Charakterisierung des Core-Proteins von Pestiviren

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Oldwig Raske
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1 Aus dem Institut für Virologie des Fachbereiches Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. Till Rümenapf Charakterisierung des Core-Proteins von Pestiviren INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von GLEYDER ROMAN-SOSA Tierarzt aus el Mariel, la Habana, Kuba Gießen 2007

2 1 Einleitung Pestiviren Eigenschaften und Funktion der Strukturproteine von Pestiviren Glykoproteine E'"\ El und E Kapsid-Protein (Core) Eigenschaften und Funktion des Core-Proteins anderer Mitglieder der Familie Flaviviridae Hepatitis C Virus Flaviviren Zielsetzung der Arbeit 10 2 Material und Methoden Material Eukaryotische Zelllinien Prokaryotische Zellen Virusstämme Antikörper Enzyme 13 2.,1.6 Chemikalien Verbrauchsmaterialien Geräte Methoden Zellkulturtechniken für Säugerzellen und Virusarbeiten Medien und Puffer Allgemeine Zellkulturarbeiten Elektroporation von RNS in SK6-Zellen Indirekter immunhistochemischer Nachweis Indirekte Immunperoxidase Protein Nachweis durch indirekte Immunfluoreszenz Einbettungsmedium Färbung von Zellkernen mit 4 '-6-Diamidino-2-phenylindole (DAP1) 20

3 Titration von Pestiviren Bestimmung der Proteinkonzentratipn (BC-Mikroassay) Herstellung monoklonaler Antikörper Erzeugung rekombinanter Proteine Immunisierung von Mäusen Gewinnung undausplattierung von,,feeder"-zellen Gewinnung der Splenozyten (Milzzellen) Bestimmung der Zellzahl Fusion von Splenozyten undmyelomzellen Selektion von Hybridomzellen ELISA zum Screening von Hybridom Überständen Screening von Hybridomzellen Klonierimg positiver Hybridome Produktion von maks Isotypisierung der maks mit einem kommerziellen vorgefertigten Test (ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit I (HRP/ABTS)) Bestimmung der Epitope der anti Core-Protein maks Kolokalisierungsstudien Kolokalisierung von Struktur- bzw. Nichtstrukturproteinen mit dem ER Kolokalisierung des Core-Proteins mit den Mitochondrien Färbung von Mitochondrien Kolokalisierung des Core-Proteins mit lipiddroplets" Färbung der lipiddroplets" mit Red Oil O Kolokalisierung des Core-Proteins mit P-Bodies " Kolokalisierung des Core-Proteins mit NS Direkte Markierung der maks mit dem Zenon m Mouse Labeling Kit" (Fa. Pierce) Reinigung von monoklonalen Antikörpern Kolokalisierung des Core-Proteins mit NS5B Protein-RNS Agarose Gel Bindungsassay Proteinbiochemische Methoden SDS-PAGE 34

4 Coomassie-Färbung Immunoblot-Analyse von Proteinen (Western Blot) Gewinnung von Virionen aus dem Oberstand infizierter Zellkulturen Präparation von Lysaten aus KSPVinfizierten Zellen zur Western Blot Analyse Präparation von Lysaten aus mit nzp7 NS5A-B transfizierten Zellen zur Western Blot Analyse Molekularbiologische Methoden Anzucht von Bakterien Plasmidisolierung Herstellung und Transformation kompetenter Bakterien Isolierung von Gesamt-RNS durch RNeasy Phenol/Chloroform Extraktion von DNS Ethanolpräzipitation von DNS/RNS und Isopropanolpräzipitation von DNS Quantifizierung von DNS/RNS-Proben DNS- bzw. RNS-Agarose-Gelelektrophorese Dephosphorylierung von DNS ^ ufreinigung und Ligation von DNS-Fragmenten Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Ortsgerichtete Mutagenese mittels QuickChange Site-Directed Mutagenesis " und Deletions-PCR In vitro Transkription Herstellung von Transkripten verschiedener Länge Sequenzierung der DNS durch Cycle-Sequencing" mit Fluoreszenzfarbstoff-markiertem Primer Elektrophorese in denaturierenden Harnstoff-Polyacrylamidgelen Klonierungen Synthetische Oligonukleotide Klonierung des Gens des KSPV Core-Proteins Generierung der am 3 -Ende verkürzten Formen des KSPV Core-Protein Gens (pcore 6, pcore 8, pcore 11, pcore 14) 53

5 Generierung eines KSPV Gesamtklons mit einem Cystein an der Aminosäureposition 200 des Core-Proteins (pcore29) Klonierung des Gens vom BVDV Core-Protein (p940) Generierung der am 3 '-Ende verkürzten Formen des BVDV Core-Protein Gens (pcore 24, pcore 26, pcore 27, pcore 28) Klonierung des KSPVNS5B-Protein Gens (pll41) 55 3 Ergebnisse 3.1 Klonierung, Expression und A ufreinigung des Core-Proteins vom Virus der klassischen Schweinepest Klonierung Expression Reinigung Klonierung, Expression und Aufreinigung des BVDVncp7 Core-Proteins Klonierung 61 3.,2.2 Expression Reinigung Präparation monokionaler Antikörper gegen das pestivirale Core-Protein Immunisierung Fusion von Splenozyten immunisierter Mäuse mit Myelomzellen Gewinnung von Splenozyten (Milzzellen) zur Fusion Fusion von Splenozyten und Myelomzellen Etablierung eines Screeningsystems zur Identifizierung positiver Hybridome Screening" von Hybridom-Überständen im ELISA, Selektion und Klonierung positiver Hybridome , creening" der Fusionen von Splenozyten aus Mäusen, die mit KSPV Core-Protein immunisiert wurden , creening" der Fusionen von Splenozyten aus Mäusen, die mit B VD V Core-Protein immunisiert wurden Isotypisierung der gewonnenen monoklonalen Antikörper 67

6 3.4 Charakterisierung der anti Core-Protein maks Reaktion der maks im Western Blot mit gereinigtem bakteriellen Core-Protein Nachweis des Core-Proteins in Virionen von Pestiviren verschiedener Spezies im Western Blot mit den hergestellten monoklonalen Antikörpern Epitop Lokalisierung der anti Core-Protein maks Epitop Lokalisierung von mak GRS-Cl und GRS-C Epitop Lokalisierung der maks GRS-C3, GRS-C4, GRS-C5, GRS-C6, GRS-C7 und GRS-C Charakterisierung des höheren Molekulargewichtproduktes des Core-Proteins vom Stamm 890 und vom Jsolat Gi Stabilität des Produktes in Anwesenheit reduzierender Reagenzien Funktion der Homodimerisierung von Core RNS bindende Aktivität des KSPVAlforta Core-Proteins Bindung des Core-Proteins anpestivirale RNS Bindung des Core-Proteins an KSPV RNS Transkripte verschiedener Länge Bindung des Core-Proteins an nicht pestivirale RNS Bindung des Core-Proteins an RNS Homopolymere Bindung des Core-Proteins an dsrns Nachweis des Core-Proteins von Pestiviren mit indirekter Immunfluoreszenz Kolokalisierungsstudien des Core-Proteins in infizierten Zellen mit Hilfe der konfokalen Lasermikroskopie Kolokalisierung vom KSPV Core-Protein mit dem ER Marker Protein-Disulfidisomerase (PDI) Kolokalisierung der KSPVStrukturglykoproteine *" ', El und E2 mit PDI Kolokalisierung vom KSPV Core-Protein mit Mitochondrien Kolokalisierung des Core-Proteins mit,jwa processing bodies (P-Bodies) u Kolokalisierung des KSP V Core-Proteins mit lipid droplets "(LD) Kolokalisierung des Core-Proteins mit den Bestandteilen des Replikationskomplexes NS3 undns5b Kolokalisierung des Core-Proteins mit NS3 96

7 Herstellung von mak gegen das NS5B Protein von KSPV Klonierung, Expression und Reinigung des KSPV Alfort, s NS5B Proteins (RNS abhängige RNS Polymerase) Immunisierung von Mäusen und Fusion von Lymphozyten mit Myelomzellen ,, Screening", Isolierung und Klonierung positiver Hybridome Charakterisierung der gegen das NS5B hergestellten monoklonalen Antikörper GRS-Pol-1, -2, -3, -4, -5 und Bestimmung des Subtyps der anti NS5B maks Western Blot Analyse der Hybridom-Überstände mit Zelllysaten von KSPV infizierten und BVDV NS5A-B transient exprimierenden Zellen Detektion des NS5B Proteins KSPV infizierter Zellen in indirekter Immunfluoreszenz Kolokalisierung des NS5B Proteins mit dem ER Kolokalisierung des Core-Proteins mit NS5B Diskussion Herstellung und Charakterisierung von mak gegen das pestivirale Core-Protein und Nachweis des Core-Proteins in Virionen von Pestiviren verschiedener Spezies Nachweis des Core-Proteins von Pestiviren verschiedener Spezies in infizierten Zellen, und Kolokalisierungsuntersuchungen mit Hilfe monokionaler Antikörper Charakterisierung der RNS bindenden Aktivität des Core Proteins Zusammenfassung Summary Literatur 115

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