DICER Komplex zur sirna führt. Die komplementären Oligonukleotide wurden zunächst zusammengefügt (Annealing). Dazu wurden je 1 µg der Oligonukleotide mit 48 µl Annealing Puffer vermischt und 4 min bei 90 C inkubiert. Nach einer weiteren Inkubation für 10 min bei 70 C wurde die Mischung langsam auf 4 C abgekühlt. Parallel erfolgte die Linearisierung des Vektors psuper bzw. pegfp-h1pb. Dazu wurden 3 µg Plasmid mit HindIII und BglII enzymatisch gespalten und nach Separierung auf einem 0.8 % igen Agarosegel mithilfe von Phenol extrahiert (siehe ). Anschließend wurden die so vorbereiteten Oligonukleotide mit dem Vektor ligiert: 66

74 Methoden Tabelle 2.24: Pipettierschema zur Ligation von Oligonukleotiden Reagenz Menge A. dest. 5 µl Oligonukleotide 2 µl psuper/ pegfp-h1pb 1 µl 10 x Ligasepuffer 1 µl Ligase 1 µl Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde bei Raumtemperatur wurde der Ligationsansatz in kompetente Bakterien transformiert und Ampicillin-resistente Klone selektiert. Positive Klone konnten durch anschließende Restriktion von DNA- Minipräparation mit HindIII und BglII ermittelt werden Design von sirna Für die Selektion geeigneter sirnas wurde die kodierende Region des Gens ermittelt (CDS coding sequences) und diese in ein online verfügbares Design-Programm eingegeben ( sirna_finder.html). Die zur Verfügung stehenden Parameter zur Selektion geeigneter Sequenzen wurde genutzt, um die Suche weiter einzuschränken. Für eine optimale Bindung der sirna an die Zielsequenz wurde ein mittlerer GC-Gehalt gewählt, der im Optimum zwischen 40 und 50 % liegen sollte. Damit die sirna in ihrer gesamten Länge eine verhältnismäßig gleichmäßige Bindung erreicht, sind auch Sequenzen, die mehr als vier aufeinander folgende Thymin- oder Adenin-Reste aufweisen, ungeeignet. Die anschließend vom Programm angebotenen Sequenzen (je nach Gen etwa 50) können durch weitere Parameter eingeschränkt werden, um optimal wirksame sirnas zu erhalten. Da durch die sirna ein Abbruch der Proteinsynthese erreicht werden sollte, sollte die Bindung im ersten Drittel des Gens erfolgen (ab 50 Nukleotide abwärts des Startkodons). Weiterhin ist es von Vorteil, wenn die Sequenz mit einem AA, gefolgt von G oder C, beginnt. Im Gegensatz dazu sollte die sirna Sequenz nicht mit TT oder AT enden. 67

75 Methoden Arbeiten mit Proteinen Herstellung von Zelllysaten Für die Untersuchung sowohl zellulärer als auch viraler Proteine wurden Zellen in einer geeigneten Gewebekulturschale ausgesät. Nach Auswachsen der Zellen zu einem Zellrasen konnten diese nach Bedarf infiziert oder transduziert werden. Die Ernte der Zellen erfolgte durch vorsichtiges Abkratzen des Zellrasens mit einer Pipettenspitze oder einem Zellschaber und Überführung in geeignete Zentrifugenröhrchen. Durch Zentrifugation (2 min, 13,000 rpm, RT) wurden die Zellen sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet durch zweimaliges Waschen mit PBS und Zentrifugieren (2 min, 13,000 rpm, RT) von Mediumresten befreit. Anschließend wurde das Pellet in einer geeigneten Menge PBS aufgenommen und die gleiche Menge SDS-Proteinprobenpuffer hinzugefügt, um eine Lyse der Zellen zu erreichen. Die anschließende Behandlung mit Ultraschall bewirkte eine Fragmentierung der zellulären DNA in der Probe. Durch das enthaltene ß-Mercaptoethanol werden Disulfidbrücken gelöst, SDS bewirkt eine stark negative Ladung der Proteine Fixierung von Zellen Für die Überprüfung der Expression von Proteinen durch Immunfluoreszenz wurden die Zellen nach Transfektion, Transduktion oder Infektion fixiert. Hier standen drei Fixierungsmethoden zur Verfügung, welche nach Bedarf zum Einsatz kamen. Die Fixierung der Zellen mit Alkoholen oder Aceton hat den Effekt, dass die Membranen der Zellen geöffnet werden und dadurch eine gute Antigenerkennung durch den Antikörper erfolgen kann. Ein Nachteil besteht darin, dass die zelluläre Struktur weniger gut erhalten bleibt. Zusätzlich kann die Fixierung mit Aceton nur auf Deckgläsern erfolgen, da das Lösungsmittel für Kunststoffe nicht geeignet ist. Für die Fixierung mit Ethanol oder Aceton wurde das Medium von den Zellen abgenommen und diese vorsichtig mit PBS gewaschen. Anschließend wurde eiskalter Ethanol bzw. Aceton auf die Zellen gegeben und für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Abnehmen des Ethanols bzw. Acetons konnte die Gewebekulturschale mit den fixierten Zellen getrocknet und entweder im Kühlschrank oder bei -20 o C aufbewahrt werden. 68

76 Methoden Die Untersuchung der subzellulären Lokalisierung der Proteine erfolgte mit Zellen, die mit Paraformaldehyd fixiert wurden. Diese Fixierungsmethode ist von Vorteil, wenn die Zellstruktur erhalten bleiben soll. Ebenso bleiben die Emissionen der Autofluoreszenzproteine wie egfp und mcherry erhalten. Zur Fixierung wurden die Zellen nach dem Waschen mit PBS zunächst 20 min mit 3 % Paraformaldehyd inkubiert und für die Permeabilisierung eine weitere Inkubation für 10 min mit 3 % Paraformaldehyd % Triton X-100 angeschlossen. Reste der Fixierungsreagenzien wurden durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt. Da durch die Fixierung von Zellen Antigene maskiert werden können, hängt die Art der Fixierung im Wesentlichen vom Antigen bzw. dessen Erkennung durch den Antikörper ab. Daher sind die Fixierungsmethoden den Antigenen anzupassen Indirekter Immunfluoreszenztest In fixierten Zellen können durch die indirekte Immunfluoreszenz Proteine nachgewiesen werden. Dazu wurden die Zellen nach der Fixierung (siehe ) 3- mal mit PBS gewaschen und mit dem Erstantiserum für eine Stunde auf dem Wipp- Schüttler inkubiert. Nach erneutem 3-maligem Waschen mit PBS erfolgte die Inkubation mit einem fluoreszenz-gekoppelten Zweitantiserum für 30 min auf dem Wipp-Schüttler. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellen mit Fluoreszenzerhaltungspuffer bedeckt. Optional konnte dieser mit dem DNA Farbstoff Propidiumiodid versetzt werden Konfokale Laserscanmikroskopie Folgende Einstellungen wurden für die verschiedenen Farbstoffe angewandt: Tabelle 2.25: Einstellung des konfokalen Laserscanmikroskops Farbstoff Anregung Filter Alexa nm BP Alexa nm BP TO-PRO nm LP

77 Methoden Zur Aufnahme der Bilder wurde die Software Zeiss LSM Image Browser angewandt, während die Bearbeitung der Aufnahmen mit dem Programm Image J erfolgte SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Auftrennung von Zelllysaten Mithilfe der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist es möglich, Proteingemische nach ihrer Größe aufzutrennen. Dazu wurden Zelllysate (siehe ) zunächst für 3 min bei 95 C erhitzt, um eine vollständige Denaturierung zu erreichen. Die Proben wurden in die ins Sammelgel eingelassenen Taschen pipettiert. Als Größenstandard wurden 5 µl der Prestained Protein Ladder genutzt. Die Auftrennung der Gele erfolgte bei 200 V für min. Als Orientierung diente dazu die Lauffront des Bromphenolblaus aus dem Proteinprobenpuffer, welches ein Molekulargewicht von ca. 700 Da hat. Coomassie-Färbung von Gelen Für die Färbung von Proteinen kann nach der SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese das Gel mithilfe von Coomassieblau gefärbt werden. Dazu wurde nach dem Lauf das Sammelgel entfernt und das Trenngel zunächst für 20 min in Fixierlösung auf dem Wipp-Schüttler inkubiert. Anschließend wurde das Gel für ca. 30 min oder über Nacht auf dem Wipp-Schüttler mit der Coomassie-Färbelösung gefärbt. Die Entfärbung des Gels erfolgte mit A. dest oder Fixierlösung. Western Blot Die aufgetrennten Proteine aus dem SDS-Polyacrylamid-Gel können auch elektrophoretisch auf eine Membran übertragen werden, um anschließend über Immunreaktion spezifisch Proteine nachzuweisen. Für den Nasstransfer wurden Gel und Membran in Transferpuffer getränkt und in die Halter-Kassetten gespannt. Zusammen mit einem Kühlakku erfolgte der Proteintransfer bei 100 V für 1 h. Für eine optimale Kühlung sorgte die Durchmischung des Transferpuffers auf einem Magnetrührer. Nach dem Nasstransfer wurde die Membran für 30 min in einer 6 % Magermilchlösung (Magermilchpulver in TBS-T gelöst) geblockt. Dies verhinderte die unspezifische Bindung von Antikörpern auf der Membran. 70

78 Methoden Anschließend erfolgte die Inkubation der Membran mit dem Erstantiserum gegen das gesuchte Protein. Hierfür wurden polyklonale Antiseren aus Kaninchen oder Maus, bzw. monoklonale Antiseren aus der Maus genutzt und in TBS-T entsprechend verdünnt. Die Inkubation erfolgte für eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Wipp- Schüttler. Anschließend wurde nicht gebundener Antikörper durch Waschen mit TBS-T entfernt (3 x 5 min) und die Membran für 30 min mit einem Peroxidasegekoppelten anti-kaninchen oder anti-maus Antiserum inkubiert. Nach erneutem Waschen mit TBS-T (3 x 5 min) wurde die gebundene Peroxidase mit Peroxidase- Substrat gemäß der Herstellerangaben angeregt. Die Reaktion konnte anschließend in einem Geldokumentationsgerät detektiert werden Identifizierung von Proteinen über Massenspektrometrie Mithilfe der Matrix-assoziierten Laserdesorptions/Ionisations (MALDI)-TOF (time of flight)-analyse war es möglich, Proteine anhand der Größe ihrer Spaltprodukte zu identifizieren. Dazu wurden die im Coomassie-Gel (siehe Coomassie- Färbung von Gelen) gefärbten Proteinbanden ausgestochen. Der anschließende Verdau durch Trypsin und die Analyse der Proben erfolgte durch das Labor Dr. Karger, FLI, Insel Riems. 71

79 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Studien zu funktionellen Domänen des UL34 Proteins Das virale Protein UL34 lokalisiert als Typ-II Membranprotein während der Infektion in die Kernmembran der Wirtszelle. Seine Funktion besteht in der Interaktion mit dem löslichen pul31 zur Bildung des Kernfreisetzungskomplexes an der inneren Kernmembran (nuclear egress complex, NEC) und damit der Freisetzung viraler Kapside aus dem Zellkern (Klupp et al., 2000; 2007). Da pul34 auch in Abwesenheit anderer viraler Proteine in die Kernmembran integriert wird, ist anzunehmen, dass es ähnliche Lokalisierungsmotive wie zelluläre Proteine der inneren Kernmembran wie z.b. der Lamin-B-Rezeptor (LBR), Emerin und das Lamina-assoziierte Polypeptid (Lap)2ß besitzt. Um zu testen welche Bereiche von pul34 dabei virusspezifisch sind und welche durch ähnliche Bereiche zellulärer Proteine ausgetauscht werden können, wurden chimäre Proteine hergestellt. Dazu wurde zunächst die Transmembrandomäne von pul34 gegen die der zellulären Proteine LBR, Emerin und Lap2ß ausgetauscht. Da es sich zeigte, dass dies ohne Funktionsverlust möglich war, wurden Chimären zwischen pul34 und Lap2ß generiert, in denen größere Teile des C- aber auch des N-Terminus ausgetauscht wurden. Diese chimären Proteine wurden im Hinblick auf ihre Lokalisierung und Interaktionseigenschaften mit pul31 charakterisiert. Wachstumskinetiken, Plaquegrößenvergleiche und ultrastrukturelle Analysen mit der PrV- UL34- Deletionsmutante auf den exprimierenden Zelllinien dienten der Aufklärung der Funktionalität während der Replikation (Schuster et al., 2012) Herstellung der UL34-Chimären Generierung der chimären Gene durch Fusions-PCR Chimäre Gene aus Teilen des PrV UL34 und Genen, die für zelluläre Kernmembranproteine kodieren, wurden mit Hilfe der Fusions-PCR (siehe Fusions PCR) generiert. Dazu wurden in einer ersten PCR die beiden Anteile mit überlappenden Enden getrennt amplifiziert, die in einer zweiten PCR nach dem Annealing der beiden Produkte aus der ersten PCR mit den entsprechenden Primern komplettiert wurde. 72

80 Ergebnisse Zunächst wurden chimäre Gene konstruiert, in denen der für die Transmembrandomäne des pul34 kodierende Bereich, der zwischen den Codons 245 und 261 vorhergesagt ist, durch die entsprechenden Regionen inklusive der 3 nachfolgenden kodierenden Regionen verschiedener Gene zellulärer Kernmembranproteine ausgetauscht wurde. Hierfür wurden die Bereiche, die für die erste vorhergesagte Transmembrandomäne (TM) des Lamin-B-Rezeptor (LBR) und neun nachfolgende Aminosäuren, die TM von Emerin mit 11 C-terminalen Aminosäuren, sowie für die TM von Lap2ß mit 22 C-terminalen Aminosäureresten kodieren, amplifiziert (siehe Abb. 3.1). LBR (615 aa, 71kD) LamB BD TM Emerin (254 aa, 25kD) LEM LamA BD TM pul34 (262 aa, 28kD) Lap2ß (452 aa, 50kD) LEM-like LEM LamB BD TM TM Abb. 3.1: Schematische Darstellung der zellulären Kernmembranproteine und PrV pul34. Die offenen Leserahmen mit der vorhergesagten Anzahl der Aminosäuren, Molekulargewicht, Transmembrandomänen (TM; TM-1 bis 8 bei LBR), sowie ausgewählten funktionellen Domänen sind schematisch dargestellt. Dazu gehören die Lamin A Bindedomäne (LamA BD) des Emerin (Clements et al., 2000; Fairley et al., 1999), die Lamin B Bindedomänen (LamB BD) von Lap2ß (Furukawa, 1999; Furukawa und Kondo, 1998) und Lamin-B-Rezeptor (LBR, Olins et al., 2010) sowie die LEM und LEMlike Domänen von Emerin und Lap2ß (Furukawa et al., 1998; Lin et al., 2000; Shumaker et al., 2001). Die Zahlen entsprechen den Aminosäurepositionen (LBR: GenBank Acc.No.: AAA59494; Emerin: 73

81 Ergebnisse GenBank Acc.No.: NP_000108; Lap2ß: GenBank Acc.No.: NP_037019; pul34: GenBank Acc.No.: BK001744). Zur Untersuchung der Transmembrandomäne von pul34 wurden zunächst chimäre Gene konstruiert, in denen die Sequenz von UL34 mit den Sequenzen der Transmembrandomänen inklusive darauf folgender nukleoplasmatischer Domänen von LBR, Emerin und Lap2ß ersetzt wurde. Für die Generierung von UL34-LBRTM wurde zunächst in der ersten PCR der 5 -Bereich des UL34-Gens, der für die Aminosäuren 1 bis 244 bis zur vorhergesagten Transmembrandomäne kodiert, mit den Primern UL34-for und UL34- LBRTM-rev (siehe 2.1.8) amplifiziert, sodass ein Fragment mit einer Größe von 764 bp entstand. In einer parallelen PCR wurde mit den Primern UL34-LBRTM-for und LBR-rev der Bereich, der für die erste Transmembrandomäne und neun nachfolgende Aminosäuren des LBR kodiert und 107 bp umfasst, vervielfacht. Die Primer UL34-LBRTM-rev und UL34-LBRTM-for sind zueinander komplementär, sodass nach der ersten PCR die beiden Produkte passende Enden aufweisen. In einer zweiten PCR wurde nach dem Annealing und Elongation der beiden PCR Produkte über diese passenden Enden das gesamte Konstrukt UL34-LBRTM mit den Primern UL34-for und LBR-rev amplifiziert. Das so entstandene PCR Produkt hatte eine Größe von 831 bp. Für den Austausch der TM von pul34 durch die entsprechende Region des Emerin wurden die ersten PCRs mit den Primern UL34-for und UL34-EMDTM-rev (siehe 2.1.8, Fragmentgröße 764 bp) und UL34-EMDTM-for und EMD-rev (Fragmentgröße 117 bp) amplifiziert. Die Fusions-PCR mit den Primern UL34-for und EMD-rev ergab ein 841 bp großes Fragment. Für den Austausch der pul34 TM durch den entsprechenden Bereich des Lap2ß wurden die Primer UL34-for und UL34-Lap2ß-rev (Fragmentgröße 764 bp) und die Primer UL34-Lap2ß-for und Lap2ß-rev (Fragmentgröße 184 bp) verwendet. In der anschließenden Fusions-PCR wurden die Primer UL34-for und Lap2ß-rev eingesetzt (Fragmentgröße 908 bp). Da die Daten zeigten, dass diese Konstrukte den Defekt von PrV- UL34 komplementieren konnten, sollten in weiterführenden Versuchen chimäre Gene hergestellt werden, bei denen größere Bereiche des pul34 durch entsprechende Lap2ß Sequenzen ersetzt werden. Für UL34-LapCT50 wurde der Bereich, der für die 74

82 Ergebnisse 50 C-terminalen Aminosäuren des pul34 kodiert gegen Lap2ß-Sequenzen bis zur Lamin-B-Bindedomäne ausgetauscht (Abb. 4.2). Die Amplifizierung der beiden Genfragmente mit den Primern UL34-for und UL34-LapCT50-rev bzw. UL34- LapCT50for und Lap2ß-rev ergab Produkte von 655 bzw. 304 bp (siehe 2.1.8). In der nachfolgenden Fusions-PCR mit den Primern UL34-for und Lap2ß-rev wurde das komplette chimäre Gen mit 919 bp amplifiziert. Für UL34-LapCT100 wurde der C-terminale Bereich bis zur Aminosäure 161 von pul34 gegen Lap2ß Sequenzen inklusive der Lamin-B-Bindedomäne ausgetauscht. In der ersten PCR wurden dazu die Primer UL34-for und UL34-LapCT100-rev (Fragmentgröße 515 bp) bzw. UL34-LapCT100-for und Lap2ß-rev eingesetzt (siehe 2.1.8, Fragmentgröße 535 bp). Nach der Fusions-PCR zur Vervollständigung des Gens mit den Primern UL34-for und Lap2ß-rev entstand ein Amplifikat von 1010 bp. Die Herstellung einer pul34-cimäre mit Austausch N-terminaler Aminosäuren diente der genaueren Lokalisierung der pul31 Bindedomäne. Für UL34-LapNT wurde der Genbereich, der für die 100 N-terminalen Aminosäuren von pul34 kodiert, gegen Lap2ß-Sequenzen bis zur LEM-Domäne ersetzt (Abb. 4.1 und 4.2). Die Amplifikation der Teilstücke von 504 und 470 bp erfolgte mit den Primern Lap2ß-for und UL34- LapNT100-rev bzw. UL34-LapNT100-for und UL34-rev. Die Fusions-PCR nach Annealing der ersten PCR Produkte mit den Primern Lap2ß-for und UL34-rev ergab ein Amplifikat mit der Länge von 934 bp Klonierung der chimären Gene in den Expressionsvektor pcdna3 Nach der Amplifikation der chimären Gene wurden diese in den eukaryontischen Expressionsvektor pcdna3 (siehe 2.1.4) kloniert. Durch die Verwendung von Primern, die die Erkennungssequenz gängiger Restriktionsenzyme trugen, konnten die Amplifikate direkt gespalten und in den entsprechend gespaltenen Vektor kloniert werden. Für die Konstrukte pcdna-ul34-lbrtm, pcdna-ul34-emdtm, pcdna-ul34- LapTM, und pcdna-ul34-lapct50 wurden die Amplifikate und der Vektor mit HindIII und EcoRI (siehe 2.1.5) gespalten und anschließend ligiert (siehe , ). 75

83 Ergebnisse Für die Generierung der Plasmide pcdna-ul34-lapct100 und pcdna-ul34- LapNT100 wurden die PCR Produkte mit Klenow-Polymerase zur Generierung von blunt-ends behandelt und anschließend in den SmaI (siehe 2.1.5) gespaltenen Vektor pbluescript-ks+ kloniert (siehe 2.1.4, ). Aus diesen Plasmiden konnten die chimären Gene nach Verdau mit HindIII isoliert und anschließend in den HindIII gespaltenen Vektor pcdna3 kloniert werden. Die Klonierung über SmaI war nötig, da sich in der Primersequenz und in den PCR-Produkten eine Schnittstelle für EcoRI im Lap2ß Anteil befand. Die Ligationsansätze wurden in E. coli DH5 (siehe ) transformiert. Anschließende Selektion und Kultivierung der Bakterien erfolgte auf LB-Agar Platten mit Ampicillin. Resistente Bakterienkolonien wurden gepickt und die Plasmid-DNA aus einer Flüssigkultur isoliert (siehe ). Durch Kontrollspaltung (siehe ) und Sequenzierung der Plasmide (siehe ) wurden das Ergebnis der PCR und die korrekte Klonierung der chimären Gene verifiziert. 76

84 Ergebnisse pul34-lbrtm (270 aa, 29kD) pul34-emdtm (273 aa, 30kD) pul34-laptm (286 aa, 30kD) pul34-lapct50 (293 aa, 32kD) pul34-lapct100 (316 aa, 36kD) pul34-lapnt (312 aa, 33kD) Abb. 3.2: Übersicht über die chimären Konstrukte. Schematisch dargestellt sind die Bereiche des pul34 (türkis) sowie die entsprechenden Aminosäurepositionen der originalen Sequenzen, die in den Fusionskonstrukten vorliegen. Dabei entsprechen die Zahlen über den Diagrammen den Aminosäurepositionen des pul34, die unterhalb deren von LBR, Emerin und Lap2ß. Weiterhin sind die Anzahl der Aminosäuren sowie die berechnete molekulare Masse der chimären Proteine angegeben Generierung stabil exprimierender Zelllinien und Überprüfung der Expression Mit den pcdna3-expressionsvektoren wurden stabil exprimierende Zelllinien hergestellt. Hierfür wurden je zwei Vertiefungen einer 6-Well Platte RK13 Zellen mit dem entsprechenden Plasmid transfiziert (siehe ). Nach 3 Tagen wurde je ein Well für die indirekte Immunfluoreszenz mit dem UL34-spezifischen Serum 77

85 Ergebnisse verwendet um die Transfektion und die erfolgreiche Expression zu überprüfen. Die Zellen aus dem Parallelansatz wurden anschließend auf 10 cm Schalen umgesetzt und mit Selektionsmedium ZB5 mit 0.5mg/ml G418 inkubiert. Resistente Zellklone wurden in Mikrotiterplatten gepickt und die Expression der pul34-chimären durch indirekte Immunfluoreszenz (siehe ) sowie Western Blot Analyse (siehe ) getestet. 49 RK13 RK13-UL34 RK13-UL34-LBRTM RK13-UL34-EMDTM RK13-UL34-LapTM RK13-UL34-LapCT50 RK13-UL34-LapCT100 RK13-UL34-LapNT Abb. 3.3: Western Blot Analyse der generierten stabilen Zelllinien. Proteine aus dem Lysat von RK13, RK13-UL34, RK13-UL34-LBRTM, RK13-UL34-EMDTM, RK13-UL34-LapTM, RK13-UL34- LapCT50, RK13-UL34-LapCT100 und RK13-UL34-LapNT Zellen wurden in einem 10 % SDS- Polyacrylamidgel separiert. Nach dem Transfer auf Nitrozellulose wurden die Proteine mit dem pul34- spezifischen Antiserum detektiert. Auf der linken Seite ist der Massenstandard in Kilodalton angegeben. Für alle UL34-Chimären konnten stabil exprimierende Zelllinien hergestellt werden. Die korrekte Expression wurde mittels Western Blot Analysen (Abb. 4.3) und über indirekte Immunfluoreszenz mit dem pul34-spezifischen Antiserum (Daten nicht gezeigt) überprüft. Im Western Blot entsprach das Laufverhalten der Banden in etwa dem berechneten Molekulargewicht (Compute pi/mw tool). 78

86 Ergebnisse Charakterisierung der chimären Proteine Intrazelluläre Lokalisierung der chimären Proteine Im Rahmen der Charakterisierung der chimären Proteine wurde zunächst deren Lokalisierung in den Zellen untersucht. Hierfür wurden RK13-Zellen auf Zellkulturplatten im 6-well Format auf Deckgläsern ausgesät und anschließend mit den Plasmiden pcdna-ul34, pcdna-ul31, pcdna-ul34-lbrtm, pcdna-ul34- EMDTM, pcdna-ul34-laptm, pcdna-ul34-lapct50, pcdna-ul34-lapct100 und pcdna-ul34-lapnt transfiziert (siehe ). Nach 24 h wurden die Zellen mit Paraformaldehyd fixiert (siehe ) und über die indirekte Immunfluoreszenz mit pul34 bzw. pul31 spezifischen Antiseren überprüft. Als Kernmarker wurde TO- PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1000 zum Zweitantikörper gegeben. Die Präparate wurden durch konfokale Laserscanmikroskopie analysiert (siehe ). -UL31 TO-PRO-3 merge pcdna-ul34- LBRTM pcdna-ul34 pcdna-ul31 79

87 Ergebnisse -UL31 TO-PRO-3 merge pcdna-ul34- LapNT pcdna-ul34- LapCT100 pcdna-ul34- LapCT50 pcdna-ul34- LapTM pcdna-ul34- EMDTM Abb. 3.4: Lokalisierung der chimären Proteine nach transienter Expression in RK13-Zellen. Die Zellen wurden mit den entsprechenden pcdna-konstrukten transfiziert, nach 24 h mit 80

88 Ergebnisse Paraformaldehyd (siehe ) fixiert und mit den anti-pul31 bzw. anti-pul34 spezifischen Seren inkubiert. Die Färbung der DNA erfolgte mit TO-PRO-3. Die Analyse der Präparate wurde am konfokalen Laserscanmikroskop durchgeführt. Der Größenmarker entspricht 5 µm. Das lösliche pul31 war wie erwartet (Fuchs et al., 2002) nach Transfektion diffus im gesamten Zellkern zu finden, während keine Fluoreszenz im Zytoplasma zu erkennen war. Die Immunfluoreszenz mit dem pul34-spezifischen Antiserum nach Transfektion von pcdna-ul34 zeigte eine deutliche Kernrandfluoreszenz als scharf umgrenzte Linie. Die Verteilung der chimären pul34 Konstrukte war mit dem nativen pul34 vergleichbar. Alle Proteine zeigten eine klare Lokalisierung am Kernrand. Teilweise konnte eine Fluoreszenz in ER-ähnlichen Strukturen im Zytoplasma beobachtet werden, was auf die starke Überexpression des jeweiligen Proteins zurückzuführen sein könnte Kolokalisierung der chimären Proteine mit pul31 pul34 ist durch Interaktion mit pul31 in der Lage, dieses an den Kernrand zu rekrutieren und dort vesikelähnliche Strukturen auszubilden, die im Mikroskop durch körnige Strukturen ( Speckles ) erkennbar sind (Klupp et al., 2007). Nach Kotransfektion mit pcdna-ul31 sollte nun die Interaktion der verschiedenen chimären Proteine mit pul31 untersucht werden. Dazu wurden RK13-Zellen auf Deckgläsern mit pcdna-ul31 und pcdna-ul34, pcdna-ul34-lbrtm, pcdna- UL34-EMDTM, pcdna-ul34-laptm, pcdna-ul34-lapct50, pcdna-ul34- LapCT100 oder pcdna-ul34-lapnt transfiziert. Auch hier wurden die transfizierten Zellen nach 24 Stunden mit Paraformaldehyd fixiert (siehe ). Um beide Proteine gleichzeitig nachzuweisen, wurden für den indirekten Immunfluoreszenztest (siehe ) das pul34-spezifisches Antiserum aus der Maus und das pul31-spezifisches Kaninchenantiserum verwendet. Mithilfe unterschiedlich gekoppelter Zweitantikörper konnte so pul34 grün und pul31 rot gefärbt werden (siehe 2.1.6). Bilder der Präparate wurden ebenfalls mit dem konfokalen Laserscanmikroskop (siehe ) aufgenommen. 81

89 pcdna-ul31 + pcdna-ul34- LapCT100 pcdna-ul31 + pcdna-ul34- LapCT50 pcdna-ul31 + pcdna-ul34- LapTM pcdna-ul31 + pcdna-ul34- EMDTM pcdna-ul31 + pcdna-ul34- LBRTM pcdna-ul31 + pcdna-ul34 Ergebnisse -UL34 -UL31 TO-PRO-3 merge 82

90 Ergebnisse -UL34 -UL31 TO-PRO-3 merge pcdna-ul31 + pcdna-ul34-lapnt Abb. 3.5: Kolokalisierung der chimären Proteine mit pul31. 24h nach Kotransfektion mit den verschiedenen pcdna-ul34 Konstrukten und pcdna-ul31 wurden die RK13-Zellen fixiert und die exprimierten Proteine mit anti-ul31-kaninchenserum und anti-ul34-mausserum detektiert. Als Zweitantikörper wurden Alexa 488-Ziege anti-maus und Alexa 555 Ziege anti-kaninchen eingesetzt. Die Zellkerne wurden mit dem DNA-Marker TO-PRO-3 angefärbt. Die Analyse der Präparate erfolgte am konfokalen Laserscanmikroskop. Der Größenmarker entspricht 5 µm. Nach Koexpression von pul31 mit nativem pul34 ist eine Kolokalisierung der beiden Interaktionspartner zu beobachten. Dabei wird das ohne Bindungspartner diffus im Kern vorhandene pul31 durch Interaktion mit pul34 an den Kernrand rekrutiert und bildet dort punktförmige Strukturen aus (Fuchs et al., 2002; Klupp et al., 2007). Nach Koexpression von pul31 und den pul34-chimären mit den verschiedenen Transmembrandomänen (pul34-lbrtm, pul34-emdtm und pul34-laptm) zeigte sich ein mit dem nativen pul34 vergleichbares Fluoreszenzmuster. Die chimären pul34 Proteine mit ausgetauschter Transmembrandomäne waren noch in der Lage, das nukleoplasmatische pul31 an den Kernrand und in speckles zu rekrutieren. pul34-lapct50 und pul34-lapct100 zeigten ebenfalls eine Kolokalisation mit pul31, wobei die punktförmigen Strukturen hier jedoch deutlich größer erschienen. Im Gegensatz dazu stand das Ergebnis der Koexpression von pul31 mit pul34- LapNT. Hier war keine Kolokalisierung der beiden Proteine zu erkennen. Wie nach Einzeltransfektion war pul34-lapnt am Kernrand detektierbar, während pul31 diffus verteilt im Zellkern vorlag. pul34-lapnt ist demnach nicht mehr in der Lage, mit pul31 zu interagieren und es an den Kernrand zu rekrutieren. Auch die typischen punktförmigen Strukturen (speckles) konnten nicht nachgewiesen werden. 83

91 Ergebnisse Komplementierung von PrV-ΔUL34 durch die pul34-chimären Um zu testen, ob die pul34-chimären mit pul31 einen funktionellen Kernaustrittkomplex (NEC) bilden, wurden Ein-Stufen-Wachstumskinetiken durchgeführt. Dazu wurden die Zelllinien RK13, RK13-UL34, RK13-UL34-LBRTM, RK13-UL34-EMDTM, RK13-UL34-LapTM, RK13-UL34-LapCT50, RK13-UL34- LapCT100 und RK13-UL34-LapNT mit PrV-Ka oder PrV-ΔUL34 infiziert (siehe Ein-Schritt-Wachstumskinetik). Zellen und Überstand wurden jeweils nach 0, 4, 8, 12, 24 und 36 Stunden geerntet und die Virustiter auf der komplementierenden Zelllinie RK13-UL34 bestimmt (siehe Plaquetest und Titerbestimmung) A PrV-Ka 10 8 B PrV- UL Titer (pfu/ml) Titer (pfu/ml) t (h) t (h) RK13 RK13-UL34 RK13-UL34-LBRTM RK13-UL34-EMDTM RK13-UL34-LapTM Abb. 3.6: Ein-Schritt-Wachstumskinetiken. Dargestellt sind die Titer von PrV-Ka (A) und PrV- ΔUL34 (B) auf den Zelllinien RK13, RK13-UL34, RK13-UL34-LBRTM, RK13-UL34-EMDTM und RK13-UL34-LapTM. Die Zellen wurden synchron mit einer MOI von 3 infiziert und nach den angegebenen Zeiten geerntet. Die Bestimmung der Titer erfolgte auf RK13-UL34 Zellen. Abgebildet sind die Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten mit entsprechenden Standardabweichungen. Als Kontrolle dienten RK13 Zellen, in denen PrV-ΔUL34 nur zu Titern von 10 3 bis maximal 10 4 pfu/ml replizierte (Abb. 3.6 B). Im Gegensatz dazu konnte die Zelllinie 84

92 Ergebnisse RK13-UL34 den Defekt der Deletionsmutante ausgleichen und die Titer erreichten mit dem Wildtyp (PrV-Ka) vergleichbare Werte (Abb. 3.6 A). Auf den Zelllinien, die die rekombinanten UL34-Proteine mit den Austauschen der Transmembrandomänen exprimieren (RK13-UL34-LBRTM, RK13-UL34-EMDTM und RK13-UL34-LapTM), zeigte die PrV UL34-Deletionsmutante ähnliche Titer wie auf den pul34-exprimierenden Zellen, was darauf hindeutet, dass pul34-lbrtm, pul34-emdtm und pul34-laptm den Defekt ähnlich gut wie das native pul34 komplementieren können (Abb. 3.6 B) A PrV-Ka 10 8 B PrV- UL Titer (pfu/ml) Titer (pfu/ml) t (h) t (h) RK13 RK13-UL34 RK13-UL34-LapCT50 RK13-UL34-LapCT100 RK13-UL34-LapNT Abb. 3.7: Ein-Schritt-Wachstumskinetiken. Dargestellt sind die Titer von PrV-Ka (A) und PrV- ΔUL34 (B) auf den Zelllinien RK13, RK13-UL34, RK13-UL34-LapCT50, RK13-UL34-LapCT100 und RK13-UL34-LapNT. Die Vorgehensweise war analog der Legende zu Abbildung 4.6. Die Kurvenverläufe entsprechen den Mittelwerten aus drei unabhängigen Experimenten mit entsprechenden Standardabweichungen. Auf der Zelllinie RK13-UL34-LapCT50 erreichte PrV-ΔUL34 im Vergleich zur komplementierenden Zelllinie RK13-UL34 ca. 10-fach niedrigere Titer. Auf den Zelllinien RK13-UL34-LapCT100 und RK13-UL34-LapNT waren die Titer ähnlich niedrig wie auf den nicht komplementierenden RK13 Zellen (Abb. 3.7 B). Im Gegensatz dazu replizierte PrV-Ka auf allen Zelllinien ähnlich gut (Abb. 3.7 A). 85

93 Ergebnisse Plaquebildung von PrV- UL34 auf den exprimierenden Zelllinien Für die weitere Charakterisierung der Zelllinien wurden diese mit PrV-Ka und PrV- ΔUL34 für einen Plaquetest infiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen fixiert, mit Kristallviolett angefärbt (siehe Plaquetest) und anschließend die Plaquedurchmesser mikroskopisch ausgemessen (siehe Plaquegrößenbestimmung). So konnte untersucht werden, wie gut sich die Virusmutante mit Hilfe des jeweiligen chimären Proteins von Zelle zu Zelle ausbreiten konnte. Abb. 3.8 Vergleich der Plaquegrößen. Die Zelllinien RK13, RK13-UL34, RK13-UL34-LBRTM, RK13- UL34-EMDTM, RK13-UL34-LapTM, RK13-UL34-LapCT50, RK13-UL34-LapCT100 und RK13-UL34- LapNT wurden mit PrV-Ka und PrV-ΔUL34 infiziert, nach 2 Tagen fixiert und die Durchmesser von jeweils 50 Plaques mikroskopisch gemessen. Die Plaquedurchmesser von PrV-Ka auf der jeweiligen Zelllinie wurden auf 100 % und die Plaquegrößen von PrV-ΔUL34 dazu ins Verhältnis gesetzt. Dargestellt sind die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten mit den entsprechenden Standardabweichungen. Zwei Tage nach Infektion mit PrV-ΔUL34 waren nur kleine Foci infizierter RK13- Zellen zu finden. Im Gegensatz dazu war die Zelllinie RK13-UL34 in der Lage, den Defekt der Deletionsmutante zu komplementieren und die Plaquedurchmesser waren mit denen von PrV-Ka vergleichbar. Die Zelllinien RK13-UL34-EMDTM und RK13-86

94 Ergebnisse UL34-LBRTM zeigten ein ähnliches Bild. Die Durchmesser der Plaques entsprachen in etwa denen von PrV-Ka auf den entsprechenden Zelllinien. Eine Infektion der Zelllinie RK13-UL34-LapTM mit PrV-ΔUL34 zeigte trotz effizienter Komplementierung in den Wachstumskinetiken (siehe Abb. 3.6) deutlich reduzierte Plaquedurchmesser. Im Vergleich zu PrV-Ka waren die Plaquegrößen auf etwa 50 % reduziert. Auf der Zelllinie RK13-UL34-LapCT50 waren die Plaquedurchmesser im Vergleich zum Wild- Typ Virus auf etwa 70 % reduziert. Obwohl die Titer von PrV- UL34 auf der Zelllinie RK13-UL34-LapCT100 ähnlich gering wie von den nicht komplementierenden RK13 Zellen waren, erreichten die Plaques mit ca. 30 % deutlich größere Durchmesser als auf RK13 Zellen. Auf RK13- UL34-LapNT Zellen waren nach Infektion mit PrV- UL34 wie auf den RK13 Zellen nur kleine Foci erkennbar Ultrastrukturelle Analysen der PrV-ΔUL34 infizierten Zelllinien Zur genaueren Untersuchung der pul34 chimären Zelllinien wurden Ultrastrukturanalysen durch geführt. Dazu wurden die stabil exprimierenden Zelllinien in einer T75-Zellkulturflasche mit einer MOI von 1 mit PrV- UL34 infiziert und nach 14 h für die elektronenmikroskopischen Untersuchungen fixiert. Die Präparation der Zellen sowie die anschließende Analyse erfolgten durch das Labor Dr. Granzow, FLI, Insel Riems. 87

95 Ergebnisse RK13-UL34-LapTM RK13-UL34-EMDTM RK13-UL34-LBRTM Abb. 3.9: Ultrastrukturanalyse der pul34-tm Chimären. Die Zelllinien RK13-UL34-LBRTM, RK13- UL34-EMDTM und RK13-UL34-LapTM wurden mit einer MOI von 1 mit PrV-ΔUL34 infiziert und nach 14 h fixiert. Auf der linken Seite sind infizierte Zellen in der Übersicht gezeigt, während Detail- Aufnahmen auf der rechten Seite abgebildet sind. Primär umhüllte Virionen im Kernspalt sind durch einen Stern gekennzeichnet, sekundär umhüllte Virionen im Zytoplasma durch ein weißes Dreieck. Schwarze Dreiecke kennzeichnen Nukleokapside im Stadium der sekundären Umhüllung während nackte intrazytoplasmatische Nukleokapside durch Pfeile markiert sind. Maßstab: A: 3 µm, B: 2 µm, C: 1.4 µm, D: 1 µm. Nach Infektion der Zelllinien RK13-UL34-LBRTM, RK13-UL34-EMDTM und RK13- UL34-LapTM mit PrV- UL34 konnten in der Ultrastrukturanalyse alle Stadien der 88

96 Ergebnisse Virusmorphogenese, wie Nukleokapside im Zellkern, Knospungsprozesse an der inneren Kernmembran, primär umhüllte Virionen im Kernspalt, Nukleokapside im Zytoplasma ohne und mit Hülle, sowie reife Virionen auf der Zelloberfläche beobachtet werden. RK13-UL34-LapNT RK13-UL34-LapCT100 RK13-UL34-LapCT50 Abb. 3.10: Ultrastrukturanalysen der Lap2ß-Chimären. Die Zelllinien RK13-UL34-LapCT50, RK13- UL34-LapCT100 und RK13-UL34-LapNT wurden mit einer MOI von 1 mit PrV- UL34 infiziert und nach 14 h fixiert. Auf der linken Seite sind Übersichten und auf der rechten Seite entsprechende Vergrößerungen zu sehen. Sekundär umhüllte Virionen sind durch ein weißes Dreieck markiert. Schwarze Dreiecke kennzeichnen Nukleokapside im Stadium der sekundären Umhüllung und durch 89

97 Ergebnisse Pfeile sind intrazytoplasmatische Nukleokapside markiert. Maßstab: A: 2 µm, B: 1.4 µm, C: 5 µm, D: 3 µm, E: 5 µm, F: 3 µm. Die Infektion der Zelllinie RK13-UL34-LapCT50 zeigte ein ähnliches Bild wie die RK13-UL34 Zellen (Klupp et al., 2000) und der Zelllinien mit den Austauschen der Transmembrandomänen (Abb. 3.9). Auch hier wurden alle Stadien der Virusmorphogenese beobachtet. In Abbildung 3.10 A sind deutlich Kapside im Zellkern und in der Vergrößerung in B auch im Zytoplasma, zum Teil umhüllt, zu erkennen. Im Gegensatz dazu stehen die Ultrastrukturanalysen der Zelllinien RK13-UL34- LapCT100 und RK13-UL34-LapNT. Hier konnte eine Vielzahl von Kapsiden im Zellkern, jedoch nicht im Zytoplasma beobachtet werden. Dieser Phänotyp ist mit der Infektion der nicht-komplementierenden Zelllinie RK13 vergleichbar und spiegelt den in Abwesenheit von pul34 zu beobachtenden Defekt in der Freisetzung der reifen Kapside aus dem Zellkern wider (Klupp et al., 2000). 3.2 Expression der PrV Kapsidproteine durch Baculovirusvektoren Der Zusammenbau von Kapsiden erfolgt bei Herpesviren im Zellkern. Durch Studien an HSV-1, MDV und EBV konnte gezeigt werden, dass Kapside auch nach Expression der notwendigen Gene in Insektenzellen erfolgreich gebildet werden konnten (Thomsen et al., 1994; Tatman et al., 1994; Kut und Rasschaert, 2004; Henson et al., 2009). Dieser autokatalytische Prozess sollte in den folgenden Versuchen nachgestellt werden. Dazu wurden rekombinante Baculoviren hergestellt, die die Kapsidproteine nach Transduktion in Säugerzellen exprimierten. Untersuchungen an HSV-1 zeigten, dass die Lokalisierung der einzelnen Kapsidproteine von der Anwesenheit anderer viraler Proteine abhängt (Nicholson et al., 1994; Rixon et al., 1996). Daher wurde zunächst die Expression und Lokalisierung der Kapsidproteine und der Einfluss der Koexpression der Kapsidproteine auf die Lokalisierung untersucht. Anschließende Versuche befassten sich mit dem autokatalytischen Zusammenbau der Kapside nach Koexpression aller Kapsidproteine. 90

98 Ergebnisse Herstellung der rekombinanten Baculoviren Für die Expression der PrV Kapsidproteine wurden zunächst die entsprechenden rekombinanten Baculoviren konstruiert. Baculoviren als Vektoren wurden auf Grund der deutlich besseren Effizienz im Vergleich zur chemischen Transfektion genutzt. Hierfür wurde das als BAC (bacterial artificial chromosome, bakterielles künstliches Chromosom) vorliegende Virus Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) verwendet (pfastbacdual, Invitrogen). Dazu wurden zunächst die einzelnen Kapsidgene des PrV in den Vektor pbacmamhie/mie1 kloniert (Keil et al., 2009). Dieser enthält eine gfp-kassette (gfp = green fluorescent protein, grün fluoreszierendes Protein) unter der Kontrolle des Baculovirus-spezifischen Polyhedrin-Promotors, der nur in den Insektenzellen aktiv ist, was der einfachen und schnellen Identifizierung infizierter Insektenzellen diente. Für die Expression von bis zu zwei Fremdgenen trägt der Vektor immediate-early Promotoren des humanen (HCMV) und des murinen Cytomegalovirus (MCMV). Für die Bildung von Herpesviruskapsiden sind fünf Proteine notwendig: das Hauptkapsidprotein pul19, die Triplexproteine pul18 und pul38, das Gerüstprotein pul26.5 und zusätzlich die virale Protease pul26 (Henson et al., 2009; Newcomb et al., 1994; Thomsen et al., 1994; 1995). Die Anwesenheit von pul26 oder pul26.5 reicht zwar für die Bildung von Herpesviruskapsiden aus, die Expression beider Proteine ist jedoch für die Morphogenese effektiver (Thomsen et al., 1995). Für die folgenden Studien wurde für pul26 der gesamte offene Leserahmen genutzt. Durch die N-terminal lokalisierte Protease wird das Gerüstprotein pul26.5 abgespalten (Liu und Roizman, 1991a; Liu und Roizman, 1993). Für Untersuchungen, die sich nur auf das Gerüstprotein beziehen, kam dieses ohne die Protease zum Einsatz (pul26.5). Weitere Kapsidproteine, die allerdings nicht essentiell für die Kapsidmorphogenese sind, aber in diesen Studien mit einbezogen werden sollten, sind pul17, pul25 und das kleine Kapsidprotein pul35. Da pul25 allein nicht in den Zellkern gelangt, wurden für die Expression in Baculoviren zwei Varianten konstruiert, bei denen pul25 mit dem Kernlokalisierungssignal des großen Tegumentproteins pul36 fusioniert worden war (NLS1-UL25, NLS1/2-UL25) (Möhl et al., 2009). Alle Gene lagen bereits kloniert in pcdna3 oder puc19 vor, aus denen sie durch Restriktionsenzymspaltung isoliert und in den Baculovirusvektor kloniert werden konnten (siehe Tabelle 3.1). 91

99 Ergebnisse Tab. 3.1: Klonierungsschema für die Herstellung der Baculovirus-Rekombinationsplasmide. Die Plasmide wurden wie angegeben gespalten und die entsprechenden DNA-Fragmente nach Auftrennung in einem Agarosegel ausgeschnitten und eluiert. Gen Größe Restriktionsenzyme UL kb BamHI / EcoRI UL kb EcoRI / XbaI UL kb BamHI / EcoRI NLS1-UL kb HindIII / XbaI NLS4-UL kb HindIII / XbaI UL kb HindIII / BamHI UL kb KpnI / BamHI UL kb EcoRI / XbaI UL35mcherry 1.4 kb NotI / SacI (aus puc) Nach dem Restriktionsenzymverdau wurden die Spaltansätze in einem Agarosegel separiert und die entsprechenden Banden aus dem Gel isoliert (siehe ). Die Enden der Genfragmente wurden anschließend mit Klenow-Polymerase behandelt (siehe ) und blunt end mit dem SmaI gespaltenen Vektor pbacmamhie/mie1 ligiert (siehe , ). Die korrekte Orientierung der Inserts wurde anschließend durch Kontrollspaltung (siehe Tabelle 3.2) und nach Transfektion der Plasmid-DNA in der indirekten Immunfluoreszenz getestet (siehe ). Tab.: 3.2: Fragmentgrößen der rekombinanten Plasmide. Die Baculovirus-Expressionsplasmide wurden durch Verdau mit den angegebenen Restriktionsenzymen überprüft. Plasmid Restriktionsenzym Erwartete Fragmentgrößen pbm-ul17 NotI 7.6 kb, 2.8 kb pbm-ul18 EcoRI 6.3 kb, 3.4 kb pbm-ul19 NotI 7.1 kb, 3.3 kb, 2.5 kb 92

100 Ergebnisse Plasmid Restriktionsenzym Erwartete Fragmentgrößen pbm-nls1-ul25 EcoRI 7.8 kb, 2.7 kb pbm-nls1/2-ul25 EcoRI 7.8 kb, 2.7 kb pbm-ul26 NotI 6.4 kb, 3.8 kb pbm-ul26.5 NotI 6.4 kb, 3.1 kb pbm-ul38 EcoRI 6.3 kb, 3.6 kb pbm-ul35mcherry StuI 6.6 kb, 3.4 kb Mithilfe der Baculo-Expressionsplasmide konnten anschließend rekombinante Baculoviren generiert werden (siehe Herstellung rekombinanter Baculoviren). Dazu wurden die Plasmide zusammen mit dem als BAC vorliegenden Baculovirusgenom (Keil et al., 2009) in Insektenzellen (HighV) transfiziert. Nach einmaliger Plaquereinigung wurden die rekombinanten Baculoviren aus den Überständen durch Ultrazentrifugation konzentriert und anschließend für Transduktionsexperimente genutzt Überprüfung der Expression nach Transduktion Western Blot Analyse Zur Überprüfungung der Expression wurden RK13-Zellen in 24-well Zellkulturplatten kultiviert und anschließend mit den Baculovirus-Rekombinanten BacMam-UL17, BacMam-UL18, BacMam-UL19, BacMam-NLS1-UL25, BacMam-NLS4-UL25, BacMam-UL26, BacMam-UL26.5, BacMam-UL38 und BacMam-UL35mcherry mit einer MOI von 10 transduziert (siehe Transduktion von Säugerzellen). Parallel erfolgte als Kontrolle die Infektion von RK13-Zellen mit PrV-Ka. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Zellen geerntet, Zelllysate hergestellt (siehe ) und diese in einem SDS-10 % Polyacrylamidgel aufgetrennt (siehe ). Nach dem Transfer wurde die Nitrozellulosemembran mit den entsprechenden Antikörpern inkubiert (siehe Western Blot). 93

101 Ergebnisse BacMam-UL17 PrV-Ka BacMam-UL18 PrV-Ka BacMam-UL19 PrV-Ka BacMam-UL26 PrV-Ka BacMam-UL26.5 PrV-Ka BacMam-NLS1-UL25 PrV-Ka BacMam-NLS1/2-UL25 PrV-Ka BacMam-UL35mcherry PrV-Ka BacMam-UL28 PrV-Ka UL17 -UL18 -UL19 -UL26 -UL26.5 -UL25 -UL25 -UL35 -UL38 Abb. 3.11: Western Blot der Zelllysate nach Transduktion bzw. Infektion. RK13-Zellen wurden mit BacMam-UL18, BacMam-UL19, BacMam-UL26, BacMam-UL26.5 und BacMam-UL38 transduziert. Parallel dazu wurden RK13-Zellen mit PrV-Ka infiziert. Nach 24 h wurden Zelllysate hergestellt, auf einem SDS-10 % -Polyacrylamidgel separiert und die Proteine auf Nitrozellulosemembranen geblottet. Die Inkubation der Membranen erfolgte mit den entsprechenden Antiseren. Aufgetragen wurden jeweils die Lysate der transduzierten (BacMam) und infizierten Zellen (PrV-Ka). Der Massenstandard in Kilodalton ist auf der linken Seite angegeben. In der Western Blot Analyse konnten alle PrV-Kapsidproteine in infizierten und in transduzierten Zellen nachgewiesen werden. Mit den spezifischen Antiseren für pul18 (32 kda), pul19 (146 kda), pul26 (26 kda) wurden vergleichbare Proteinbanden in den transduzierten wie in den infizierten Zelllysaten dargestellt während die Transduktion mit BacMam-UL26.5 (28 kda) nur eine sehr schwache Bande ergab. Die Expression der Proteine NLS1-UL25 und NLS4-UL25 ergab größere Signale als bei der Infektion mit PrV-Ka (58 kda), was auf die zusätzlichen NLS-Sequenzen zurückzuführen ist. Das kleine Kapsidprotein pul35 sollte nach Transduktion ebenfalls analysiert werden. Dafür wurde eine mit mcherry markierte Variante gewählt. Das durch das pul35 spezifische Antiserum detektierte Protein war daher ebenfalls größer als das authentische Protein. Das native pul35 hat eine Größe von etwa 11.5 kda, welche durch Fusion mit mcherry auf eine relative molekulare Masse von ca. 40 kda erhöht ist. 94

102 Ergebnisse Dies deutet darauf hin, dass diese Proteine korrekt exprimiert wurden. Erstaunlicherweise zeigte der Blot mit dem UL38-spezifischen Serum in den transduzierten Zellen ein größeres Produkt (etwa 40 kda) als in den infizierten Zellen (36kDa). Im UL38 Gen befinden sich zwei mögliche Startcodons. Dies ließ vermuten, dass bei einer PrV-Infektion das zweite Startcodon für die Expression des pul38 genutzt wird. Für die weiteren Untersuchungen wurde daher ein Plasmid hergestellt, welches lediglich das zweite Startcodon beinhaltete. Western Blot Analysen, in denen Lysate von transfizierten Plasmiden mit Lysaten von infizierten Zellen verglichen wurden, zeigten allerdings, dass die Expression des pul38 vom zweiten Startcodon zur Synthese eines entsprechend kleineren Proteins führte. PrV-Ka pcdna-ul38 (1.ATG) pcdna-ul38 (2.ATG) Abb. 3.12: Western Blot Analyse der Expression von pul38. RK13 Zellen wurden mit PrV-Ka infiziert bzw. mit den Plasmiden pcdna-ul38 (1. ATG) oder pcdna-ul38 (2. ATG) transfiziert. Nach 24 h wurden die Zellen geerntet und Lysate hergestellt welche auf einem SDS 10 % Gel separiert wurden. Nach Transfer auf Nitrocellulose wurde das Triplexprotein pul38 mit dem polyklonalen Kaninchen-Serum detektiert. Der Größenstandard in kda ist auf der linken Seite angegeben. Mithilfe des Western Blots konnten nach Transduktion der generierten rekombinanten Baculoviren alle Kapsidproteine nachgewiesen werden. Kapsidproteine, die durch zusätzliche Sequenzen (NLS, mcherry) gekennzeichnet waren, hatten, wie erwartet, eine größere Masse im Vergleich zu den nativen Proteinen aus dem infiziertem Zelllysat. Der Größenunterschied zwischen dem 95

103 Ergebnisse nativen Triplexprotein pul38 und dem Lysat aus transduzierten Zellen war nicht erwartet und konnte auch durch weitere Untersuchungen nicht erklärt werden. Indirekter Immunfluoreszenztest Eine weitere Überprüfung der Expression der Proteine sowie deren Lokalisierung in den transduzierten Zellen im Vergleich zu mit des pcdna3-expressionvektoren transfizierten Zellen erfolgte durch den indirekten Immunfluoreszenztest. Dazu wurden RK13-Zellen in 24-well Zellkulturplatten kultiviert und mit den rekombinanten Baculoviren transduziert oder mit den pcdna3-expressionskonstrukten transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen fixiert und ein indirekter Immunfluoreszenztest (siehe ) durchgeführt. exprimiertes Gen Antikörper Transfektion der pcdna Plasmide Transduktion der rekombinanten Baculoviren UL17 -UL17 UL18 -UL18 96

104 Ergebnisse exprimiertes Gen Antikörper Transfektion der pcdna Plasmide Transduktion der rekombinanten Baculoviren UL19 -UL19 NLS1-UL25 -UL25 NLS1/2-UL25 -UL25 UL26 -UL26 UL26.5 -UL

105 Ergebnisse exprimiertes Gen Antikörper Transfektion der pcdna Plasmide Transduktion der rekombinanten Baculoviren UL38 -UL38 UL35/ UL35mCherry -UL35 Abb. 3.13: Indirekter Immunfluoreszenztest nach Transfektion und Transduktion von RK13- Zellen. RK13-Zellen wurden mit pcdna-ul17, pcdna-ul18, pcdna-ul19, pcdna-nls1-ul25, pcdna-nls1/2-ul25, pcdna-ul26, pcdna-ul26.5, pcdna-ul38 und pcdna-ul35 transfiziert bzw mit BacMam-UL17, BacMam-UL18, BacMam-UL19, BacMam-NLS1-UL25, BacMam-NLS1/2-UL25, BacMam-UL26, BacMam-UL26.5, BacMam-UL38 und BacMam-UL35mcherry transduziert. 24 Stunden nach Transfektion bzw. Transduktion wurden die Zellen fixiert und mit spezifischen polyklonalen Seren inkubiert. Die Expression des pul35mcherry wurde durch dessen Autofluoreszenz detektiert. Alle Proteine konnten in der indirekten Immunfluoreszenz mit den spezifischen Antiseren nachgewiesen werden. Die Expression des pul17 in den transfizierten und transduzierten Zellen zeigte ein ähnliches Bild. Das Protein lag in der gesamten Zelle verteilt vor, wobei eine körnigere Struktur in transfizierten Zellen zu beobachten war. In transduzierten Zellen war das pul17 ebenso ungleichmäßig verteilt. Das Triplexprotein pul18 lokalisierte ebenfalls in der gesamten Zelle. Dabei war auffällig, dass die Lokalisierung im Zellkern sowohl in transfizierten und weitaus deutlicher in transduzierten Zellen durch grobe Körnung gekennzeichnet war. Vergleiche zwischen der Expression des Hauptkapsidproteins pul19 in transfizierten und transduzierten Zellen zeigten ebenfalls ein ähnliches Bild. Sowohl nach Transfektion als auch in transduzierten Zellen scheint pul19 im Zytoplasma vorzuliegen, während 98

106 Ergebnisse es im Zellkern nicht detektierbar war. Die Verteilung wirkt diffus, wobei kleinere Bereiche des Zytoplasmas verstärkte Fluoreszenzen aufwiesen. Durch das Kernlokalisierungssignal NLS1 des pul36 konnte sowohl nach Transduktion des BacMam-NLS1-UL25 als auch nach Transfektion mit pcdna- NLS1-UL25 das pul25 zusätzlich zu einer schwachen Fluoreszenz im Zytoplasma deutlich im Kern nachgewiesen werden. Das pul25 Konstrukt, welches beide Kernlokalisierungsmotive (NLS1/2) aus pul36 besitzt, war dagegen fast ausschließlich im Kern nachweisbar. Auch hier war die Verteilung nach Transfektion und Transduktion vergleichbar. Allerdings fiel auf, dass die Expressionsstärke zwischen Transfektion und Transduktion deutliche Unterschiede zeigte. So konnte in transduzierten Zellen eine sehr starke Expression nachgewiesen werden, die in transfizierten Zellen war dagegen deutlich schwächer. BacMam-UL26 transduzierte Zellen zeigten eine deutliche Fluoreszenz in der gesamten Zelle. Die Lokalisierung schien allerdings im Zellkern etwas schwächer zu sein. Gleichzeitig war erkennbar, dass die exprimierte Protease scheinbar zellschädigend wirkt, da viele Zellen im Präparat bereits abgekugelt vorlagen. Diese Beobachtung war in transfizierten Zellen noch deutlicher. Hier lagen fast ausschließlich abgekugelte Zellen im Präparat vor. Eine ähnliche Beobachtung konnte für die Expression des pul35 bzw. pul35mcherry gemacht werden. Auch hier war 24 Stunden nach Transduktion ein Großteil der transfizierten bzw. transduzierten Zellen abgekugelt und löste sich bereits von der Zellkulturschale. Das pul26.5 spezifische Serum zeigte in transduzierten Zellen nur eine schwache Fluoreszenz. Es konnte keine homogene Verteilung des Proteins beobachtet werden. Vielmehr lag das Protein in punktförmigen Aggregaten im Zellkern vor. Die deutlichere Fluoreszenz in transfizierten Zellen zeigte ein vergleichbares Bild. Nach Transduktion von BacMam-UL38 konnte das Protein ähnlich wie nach Transfektion in der gesamten Zelle nachgewiesen werden. Die Fluoreszenz erschien diffus und wurde in transduzierten Zellen noch deutlicher. Zusätzlich konnte in einigen Zellen eine körnige Struktur nachgewiesen werden Charakterisierung der Kapsidproteine In der indirekten Immunfluoreszenz konnte gezeigt werden, dass die Kapsidproteine nach Einzelexpression unterschiedliche Lokalisierungen in der Zelle aufwiesen und teilweise nicht im Kern nachweisbar waren. Daher sollte durch die Koexpression 99

107 Ergebnisse verschiedener Kapsidproteine die Interaktionen zwischen den Proteinen untersucht werden, bzw. getestet werden durch welche Interaktionen die Kapsidproteine an den Ort der Kapsidmorphogenese gelangen Lokalisierung der Kapsidproteine in der Zelle nach Einzel-Transduktion Für die Expression der einzelnen Kapsidproteine wurden RK13-Zellen in Zellkulturplatten im 24-well Format auf sterilen Deckgläsern kultiviert und mit den rekombinanten Baculoviren mit einer MOI von 10 transduziert (siehe ). 24 Stunden nach Transduktion wurden die Zellen fixiert und anschließend mit den entsprechenden polyklonalen Seren inkubiert. Als Zweitantikörper diente Alexa 488 (anti-kaninchen), während die Anfärbung der Zellkerne durch Propidiumiodid (PI) erfolgte. Die Auswertung der Präparate fand am konfokalen Laserscanmikroskop statt. Virus Antiserum PI merge BacMam-UL19 BacMam-UL38 100

108 Ergebnisse Virus Antiserum PI merge BacMam-UL18 BacMam-UL26 BacMam- UL26.5 Abb. 3.14: Lokalisierung der Kapsidproteine nach Einzeltransduktion. RK13-Zellen wurden mit den rekombinanten Baculoviren BacMam-UL19, BacMam-UL38, BacMam-UL18, BacMam-UL26 und BacMam-UL26.5 transduziert, nach 24 h fixiert und anschließend mit den entsprechenden polyklonalen Kaninchenseren inkubiert. Die Detektion gebundener Antikörper erfolgte mit dem Alexa 488 konjugierten Anti-Kaninchenserum aus der Ziege, die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (PI) markiert. Maßstab: 5µm. Das Hauptkapsidprotein pul19 konnte ausschließlich im Zytoplasma detektiert werden. Die Immunfluoreszenz zeigte eine strukturierte Verteilung des Proteins, die netzartig das Zytoplasma ausfüllte. Im Zellkern dagegen konnte kein pul19 nachgewiesen werden. Das Triplexprotein pul38 wurde, ähnlich wie das Hauptkapsidprotein pul19, im Zytoplasma nachgewiesen, während kein Signal im Zellkern zu finden war. Die Verteilung des pul38 erschien weniger stark strukturiert und hatte teilweise einen diffusen Charakter. 101

109 Ergebnisse Die indirekte Immunfluoreszenz zeigte, dass das kleine Triplexprotein pul18 inhomogen in der Zelle verteilt vorlag. So waren grobkörnige und fleckige Strukturen im Zytoplasma zu sehen. Teilweise konnte auch pul18 spezifische Fluoreszenz punktförmig im Zellkern nachgewiesen werden. Auffällig im Zytoplasma war die Akkumulation der pul18-spezifischen Fluoreszenz in Kernnähe und entlang des Zellkerns. Die Protease pul26 konnte teilweise und das Gerüstprotein pul26.5 fast ausschließlich im Zellkern detektiert werden. Dabei war bei beiden Proteinen auffällig, dass die Lokalisierung im Zellkern auf wenige Bereiche beschränkt schien. Dies zeigte sich durch starke Fluoreszenz in Form von größeren Punkten Lokalisierung der Kapsidproteine in der Zelle nach Kotransduktion Obwohl der Kapsidzusammenbau der Herpesviren im Zellkern erfolgt, lagen die Proteine, die für die Kapsid-Struktur notwendig sind, vorwiegend im Zytoplasma vor. Studien an HSV-1 zeigten, dass verschiedene Kapsidproteine bereits im Zytoplasma miteinander interagieren und gemeinsam in den Kern transportiert werden (Nicholson et al., 1994; Rixon et al., 1996). Koexpression von zwei Kapsidproteinen In einem weiteren Versuch wurden nun je zwei rekombinante Baculoviren kotransduziert um zu testen, welche Kombinationen für eine Kernlokalisierung der Kapsidproteine notwendig sein könnten. Die Kotransduktion erfolgte auf RK13-Zellen in 24-well Platten mit einer MOI von 10 pro Virusrekombinante. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Aceton fixiert (siehe ) und ein indirekter Immunfluoreszenztest (siehe ) durchgeführt. Der Nachweis der Kapsidproteine in der Zelle konnte hier nur einzeln erfolgen, da für diese Proteine nur Kaninchenseren zur Verfügung standen. 102

110 Ergebnisse BacMam -UL19 PI merge UL19 + UL38 UL19 + UL18 UL19 + UL26 UL19 + UL26.5 Abb Lokalisierung des pul19 nach Kotransduktion. RK13-Zellen wurden mit BacMam-UL19 und BacMam-UL38, BacMam-UL38, BacMam-UL26 oder BacMam-UL26.5 kotransduziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Aceton fixiert, mit dem polyklonalen anti-ul19 Serum und anschließend mit Alexa 488 inkubiert. Die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (PI) gefärbt. Maßstab: 5 µm. Nach Koexpression des pul19 mit den Triplexproteinen pul18 und pul38 zeigten sich keine Unterschiede in der Lokalisierung des pul19 zu der Einzelexpression. 103

111 Ergebnisse Das Hauptkapsidprotein war, wie in Abb. 3.14, im Zytoplasma nachweisbar, während keine Fluoreszenz im Zellkern sichtbar war. Nach Kotransduktion mit BacMam-UL26 oder BacMam-UL26.5 war pul19-spezifische Fluoreszenz jedoch fast ausschließlich im Kern detektierbar. Während nach Koexpression mit pul26 noch geringe Mengen pul19 im Zytoplasma und vor allem am Kernrand nachweisbar waren, konnte pul19 nach Koexpression mit pul26.5 nur noch im Zellkern detektiert werden. BacMam -UL38 PI merge UL38 + UL19 UL38 + UL18 UL38 + UL26 UL38 + UL

112 Ergebnisse Abb Lokalisierung des pul38 nach Kotransduktion. RK13-Zellen wurden mit BacMam-UL38 und BacMam-UL19, BacMam-UL18, BacMam-UL26 und BacMam-UL26.5 kotransduziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Aceton fixiert, mit dem polyklonalen anti-ul38 Serum und Alexa 488 inkubiert. Die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (PI) markiert. Maßstab: 5 µm. Die Kotransduktion von BacMam-UL38 mit BacMam-UL19 zeigte kaum Unterschiede in der Lokalisierung von pul38 zu einer Einzeltransduktion und spezifische Fluoreszenz war fast ausschließlich im Zytoplasma zu erkennen. Nach Koexpression von pul38 und pul18 hingegen lokalisierte das pul38 ähnlich wie das pul18 in punktförmigen Aggregaten im Zellkern, war aber auch noch im Zytoplasma nachweisbar. Wie bei pul19 war pul38 nach Koexpression mit pul26 oder pul26.5 ebenfalls vermehrt im Kern nachweisbar. BacMam -UL18 PI merge UL18 + UL19 UL18 + UL38 UL18 + UL26 Abb Lokalisierung von pul18 nach Kotransduktion. RK13-Zellen wurden mit BacMam-UL18 und BacMam-UL19, BacMam-UL38, BacMam-UL26 und BacMam-UL26.5 kotransduziert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit Aceton fixiert, mit dem polyklonalen anti-ul18 Serum und 105

113 Ergebnisse anschließend mit Alexa 488 inkubiert. Die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (PI) gefärbt. Maßstab: 5 µm. Die Kotransduktion von BacMam-UL18 mit BacMam-UL19, BacMam-UL26, BacMam-UL26.5 und BacMam-UL38 zeigte bei allen ein vergleichbares Bild (siehe Abb. 3.17). Wie in der Einzeltransduktion war pul18 spezifische Fluoreszenz in allen Ansätzen auch im Zellkern in punktförmigen Aggregaten zu erkennen. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Hauptkapsidprotein mit dem Gerüstprotein entweder in Anwesenheit oder auch in Abwesenheit der Protease in den Zellkern gelangen kann. Die Anwesenheit des Triplexkomplexpartners pul18 und der Protease/Scaffoldprotein führt zu einer besseren Kernlokalisierung von pul38. Wie bei HSV-1 gezeigt, lässt das Ergebnis auch hier vermuten, dass im Zytoplasma eine Interaktion zwischen den Triplexproteinen und eine Interaktion des Hauptkapsidproteins mit dem Gerüstprotein stattfindet, welche den Kerntransport begünstigt (Rixon et al., 1996). Koexpression aller Kapsidproteine Zur Analyse der intrazellulären Lokalisierung nach Koexpression aller Kapsidproteine (pul19, pul18, pul38, pul26 und pul26.5) wurden in 24-well Zellkulturplatten kultivierte RK13 Zellen mit einer MOI von 10 von jedem rekombinanten Baculovirus transduziert. Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurden die Zellen mit Aceton fixiert (siehe ), ein indirekter Immunfluoreszenztest durchgeführt (siehe ) und dieser am konfokalen Laserscanmikroskop ausgewertet. Antiserum PI merge -UL19 106

114 Ergebnisse Antiserum PI merge -UL26.5 -UL26 -UL38 -UL18 Abb. 3.18: Koexpression aller Kapsidproteine. RK13 Zellen wurden mit BacMam-UL19, BacMam- UL18, BacMam-UL38, BacMam-UL26 und BacMam-UL26.5 kotransduziert. Nach 24 h wurden die Zellen mit Aceton fixiert und mit Antiseren gegen die verschiedenen Kapsidproteine ( -UL18, -UL19, -UL26, -UL26.5, -UL38) und Alexa 488 inkubiert. Die Zellkerne wurden mit Propidiumiodid (PI) gefärbt. Maßstab: 5 µm. Nach Kotransduktion aller BacMam-Vektoren waren alle Kapsidproteine fast ausschließlich im Kern nachweisbar. Im Gegensatz zur Einzelexpression ist bei der 107

115 Ergebnisse Kotransduktion mit allen BacMam-Vektoren wieder eine etwas geringere Effizienz als bei Einzeltransduktion zu beobachten, die etwa bei 40 bis 50 % lag. Das Triplexprotein pul18 konnte wie in der Einzelexpression als körnige Struktur im Zellkern detektiert werden. Diese war nach Kotransduktion aller BacMam-Vektoren allerdings feiner und sowohl im Zellkern aber auch teilweise im Zytoplasma zu finden. Die Transduktionseffizienz war mit etwa 50% mit der Einzeltransduktion von BacMam-UL18 vergleichbar. pul38 war nach Kotransduktion hauptsächlich im Zellkern, in körniger Struktur in einzelnen Bereichen des Zellkerns, detektierbar. Nach Einzelexpression von pul26 lag das Protein sowohl im Kern als auch im Zytoplasma vor. Koexpression mit allen Kapsidproteinen zeigte Fluoreszenz, die meist grobkörnig im Zellkern verteilt war. Die Transduktionseffizienz schien auch hier deutlich schlechter, wobei im Durchschnitt etwa 30 % der Zellen pul26 exprimierten. Deutlich höhere Transduktionseffizienzen von 70 bis 80 % wurden bei BacMam- UL26.5 erreicht. Das Protein wurde ausschließlich im Zellkern detektiert. Neben homogener Fluoreszenz traten auch körnige Strukturen im Zellkern auf. Die Einzelexpression von pul26.5 ist durch zwei bis drei größere Bereiche im Zellkern gekennzeichnet, in denen das Gerüstprotein lokalisiert. Die Anzahl der Fluoreszenz-positiven Zellen war nach Kotransduktion aller BacMam- Vektoren, die die für die Morphogenese von Kapsiden notwendigen Proteine exprimierten, beeinträchtigt und erreichte zwischen 30 und 80% der Einzeltransduktionsraten. Im Gegensatz zu den Einzeltransduktion waren deutliche Unterschiede in der Lokalisierung der Kapsidproteine zu beobachten Kapsidreinigung nach Kotransduktion In den folgenden Versuchen sollte überprüft werden, ob es trotz der geringen Kotransduktionsrate möglich ist, die Bildung von Kapsiden nachzuweisen. Dazu wurde die Methode der Kapsidreinigung genutzt, die bereits in anderen Studien zur Isolierung von Herpesviruskapsiden erfolgreich Anwendung fand. 108

116 Ergebnisse Versuche zur Lyse der Zellkerne Der autokatalytische Zusammenbau der Kapside findet im Zellkern statt. Da dieser eine sehr stabile Struktur besitzt, war es zunächst notwendig, eine möglichst effiziente Methode des Aufbrechens der Zellkerne zu finden. Dazu wurden PSEK Zellen mit unterschiedlichen Reagenzien behandelt. Zellen einer 6-well Platte wurden vorsichtig vom Boden der Zellkulturplatte abgelöst und im Kulturmedium resuspendiert. Nach Überführen in ein Reaktionsgefäß wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen um Mediumreste zu entfernen. Das Zellpellet wurde anschließend in PBS, A. dest. oder Capsid-Lysispuffer resuspendiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. PBS sollte hier als Kontrolle dienen, da es für die Zellen nicht schädlich ist. Für eine Zerstörung der Zellkerne durch osmotischen Druck wurden die Zellen in einem zweiten Ansatz mit A. dest. behandelt. Als drittes Reagenz diente der Capsid-Lysispuffer, dessen Lyseeigenschaften auf Triton-X 100 beruhen. Nach Behandlung der Zellen wurden alle Ansätze mit dem Nukleinsäurefarbstoff Propidiumiodid gefärbt und Ausstriche der Zellen im Fluoreszenzmikroskop auf intakte Zellkerne untersucht. Reagenz PI PBS A. dest 109

117 Ergebnisse Reagenz PI Capsid-Lysis Puffer Abb Untersuchung zur Lyse der Zellkerne mit verschiedenen Reagenzien. PSEK Zellen wurden mit unterschiedlichen Reagenzien behandelt (PBS, A. dest. und Capsid-Lysispuffer) nach dem Färben mit dem interkalierenden Farbstoff Propidiumiodid auf intakte Zellkerne untersucht. Durch die Färbung der DNA konnten die Zellkerne spezifisch markiert werden und stellten sich im Fluoreszenzmikroskop als kugelige Formen dar. Nach der Behandlung mit PBS wurden im Präparat viele intakte Zellkerne beobachtet. Durch den osmotischen Druck in der Gegenwart von A. dest. konnten die meisten Zellkerne zerstört werden. Eine nahezu vollständige Lyse konnte durch die Behandlung der PSEK Zellen mit Capsid-Lysispuffer erreicht werden. Die Anzahl intakter Zellkerne war nur noch sehr gering und zeigte, dass die Lyse mittels Triton-X 100 für die Reinigung von Kapsiden am besten geeignet ist. Isolierung und Nachweis von Kapsiden im Elektronenmikroskop Die Kapsidbildung sollte nun mithilfe der rekombinanten BacMam-Vektoren gezeigt werden. Dazu wurden PSEK Zellen mit BacMam-UL18, BacMam-UL19, BacMam- UL26, BacMam-UL26.5 und BacMam-UL38 mit einer MOI von jeweils 10 kotransduziert und ein zweiter Ansatz als Kontrolle mit PrV-Ka infiziert. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die transduzierten bzw. infizierten Zellen geerntet und eine Kapsidreinigung durch geführt ( Reinigung von Virus- Kapsiden; Thomsen et al., 1994). Die erhaltenen Präparate wurden anschließend durch Dr. Granzow, FLI Riems elektronenmikroskopisch untersucht. Nach Reinigung aus infizierten Zellen konnten intakte Herpesviruskapside nachgewiesen werden wohingegen dies aus den transduzierten Zellen nicht möglich war. 110

118 Ergebnisse Western-Blot Analyse nach Reinigung Da durch ultrastrukturelle Analysen keine Kapside in Lysaten transduzierter Zellen nachgewiesen werden konnten, wurden die erhaltenen Lysate im Western Blot auf das Vorhandensein der Kapsidproteine analysiert PrV-Ka Kotransduktion PrV-Ka Kotransduktion PrV-Ka Kotransduktion PrV-Ka Kotransduktion PrV-Ka Kotransduktion UL18 -UL19 -UL26 -UL26.5 -UL38 Abb Western Blot Analyse nach Kapsidreinigung. PSEK Zellen wurden mit den rekombinanten Baculoviren BacMam-UL18, BacMam-UL19, BacMam-UL26, Bac-Mam-UL26.5 und BacMam-UL38 mit einer MOI von 10 kotransduziert. Parallel wurden PSEK-Zellen mit PrV-Ka mit einer MOI von 5 infiziert. Nach 24h wurden die transduzierten sowie infizierten Zellen lysiert und die Pellets nach Zentrifugation durch ein 30% Sucrosekissen in einem SDS-10%-Polyacrylamidgel aufgetrennt und anschließend geblottet. Die Membranen wurden mit den verschiedenen Antiseren ( - UL18, -UL19, -UL26, -UL26.5 und -UL38) inkubiert. Auf der linken Seite ist der Größenstandard in Kilodalton angegeben. Im Western Blot konnten alle Kapsidproteine im Pellet aus der Kapsidreinigung nachgewiesen werden. Im Vergleich zum Präparat aus den infizierten Zellen zeigten pul18, pul19, pul26 und pul38 ein deutlich stärkeres Signal in den Spuren mit Proben aus den transduzierten Zellen, während das Gerüstprotein pul26.5 in beiden Ansätzen nur schlecht nachweisbar war. Auffällig war auch hier wieder, dass pul38 in den kotransduzierten Zellen deutlich größer war als in den infizierten Zellen. 111

119 Ergebnisse Die Analyse der Lysate transduzierter Zellen zeigte, dass die Kapsidproteine vorhanden waren. Allerdings lassen sich durch die Analyse im Western Blot keine Rückschlüsse darauf ziehen, wie viele Zellen alle Kapsidproteine exprimierten. Coomassie-Gel nach Reinigung und massenspektrometrische Analyse der Proteinbanden Für die weitere Untersuchung wurden erneut PSEK Zellen entweder infiziert oder kotransduziert. Die Infektion der Zellen erfolgte diesmal mit PrV- UL34. Durch die fehlende Freisetzung sollte sich die Zahl der Kapside im Zellkern erhöhen. Nach 24h wurden die Zellen geerntet und eine Kapsidreinigung vorgenommen (siehe Reinigung von Virus-Kapsiden). Die erhaltenen Präparate wurden wiederum in einem SDS-10%-Polyacrylamidgel aufgetrennt und anschließend mit Coomassie-Blau (siehe Coomassie-Färbung von Gelen) gefärbt. Die sichtbaren Banden wurden anschließend aus dem Gel ausgestochen und im Massenspektrometer untersucht. 112

120 Ergebnisse Kotransduktion Infektion Abb Coomassie gefärbtes Gel. PSEK Zellen wurden mit den Baculoviren BacMam-UL18, Bac- Mam-UL19, BacMam-UL26, BacMam-UL26.5 und BacMam-UL38 mit einer MOI=10 je Virus transduziert. Parallel erfolgte die Infektion mit PrV-ΔUL34 mit einer MOI=5. Die Zellen wurden nach 24h geerntet und Lysate hergestellt. Die Proben wurden anschließend auf einem SDS-10% Polyacrylamidgel separiert und mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Analyse der ausgeschnittenen Banden erfolgte durch Labor Dr. Karger, FLI Insel Riems. Dargestellt sind die Lysate nach Kotransduktion bzw. Infektion mit PrV-ΔUL34. Angezeigt sind der Größenstandard (links) sowie die relevanten identifizierbaren Banden nach massenspektrometrischer Analyse (rechts). Im Massenspektrometer konnten die Kapsidproteine pul19, pul18 und pul38 in den transduzierten Zellen identifiziert werden. Im Gegensatz dazu konnten weder die Protease pul26 noch das Gerüstprotein pul26.5 im Gel gefunden werden. Obwohl die Kapsidstrukturproteine sowohl im Western Blot als auch im Massenspektrometer in den transduzierten Zellen wie in den infizierten Zellen nachgewiesen werden konnten, scheinen nach Transduktion keine oder nicht 113

121 Ergebnisse genügend Kapside gebildet zu werden. Ob die Ursache in der zu geringen Kotransduktionsrate oder am pul38 lag, dass in den Baculovirus-transduzierten Zellen in einer größeren Form exprimiert wurde als in den infizierten Zellen konnte leider nicht geklärt werden. 3.3 Gezielte Beeinflussung der Expression von p97 durch sirna Durch massenspektrometrische Analysen infizierter Zellen konnte gezeigt werden, dass während der Infektion mit PrV die Proteinsynthese der Wirtszelle maßgeblich beeinflusst wird (Skiba et al., 2008; Blanchard et al., 2006). Dabei ist beobachtet worden, dass die Expression der zellulären AAA-ATPase p97 (Syn.: VCP, Valosin Containing Protein) nach Infektion verstärkt exprimiert wurde (Skiba, persönliche Mitteilung). Dem p97 wird in der Zelle eine Reihe von Funktionen zugeschrieben, unter anderem auch eine Rolle bei der Membranfusion (Uchiyama und Kondo, 2005). Da bis jetzt nicht bekannt ist, welche zellulären Proteine an der Freisetzung der Herpesviruskapside aus dem Kern beteiligt sind, sollte die Rolle von p97 während der PrV Infektion untersucht werden. Durch spezifische sirna sollte versucht werden, die Synthese dieses Proteins gezielt zu hemmen und die Auswirkungen auf die Replikation von PrV zu untersuchen Anwendung von shrna Klonierung von psuper-p97 Im Gegensatz zur sirna (small interfering RNA) liegt shrna (short hairpin RNA) kloniert in einem Vektor vor, der gut zu vermehren und zu transfizieren ist. Neben der einfachen Handhabung sind die Effekte der Transfektion auf die Zellen leichter nachzuweisen (beispielsweise durch das gleichzeitige Vorhandensein eines Gens für autofluoreszierende Proteine). Für die Modulierung der Expression des p97 wurde daher eine bekannte shrna (Alzayady et al., 2005), welche gegen das p97 der Ratte gerichtet ist, genutzt. Dazu wurden die dort verwendeten Oligonukleotide synthetisiert und in den Vektor psuper kloniert. Plasmide, die nach Restriktionsverdau das erwartete Bandenmuster zeigten, wurden auf die korrekte Insertion der 114

122 Ergebnisse Oligonukleotide durch Sequenzierung überprüft und eine DNA-Maxipräparation angefertigt. Infektion verschiedener Rattenzelllinien Da die verwendete shrna spezifisch für p97 aus der Ratte ist, sollten Rattenzellen als Wirtszellen verwendet werden. Dazu wurde zunächst die Replikationsfähigkeit von PrV-Ka auf den zur Verfügung stehenden Rattenzelllinien untersucht. Alle Zelllinien wurden in einer Zellkulturschale im 24 well Format kultiviert und mit einer MOI von 3 infiziert. Nach 24 h wurden die Zellen mit dem Überstand geerntet und die Virustiter auf RK13 Zellen bestimmt. Tab. 3.3 Infektion unterschiedlicher Zelllinien mit PrV-Ka. Die Zellen wurden mit einer MOI von 3 infiziert und nach einer Inkubationszeit von 24 h geerntet. Zur Titerbestimmung wurde ein Plaquetest auf RK13 Zellen durchgeführt. Zelllinie Titer in pfu/ml RK x 10 7 NRK-49F 1.9 x 10 7 NRK-52E 2.7 x 10 5 RE-R 1.4 x 10 7 Die Infektion von RK13 Zellen führte zu hohen Virustitern. Im Vergleich dazu lagen die Titer der infizierten Rattenzellen darunter. Am schlechtesten vermehrten die NRK-52E (Nierenepithel) Zellen PrV. Bessere Ergebnisse wurden nach Infektion der Zelllinien NRK-49F (Nierenfibroblasten) und RE-R (Rattenembryo) erreicht, die etwa 5-fach niedrigere Titer als die RK13 Zellen zeigten. Transfektion verschiedener Rattenzelllinien Da sich RK13 Zellen sehr gut transfizieren lassen, dienten sie auch als Vergleich zur Überprüfung der Effizienz verschiedener Transfektionsreagenzien auf den unterschiedlichen Rattenzelllinien. Wie im vorangegangenen Infektionsversuch wurden die verschiedenen Zelllinien auf Zellkulturplatten im 24 well Format kultiviert und mit psuper transfiziert. Durch die Schätzung GFP-positiver Zellen wurde die Effizienz der Transfektionen nach 24 und 48 h bestimmt. 115

123 Ergebnisse Tab. 3.4 Transfektionsraten verschiedener Zellen. Die verschiedenen Zelllinien wurden mit psuper transfiziert. Anhand der grün leuchtenden Zellen wurde nach 24 h und 48 h geschätzt, wie viele Zellen transfiziert wurden. Zelllinie RK13 NRK-49F NRK-52E RE-R Transfektionsagenz HBS 80 % 0 % 0 % 10 % Lipofektamin 60 % 40 % 0 % 40 % Fugene 80 % 20 % 10 % 20 % Die Transfektion von RK13 Zellen war im Vergleich zu den Rattenzellen deutlich effizienter. Die schonende Methode der HBS Transfektion zeigte bei den RK13 Zellen sehr gute Ergebnisse, bei der bis zu 80 % der Zellen GFP exprimierten. Im Gegensatz dazu gelang die Transfektion der Rattenzellen damit ungenügend bis gar nicht. Durch Lipofektamin konnte bei NRK-49F und RE-R die beste Transfektionseffizienz erreicht werden. Dabei war allerdings zu beobachten, dass das Reagenz für längere Inkubationszeiten aufgrund von zellschädigenden Eigenschaften weniger geeignet ist. Auch hiermit waren die NRK-52E sehr schlecht transfizierbar. Die Transfektion mit Fugene war bei den RK13 Zellen in der Effizienz mit der HBS Transfektion vergleichbar. Bei den NRK-49F und RE-R Zellen war die Effizienz deutlich schlechter und lag mit etwa 20 % noch unter der von Lipofektamin. Die NRK- 52E Zellen schienen für alle genutzten Transfektionsagenzien ungeeignet und die Effizienz lag maximal bei 10 %. Für nachfolgende Versuche wurden daher NRK-49F Zellen genutzt, da diese die höchsten Transfektionseffizienzen aufwiesen und das Virus am besten vermehrten. Untersuchung der Expression von p97 in Anwesenheit von shrna Um den Effekt der shrna auf p97 zu testen, wurden NRK-49F Zellen in Zellkulturschalen im 24 well Format kultiviert und mit psuper-p97 unter Einsatz von Lipofektamin transfiziert. Als Kontrolle diente der Vektor psuper ohne Insert. Um die Transfektionseffizienz ggf. noch zu erhöhen, wurde nach Herstellerangaben das Verhältnis von DNA und Lipofektamin variiert. Nach 24 h und 48 h wurden die Zellen 116

124 Ergebnisse geerntet und Lysate hergestellt. Diese wurden in einem SDS 7.5 % -Polyacrylamidgel separiert und auf eine PVDF Membran geblottet. Die Detektion von p97 erfolgte mit einem monoklonalen anti-p97 Serum, wobei als Kontrolle, dass vergleichbare Mengen Zelllysat aufgetrennt wurden, ein monoklonales anti- -Tubulin Serum diente. Abb. 3.22: Transfektion von psuper-p97. NRK-49F Zellen wurden mit psuper oder psuper-p97 transfiziert. Das Verhältnis von DNA zum Transfektionsreagenz wurde dabei von 1:3 (entspricht 1µg DNA und 3 µl Lipofektamin) bis 1:5 variiert. Nach 24 und 48 h wurden die Zellen geerntet und Lysate im Western Blot mithilfe entsprechender Antiseren gegen p97 und -Tubulin untersucht. Der Größenmarker in Kilodalton ist auf der linken Seite angegeben. Aufgrund der zellschädigenden Wirkung von Lipofektamin war die Kultivierung der Zellen nur bis 48 h nach Transfektion möglich. In diesem Zeitraum war bei den mit der shrna behandelten Zellen kein Unterschied zu den mit leerem Vektor transfizierten Zellen zu sehen. Rattenzellen zeigten im Vergleich zu RK13 Zellen eine sehr schlechte Transfektionseffizienz, die auch durch Variation der Versuchsbedingungen nur geringfügig gesteigert werden konnte. Aufgrund der zellschädigenden Wirkung des Transfektionsreagenz Lipofektamin war außerdem eine Verlängerung der Inkubationszeit der shrna nicht möglich Klonierung von pegfp-h1pb-p97 und Herstellung einer knock-out Zelllinie Durch den vorangegangenen Versuch wurde ersichtlich, dass Lipofektamin zytotoxisch wirkt und auch die Transfektionseffizienzen eher gering waren. Dadurch 117

125 Ergebnisse erschien es durch transiente Versuche nur schwer möglich, eine Veränderung der Expression von p97 zu detektieren. Daher sollte eine Zelllinie hergestellt werden, die stabil die p97-shrna exprimiert. Dazu wurden die spezifischen Oligonukleotide in den Vektor pegfp-h1pb (bereitgestellt durch Labor Dr. Fuchs, FLI Riems) kloniert. Dieser Vektor entspricht psuper enthält aber zusätzlich eine Neomycinresistenz- Kassette, die es ermöglicht, durch Selektion mit G418 stabil exprimierende Zelllinien herzustellen. Für die Herstellung der stabilen Zelllinie wurden NRK-49F Zellen mit pegfp-h1pbp97 mit Lipofektamin transfiziert und nach 2 Tagen in Selektionsmedium (Medium ZB5 + G418) weiter kultiviert. Transgene Zellklone wurden über die GFP- Autofluoreszenz selektiert. Verschiedene GFP-positive Zellklone wurden auf Expression des p97 im Western Blot analysiert. Als Kontrolle diente erneut die Expression von -Tubulin sowie Lysate der nicht transfizierten NRK-49F Zellen, welche eine normale Expression von p97 aufweisen sollten. Abb. 3.23: Western Blot Analyse der Zellklone NRK-49F- p97. Aus verschiedenen Zellklonen von NRK-49F- p97 wurden Lysate hergestellt und diese auf einem SDS-7.5 % Polyacrylamidgel separiert. Anschließender Transfer auf eine PVDF Membran ermöglichte die Detektion von p97 und -Tubulin mit spezifischen monoklonalen Antikörpern. Der Größenmarker in Kilodalton ist auf der linken Seite angegeben. Die Expression von p97 und Tubulin war in den NRK-49F Zellen, welche als Kontrolle dienten, etwa gleich stark. Einige der Zellklone hingegen wiesen eine Abnahme der Expression von p97 im Vergleich zu Tubulin auf. Dazu zählten die 118