Trenn- und Analysenmethoden organischer Arzneistoffe

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1 Trenn- und Analysenmethoden organischer Arzneistoffe Abschnitt B - Trennmethoden N. Haider SS 2005 Inhaltsübersicht Chromatographische Methoden Funktionsprinzip, theoretische Grundlagen Dünnschichtchromatographie (DC, TLC) Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) Säulenchromatographie (SC, CC) Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Gaschromatographie (GC) Auswertung von Chromatogrammen (qualitativ, quantitativ) 1

2 Das Prinzip chromatographischer Methoden Definition: Chromatographische Methoden sind physikalisch-chemische Trennmethoden, die alle im Prinzip darauf beruhen, dass Substanzen zwischen einer ruhenden (stationären) und einer sich an dieser vorbeibewegenden (mobilen) Phase verteilt werden. Beispiel zur Veranschaulichung: Dünnschichtchromatographie Fließmittelfront Start Fall A Fall B Fall C Substanz Fall A, B: keine Chromatographie; Fall C: Chromatographie Trennung von Substanzgemischen 2

3 Wichtige Begriffe Chromatographisches Arbeiten erfordert folgende Schritte: Aufbringen der Probe Entwickeln des Chromatogramms (mobile Phase wandert) Nachweis der getrennten Substanzen (Detektion) Jedes chromatographische System besteht aus: der mobilen Phase der stationären Phase dem zu trennenden Substanzgemisch Charakteristika chromatographischer Verfahren Vorteile gegenüber klassischen Methoden zur Stofftrennung (Fällen, Kristallisieren, Destillieren, Sublimieren, Extrahieren): höhere Trennschärfe größere Empfindlichkeit geringerer Zeitaufwand manchmal einfachere Durchführbarkeit (DC, klass. SC) Verhalten von Substanzen in einem gegebenen chromatograph. System spezifische Substanzeigenschaft; geeignet zur Charakterisierung und Identifizierung von Substanzen (bzw. Identitätsprüfung) 3

4 Charakterisierung des Wanderungsverhaltens (DC) Glasplatte Sorbensschicht R F -Wert Fließmittelfront R F = a c R X -Wert (R St -Wert) R X = R St = a b Messpunkte: c Startpunkt 3 mm b Fleckenmittelpunkt bzw. a Fließmittelfront... St Pr St 20 mm 5 mm Grundlagen chromatographischer Trennungen Trennprinzipien (Trennmechanismen): Adsorption Verteilung Molekularsiebwirkung (Ausschluss) Ionenaustausch Bioaffinität manchmal keine 100%ige Abgrenzung möglich 4

5 Grundlagen chromatographischer Trennungen Adsorption Definition: Anreicherung eines gelösten Stoffes oder eines gasförmigen Stoffes ( = ADSORBAT) an der Oberfläche eines Feststoffes ( = ADSORBENS = SORBENS); Oberflächenreaktion reversibler Prozess Desorption (Konkurrenz mit anderen Substanzen, v.a. mit Lösungsmittel!) Bindung erfolgt bei der physikalischen Adsorption durch: Dipol-Dipol-Wechselwirkungen H-Brückenbindungen Charge-Transfer-Wechselwirkungen Grundlagen chromatographischer Trennungen: Adsorption ständiger Wechsel von Adsorptions- und Desorptionsprozessen, Beschreibung durch Adsorptionsisothermen C s ideale Adsorptionsisotherme (linearer Verlauf) C s, C m : Substanzkonzentration in der stationären bzw. mobilen Phase C m 5

6 ideale Adsorptionsisothermen flacher Verlauf: rasche Wanderung steiler Verlauf: langsame Wanderung Zur Trennung zweier Substanzen ist ein ausreichender Steigungsunterschied der beiden Adsorptionsisothermen erforderlich. reale Adsorptionsisothermen: Langmuir-Isotherme Krümmung der Isotherme infolge beschränkter Adsorptionskapazität der stationären Phase; aktivste Stellen an der Oberfläche zuerst besetzt. Resultat: Tailing Abhilfe: in niedrigerem Konzentrationsbereich arbeiten 6

7 Grundlagen chromatographischer Trennungen Verteilung System besteht aus 2 nicht miteinander mischbaren Phasen: 2 Flüssigkeiten oder 1 Flüssigkeit + 1 Gas; in beiden Phasen (zumindest teilweise) löslicher Analyt Trägermaterial für flüssige stationäre Phase erforderlich es gilt das Nernst sche Verteilungsgesetz K = C a in Phase 1 C a in Phase 2 C a... Konzentration der Substanz a K... Verteilungskoeffizient = Gleichgewichtskonstante des Verteilungsgleichgewichtes K abhängig von: Art der beiden Phasen Temperatur Druck K unabhängig (im Idealfall) von Konzentrationsbereich ideale / reale Nernst-Verteilung ideale Nernst-Verteilung C a in Phase 1 reale Nernst-Verteilung C a in Phase 2 Abweichungen vom linearen Verlauf infolge von Aggregatbildung, Sättigungseffekten bei höheren Konzentrationen Resultat: Tailing Abhilfe: in niedrigerem Konzentrationsbereich arbeiten 7

8 Verteilung Substanzen sind verteilungschromatographisch trennbar, wenn sich ihre Verteilungskoeffizienten hinreichend voneinander unterscheiden Maßzahl für Trennbarkeit: Trennfaktor β β = K K a b K a... Verteilungskoeffizient für Substanz a K b... Verteilungskoeffizient für Substanz b Normale Verteilungschromatographie: polare stationäre Phase (z.b. H 2 O), apolare mobile Phase (organ. LM) Umkehrphasen-Verteilungschromatographie (reversed phase): apolare stationäre Phase (z.b. Paraffinöl, Silikonöl), polare mobile Phase (H 2 O- hältiges LM-Gemisch; z.b. H 2 O/Methanol, H 2 O/Acetonitril, etc.) Wanderungsverhalten verschieden polarer Substanzen Adsorptionschromatographie: apolare Substanzen wandern immer schneller als polarew Substanzen Verteilungschromatographie: Umkehrung des Wanderungsverhaltens möglich Verteilungs-DC Adsorptions-DC FM-Front A P A P P A A P o o Start o o "normal" mit Phasenumkehr aktives Sorbens, apolares Fließmittel wenig aktives Sorbens, polares Fließmittel 8

9 Grundlagen chromatographischer Trennungen Ionenaustausch Ionenaustauscher: unlösliche Festsubstanzen mit Polyelektrolyt-Charakter, die aus Elektrolytlösungen Anionen bzw. Kationen aufnehmen können und dafür äquivalente Mengen gleichsinnig geladener Ionen in die Lösung abgeben. Je nachdem, ob Anionen oder Kationen abgegeben werden Anionen- bzw. Kationenaustauscher. Häufig verwendet: Co-Polymerisate aus Styrol und Divinylbenzol mit ionischen funktionellen Gruppen an den Phenylresten. starke IAT: bei jedem ph-wert in ionischer Form starke Kationenaustauscher: z.b. R-SO 3- Na + starke Anionenaustauscher: z.b. R-N(R ) 3+ Cl - schwache IAT: nur in bestimmtem ph-bereich ionisch schwache Kationenaustauscher: z.b. R-COO - Na + schwache Anionenaustauscher: z.b. R-NH 3+ Cl - Ionenaustauschchromatographie Trennung infolge unterschiedlich starker Wechselwirkungskräfte zwischen verschiedenen ionischen Analyten und den Festionen des IAT stationäre Phase: ionische Stellen des Austauscherharzes mobile Phase: Elektrolytlösung 9

10 Grundlagen chromatographischer Trennungen Molekülsiebwirkung, Ausschluss-Chrom. verwendet in Gel-Chromatographie (Gel-Permeation), Gel-Filtration Trenneffekt durch sterischen Ausschluss (Molekülgröße bzw. Molekulargewicht), nur für Verbindungen ab einer best. Mindestgröße geeignet kleinere Moleküle diffundieren weiter in die Poren hinein längerer Aufenthalt in der stationären Phase langsamere Wanderung mobile Phase: geeignetes LM (meist wässrige Pufferlösungen) stationäre Phase: das selbe LM, und zwar dessen Anteil innerhalb der Poren Grundlagen chromatographischer Trennungen Bioaffinitäts-Chromatographie An der Oberfläche eines inerten, polymeren Trägers sind Substanzen chemisch gebunden, die zu bestimmten Biomolekülen eine besonders hohe Affinität besitzen und diese daher hervorragend retinieren können. z.b.: Antikörper Antigen Enzym Substrat, Inhibitor Rezeptor Arzneistoff, Hormon 10

11 Einteilung chromatographischer Verfahren nach dem Trennprinzip nach der Ausführungstechnik: säulenchromatographische Verfahren flat-bed-verfahren nach dem Phasenaufbau: stationäre Phase fest (S) oder flüssig (L), mobile Phase flüssig (L) oder gasförmig (G) Bezeichnungen wie LSC, LLC, GSC, GLC danach, wo die Substanzen nachgewiesen werden: innerhalb der Trennstrecke inneres Chromatogramm nach Verlassen der Trennstrecke äußeres Chrom. Theorie des chromatographischen Prozesses Mehrere Theorien zur Beschreibung der relevanten Vorgänge: kinetische Theorie Theorie der Böden (Trennstufen-Modell) dynamische Theorie molekularstatistische Theorie (random-walk-modell) Ziel: besseres Verständnis, Möglichkeit der Vorhersage 11

12 kinetische Theorie Verhalten einzelner Moleküle verschiedenen Typs wird betrachtet; Boots-Modell (verschiedene Typen von Booten auf einem Fluss) Beispiel: 3 Substanzen (I, a, b) I Inertsubstanz (ohne Retention), wandert gleich schnell wie mobile Phase a mit einer bestimmten Retention b mit Retention größer als a (wandert langsamer als a) am Säulenkopf aufgegeben, dann LM-Gemisch zugeführt (wandert infolge Schwerkraft durch die Säule), Subst. I, a und be werden mittransportiert und verlassen nacheinander die Säule am unteren Ende; Zeit vom Beginn der Entwicklung gemessen, Subst.-Konzentration am Ende der Trennstrecke laufend gemessen Darstellung als zeitabhängiges Konzentrationsprofil: Elutionskurve kinetische Theorie Substanz-Zone: Peak (annähernd Gauß sche Glockenkurve) 12

13 Theorie der Böden (Trennstufen-Modell) Verteilungsgleichgewicht (Substanz mobile/stationäre Phase) stellt sich nicht unendlich schnell ein. Trennstrecke wird in gedachte Abschnitte zerlegt, die gerade lang genug sind, damit Gleichgewichtseinstellung erfolgen kann: Länge so eines Abschnittes: Höhenäquivalent eines theoretischen Bodens (Begriff aus der Destillation) bzw. height equivalen to a theoretical plate (HETP) bzw. Trennstufenhöhe (H) Ursachen für nicht ideale Chromatographie: Viskosität der mobilen Phase Diffusionseffekte: Longitudinale Diffusion: durch unterschiedlich lange Aufenthaltszeiten gleichartiger Substanzmoleküle in der stationären Phase Streudiffusion = Eddy-Diffusion: durch unterschiedlich lange Aufenthaltszeiten glaichartiger Substanzmoleküle in der mobilen Phase Je kleiner die Trennstufenhöhe, umso mehr Trennstufen pro Trennstreckenlänge umso besser die Trennleistung des Systems Kenngrößen eines chromatographischen Peaks Basisbreite: Ermittlung der Wendepunkte Anlegen der Wendetangenten Abstand der Schnittpunkte der Wendetangenten mit der Basislinie Halbwertsbreite: keinewendetangenten erforderlich Schnittpunkt einer horizontalen Linie auf halber Peakhöhe mit den beiden Peakflanken bei unsymmetrischen oder überlappenden Peaks leichter zu ermitteln als Basisbreite Halbwertsbreite ist nicht die halbe Basisbreite!!! 13

14 Ermittlung der Trennstufenzahl und -höhe H = L Z H... Höhe eines theoretischen Bodens L... Länge der chromatographischen Trennstrecke in mm Z... Trennstufenzahl B... Basisbreite eines Peaks Z = 16 ( t R ) 2 Z = 5.54 ( t ) B BR 2 1/2 bei symmetrischen Peaks bei verzerrten Peaks (Peaks mit Tailing, überlappende Peaks) Ermittlung der Symmetrie eines Peaks der Symmetriefaktor 14

15 dynamische Theorie Erweiterung der Theorie der Böden Zusammenhang zwischen der theoretischen Trennstufenhöhe H und dynamischen Erscheinungen (Diffusions-, Strömungseffekte und Nichtgleichgewichtseinstellung): van Deemter-Gleichung dynamische Theorie van Deemter-Gleichung stellt Trennstufenhöhe H der linearen Strömungsgeschwindigkeit u gegenüber H umso kleiner ( mehr Trennstufen!), wenn A, B, C möglichst klein sind A: berücksichtigt Eddy-Diffusion, ist klein bei: gleichmäßiger Packung einheitlichem Teilchendurchmesser der stationären Phase kleiner Teilchengröße der stat. Phase B: berücksichtigt longitudinale Diffusion, ist klein bei weiten und unverzweigten Poren in der stationären Phase C: berücksichtigt Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung, ist klein bei niedriger Viskosität der mobilen Phase 15

16 chromatographische Trennmethoden Dünnschichtchromatographie (DC) Thin-Layer Chromatography (TLC) geringer apparativer Aufwand (billig) geringer Zeitaufwand hohe Trennleistung niedrige Nachweisgrenzen hohe Selektivität des Nachweises charakteristische Merkmale: Trennstrecke besteht aus dünner Schicht stationärer Phase, die sich auf einer geeigneten inerten Unterlage (Glas, Alu-, Plastikfolie) befindet. Die Trennung erfolgt näherungsweise in zweiter Dimension (Unterschied zu SC). flat-bed-methode. Dünnschichtchromatographie Bezüglich Trennmechanismen: am häufigsten Adsorption, Verteilung (ev. auch Ionenaustausch) Anwendungsmöglichkeiten: analytisch, mikropräparativ (100 mg Maßstab) für Trennung größerer Stoffmengen nur wenig geeignet (dafür ist SC besser) 16

17 Dünnschichtchromatographie Sorbentien in der DC Kieselgel 1,2) Aluminiumoxid 2) basisch (ph 9.0) neutral (ph 7.5) sauer (ph 4.0) Kieselgur Polyamid (Nylon, Perlon) Cellulose Acetylierte Cellulose Dextrangele Stärke 1) G: mit CaSO 4 ( 13%) H: ohne Bindemittel 2) F: mit Fluoreszenzindikator P: für präparative Chromatographie R: besonders gereinigt (z.b. für quant. in situ Auswertung) Zahlenangaben: mittlerer Porendurchmesser in Å (z.b. Typ Å) Dünnschichtchromatographie Adsorptionskraft des Sorbensmaterials Aktivität hängt ab von: Teilchengröße (kleine Teilchen große spezifische Oberfläche (z.b. Kieselgel 60: 500 m 2 /g); in DC ca µm Zahl und Durchmesser der Kanäle (Poren), die bei der Herstellung entstehen Wassergehalt des Sorbens Herstellung der Schichten: heute prakt. nur mehr industriell 17

18 Dünnschichtchromatographie Auftragen der Substanzen etwa 5-20 µg Substanz in einem LM, das die Substanz gut löst: z.b. Aceton, Methanol, Ethanol, Dichlormethan 0.1-5%ige Lösungen, 2-20 µl mit Mikropipetten, Mikroliterspritzen Belastbarkeit: 10-5 g/g Sorbens Entwicklung des Chromatogramms erst nach völligem Abdunsten des zum Auftragen verwendeten LM punktförmiges Auftragen: v.a. in analytischer DC strichförmiges (bandförmiges) Auftragen: v.a. in präparativer DC Fleckenform und -größe beeinflussen Ergebnis der Trennung Dünnschichtchromatographie Thermomikro-Auftrageverfahren nach Stahl (TAS) spezielles Verfahren zum Auftragen leicht flüchtiger Substanzen aus komplexer Matrix (z.b. pflanzl. Material) 18

19 Dünnschichtchromatographie Fließmittel-Auswahl Nacharbeiten vorgegebener Arbeitsvorschriften: LM mit definierter Reinheit und def. Wassergehalt verwenden (p.a.-qualität) eigene Methodenentwicklung Struktur der Probenmoleküle bekannt Abschätzung der Polarität Abschätzung der erforderlichen Elutionskraft Reihung der Lösungsmittel nach steigender Elutionskraft in Verbindung mit einem bestimmten Sorbens, bezogen auf n-pentan als Nullpunkt eluotrope Reihe unbekannte Eigenschaften der Analysensubstanz Auswahl des Fließmittels durch Versuch und Irrtum ; experimentell rasch durchzuführen mittels Mikrozirkulartechnik Dünnschichtchromatographie Elutionskraft ε 0 verschiedener Lösungsmittel Lösungsmittel Al2O3 SiO2 MgO Florisil DK δ Pentan Hexan Cyclohexan Tetrachlormethan Diisopropylether Benzol Diethylether Chloroform Dichlormethan Aceton ,4-Dioxan Essigsäureethylester Acetonitril Pyridin 0.71 > Ethanol Methanol Wasser sehr groß

20 Dünnschichtchromatographie Fließmittel-Auswahl mittels dem Stahl schen Dreieck: Dünnschichtchromatographie Fließmittel-Auswahl mittels Mikrozirkulartechnik Startfleck mehrere Versuche nebeneinander auf einer einzigen DC-Platte möglich (geringer Platzbedarf) FM zu apolar FM zu polar optimales FM 20

21 Dünnschichtchromatographie Fließmittel-Auswahl Gemische von Lösungsmitteln mit sehr großem Polaritätsunterschied vermeiden Möglichkeit der Ausbildung einer β-front (teilweise Entmischung des Fließmittels auf der DC-Platte) Dünnschichtchromatographie Entwicklung des Chromatogramms häufigste und einfachste Form: aufsteigende Entwicklung; 2 Möglichkeiten: ohne Kammersättigung (Problem der nicht konstanten FM-Zusammensetzung) mit Kammersättigung (gibt besser reproduzierbare R F -Werte) 21

22 Dünnschichtchromatographie Entwicklung des Chromatogramms Laufstrecken meist 5-15 cm Trennstufenzahl meist zwischen 500 und 3000 Laufzeit meist min bei aufsteigender DC unter Kammersättigung verhalten sich die Laufzeiten wie die Quadrate der Laufstrecken neben normalen Kammern auch Horizontal-Entwicklungskammern, Sandwich-Kammern (S-Kammern), Doppeltrog-Kammern Dünnschichtchromatographie Sandwich-Kammer Doppeltrog-Kammer 22

23 weitere DC-Entwicklungstechniken Mehrfach-Entwicklung bei ungenügender Trennung, vor allem bei präp. DC; Trocknen, neuerliche Entwicklung mit gleichem FM Trennstufenzahl ist dadurch zu vergrößern. Berechnung, dass bei der DC die Auflösung am besten bei einem R F von ca. 0.3 ist. (kleiner zu geringe Trennstufenzahl; größer Auflösungsverschlechterung durch Fleckenverbreiterung) Berechnung des R F -Wertes nach Mehrfach-Entwicklung: n R F = 1-(1-R F ) n n... Anzahl der Entwicklungen weitere DC-Entwicklungstechniken Stufentechnik nach Entwicklung mit FM 1 Trocknen Entwickeln mit FM 2; vor allem, wenn präp. Trennung von mehreren polaren und mehreren unpolaren Verbindungen erfolgen soll: stark polares FM bis zur halben Plattenhöhe dann schwach polares FM bis oben. Keilstreifentechnik vor allem bei knapp beieinander liegenden R F -Werten. Nach der Verjüngung tritt zusätzlich zur Strömung in Laufrichtung eine dazu senkrechte auf, welche die Substanz-Zonen quer zur Laufrichtung und damit auseinander zieht. Zirkulartechnik In der Plattenmitte wird FM mit einem Docht auf die Schicht gebracht, welche nach unten liegt; kreisförmige Ausbreitung in alle Richtungen. R F(circ) = RF(lin) 23

24 weitere DC-Entwicklungstechniken weitere DC-Entwicklungstechniken zweidimensionale Entwicklung Art der Ausführung: mit zwei verschiedenen FM zur besseren Trennung schwer trennbarer Gemische (z.b. Arzneistoff in biolog. Proben) mit gleichem FM: falls während der Analyse keine Veränderung der Substanzen eintritt Punkte nach der 2. Entwicklung auf einer Diagonalen tritt Reaktion auf aktiver Oberfläche während der Chromatographie (oder beim Zwischentrocknen) ein Punkte liegen nicht auf Diagonale TRT-Technik (Trennung - Reaktion - Trennung) damit kann die chemische Reaktionsfähigkeit von Substanzen untersucht werden. Mögliche Reaktionstypen: Oxidation Hydrolyse Photochemische Reaktionen Halogenierungen (z.b. mittels Br 2 -Dampf) 24

25 Dünnschichtchromatographie Detektion der Substanzen Eigenfarbe Fluoreszenz a) bei Tageslicht b) durch Anregung mit UV 366 (UV-Lampe) Fluoreszenzminderung: erfordert Fluoreszenzindikator (Anregungsstrahlung: UV 254 ) chemische Farbreaktionen ( Sprühreagentien), z.b.: I 2 (Lsg. od Dämpfe) KMnO 4 Dragendorff FeCl 3 Ninhydrin etc. etc. braune Flecken bei basischen N-Verbindungen weiße Flecken auf rosa Grund bei reduzierenden Verb. orange-gelbe Flecken bei Alkaloiden zart-violette Flecken bei Phenolen (int. grün bei 1,2-Diphenolen) blauviolette Flecken bei Aminosäuren Dünnschichtchromatographie Charakterisierung des Migrationsverhaltens R F -Wert R X -Wert (R St -Wert) Glasplatte Sorbensschicht Fließmittelfront R F = R X = R St = a c a b R F -Wert immer zwischen 0 und 1 R X -Wert auch > 1 möglich c hr F -Wert = R F -Wert x mm b a... St Pr St 20 mm 5 mm 25

26 Dünnschichtchromatographie Abhängigkeit des R F -Wertes R F -Wert wäre eigentlich substanzspezifische Kenngröße, wären alle Einflussfaktoren vollständig kontrollierbar; dies ist aber nicht der Fall, daher gewisser Schwankungsbereich. Experimentelle Faktoren, die den R F -Wert beeinflussen können: durchschnittliche Korngröße Aktivierungsgrad Luftfeuchtigkeit Schichtdicke Art der Schichtherstellung Sättigungsgrad der Kammeratmosphäre Entwicklungstechnik Länge der Laufstrecke Substanzmenge u. a. Dünnschichtchromatographie Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie / High Performance Thin Layer Chromatography (HPTLC) Schichtdicke Fleckdurchmesser Teilchen Trennstufenzahl Trennstrecke Entwicklungszeit Nachweisgrenze 0.19 mm mm 5 µm (eng klassiert) ca. 3 x DC 1-3 cm 2-3 min ng (DC: 5-50 ng) 26

27 Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie Auftragen der Substanzen in Lösung mit geeigneten Mikroliterspritzen; spezielle Auftragevorrichtung (z.b. Linomat ) Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie Entwicklung meist horizontal in Flachkammern, sodass praktisch kein Gasraum daher hervorragende Reproduzierbarkeit. Phasenfluss ist konstant; Zufuhr des FM mittels Kapillareffekt (hydrostatisch mit FM versorgt). 27

28 Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie Detektion meist mittels Densitometer = DC-Scanner (bzw. HPTLC-Scanner) rel. genaue quantitative Auswertung möglich: Platte wird von Lichtstrahl abgetastet, Intensität des durchtretenden oder diffus reflektierten Lichtes wird gemessen und als Kurve aufgezeichnet chromatographische Trennmethoden Säulenchromatographie (SC) Column Chromatography (CC) Durchführung in vertikal montierter Glasröhre (= Säule ; Länge einige cm bis m), Verhältnis Länge/Durchmesser ca. 40 :

29 Säulenchromatographie Säulenchromatographie Sorbentien: alle schon bei der DC angeführten Materialien; Teilchendurchmesser meist ca. 100 µm; Sorbens-Aktivität kann hier vergleichsweise einfach festgelegt werden. Aktivitätsstufen nach Brockmann: Wassergehalt (%) Stufe Al 2 O 3 Kieselgel I * ) II III IV V *) nach Erhitzen auf 150 C 29

30 Säulenchromatographie Problem der gleichmäßigen Dampfraumsättigung (s. DC) entfällt bei SC; Gleichmäßigkeit der Säulenfüllung wichtig für Trennergebnis Einschlämmen des Füllmaterials; Fließmittel wandert infolge der Schwerkraft, ev. geringer Überdruck (bis ca. 5 bar, MPLC = "medium pressure liquid chromatography"), falls Strömungsgeschwindigkeit bei Verkleinerung der Teilchengröße zu stark abnimmt. In der Adsorptions-SC gelten die bekannten Elutionsreihen. Übliche Druchflussrate 1-10 ml/min. Auffangen von Eluatfraktionen (automatisierbar). Man erhält ein äußeres Chromatogramm Säulenchromatographie Entwicklungstechniken Elutionstechnik: am meisten verwendet Substanzgemisch in konzentrierter Lsg. aufgetragen, mit FM so lange entwickelt, bis alle Substanzen nacheinander die Säule verlassen haben isokratische Elution: FM-Zusammensetzung konstant Gradienten-Elution: Elutionskraft wird stetig erhöht 30

31 Säulenchromatographie Gradientenelution: Verkürzung der Analysenzeit Verringerung des LM-Verbrauchs Verbesserung des Trennergebnisses durch Zurückdrängen von tailing Verbesserung der Peakform (schmäler, dafür höher), wichtig bei Peaks mit großer Retentionszeit innere Gradienten: Polaritäts-, ph-, Konzentrations-, Ionenstärke-Gradienten äußere Gradienten: Temperatur, Durchflussrate Säulenchromatographie weitere Entwicklungstechniken Frontaltechnik: Verdünnte Lösung des zu trennenden Gemisches im Fließmittel wird kontinuierlich auf die Säule aufgegeben. Substanz mit geringster Retention erscheint als erste im Eluat rein, weitere Fraktionen sind dann Mischfraktionen. Anwendungsbeispiele: Entfernung von Peroxiden aus LM (Ether) Entfernung von Stabilisator-EtOH aus Chloroform Entwässern von LM Verdrängungstechnik: mobile Phase enthält Displacer, um stark retinierte Substanzen von der stat. Phase zu verdrängen; Anwendung v.a. in der Ionenaustauschchromatographie 31

32 Säulenchromatographie Detektion diskontinuierlich Zeit- oder Volumengesteuerte Fraktionskollektoren; Untersuchung der einzelnen Fraktionen mittels Farbreaktionen, DC, GC,... kontinuierlich a) UV/Vis-Durchflussphotometer 10-9 g/ml (mit konstanter oder mit variabler Wellenlänge) b) Fluorimeter g/ml c) Polarograph g/ml d) Differentialrefraktometer 10-7 g/ml mehr zu Detektoren: s. HPLC Säulenchromatographie Anwendungen präparative Trennungen, auch im industriellen Maßstab zur chrom. Racemattrennung (chirale Sorbentien) zur Gel-Chromatographie bzw. Gel-Filtration zur Ionenaustausch-Chromatographie zur Lösungsmittelreinigung 32

33 chromatographische Trennmethoden Hochleistungs-Flüssigchromatographie High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Weiterentwicklung der klassischen SC; mit abnehmender Teilchengröße steigt erforderlicher Druck exponentiell an; Schwerkraft reicht nicht mehr aus, FM muss mittels geeigneter Einrichtungen unter Druck gesetzt werden (Pumpen): bar. Feinkörnigeres Material der stationären Phase (ca. 5 µm) wesentliche Steigerung der Trennstufenzahl pro Säule gegenüber klass. SC erzielbar ca Trennstufen/m typische Säulenlänge 12.5 cm ca Trennstufen / Säule Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Geräteaufbau System für Gradientenelution (schematisch) 33

34 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Geräteaufbau System für Gradientenelution Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Geräteaufbau Pumpen: möglichst gleichmäßige Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase; häufigster Pumpen-Typ: Kurzhub-Kolbenpumpe Kolben (meist aus künstl. Saphir) über Nockenwelle angetrieben; hohe Anforderungen an Dichtungen (bes. bei Verwendung aggressiver Medien: Puffer, Salzlösungen); Einlass- u. Auslassventil (Kugeln); Förderleistung meist 0-10 ml/min Pulsationen: müssen gedämpft werden (wichtig bei best. Detektoren) Pulsationsdämpfer oder Doppelkolbenpumpen (Gegentakt) Gradientenerzeugung: a) Niederdruck-Gradient: nur 1 HPLC-Pumpe notwendig b) Hochdruck-Gradient: 2 Pumpen notwendig; besser reproduzierbar 34

35 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Geräteaufbau Probenaufgabe: druckloses Einbringen der Probe in eine "Probenschleife" (Volumen 1 µl µl, exakt reproduzierbar!), mittels Mehrweghahn- Vorrichtung (Probenventil) in Trennsäule gespült Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Geräteaufbau Probenaufgabe mittels automat. Probenwechsler (Autosampler): Magazin mit einer größeren Anzahl an vorbereiteten Probenfläschchen beladen; Roboterarm mit Nadel, sticht durch Gummiseptum in das gewünschte Fläschchen, saugt Probelösung auf und injiziert automatisch über ein Probenventil; Gerät muss entsprechend programmiert werden; ermöglicht unbeaufsichtigte Serienanalysen (z.b. bei Qualitätskontrolle in pharm. Industrie, in diagnostischen Labors, bei Behörden etc.) 35

36 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Säulen Material: meist Edelstahl, innen poliert, ev. glasbeschichtet; Endverschraubung mit Stahlfritte; Stahlkapillare mit Klemmring-Anschluss (z.b. "Swagelok"). Andere Variante: auswechselbare Kartuschen-Säulen aus gehärtetem Spezialglas (kostengünstiger als Edelstahlsäulen) + Kartuschenhalterung aus Stahl (einmalige Anschaffung). Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Säulen Innendurchmesser: meist ca. 4 mm; präp. HPLC: auch 20 mm und mehr Länge: 5-50 cm; meist 12.5 oder 25 cm (Vorsäulen 2-5 cm) Säulenfüllen: Slurry-Verfahren entgaste Aufschlämmung des Füll- Materials in geeignetem LM unter hohem Druck eingepresst 36

37 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Säulen Montage: in entsprechender Halterung; vorteilhaft: thermostatisierbarer Säulenofen (Trennungen besser reproduzierbar, bes. bei Verteilungschromatographie) Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Detektoren prakt. nur kontinuierliche Detektion selektive - unselektive Detektoren; unterschiedliche Empfindlichkeiten UV/Vis-Durchflussphotometer a) mit konstanter Wellenlänge b) mit variabler Wellenlänge c) Diodenarray-Detektor Fluorimeter Differentialrefraktometer Polarograph Leitfähigkeitsdetektor Massenspektrometer 37

38 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) UV/Vis-Detektor selektiv, nur UV/Vis-absorbierende Substanzen erfassbar; trotzdem relativ universell einsetzbar (Detektoren mit variabler Wellenlänge); Nachweisgrenze ca g/ml meist 2-Strahl-Prinzip: Lichtquelle, 2 Strahlen durch Blenden/Linsen-Kombination, Küvetten aus Quarzglas, Photodiode, elektr. Verstärkung; statt (austauschbarem) Filter: Monochromator (stufenlose Selektion der Wellenlänge möglich); Bereich: nm (mit Deuteriumlampe), nm (mit Wolframlampe) Fließmittel darf bei gewählter Wellenlänge nicht absorbieren; Gradientenelution möglich Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Diodenarray-Detektor Weiterwentwicklung des UV/Vis-Detektors: viele Wellenlängen gleichzeitig erfasst; zusätzliche Information über substanzspezifische Eigenschaft (UV-Spektrum); graphische Darstellung in 3-dimensionaler Matrix; Array = Reihe (hier: Reihe von Photodioden; jede Diode misst Licht einer bestimmte Wellenlänge nach Auffächerung des polychromatischen Lichtstrahls mittels Beugungsgitter) 38

39 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Diodenarray-Detektor auch Aussage über Peakreinheit (= Einheitlichkeit) möglich Vergleich des UV-Spektrums an ansteigender Peakflanke mit UV-Spektrum an abfallender Peakflanke müssen bei einem einheitlichen Substanzpeak übereinstimmen (X-Achse: Chromatogramm, Y-Achse: UV-Spektrum) Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Fluoreszenz-Detektor (Fluorimeter) noch selektiver als UV/Vis Prinzip: best. Substanzen durch UV-Licht zur Fluoreszenz angeregt (Eigenstrahlung bei höherer Wellenlänge); Messung der Intensität des emittierten Lichtes erfolgt rechtwinkelig zur Richtung der UV-Anregungsstrahlung Nachweisgrenze ca g/ml; ev. Derivatisierung mit fluoreszenzfähigen Reagentien auch Verbindungen erfassbar, die von Haus aus nicht fluoreszieren 39

40 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Brechungsindex-Detektor (Differential-Refraktometer) unselektiv, dafür universell verwendbar; rel. unempfindlich; Lichtquelle, Blende/Linse, Referenz- und Messzelle mit schräggestellter Trennwand (Winkel beeinflusst Empfindlichkeit), Spiegel, opt. Nullpunkt, Photodiode; Referenzzelle: mit reinem Eluenten gefüllt; genaue Thermostatisierung erforderlich (Brechungsindex ist temperaturabhängig!), kein Gradientenbetrieb möglich; Anwendung: z.b. für Zucker; Nachweisgrenze ca g/ml Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Elektrochemischer Detektor (Polarograph) Oxidierbarkeit oder Reduzierbarkeit von Substanzen genutzt; mobile Phase muss gewisse Leitfähigkeit besitzen (ev. Zusatz geeigneter Elektrolyte) Messung des Stromflusses; sehr empfindlich (leider auch auf Pulsationen); selektiv Nachweisgrenze ca g/ml Leitfähigkeits-Detektor bei leitender mobiler Phase zur Detektion von Ionen: 2 Elektroden, Spannung, Messung des Widerstandes 40

41 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) MS-Detektor (Massenspektrometer) Vorteil: hoher Informationsgehalt Hochleistungstrennverfahren + Verfahren zur Strukturaufklärung Großer apparativer Aufwand zur Kopplung der beiden Geräteteile (HPLC + MS) Fließmittel muss entfernt werden (versch. Spray-Verfahren, z.b. Electrospray ); Einschränkungen z.b. bei Wahl von Pufferlösungen Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Detektor-Output: analoges elektr. Signal (Ausnahme: Diodenarray, MS) Spannung proportional Signalintensität Schreiber, manuelle Integration, elektron. Integrator, Datenstation (PC), A/D-Wandlung notwendig qualitative Information: Anzahl d. Peaks, Retentionszeiten (Identifizierung von Substanzen) quantitative Information: Fläche (ev. Höhe) eines Peaks Rückschluss auf Substanzmenge 41

42 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Trennmechanismen Adsorption: polare stationäre Phase; Kieselgel (Si-OH-Gruppen): schwach sauer Aluminiumoxid: meist basisch - neutral apolare mobile Phase: z.b. Kohlenwasserstoffe, Ether: definierter Wassergehalt! (z.b. 50% Sättigung) langsame Gleichgewichtseinstellung; Problem: Reproduzierbarkeit Verteilung: meist als Reversed-Phase-Chromatographie: RP-Säulen a) Flüssig-flüssig-Verteilung: apolare flüssige stationäre Phase (auf inertem porösem Trägermaterial); polare (wässrige) mobile Phase; Gefahr des Ausblutens der stat. Phase b) chemisch gebundene Phasen (heute üblich): Alkylketten kovalent mit Kieselgel verknüpft, z.b. RP-18 Si OH + Cl 3 Si-(CH 2 ) 17 -CH 3 - HCl Si O-SiCl 2 -(CH 2 ) 17 -CH 3 O H 2 Si O-Si(OH) 2 -(CH 2 ) 17 -CH 3 (CH 3 ) 3 SiCl O-Si(CH 3 ) 3 Si O Si (CH 2 ) 17 -CH 3 O-Si(CH 3 ) 3 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Trennmechanismen Gelchromatographie: Trennung nach Molekülgröße soft-gels: wenig druckbeständig (z.b. Polyacrylamid), nur für SC semi-rigid-gels: bis ca. 60 bar (vernetztes Polystyrol) rigid-gels: druckstabil (z.b. poröses Glas) Ionenaustausch-Chromatographie: Kationen-, Anionenaustausch; mobile Phase: Pufferlösung Ionenpaarchromatographie: Ionenpaar: Alternative zu Ionenaustausch und Ionensuppression Systeme für Kationen und Anionen verfügbar; Zusatz eines geeigneten Gegenions, z.b. Alkylsulfonate für Kationen, Tetraalkylammoniumverbindungen für Anionen; gemeinsame Solvathülle; chromatograph. Verhalten wie Neutralstoff; Trennung auf RP-Säulen möglich Bioaffinitätschromatographie: für biologische Problemstellungen; stationäre Phase: makromolekulare Verbindung mit biologisch aktiven Gruppen; Wechselwirkungsprinzip: z.b. Antigen - Antikörper; Enzym - Ligand (Inhibitor) 42

43 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Variationsmöglicgkeiten stationäre Phase: Trennmechanismus (und damit Selektivität) mobile Phase: bei Adsorption und Verteilung: Polarität; bei Puffern (Ionenaustausch): ph, Ionenstärke Gradientenelution: binär, ternär; auch Flussgradient (innere/äußere Gradienten) Temperatur: Säulenofen, Wasserbad Derivatisierung vor der Injektion: pre-column Vorteil: Reaktionsbedingungen frei wählbar; chrom. Eigenschaften der Probe u.u. verbesserbar Nachteil: Gefahr von Artefakten, ev. keine quant. Umsetzung nach der Elution (kurz vor Detektor): post-column Vorteil: Nebenprodukte irrelevant; zusätzlich 2. Detektor möglich Nachteil: technisch aufwendig, Reaktion muss in mobiler Phase ablaufen können, Reagens selbst darf kein Signal liefern Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Anwendungen Analytik: universelle Methode, sehr flexibel, gut standardisierbar, auch für sehr geringe Probenkonzentrationen geeignet; quantitative Bestimmungen gut reproduzierbar; durch Kombination mit speziellen Detektoren (Diodenarray, Massenspektrometer) großer Gewinn an Information präparative Trennungen: HPLC sehr leistungsfähig, trotzdem weniger verbreitet infolge hoher Investitions- und Betriebskosten (Säulen, Lösungsmittel) 43

44 chromatographische Trennmethoden Gaschromatographie (GC) besondere Form der Säulenchromatographie, bei der als mobile Phase ein Gas fungiert; einsetzbar zur Trennung und qual. und quant. Bestimmung von Substanzen, die unzersetzt in die Dampfform übergeführt werden können, bzw. aus denen sich unzersetzt verdampfbare Derivate herstellen lassen. Verflüchtigungstemperatur C. Fest-Gas-Chromatographie (GSC): Adsorptions-Chrom. Flüssig-Gas-Chromatographie (GLC): Verteilungschrom. Besonderheiten infolge niedriger Viskosität der mobilen Phase: kurze Analysenzeiten hohe Trennschärfe sehr geringe Substanzmengen trennbar Substanzen im Gaszustand hohe Diffusionsgeschwindigkeiten, daher rasche Einstellung der Gleichgewichte zwischen mobiler und stationärer Phase Gaschromatographie (GC) Prinzip des Geräteaufbaus Regelventil Probeneinlaß Spritze Detektor Schreiber Säule Trägergas Säulenofen (thermostatisiert) Zeit (min) Chromatogramm Probe wird mittels Injektionsspritze in den geheizten Probeneinlass eingebracht, dort verdampft sie augenblicklich und wird vom Trägergas durch die Trennsäule transportiert. Die mit dem Trägergas in den Detektor gelangenden getrennten Substanzen werden vom Schreiber/Integrator/PC als Peak erfasst. 44

45 Gaschromatographie (GC) Geräte Die meist sehr lange, aber dünne Trennsäule ist nicht langgestreckt montiert, sondern aus Platzgründen aufgewickelt (s. rechtes Bild). Gaschromatographie (GC) Trägergase: He, Ar, H 2, N 2 (wichtig!), CO 2 (zunehmende Polarität) H 2 : niedrigste Viskosität, daher auch bei längeren Säulen optimale Strömungsgeschwindigkeit gewährleistet, jedoch Explosionsgefahr; Durchflussgeschwindigkeit: ml/min Trennsäulen: gepackte Säulen: Edelstahl bzw. Glassäulen, Belastbarkeit bis 10 µl Lösung; stationäre Phase ist auf Oberfläche eines inerten gekörnten Trägermaterials aufgezogen; meist 2-3 mm Durchmesser, Länge: einige m Kapillarsäulen: stationäre Phase befindet sich als dünner Film an der Innenwand einer Quarzglaskapillare; meist mm Durchmesser, Länge: m Belastbarkeit 10-1 bis 10-3 µl Lösung (spezielle Injektoren: Split) wesentlich höhere Z erzielbar, wesentlich bessere Trennergebnisse Dünnfilmkapillare: 2-3 µm dünner Film der stat. Phase Dünnschichtkapillare: an Innenwand dünne Schicht von mit stat. Phase belegtem Trägermaterial 45

46 Gaschromatographie (GC) Stationäre Phasen: für Adsorptions-GC Adsorbentien: Aktivkohle Kieselgel Aluminiumoxid Molekularsiebe Poropak (poröses Polystyrol) Ionenaustauscher für Verteilungs-GC Trägermaterialien: Kieselgel Kieselgur Teflon Glaskugeln Trennflüssigkeiten: Squalan Apiezonfette steigende Siliconöle Polarität Polyethylenoxide Polyether Polyester cyanethylierte Alkohole, Glykole Gaschromatographie (GC) Probenaufgabe: Mit Mikroliterspritze durch ein Silikongummiseptum; muss so erfolgen, dass die Probe augenblicklich verdampft. Gase: ml; Flüssigkeiten: gepackte Säulen: µl, Kapillarsäulen um Faktor 1000 weniger; Feststoffe: nur wenn ausreichende Flüchtigkeit gegeben ist, in LM gelöst, in Injektor wie Flüssigkeit eingebracht; Für nicht unzersetzt verflüchtigbare Verbindungen Derivatisierung zu flüchtigen Derivaten a) Acetylierung: OH, NH 2, NHR, z.b. mit Acetanhydrid, Trifluoracetanhydrid (mit hochempfindlichem ECD Fluor gut erfassbar) b) Silylierung: H in OH, NH, COOH, SH durch Trimethylsilylgruppe ersetzt (z.b. mit N,O-bis-Trimethylsilylacetamid) Trennung: isotherm (bei konstanter Temp.) oder mit programmiertem Temperaturanstieg Temperaturgradient; Obergrenze, wenn stationäre Phase zu verdampfen beginnt ( Säulenbluten = "bleeding") 46

47 Detektoren für die Gaschromatographie Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD): Vergleich der Wärmeleitfähigkeit des Trägergases allein und des Trägergases, das Komponenten der Probe enthält Differential-Detektor. Beruht auf der Änderung des Widerstandes eines Heizdrahtes je nach Ausmaß, in dem ein ihn umgebendes Gas Wärme an die Detektorwand abtransportiert. Signal ist konzentrationsabhängig. Erfasst werden alle (auch C-freie) Verbindungen, welche die WLF des Trägergases verändern universell Detektoren für die Gaschromatographie Flammenionisationsdetektor (FID): Eluat wird in eine Wasserstoff-Flamme geleitet und dort verbrannt. Gemessen wird die Zunahme der Ionen in der Flamme dadurch, dass der zwischen 2 Elektroden fließende Strom registriert wird. Angezeigt werden nur kohlenstoffhältige verbrennbare Verbindungen (also nicht Wasser, Edelgase, Stickstoff, CO, CO 2, O 2, CCl 4, NH 3 ) Das Signal ist massenstromabhängig; auch Halogen-, N-, P-selektive FIDs verfügbar. 47

48 Detektoren für die Gaschromatographie Elektroneneinfangdetektor, Electron Capture Detector (ECD): Im Detektor befindet sich ein Beta-Strahler ( 63 Ni, 3 H). Gasraum ist durch freie Elektronen leitend. Substanzen, die Elektronen einfangen können (vor allem halogenhältige) führen zur Abnahme des gemessenen Elektronenstroms zeigt Substanzen mit hoher Elektronenaffinität an Massenspektrometer (MS): hochspezifisch (Kopplung on-line, heute nur mehr mit Kapillar-GC); Trägergas muss vollständig entfernt werden leichter bei Kapillar-GC realisierbar; Aufzeichnung des Totalionenstroms (total ion current, TIC); zu jedem GC-Peak wird das entsprechende Massenspektrum erhalten (Vergleich mit Spektrenbibliotheken möglich) Bei fixer Einstellung des MS auf ein bestimmtes m/z Verhältnis massenspezifische Detektion, "single ion monitoring" (SIM) Gaschromatographie (GC) Anwendungen: qualitative und quantitative Analyse von Gemischen flüchtiger Verbindungen; auch wenn sehr komplexe Gemische vorliegen (z.b. äther. Öle) wenig verbreitet: präparative GC Kopplung: Trennverfahren mit Nachweisverfahren on-line: direkte Verbindung z.b. GC-MS, auch GC-IR (hier FT-IR) off-line (Transfer erforderlich), z.b. GC-NMR Normierung des Retentionsverhaltens von Verbindungen möglich (Kovats-Index, McReynolds-Konstante) 48

49 weitere chromatographische Trennmethoden Supercritical Fluid Chromatography (SFC): Zwischenstellung zwischen HPLC und GC mobile Phase: überkritisches Fluid Kompression eines Gases Verflüssigung, aber nur wenn Temperatur unterhalb der sog. kritischen Temperatur liegt. Andernfalls Gas immer dichter und dichter (Fluid), aber keine Kondensation zu flüssiger Phase. geringe Viskosität (ähnl. GC) hohe Beladbarkeit (ähnl. HPLC) mobile Phase: meist überkritisches CO 2, ev. mit polarem Modifier, z.b. MeOH (bis zu 30%); ev. + Additiva (geringe Mengen Säure oder Base) stat. Phase: z.b. stat. Phasen aus HPLC verwendbar weitere chromatographische Trennmethoden Supercritical Fluid Chromatography (SFC): Kapillar-SFC: Erwartungen nicht ganz erfüllt zurück zur SFC in gepackten Säulen Druck mittels Restriktor bis nach dem Detektor aufrechterhalten (z.b. 30 C, 200 bar) Detektoren: modifizierte HPLC-Detektoren, ev. auch FID 49

50 weitere chromatographische Trennmethoden Gegenstrom-Verteilungschromatographie (Counter-Current Chromatography, CCC): kommt ohne festes Trägermaterial für die flüssige stationäre Phase aus. Frühe Versionen: Craig-Apparatur, DCCC (Droplet Counter-Current Chromatography), RLCCC (Rotation Locular Counter-Current Chromatography); neuere Entwicklung: HSCCC (High-Speed Counter-Current Chromatography) stationäre Phase in spiralförmig aufgewickelten Kunststoffschläuchen, die in einem Exzenter-System um zwei Achsen gleichzeitig rotieren; mobile Phase langsam durchgepumpt; gute Trennleistung, auch für präparative Trennungen geeignet (z.b. Phytochemie) weitere chromatographische Trennmethoden Gegenstrom-Verteilungschromatographie (Counter-Current Chromatography, CCC): DCCC-Anlage HSCCC-Anlage 50

51 chromatographische Trennmethoden Auswertung von Chromatogrammen Beurteilung der Trennleistung eines chrom. Systems Qualitative Auswertung eines Chromatogramms Quantitative Auswertung eines Chromatogramms äußere Chromatogramme (Elutionskurven) innere Chromatogramme Validierung von Analysenmethoden Beurteilung der Trennleistung eines chrom. Systems die Auflösung (A) angestrebt wird optimale Trennung (nicht unbedingt maximale Trennung), nähere Definition über den Begriff der Auflösung: Auflösung A = Maßzahl dafür, wie weit die Peaks zweier Substanzen (a, b) voneinander getrennt sind; A ist eine rechnerische Größe, aus einem äußeren Chromatogramm ermittelbar: A = 2 t R(b) -t R(a) B b + B a t R = Gesamtretentionszeit, B = Basisbreite des jeweiligen Peaks 51

52 Beurteilung der Trennleistung eines chrom. Systems die Auflösung (A) Peaks können mit Hilfe der Wendetangenten zu Dreiecken vereinfacht dargestellt werden: A = 0 : keine Trennung A < 1 : unvollständige Trennung A = 1 : Dreiecksformen getrennt, aber infolge der Glockenform der Peaks noch teilweise Überlappung A = 1.5 und darüber: gute Trennung (Basislinien-Trennung) Beurteilung der Trennleistung eines chrom. Systems die Auflösung (A) Bei unvollständiger Trennung: Basisbreiten d. Peaks schwierig zu ermitteln Auflösung kann auch mit Hilfe der Halbwertsbreiten d. Peaks berechnet werden. A = 1.18 t R(b) -t R(a) B 0.5(b) + B 0.5(a) 52

53 Beurteilung der Trennleistung eines chrom. Systems Qualität einer Trennung Eine Verbesserung der Trennung zweier Substanzen (= Vergrößerung der Auflösung) kann erzielt werden durch: Erhöhung der Selektivität (z.b.: andere mobile Phase) mehr Trennstufen (z.b.: kleinere Korngröße d. stat. Phase) Beurteilung der Trennleistung eines chrom. Systems Zusammenhang zwischen der Auflösung (A) und der Zahl der Trennstufen (Z): 1 A =. Z. r r k b k b + 1 r : relative Retention k : Kapazitätsfaktor 53

54 Qualitative Auswertung eines Chromatogramms Anzahl der Substanzen in einem Gemisch: Anzehl der Flecken auf innerem Chrom. (DC, HPTLC) Anzahl der Peaks in äußerem Chrom. (HPLC, GC,...) Wanderungsverhalten der einzelnen Substanzen: R F -Wert bzw. R X -Wert bei innerem Chrom. k -Wert bei äußerem Chrom. Kombination mit weiterer Information aus Detektionsmethode: spezifische Nachweisreaktionen auf DC-Platte spektroskopische Information, z.b. aus Diodenarray- Detektor (HPLC), Massenspektrometer (GC, HPLC) Quantitative Auswertung eines Chromatogramms äußere Chromatogramme (Elutionskurven) Fläche unter dem Peak ist proportional der Substanzmenge, die eluiert wurde; Dagegen ist die Peakhöhe ebenso wie die Peakbreite auch abhängig von der Retentionszeit ( Peakhöhe ist nur in bestimmten Fällen zur Quantifizierung geeignet; besser: Fläche). Ermittlung der Peakfläche: elektronische Integration (Integrator, PC) Ausschneiden der Peaks (aus Kopie des Chromatogramms) und Wägen Gewicht ist proportional der Fläche Berechnung mit Hilfe der Peakabmessungen: F = h. B

55 Quantitative Auswertung eines Chromatogramms Standardisierungsmethoden: Interner Standard: eine weitere Substanz in bekannter Konz. wird dem Analysengemisch zugesetzt; Flächenverhältnis für Analysensubstanz-Peak zu Standardsubstanz-Peak separat ermitteln (in mehreren Konzentrationen) Eichgerade Externer Standard: Authentische Analysensubstanz wird in getrennten Analysenläufen in jeweils bekannter Konz. vermessen Eichgerade; hier: kein zusätzlicher Peak im Chromatogramm, aber höhere Anforderungen an Reproduzierbarkeit der Bestimmung (Probenvorbereitung, Detektor-Empfindlichkeit, Genauigkeit des injizierten Probenvolumens, usw.) Quantitative Auswertung eines Chromatogramms innere Chromatogramme Fleckengröße (visuell): wichtig für quantitative bzw. semiquant. Auswertung, jedoch kein linearer Zusammenhang mit Substanzmenge: F = prop. log M F : Fleckengröße M : Substanzmenge beobachtete Fleckengröße hängt von verschiedenen Faktoren ab 55

56 Quantitative Auswertung eines inneren Chromatogramms Abhängigkeit der beobachteten Fleckengröße: Nachweisgrenze der verwendeten Detektionsmethode Quantitative Auswertung eines inneren Chromatogramms Abhängigkeit der beobachteten Fleckengröße: aufgetragene Substanzmenge 56

57 Quantitative Auswertung eines inneren Chromatogramms Abhängigkeit der beobachteten Fleckengröße: Länge der Laufstrecke Quantitative Auswertung eines inneren Chromatogramms semiquantitative Abschätzung durch visuellen Vergleich der Fleckengrößen von Analyt und Vergleichslösungen (Verdünnungsreihe) mit bekannter Konz. (auf DC-Platte abwechselnd aufgetragen) Off-line-Quantifizierung Flecken bzw. Bänder abschaben, mit LM eluieren Photometer (UV), Polarographie, Titration, etc. In-situ-Quantifizierung ohne Zerstörung der Trennschicht; Messung von Farbe, Fluoreszenz, Fluoreszenzminderung, UV-Absorption eines Flecks; Chromatogramm wird am Fenster eines Messgerätes (DC-Scanner = Densitometer) vorbeigeführt und das gemessene Phänomen bezüglich seiner Intensität in Bezug gesetzt zum Ort. Ergebnis wird von Schreiber aufgezeichnet. Man erhält Peaks: im Fleckenmittelpunkt ist Substanzkonzentration am größten, nach außen zu abnehmend. 57

58 Quantitative Auswertung eines inneren Chromatogramms Messprinzipien bei der in-situ-quantifizierung (häufig angewandt: Messung der Lichtabsorption im UV/Vis-Bereich) Messung in Transmission Messung im Durchlicht; infolge von Streueffekten gilt hier das Lambert- Beer'sche Gesetz nicht. Es muss mit Eichfunktionen gearbeitet werden; nicht unter 330 nm möglich (mangelnde UV-Durchlässigkeit der Glasplatte). Messung in Remission Licht wird in einem best. Winkel auf Schicht gestrahlt, wird dort diffus reflektiert. Man misst Intensität des reflektierten Lichtes und vergleicht Intensität an leerer Stelle der Schicht und an Stelle mit Substanzfleck; empfindlicher; bis hinunter zu 220 nm möglich Quantitative Auswertung eines Chromatogramms Validierung von chrom. Analysenverfahren Überprüfung und Bewertung der Aussagekraft des jeweiligen Verfahrens anhand einer Reihe von Parametern, die experimentell bestimmt werden. Parameter: Genauigkeit Richtigkeit Präzision Wiederholpräzision Vergleichspräzision Linearität Wiederfindungsrate Selektivität Robustheit Nachweisgrenze Bestimmungsgrenze Aussage über: systematische und zufällige Fehler systematische Fehler zufällige Fehler laborinterne Reproduzierbarkeit Reprod. von Labor zu Labor Zusammenhang Signal/Konzentration Ausbeute der Probenvorbereitung Störungen durch Begleitstoffe Störanfälligkeit durch veränderte Parameter kleinste nachweisbare Menge kleinste quantifizierbare Menge Dokumentation, GLP, ISO

59 Trenn- und Analysenmethoden organischer Arzneistoffe Literatur zum Thema Trennmethoden J. Böcker Chromatographie Vogel Buchverlag, Würzburg, 1997 A. Dominik, D. Steinhilber Instrumentelle Analytik Deutscher Apotheker Verlag, Stuttgart, 2002 G. Rücker, M. Neugebauer, G. G. Willems Instrumentelle Pharmazeutische Analytik Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart,