Vergleichende Untersuchung der Zellqualität mononukleärer Zellen aus. Leukozytenreduktionskammern und Leukapheresaten

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1 Aus der Abteilung für Transfusionsmedizin und Hämostaseologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. R. Eckstein Vergleichende Untersuchung der Zellqualität mononukleärer Zellen aus Leukozytenreduktionskammern und Leukapheresaten Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde an der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Thomas Michael Weidinger aus Erlangen

2 Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Referent: Koreferent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler Priv.-Doz. Dr. med. E. Strasser Prof. Dr. med. R. Eckstein Tag der mündlichen Prüfung:

3 Meiner Mutter und meiner Schwester in tiefer Dankbarkeit gewidmet.

4 Inhaltsverzeichnis 4 I. Inhaltsverzeichnis I. Inhaltsverzeichnis....4 II. Zusammenfassung und Abstract....6 III. Einleitung Zelluläre Immuntherapien bei Tumorerkrankungen Dendritische Zellen und Gewinnung dendritischer Zellen Zellschädigung und Zelltod Zelltod durch Nekrose Zelltod durch Apoptose Membranintegrität und Phosphatidylserin-Switch Fragestellung 16 IV. Material und Methoden Blutspender und Blutgewinnung Blutspender Leukapheresate Thrombozytapherese und Leukozytenreduktionskammern Lagerung, Bestimmung der Zellkonzentrationen und Blutgasanalyse Durchflusszytometrische Messungen Das Prinzip der Durchflusszytometrie Färbungen Oberflächenantigenfärbungen Nachweis und Messung von Nekrose und Apoptose Nekrose und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) Apoptose, Phosphatidylserin-Switch und Annexin V Instrument Settings Auswertung der Messungen Festlegung der Gates der durchflusszytometrischen Messungen Antikörperfärbungen gegen Oberflächenantigene Färbungen mit Annexin V und 7-AAD Statistische Auswertung Verwendetet Formeln 28

5 Inhaltsverzeichnis 5 5. Versuchsreihen zur Beantwortung der Fragestellung Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweier Zellseparatoren Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduktionskammern Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Leukapheresaten 30 V. Ergebnisse Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweier Zellseparatoren Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduktionskammern Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Leukapheresaten 38 VI. Diskussion Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweier Zellseparatoren Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduktionskammern Blut aus Leukozytenreduktionskammern und aus Leukapheresaten 46 VII. Literaturverzeichnis 50 VIII. Abkürzungen.57 IX. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen.58 X. Anhang 59 Danksagung

6 Zusammenfassung 6 II. Zusammenfassung und Abstract Hintergrund und Ziele Zur Herstellung dendritischer Zellen für zelluläre Immuntherapien werden mononukleäre Zellen des peripheren Bluts benötigt. Der Goldstandard zur Gewinnung mononukleärer Zellen ist die Leukozytapherese. Die Kultivierungseffizienz von dendritischen Zellen aus Monozyten beträgt aktuell ca. 30%. Eine Vorschädigung der Monozyten im Sinne der Apoptose bzw. Nekrose kann einen Einfluss auf die Kultivierungsrate haben. Kürzlich wurde eine neue Quelle zur Gewinnung von mononukleären Zellen mit ausgezeichneter Qualität beschrieben: die Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel Thrombozytapheresemaschine. Ziel dieser Arbeit ist der Vergleich zwischen Leukozytenreduktionskammern und Leukapheresaten hinsichtlich des Leukozytengehalts und der Apoptose- und Nekroserate mononukleärer Zellen. Methoden Nach der Thrombozytapherese und nach der Leukozytapherese wurden Blutproben aus den Leukozytenreduktionskammern und Leukozytapheresaten entnommen und sofort für Messungen verwendet. Blut aus den jeweiligen Apheresen wurde in PVC-Beutel überführt und gelagert. Weitere Messungen erfolgten nach einer Lagerung von 6, 24, 48 und 72 Stunden. Bestimmt wurden Zellkonzentration, Blutgase und durchflusszytometrisch der Anteil an CD14-, CD45-, Annexin V- und 7-AAD-positiven Zellen. Ergebnisse und Beobachtungen Der Gehalt mononukleärer Zellen der Leukozytenreduktionskammern des Trima Accel Zellseparators war um ein Vielfaches höher als in denen der COBE Spectra. In den Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel korrelierte der Leukozytengehalt sehr gut mit der Dauer und dem prozessierten Blutvolumen der Thrombozytapherese; nach doppelter Thrombozytapherese waren signifikant mehr Leukozyten in den Kammern waren als nach einfacher. In den Leukozytenreduktionskammern des Trima Accel Zellseparators war die Leukozytenkonzentration signifikant höher als in Leukozytapheresaten. Auf Grund des höheren Produktvolumens der Leukozytapheresate

7 Zusammenfassung 7 war hier der Leukozytengehalt aber deutlich höher als in den Leukozytenreduktionskammern. Es wurde gefunden, dass der Anteil Annexin V+/7-AAD+ Zellen nach Kurzzeitlagerung über 72 Stunden in doppelten verglichen mit einfachen Thrombozytenspenden signifikant erhöht war. In den Leukozytapheresaten dagegen kam es während der Lagerung zu einem früheren und stärkerem Anstieg der Apoptose- und Nekroserate mononukleärer Zellen mit einem früheren und stärkeren Abfall des prozentuellen Anteils mononukleärer Zellen verglichen mit den Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel. Des Weiteren fiel der ph-wert in gelagerten Leukozytapheresaten stärker ab als in gelagerten Leukozytenreduktionskammern, wobei in den Leukozytapheresaten der ph-wert sehr gut mit dem Anteil an nekrotischen Zellen korrelierte. Praktische Schlussfolgerungen Die Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel stellen eine sehr gute Quelle für mononukleäre Zellen dar, während dies für die COBE Spectra nicht zutrifft. Die mononukleären Zellen der Trima Accel Leukozytenreduktionskammern zeigten während der Kurzzeitlagerung eine signifikant bessere Qualität verglichen mit Leukozytapheresaten. Leukozytapheresate sind auf Grund des höheren Gehalts mononukleärer Zellen der Goldstandard für die Gewinnung von mononukleären Zellen, die heute für die klinische Versorgung mit Zelltherapeutika zunehmend benötigt werden. Leukozytenreduktionskammern sind aber eine gute Leukozytenquelle für die experimentelle Zellforschung, wobei vermutlich das schonende Absammeln der Zellen in den Leukozytenreduktionskammern mit einem geringeren Zellstress und damit geringeren Zellapoptose verbunden ist.

8 Zusammenfassung 8 Background and Objectives Peripheral blood mononuclear cells are frequently used for dendritic cell culture in adoptive immunotherapies. The gold standard to obtain monocytes for dendritic cell therapies today is leukapheresis. Current culture efficiency is about 30%. Cell damage of monocytes in terms of apoptosis or necrosis might influence the efficiency of dendritic cell culture. A new source for peripheral blood mononuclear cells of good quality, the leukoreduction system chambers of Trima Accel plateletpheresis device, has recently been described. This work compares leukoreduction system chambers and leukapheresis products with regard to leukocytes cell yield and apoptosis and necrosis of mononuclear cells. Materials and Methods Immediately after platelet- and leukapheresis blood samples were transferred from leukoreduction system chambers and leukapheresis products into PVC bags where they were stored for a maximum of 72 hours. Within one hour after apheresis and after six, 24, 48 and 72 hours of storage cell counts were measured, blood gas analysis was performed and the fractions of CD14-, CD45-, Annexin V- and 7-AADpositive events were analysed by flow cytometry. Results In leukoreduction system chambers of Trima Accel mononuclear cell yield was many times higher to those of COBE Spectra. Leukocyte count of Trima Accel leukoredution system chambers correlated very well with donation time and processed blood volume. Thus, after double platelet units, leukoreduction system chambers contained a significantly higher leukocyte count compared to those of single platelet units. Leukocyte concentration of leukoreduction system chambers were higher compared to those obtained from leukapheresis products. However, due to significantly higher product volume leukocyte yields of leukapheresis products many times exceeded those contained in leukoreduction system chambers. After 72 hours of storage, fraction of Annexin V+/7-AAD+ events were significantly higher in double compared to single platelet units. In contrast, fractions of apoptotic and necrotic mononuclear cells obtained from leukapheresis products increased earlier during storage and to higher levels accompanied with an earlier drop of mononuclear cell counts compared to leukoreduction system chambers of Trima Accel. Furthermore, during short time storage ph decreased

9 Zusammenfassung 9 in leukapheresis products to lower levels compared to leukoreduction system chambers showing a very good inverse correlation of ph and fraction of necrotic cells in samples of leukapheresis products. Conclusion Leukoreduction system chambers of the Trima Accel plateletpheresis device are a very good source for peripheral blood mononuclear cells which does not apply for those of the COBE Spectra plateletpheresis device. Mononuclear cells of Trima Accel leukoreduction system chambers showed a better viablilty regarding apoptosis and necrosis compared to stored samples of leukapheresis products. Due to high cell yields leukapheresis is the gold standard to obtain mononuclear cells which today are increasingly needed for cellular therapies. For experimental purpose leukoreduction system chambers are a good source to obtain leukocytes while the gentle way to collect cells in leukoreduction system chambers might be accompanied with lower cell stress and thus lower cell apoptosis.

10 Einleitung 10 III. Einleitung 1. Zelluläre Immuntherapien bei Tumorerkrankungen Ende April 2010 wurde von der US-Gesundheitsbehörde Food and Drug Administration (FDA) das Medikament Provenge TM (Sipuleucel-T) der Firma Dendreon zur Therapie des metastasierten, asymptomatischen, hormon-resistenten Prostatakarzinoms zugelassen [17]. Die Zulassung galt als Meilenstein, da mit Provenge TM erstmals ein Medikament zugelassen wurde, das, wie eine Reihe weiterer in verschiedenen Phasen der Zulassung befindlicher Medikamente, eine zelluläre Immunreaktion gegen Tumorzellen anstößt [3, 4, 14]. Vergleichbar ist dies mit dem Prinzip der Immunreaktion bei Virusinfektionen: Zytotoxische T-Lymphozyten werden durch antigenpräsentierende Zellen aktiviert. Dadurch erkennen die zytotoxischen T-Zellen Antigene von Tumorzellen als fremd, greifen sie an und zerstören sie [38]. Im Gegensatz zur Immunreaktion bei Virusinfektionen ist das Gefahrensignal, das von Tumorzellen ausgeht, aber zu schwach, so dass es in vivo zu keiner ausreichenden Reaktion kommt [67]. Patienteneigene antigenpräsentierende Zellen müssen also ex vivo mit Tumorantigenen unter Verwendung von Zytokinen geimpft werden (Abb. 1, a-c). Die antigenpräsentierenden Zellen reifen aus und beginnen die Tumorantigene an ihrer Oberfläche zu präsentieren (Abb. 1, d & e). Nach Re-Injektion der ausgereiften antigenpräsentierenden Zellen kommt es zu der gewünschten Aktivierung von T-Zellen in vivo (Abb. 1, e) und schließlich zu einer spezifischen Immunreaktion gegen die Tumorzellen (Abb.1, f) [22]. Abb. 1: Prinzip der Immunisierung dendritischer Zellen mit Tumorantigenen und Auslösen einer Immunreaktion gegen die Tumorzelle (modifiziert nach [22]).

11 Einleitung 11 In der onkologischen Therapie werden auch reine Antikörper gegen Tumorantigene als Chemotherapeutika eingesetzt. Die Wirkweise ist mit der einer Immunreaktion vergleichbar. Allerdings geht sie nicht vom Immunsystem aus. Beispiele dafür sind die Medikamente Rituximab zur Therapie von B-Zell-Lymphomen oder Trastuzumab zur Therapie des HER2-positiven Mammakarzinoms. Zwar erspart der Einsatz monoklonaler Antikörper in der Immuntherapie gegen Tumore den Aufwand allogene antigenpräsentierende Zellen zu sammeln und diese in vitro zu immunisieren. Im Gegensatz zu einer reinen Antikörpertherapie bieten T-Zellen, die nach Aktivierung durch antigenpräsentierende Zellen gegen Tumorzellen gerichtet sind, aber einige Vorteile: T-Zellen können besser zu Tumoren in tief liegendem Gewebe vordringen, sie proliferieren bis alle Antigen tragenden Tumorzellen eliminiert sind und sie bilden ein immunologisches Gedächtnis, so dass eine Immunreaktion bei Rezidiven möglich ist [16]. 2. Dendritische Zellen und Gewinnung dendritischer Zellen Die für die Immunisierung von Patienten gegen Tumorantigene verwendeten antigenpräsentierenden Zellen sind Dendritische Zellen (griechisch dendron: Baum), da sie als die potentesten antigenpräsentierenden Zellen des menschlichen Immunsystems gelten [22, 38, 55]: Sie beeinflussen viele verschiedene Klassen der Lymphozyten (B, NK, NKT) und viele Arten der T-Zell-Antwort (Th1/Th2, T-Zell-Regulierung). Außerdem gelten sie als Wächter des Immunsystems, da sie dieses aktivieren und die frühen Immunreaktionen beeinflussen [6, 56]. Man unterscheidet Vorläuferzellen, unreife dendritische Zellen und reife dendritische Zellen. Um eine ausreichende Immunisierung gegen Tumorantigene zu erreichen sind ca. 1x10 7 reifer dendritischer Zellen nötig [50]. Diese Menge ist durch Anreicherung von dendritischen Zellen aus peripherem Blut schwer zu erreichen. In vivo können sich CD14+ Monozyten im Rahmen von Immunreaktionen bei Infekten in dendritische Zellen umwandeln. In vitro ist dies auch möglich, indem man die CD14+ Monozyten mit verschiedenen Zytokinen, bevorzugt mit GM-CSF und IL-4, kultiviert [46, 48, 50]. Der Goldstandard zur Gewinnung von Monozyten für die Zelltherapie mit dendritischen Zellen ist die Leukapherese, da bei einer Leukapherese mehr als 1x10 9 CD14+ Monozyten gewonnen werden können [59, 62]. Dietz und Kollegen haben in einer 2007 veröffentlichten Arbeit berichtet, dass aus Leukozytenreduktionskammern, die als Nebenprodukt bei Thrombozytapheresen mit den Trima Accel Apheresegeräten entstehen, mononukleäre Zellen von sehr guter Qualität gewonnen werden können [15, 35, 41]. Neron et al. beschrieben, dass der Anteil mononukleärer Zellen in Leukozytenreduktionskammern um das Fünffache höher ist als in Leukoreduktionsfiltern [41]. Leukozytenreduktionskammern werden auf Grund des geringen Volumens von maximal 10ml vorrangig zur Forschung verwendet.

12 Einleitung 12 Auch bei dem Thrombozytenspendegerät COBE Spectra werden zur Leukozytenreduktion Leukozytenreduktionskammern verwendet. Über die Qualität des hierbei gesammelten, an mononukleären Zellen reichen Blutes sind bisher noch keine Daten veröffentlicht. 3. Zellschädigung und Zelltod Aktuell beträgt die Ausreifungsrate von dendritischen Zellen aus Monozyten ca. 20% bis 40%. Es ist nahe liegend, dass hierbei eine Schädigung der Monozyten vor Kultivierung Einfluss auf die Ausreifungsrate haben kann. Eine Schädigung der Zellen kann zum Beispiel physiologisch im Sinne einer Zellalterung, aber auch unter pathologischen Umständen wie Hypoxie, immunologischen Reaktionen, Gen-Defekten und chemischen, physikalischen oder infektiösen Noxen stattfinden [38]. Abhängig vom Ausmaß der Schädigung und der Art der Schädigung erholt sich die Zelle ad integrum oder geht zugrunde. Im letzteren Fall gibt es zwei mögliche Wege: die Apoptose oder die Nekrose [51, 65] Zelltod durch Nekrose Der Begriff Nekrose leitet sich von dem griechischen Wort nekrosis (ηεκροσισ), die Tötung, ab. Jede abrupte, ausreichend intensive Zellschädigung kann zur Zellnekrose führen. Typisches Beispiel hierfür ist die Zellnekrose beim akuten Myokardinfarkt, bei der es auf Grund einer Hypoxie zur irreversiblen Schädigung der Myokardzellen kommt. Die wichtigsten morphologischen Merkmale einer Nekrose sind das Anschwellen der Zellen und der Verlust der Integrität sowohl der Plasmamembran als auch der Kernmembran ( Karyorrhexis ). Der Zellkern schrumpft ( Pyknosis ) und wird aufgelöst ( Karyolysis ). Gleichzeitig tritt der Zellinhalt mitsamt verschiedener Proteasen durch die löchrige Plasmamembran aus der Zelle aus und verursacht eine Entzündungsreaktion im umliegenden Gewebe (Abb. 2) [63]. Ursprünglich galt die Nekrose als plötzlich eintretendes Ereignis, mit zufälligem, ungeregeltem Ablauf ohne Beteiligung Abb. 2: Morphologischer Ablauf der Nekrose (modifiziert nach [30]).

13 Einleitung 13 von Signalkaskaden. Neuere Studien zeigen, dass unter bestimmten Voraussetzungen, vor allem in Abhängigkeit der auslösenden Stimuli, vorbestimmte Signalkaskaden während der Nekrose, vergleichbar zur Apoptose, ablaufen [64]. Am morphologischen Ablauf der Nekrose ändert sich dabei aber nichts, so dass diese Erkenntnis keinen Einfluss auf die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse haben wird Zelltod durch Apoptose Die Apoptose beschreibt eine Form des Zelltodes, den man als stiller Selbstmord bezeichnen könnte. Eingeführt wurde der Begriff Apoptose 1972 von Kerr et al., die eine neue Form des Zelltodes beobachtet haben; ohne Anschwellen und Platzen der Zelle und ohne Entzündungsreaktion des umliegenden Gewebes. Stattdessen lösten sich die sterbenden Zellen aus dem Zellverband, zersetzten sich nach und nach in von Plasmamembran umhüllte Vesikel und wurden von umgebenden Zellen phagozytiert (Abb. 3) [30, 31]. Den diesen Vorgang beschreibenden Begriff Apoptose, bzw. im englischen Apoptosis, prägte Professor J. Cormack (Lehrstuhl für klassische Philologie (Griechisch), Universität Aberdeen, Aberdeen, GB). Apoptosis (άπωπτωσισ) wird im griechischen als Beschreibung des Abfallens von Laub oder Blütenblättern beim Welken verwendet. Abb. 3: Morphologischer Ablauf der Apoptose und Phagozytose der apoptotischen Vesikel (modifiziert nach [30]). Die Auslöser für die Apoptose sind vielfältig. Pathologische Ursachen sind DNS-Schädigung, intrazelluläre Ansammlung fehlerhaft gefalteter Proteine oder Zellschädigung bei diversen Infektionen, beispielsweise mit Adenoviren. Es gibt aber auch

14 Einleitung 14 physiologische Ursachen für die Apoptose. Bei der positiven und negativen Selektion während der Reifung der T-Lymphozyten, bei der Rückbildung von Zellen während der Embryogenese, bei der Gewebshomöostase, aber auch beim Abbau von Zellen, deren Funktionen nicht mehr gebraucht werden, spielt die Apoptose eine entscheidende Rolle [34]. Heute weiß man, dass die Apoptose auf molekularer Ebene ein streng regulierter Prozess mit genau aufeinander abgestimmten Signalübertragungswegen und Ereignissen ist [25]. Ausgelöst wird sie entweder durch Liganden an Todesrezeptoren ( extrinsische Kaskade ) oder durch Proteine mitochondriellen Ursprungs ( intrinsische Kaskade ), vorrangig Cytochrom C [18]. Bei beiden Wegen der Aktivierung wird eine Kaskade proteolytischer Enzyme angestoßen, die letztlich für fast alle Veränderungen im Verlauf der Apoptose verantwortlich zu sein scheint. Diese proteolytischen Enzyme heißen Caspasen, hergeleitet vom Cystein im aktiven Zentrum des Enzyms und der Eigenschaft Peptidbindungen immer nach einer Asparaginsäure im Substrat zu spalten (engl.: cysteinyl-aspartate specific protease). In vitalen Zellen liegen die Caspasen in inaktiver Form vor. Ihre Aktivierung erfolgt durch die proteolytische Abspaltung der N-Terminalen Pro-Domäne. Bisher wurden sieben unterschiedliche Caspasen entdeckt, die für die Apoptose menschlicher Zellen bedeutsam sind. Kommt es zu einem apoptogenen Stimulus, unabhängig ob intrinsisch oder extrinsisch, wird nach Ablauf der jeweiligen Caspase-Kaskade schließlich die Caspase 3 als zentrale Caspase der Apoptose aktiviert [42]. Die zentrale Rolle der Caspasen an der Apoptose wird daran deutlich, dass sie für die Aktivierung von DNSen mit Zersetzung der DNS, für die Fragmentierung des Zellkerns, für die Zersetzung des Zytoskeletts mit konsekutiver Bildung membranumhüllter Vesikel und für die Aufhebung der Plasmamembranasymmetrie verantwortlich sind Membranintegrität und Phosphatidylserin-Switch Die Zellmembran einer menschlichen Zelle besteht aus Phospholipiden, die sich entsprechend dem Fluid-Mosaik-Model von Singer und Nicolson in einer Doppelschicht anordnen, so dass die hydrophoben Lipidanteile im Inneren der Membran zu einander stehen und die hydrophilen Phosphatanteile an den Außenseiten der Membran aneinander gereiht sind (Abb. 4, a) [54]. In und an diese Phospholipiddoppelschicht sind weitere Moleküle wie zum Beispiel Proteine, Lipide oder Cholesterine gebunden. Die Aufgaben dieser Moleküle sind verschieden; beispielsweise können Transmembranproteine als Ionenkanäle fungieren.

15 Einleitung 15 Physiologischer Weise ist die Plasmamembran asymmetrisch. Das bedeutet, dass es bei vitalen Zellen Moleküle gibt, die nur auf der Innenseite der Membran zu finden sein können, nicht aber auf der Außenseite und umgekehrt [36]. Diese Membranintegrität ist für den physiologischen Ablauf vieler Prozesse, zum Beispiel die Aufrechterhaltung der Elektrolytverteilung zwischen dem intra- und extrazellulären Raum, einer vitalen Zelle notwendig. Eines dieser Moleküle ist das Phospholipid Phosphatidylserin. In vitalen Zellen kommt Phosphatidylserin ausschließlich in der intrazellulären Schicht der Plasmamembran vor. Die Aufrechterhaltung dieser Verteilung ist energieabhängig [49]. Wird aber eine Zelle apoptotisch, wird das Phosphatidylserin sehr früh im Verlauf der Apoptose von der inneren auf die äußere Seite der Membran verschoben, unabhängig vom Auslöser der Apoptose (Abb. 4, b) [37]. Diesen Vorgang nennt man Phosphatidylserin-Switch. Wahrscheinlich dient die Externalisation von Phosphatidylserin den umliegenden Zellen, die Apoptose zu erkennen und die Phagozytose der im Verlauf der Apoptose entstehenden membranumhüllten Zellreste zu initiiren [9, 11]. Abb. 4: Phosphatidylserin-Switch im Verlauf der Apoptose mit Phosphatidylserin in vitalen Zellen ausschließlich auf der Zytoplasma-Seite (a) und Switch im Verlauf der Apoptose auf die Außenseite der Membran (b) (modifiziert nach [40]).

16 Einleitung Fragestellung Leukozytenreduktionskammern scheinen eine vielversprechende Quelle für mononukleäre Zellen des peripheren Blutes zu sein. Einige Daten zur Qualität der aus den Leukozytenreduktionskammern gewonnenen Zellen liegen bereits vor [15, 35, 41]. Bisher wurden aber nur Kammern untersucht, die mit der Trima Accel hergestellt wurden. Des Weiteren wurden bei allen bisher veröffentlichten Daten keine Angaben zur Apoptose gemacht. Daher ergeben sich folgende Fragestellungen: 1. Nicht nur bei der Thrombozytapherese mit der Trima Accel sondern auch während der Thrombozytapherese mit der COBE Spectra werden Leukozytenreduktionskammern verwendet. Der Zellgehalt und gegebenenfalls die Qualität der Zellen der Leukozytenreduktionskammern beider Thrombozytapheresemaschinen sollen miteinander verglichen werden. 2. In den bisher veröffentlichten Daten wurde Blut von sehr homogenen Spendergruppen verwendet und Ergebnisse mit geringer Streubreiter erzielt. Zu prüfen ist, ob es bei Einfach- gegenüber Doppelapharesen zu Unterschieden in der Leukozytenzahl der Leukozytenreduktionskammern kommt. Sind im Verlauf der Kurzzeitlagerung über 72 Stunden Zeichen einer Schädigung im Sinne der Apoptose bzw. Nekrose bei mononukleären Zellen des peripheren Blutes nachweisbar? Wie verhalten sich die Zellkonzentrationen im Verlauf der Lagerung? 3. Sind Unterschiede in der Qualität bezüglich der Apoptose- und Nekroserate zwischen mononukleären Zellen aus Leukozytenreduktionskammern und mononukleären Zellen der Leukapherese nachweisbar? Haben die unterschiedlichen Prinzipien der Anreicherung mononukleärer Zellen bei der Leukapherese und in Leukozytenreduktionskammern einen Einfluss auf die Qualität der Produkte? Kommt es zu Unterschieden in über 48 Stunden gelagerten Produkten?

17 Material und Methoden 17 IV. Material und Methoden 1. Blutspender und Blutgewinnung 1.1 Blutspender Das in dieser Forschungsarbeit verwendete Blut wurde entsprechend der Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie) der Bundesärztekammer gewonnen. [2, 26, 27] Alle Spender dieser Studien wurden nach Feststellung der Spendetauglichkeit über den Spendevorgang einschließlich der Risiken aufgeklärt und stimmten der Verwendung ihres Blutes zu Forschungszwecken zu. Alle Spender waren entsprechend der Richtlinien gesund. Keiner der Spender erfüllte ein oder mehrere der unter Punkt 2.2 der Richtlinien zur Gewinnung von Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten (Hämotherapie) der Bundesärztekammer genannten Ausschlusskriterien. Für das Wohl der Spender wurde jederzeit Sorge getragen. Das Studienprotokoll war von der Ethikkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg geprüft und gebilligt worden. Verwendet wurde Blut aus Leukapherisaten des COM.TEC Zellseparators und Blut aus Leukozytenreduktionskammern der COBE Spectra und der Trima Accel Thrombozytapherese-Maschinen. 1.2 Leukapheresate In dieser Arbeit wurden ausschließlich Produkte verwendet, die mit dem COM.TEC Zellseparator (Fresenius HemoCare GmbH, Bad Homburg, Deutschland) unter dem Separationsprogramm automnc hergestellt wurden. Bei der Leukapherese wird venöses Blut des Spenders über ein geschlossenes System in die Apheresemaschine geführt. Durch Zentrifugation wird das Vollblut entsprechend der jeweiligen physikalischen Eigenschaften der Blutbestandteile in Plasma, den sogenannten Buffy Coat aus Leukozyten und Thrombozyten und in Erythrozyten aufgespaltet (Abb. 5). Bei der Aufspaltung spielt das Gewicht der einzelnen Zellen die entscheidende Rolle. Entsprechend der Zentripetalkraft und der Trägheit der Masse werden bei Bewegungen auf einer gekrümmten Bahn und bei kreisförmigen Bewegungen Körper mit einer höheren Masse weiter nach außen getragen als Körper mit einer geringeren Masse [47, 52]. Entsprechend des durchschnittlichen Gewichts der einzelnen Zellen werden daher die schwereren Erythrozyten weiter vom Mittelpunkt der Kreisbahn der Zentrifuge getragen als Leukozyten. Am wenigsten werden Thrombozyten und das Blutplasma

18 Material und Methoden 18 durch die Zentrifugation beeinflusst, so dass es zur in Abb. 5 gezeigten Aufspaltung des Blutes kommt. Durch die Aufteilung der zellulären Blutbestandteile während der Zentrifugation in verschiedene Schichten lassen sich bestimmte Blutzellen durch gezieltes Absammeln der jeweiligen Schicht gewinnen. Ziel der Leukapherese ist das Sammeln leukozytenreicher Blutprodukte, abzusaugen ist daher der Buffy Coat. Das automnc -Separationsprogramm verwendet eine einstufige Separationskammer, genannt PL1a. Die Blutzellen werden während den einstellbaren Überschuss- und Buffy Coat - Phasen gesammelt. Die Trennschicht zum Buffy Coat wurde durch acht optische Sensoren kontrolliert, wobei sieben auf die Zellschichten ausgerichtet waren und einer auf die Plasmaschicht. Während der Apherese betrug die Zentrifugendrehzahl 1500 Umdrehungen pro Minute. Die durch die Zentrifugation auf die Zellen wirkende Kraft entsprach der Kraft, die durch das 297-fache der Erdbeschleunigung hervorgerufen werden würde. Plasma Buffy Coat: Thrombozyten Leukozyten Erythrozyten Abb. 5: Schematische Darstellung der durch Zentrifugation aufgespaltenen Blutbestandteile bei der Leukozytapherese (modifiziert nach [53]). 1.3 Thrombozytapherese und Leukozytenreduktionskammern Während der Thrombozytapherese mit den Geräten Trima Accel (Caridian BCT, Lakewood, CO, USA) und COBE Spektra (Caridian BCT) werden im Spenderblut Thrombozyten von Leukozyten und Erythrozyten getrennt, damit die Thrombozyten im Konzentrat so rein wie möglich angereichert werden. Die Trennung geschieht beim

19 Material und Methoden 19 Durchlaufen einer konischen Leukozytenreduktionskammer, wobei die Trennung der Blutbestandteile von der Geometrie und den hydrodynamischen Eigenschaften der Leukozytenreduktionskammern abhängt (Abb. 6). Durch den konischen, stufenförmigen Aufbau der Kammer sammeln sich im Bereich der Kammerwand die schweren Blutbestandteile, also Erythrozyten und Leukozyten, an, während die Thrombozyten und das Blutplasma durch die Kammer hindurch fließen. So enthalten die Leukozytenreduktionskammern erythrozyten- und leukozytenreiches Blut [27]. Bisher wurden diese Leukozytenreduktionskammern nach Abschluss des Spendevorgangs entsorgt. Das in der Kammer der Trima Accel verbleibende Blut ist auf Grund des Leukozytenreichtums aber eine gute Quelle für mononukleäre Zellen des peripheren Blutes, wie kürzlich gezeigt werden konnte [15]. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die gewonnenen Monozyten und Lymphozyten eine hervorragende Qualität Abb. 6: Leukozytenreduktionskammer der Trima Accel Thrombozytapherese Maschine nach Apherese. besitzen und gut zu dendritischen Zellen kultiviert werden können [15, 35, 41]. Daten zur Eignung der Leukozytenreduktionskammer des COBE Spectra Zellseparators als Quelle für mononukleäre Zellen liegen bisher nicht vor. Bei den Thrombozytapheresen, deren Leukozytenreduktionskammern für diese Arbeit genutzt wurden, wurde an der Trima Accel die Software Version 5.1, an der COBE Spectra die Software Version 7.0 der jeweiligen Hersteller verwendet. Die Geräteeinstellungen waren bei beiden Separatoren gleich: anticoagulant ratio 11:1, draw Management 6; return Management 4, maximaler draw flow mittel. Um zu einer Thrombozytenspende zugelassen zu werden, musste die Thrombozytenkonzentration der Spender vor der Spende mindestens 160 x 10 9 Thrombozyten pro Liter betragen. Überstieg die Thrombozytenkonzentration 230 x 10 9 Thrombozyten pro Liter wurde eine doppelte Thrombozytenspende durchgeführt (Doppel-Thrombozytapherese, D- TA), sonst eine einfache (Einfach-Thrombozytapherese, E-TA). Sofort nach Abschluss der Apherese wurden die Thrombozytenkonzentrate und im direkten Anschluss auch

20 Material und Methoden 20 die zu- und abführenden Schläuche der Leukozytenreduktionskammern abgeschweißt. Das Blut der Leukozytenreduktionskammern wurde unter Wahrung aseptischer Bedingungen über einen sampling site coupler (Baxter, REF EMC1401) in Beutel aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem Fassungsvolumen von je 150ml (Compoflex R Single Bags, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) überführt und gelagert. 2. Lagerung, Bestimmung der Zellkonzentrationen und Blutgasanalyse Die Blutprodukte wurden bei 22 C ± 2 C ohne Agitati on und vor Licht geschützt im Thrombozyteninkubator gelagert. Lagermedien wurden nicht verwendet. Zur Lagerung wurden die Leukozytenreduktionskammern über ein Verbindungsstück (sampling site coupler, Baxter, REF EMC1401) in einen 150ml PVC-Beutel (Compoflex R Single Bags, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland) überführt. Um vergleichbare Bedingungen zu schaffen wurden aus den Leukapherisaten Proben mit einem Volumen von 10ml, dem maximalen Volumen der Leukozytenreduktionskammern, unter aseptischen Bedingungen entnommen und ebenfalls in den 150ml PVC-Beuteln gelagert. Die Gasaustauschraten der PVC-Beutel betrugen: O 2 : 0.675l / m 2 Beuteloberfläche / 24 h / bar; CO 2 : 4.75l / m 2 Beuteloberfläche / 24h / bar. Gelagert wurden die Beutel bis zu 72 Stunden. Um bei der Probenentnahme aus dem Beutel aseptische Bedingungen zu wahren wurde der bei der Probenüberführung bereits verwendete sampling site coupler desinfiziert und die Probe über eine Kanüle in eine 2ml Spritze abgezogen. Das jeweils abgezogene Probevolumen betrug 0,7ml. Die Zellkonzentrationen von Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten in den Blutprodukten wurde mit dem ADVIA120-Zellzähler (Bayer HealthCare Diagnostics) bestimmt. Wurde eine Blutgasanalyse zur Bestimmung von ph-wert, pco 2, po 2, HCO Konzentration, so 2 und Base Excess (BE) benötigt, so wurde diese mit dem ABL-5 (Radiometer, Kopenhagen, Dänemark) durchgeführt. 3. Durchflusszytometrische Messungen 3.1. Das Prinzip der Durchflusszytometrie Die Durchflusszytometrie, auch fluoreszenzaktivierte Zellanalyse ( fluorescence activated cell sorting, FACS) genannt, ist ein opto-elektronisches Messsystem, bei dem optische Signale in elektronische Impulse umgewandelt werden und so mit Hilfe eines EDV-Systems verarbeitet werden können. Dabei werden Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften von Einzelzellen in Suspension detektiert. Der Aufbau dieser Geräte setzt sich aus drei Teilen zusammen (Abb. 7):

21 Material und Methoden 21 a. Als Lichtquelle dient ein Laser der Wellenlänge 488nm und ein Dioden-Laser der Wellenlänge 635nm. In Geräten älterer Bauart werden Quecksilber- oder Xenondampflampen verwendet. b. In der Analysekammer werden die einzelnen Zellen durch eine schnelle laminare Strömung perlschnurartig hintereinander aufgereiht und nacheinander durch den Laserstrahl geführt. c. Das Detektionssystem besteht aus einer Reihe optischer Filter und Sensoren. Die emittierten Photonen jeder einzelnen, die Analysekammer passierenden Zelle werden durch die optischen Filter nach Wellenlängen aufgeteilt und an den optischen Sensoren (FSC, SSC und FL1-FL4) in elektronische Signale umgewandelt. Abb. 7: Schematischer Aufbau eines Durchflusszytometers (modifiziert nach [19]). Jede Zellart streut entsprechend ihrer Größe und ihrer Zellstruktur das Licht des 488nm-Lasers auf eine zellspezifische Weise. Das vorwärts gestreute Licht (foreward light scatter, FSC) ist nach Ausblenden des Zentralstrahls ein Maß für die Größe einer Zelle. Das im rechten Winkel zum Zentralstrahl gestreute Licht (sideward light scatter, SSC) ist ein Maß für die Granularität [60, 61]. Die Grundlage der Fluoreszenzmessung ist das Anfärben von Zellen bzw. der zu untersuchenden Moleküle mit Fluoreszenzfarbstoffen, meist nach dem Prinzip der Antigen-Antikörper-Reaktion. Bei Bestrahlen der Fluoreszenzfarbstoffe mit dem 635nm Dioden-Laser in der Durchflusszelle absorbieren die Farbstoffe eine für jeden Farbstoff spezifische Menge an Energie und werden dadurch kurzzeitig auf ein höheres Energieniveau gehoben. Bei dem anschließenden Absinken auf das ursprüngliche Energieniveau wird die Energiedifferenz in Form von Licht bestimmter Wellenlänge entsprechend der Planck schen Wellen-Energie- Relation E = h x f emittiert. Dabei steht E für die absorbierte und dadurch emittierbare Energie, h für eine Naturkonstante, das Plancksche Wirkungsquantum, und f für die

22 Material und Methoden 22 Frequenz und damit indirekt für die Wellenlänge des emittierten Lichts [45]. Da jeder Fluoreszenzfarbstoff ausschließlich eine bestimmte Energiemenge absorbiert, wird auf Grund der Planck schen Wellen-Energie-Relation nur Licht mit einem Intensitätsmaximum in einem bestimmtem Wellenlängenbereich, der für den Farbstoff charakteristisch ist, emittiert. Die Sensoren des Durchflusszytometers registrieren das emittierte Licht und digitalisieren das Signal. Da die Zellen einer Probe in der Durchflusszelle durch die laminare Strömung hintereinander aufgereiht werden, lassen sich für jede einzelne Zelle Aussagen bezüglich des Färbeverhaltens treffen. Auf Grund des vorbekannten Emissionsmaximums jedes Farbstoffes lässt sich mit Hilfe einer geeigneten Computer- Software das registrierte Signal mit den Messergebnissen der vorwärts und seitwärts gestreuten Lichter kombinieren und so einem Ereignis, in diesem Fall einer Zelle, zuordnen. Da bei konstanter Leistung des Lasers die Intensität der Lichtemission von der Zahl der aktivierten Fluoreszenzfarbstoffe abhängt ist, ist mit dieser Methode nicht nur ein qualitativer Nachweis, sondern auch eine (semi)-quantitative Messung möglich [29]. Die verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe sind Fluorescein isothiocyanat (FITC), Pycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC). Das Fluoreszenzmaximum von FITC liegt bei 519nm (gelb-grün), das von PE bei 578nm (rot-orange) und das von APC bei 660nm (gelb). Für die hier dargestellten Analysen wurde das Durchflusszytometer FACSCalibur mit der Software CellQuest Pro (beides BD Biosciences, San Jose, CA, USA) verwendet. 3.2 Färbungen Alle für die in dieser Arbeit durchgeführten Färbungen benötigten Geräte, Produkte, Chemikalien und Biochemikalien sind im Anhang, Tab. A1 und A2, aufgeführt Oberflächenantigenfärbungen Jeder Zelltyp hat sein spezifisches Oberflächenantigenmuster entsprechend dem er zu identifizieren ist. Diese Oberflächenantigene werden nach der cluster of differentiation -Klassifikation (CD) in Kombination mit einer Zahl eingeteilt. Hierbei gibt die zugeordnete Zahl die Reihenfolge der Zuordnung zur CD-Nomenklatur wieder. Alle Leukozyten haben das an der Oberfläche exprimierte leukocyte common antigen, kurz CD45. Monozyten besitzen zusätzlich das für sie typische Oberflächenantigen CD14. Zur durchflusszytometrischen Bestimmung des Anteils an CD14+ Monozyten in peripherem Blut wurde die Blutprobe mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen CD14 und CD45 gefärbt. Die bei der Antikörperherstellung verwendeten Klone und die an die Antikörper gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe sind in Tab. 1 aufgeführt.

23 Material und Methoden 23 Tab. 1: Fluoreszenzfarbstoffe und Klone der verwendeten Antikörper. Antikörper Klon Fluoreszenzfarbstoff CD45 HI30 PE CD14 M5E2 APC Entsprechend des Färbeprotokolls des Herstellers werden vor der Färbung mit Antikörpern gegen Oberflächenantigene die Erythrozyten mit PharM-Lyse TM bei Raumtemperatur im Dunkeln lysiert. Nach anschließendem zweimaligem Waschen mit PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung) und Zentrifugieren mit 500x g für fünf Minuten wird das Sediment mit 200µl PBS und 5µl des gewünschten Antikörpers pro 1x10 6 Leukozyten bei 4 C im Dunkeln für 25 Minuten inkubiert. Ab schließend wird die Probe zweimal mit PBS gewaschen und zur durchflusszytometrischen Messung mit PBS versetzt oder das Sediment zu weiteren Färbungen verwendet Nachweis und Messung von Nekrose und Apoptose Nekrose und 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) 7-AAD ist ein Farbstoff, der hochspezifisch an DNS bindet. Bei intakter Plasmamembran dringen die Farbstoffe nicht in die Zelle ein. Es kommt zu keiner Färbung. Bei Verlust der Membranintegrität können 7-AAD-Moleküle durch die löchrige Membran in die Zelle eindringen und eine Kernfärbung bewirken. Typischerweise ist bei der Nekrose oder bei der späten Apoptose ein Verlust der Membranintegrität zu finden. Daher dient diese Färbung als hochspezifischer Nachweis für tote Zellen. Die maximale Fluoreszenzemission von 7-AAD liegt bei 610nm. Das Färbeprotokoll sieht eine Färbung ausschließlich in Kombination mit Annexin V vor. Der Ablauf der Färbung wird unter dem entsprechenden Unterpunkt erläutert Apoptose, Phosphatidylserin-Switch und Annexin V Wie unter I beschrieben kommt es schon früh im Verlauf der Apoptose zu einem sogenannten Phosphatidylserin-Switch, bei dem Phosphatidylserin vom inneren Blatt der Plasmamembran auf das äußere wechselt. Annexin V, ursprünglich vascular anticoagulant alpha (VAC alpha) genannt, bindet spezifisch an Phosphatidylserin [2]. Durch die Koppelung an FITC werden Zellen mit externalisiertem Phosphatidylserin, also apoptotische Zellen, im Durchflusszytometer dedektierbar. Bei der Nekrose kommt es zum Verlust der Membranintegrität, wobei die Membran porös wird. Annexin V bindet somit auch an nekrotische Zellen, im Gegensatz zur Apoptose aber von intrazellulär. Um einen eventuell beginnenden Zerfall der Plasmamembran nachzuweisen und

24 Material und Methoden 24 so zwischen Apoptose und Nekrose unterscheiden zu können, erfolgt die gleichzeitige Färbung von Annexin V und 7-AAD [13, 20, 24, 66]. Dadurch ergeben sich die vier in Tab. 2 aufgezeigten Möglichkeiten, wie die Zielzellen gefärbt sein können. Tab. 2: Mögliche Messergebnisse bei gleichzeitiger Färbung mit Annexin V und 7-AAD. Mögliche Kombinationen für Annexin-V und 7-AAD Interpretation der Färbung Annexin V / 7-AAD vitale Zellen Annexin V+ / 7-AAD Annexin V / 7-AAD+ Annexin V+ / 7-AAD+ (Früh-) Apoptose Messfehler Nekrose / Spätapoptose Aus den Bindungseigenschaften von Annexin V und 7-AAD ergibt sich, dass eine gleichzeitige Bindung an 7-AAD ohne Bindung von Annexin V nicht möglich ist. Damit spricht das Ausbleiben von Annexin V /7-AAD+ Ereignissen für eine qualitativ hochwertige Messung. Die Färbung mit Annexin V erfolgt nach der Färbung mit Antikörpern gegen Oberflächenantigene. Nach letztmaligem Waschen der Zellen wird das Sediment mit 1ml Bindungspuffer (1x) pro 1x10 6 Leukozyten versetzt. Davon werden 100µl bei Raumtemperatur im Dunkeln mit je 5µl Annexin V und 7-AAD inkubiert, anschließend mit 400µl unverdünntem Bindungspuffer versetzt und durchflusszytometrisch gemessen. 3.3 Instrument Settings In dieser Arbeit wurden die Zellen mit vier Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt. Wie unter 3.1 angeführt hat jeder Farbstoff ein photometrisches Intensitätsmaximum mit der Wellenlänge des nach Aktivierung emittierten Lichts. Die Farbstoffe wurden so gewählt, dass sich die Wellenlängen der Intensitätsmaxima der einzelnen Farbstoffe unterscheiden. Da aber die Farbstoffe nicht monochromes Licht mit ausschließlich einer Wellenlänge, sondern zusätzlich Licht verschiedener Wellenlängen mit reduzierter Intensität emittieren, kommt es zu Überschneidungen der zusätzlich zum Intensitätsmaximum emittierten Wellenlängen zwischen den verschiedenen Farbstoffen. Beispielsweise emittiert der Farbstoff A auch Licht der Wellenlänge des Intensitätsmaximums des Farbstoffes B. Dadurch werden falsch positive Ereignisse am die Wellenlänge des Farbstoffes B registrierenden Sensors aufgezeichnet. Um diese falsch positiven Messwerte auszuschließen müssen in der verwendeten Computer-Software die Messungen der Sensoren gegeneinander abgeglichen werden. Diese gegenseitige Kompensation der Sensoren wird in den Geräteeinstellungen des Durchflusszytometers festgelegt. Hier kann auch festgelegt werden, ob Messereignisse bis zu einer bestimmten Größe

25 Material und Methoden 25 ausgeschlossen werden sollen ( Treshold ) oder ob die Signale verstärkt werden sollen. Die verwendeten Geräteeinstellungen des Durchflusszytometers und die Kompensationseinstellungen der Parameter FL1 bis FL4 sind in Tabelle 3 aufgeführt. Als Treshold war bei allen Messungen der Parameter FSC auf den Wert 175 eingestellt. Tab. 3: Verwendete Geräteeinstellungen am Durchflusszytometer Detector Voltage AmpGain Mode Compensation FSC E00 1,11 Linear - SSC 361 1,16 Linear - FL Logarithmisch - 0,9% FL2 FL Logarithmisch - 17,7% FL1 FL Logarithmisch - 19,9% FL2 FL Logarithmisch - 9,2% FL3 3.4 Auswertung der Messungen Festlegen der Gates der durchflusszytometrischen Messungen Antikörperfärbungen gegen Oberflächenantigene Lymphozyten und Monozyten wurden entsprechend ihrer morphologischen Eigenschaften im FSC-SSC-Blot gegatet. Monozyten sind größer, haben eine höhere Granularität als Lymphozyten und liegen daher bei höheren FSC- und SSC- Werten (Abb. 8a). Zur genauen Differenzierung wurden zusätzlich Populationen entsprechend ihrer Oberflächenantigeneigenschaften gegated: CD45+CD14 für Lymphozyten, CD45+CD14+ für Monozyten (Abb. 8b). Als Lymphozyten bzw. Monozyten wurden Events bezeichnet, die sowohl die typischen morphologischen Eigenschaften (Abb. 8a, R1: Lymphozyten, R2: Monozyten) als auch die entsprechenden Färbeeigenschaften der Oberflächenantigene (Abb. 8b, R3: Lymphozyten, R4: Monozyten) aufwiesen. Abb.8: Gates von Lymphozyten und Monozyten (a) nach morphologischen Eigenschaften und (b) in Abhängigkeit ihrer Oberflächenantigene

26 Material und Methoden Färbungen mit Annexin V und 7-AAD Wie in Tab. 2 (Seite 24) aufgezeigt, gibt es vier mögliche Kombinationen bei der Färbung mit Annexin V und 7-AAD. Die Einteilung der gemessenen Ereignisse erfolgt daher am besten mit Hilfe von Quadranten (Abb. 9). Wie bereits dargestellt, gelten Annexin V+/7-AAD+ Zellen als spät-apoptotisch bzw. nekrotisch, da die Färbung mit 7- AAD ein Kernfärbung ist. Diese nur stattfinden kann, wenn die Zellmembran einer Zelle undicht wird, so wie es während der Nekrose oder in späten Stadien der Apoptose geschieht. Zellen die Annexin V+, aber 7-AAD- sind, gelten somit als früh-apoptotisch bzw. apoptotisch. Abb. 9: Einteilung in Quadranten nach Annexin V- und 7-AAD- Doppelfärbung. Da aber bei der Zuordnung der durchflusszytometrisch registrierten Ereignisse zu Lymphozyten und Monozyten nicht nur die Färbeeigenschaften gegen Oberflächenantigene der jeweiligen Zellen, sondern auch deren Größe und Granularität beachtet wurden, konnten keine Annexin V+/7-AAD+ Lymphozyten oder Monozyten dargestellt werden. Wie unter Punkt 3 der Einleitung beschrieben, ändert sich im Verlauf der Apoptose und der Nekrose die Zellmorphologie. Die Zellen fallen also aus den für sie typischen Regionen (Abb. 8a, R1: Lymphozyten, R2: Monozyten) heraus und werden so nicht in die Auswertung einbezogen. Dies hat zwei Folgen: zum einen können die bei dieser Gating-Strategie die als Lymphozyten beziehungsweise Monozyten bezeichneten Events allein bezüglich ihrer Annexin V - Färbeeigenschaften bewertet werden, da, wie eben beschrieben, weder Lymphozyten noch Monozyten 7-AAD-positiv sein können. Bei der Differenzierung zwischen Annexin V-negativ und Annexin V- positiv kann somit auch auf ein Histogramm, welches eine eindeutigere graphische

27 Material und Methoden 27 Verteilung der registrierten Ereignisse ermöglicht, zurückgegriffen werden (Abb. 10). Der erste Peak des Histogramms gilt als Annexin V-negativ, die Trennmarke ist rechts der Basis dieses Peaks zu setzen. Alle Events, die rechts dieser Trennmarke sind gelten als Annexin V-positiv und somit als apoptotisch. Abb. 10: Histogramm zur Unterscheidung zwischen Annexin V-negativen und positiven Events Zum anderen muss eine weitere Gating-Strategie hinzugezogen werden um die Darstellung von 7-AAD-positiven Ereignissen zu ermöglichen. Die durchflusszytometrisch gemessenen Ereignisse werden wieder in Lymphozyten und Monozyten unterschieden, allerdings nur bezüglich ihrer Oberflächenantigenfärbeeigenschaften, nicht bezüglich ihrer Morphologie (Abb. 11). Dadurch verliert die Auswertung Präzision, da zum Teil auch Konglomerate von Zell- Detritus als Zellen gewertet werden. Allerdings werden Zellen mit apoptotisch oder nekrotisch bedingter Veränderung der Morphologie nicht ausgeschlossen. Die so gegateten Ereignisse werden nun in einem Annexin V/7-AAD-Boxplot angezeigt. Abb. 11: Gaten von Lymphozyten und Monozyten unabhängig ihrer Morphologie.

28 Material und Methoden 28 Da die Aufteilung in Annexin V-/7-AAD- und Annexin V+/7-AAD- bereits erfolgte, werden hierbei lediglich die Annexin V+/7-AAD+ Ereignisse bewertet und der prozentuelle Anteil an Lymphozyten beziehungsweise Monozyten angegeben Statistische Auswertung Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm PASW, Version 18. Mit Hilfe der explorativen Datenanalyse wurden Mittelwert, Standardabweichung, Spannweite und Median berechnet. Der Test auf Normalverteilung der Daten erfolgte nach Kolmogorov [33]. Zum Vergleich der Daten der Apheresemethoden und der Daten zu den verschiedenen Zeitpunkten nach Spende wurde das generalisierte lineare Model verwendet, gefolgt von post-hoc-tests entsprechend der Methode von Sidak zur Anpassung der p-werte [23]. Um den Zusammenhang zwischen verschiedenen Variablen zu erfassen wurde der Korrelationskoeffizient nach Pearson verwendet [43]. Alle Hypothesentests waren zweiseitig und wurden als signifikant angesehen, wenn die p-werte kleiner als 0,05 waren und als hochsignifikant, wenn die p-werte kleiner als 0,01 waren. 4. Verwendete Formeln a. Totales Blutvolumen (TBV), Berechnung nach Nadler [39]: : TBV = (0,3669 x (Größe in m) 3 + 0,03219 x (Gewicht in kg) + 0,6041) x 1000 [l] : TBV = (0,3561 x (Größe in m) 3 + 0,03308 x (Gewicht in kg) + 0,1833) x 1000 [l] b. Body Mass Index (BMI): BMI = (Gewicht in kg) / (Größe in m) 2 [kg/m 2 ] c. Zellgehalt eines Blutproduktes: Zellgehalt = (Zell-Konzentration in Zellen / ml) x (Produktvolumen in ml) 5. Versuchsreihen zur Beantwortung der Fragestellungen 5.1 Vergleich von Leukozytenreduktionskammern zweier Zellseparatoren Es wurde in einer 2007 veröffentlichten Studie über Leukozytenreduktionskammern des Trima Accel Zellseparators von einer hervorragenden Menge und Qualität mononukleärer Zellen des peripheren Blutes in den Kammern berichtet. [6] Wie unter Material und Methoden, Punkt 1.3 beschrieben wird beim COBE Spectra Zellseparator ebenfalls eine geometrisch gleich geformte Leukozytenreduktionskammer zur Leukozytenreduktion verwendet. Eventuelle Unterschiede zwischen dem Blut aus den

29 Material und Methoden 29 Leukozytenreduktionskammern beider Zellseparatoren wurden untersucht, indem der Gehalt von Leukozyten, mononukleären Zellen und Restzellen von zehn Leukozytenreduktionskammern der COBE Spectra und von 27 Leukozytenreduktionskammern der Trima Accel analysiert wurden. Die Auswahl der Spender der Thrombozytapheresen, deren Leukozytenreduktionskammern verwendet wurden, war zufällig. Innerhalb eines Zeitraums von zwei Stunden nach der Thrombozytapherese wurde der Inhalt der gefüllten Leukozytenreduktionskammern in Röhrchen mit dem Volumen 20 ml überführt. Die Zellkonzentrationen wurden mit dem ADVIA120 bestimmt, der prozentuelle Anteil mononukleärer Zellen durchflusszytometrisch entsprechend der oben beschriebenen Färbemethoden gegen Oberflächenantigene (Material und Methoden, Punkt 3.2.1). 5.2 Zellgehalt und Zellschädigung in Leukozytenreduktionskammern Um eventuelle Einflüsse auf den Gehalt mononukleärer Zellen in den Leukozytenreduktionskammern sowie auf die Qualität der Zellen im Sinne einer Zellschädigung durch unterschiedliche Spendeparameter wie z.b. die Spendedauer, zu erkennen sollten die Leukozytenreduktionskammern des Trima Accel Zellseparators nach einfachen Thrombozytapheresen (E-TA) mit denen nach doppelten Thrombozytapheresen (D-TA) des selben Geräts verglichen werden. Des Weiteren sollte das Blut der Leukozytenreduktionskammern kurzzeitgelagert werden, um aus einer eventuell zu beobachtenden Dynamik innerhalb des Blutes, wie Änderungen des Zellgehalts oder des Anteils geschädigter Zellen, Aussagen zur Qualität der aus Leukozytenreduktionskammern gewonnenen Zellen zu treffen. Dazu wurden je neun Leukozytenreduktionskammern nach E-TA und nach D-TA innerhalb eines Zeitraums von maximal einer Stunde nach Spende in PVC-Beutel unter aseptischen Bedingungen umgefüllt. Die Auswahl der Thrombozytapheresen, deren Leukozytenreduktionskammern verwendet wurden, erfolgte zufällig. Die mit dem Blut der Leukozytenreduktionskammern gefüllten Beutel wurden für 72 Stunden entsprechend der unter Material und Methoden, Punkt 2 angeführten Bedingungen gelagert. Zu den Messzeitpunkten 1 Stunde, 6 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach Ende der Apherese wurden über eine Kanüle Proben mit je ca. 0,7 ml Blut aus dem gelagerten Material entnommen. Bestimmt wurden das Blutbild (Leukozyten, Thrombozyten und Erythrozyten) mit dem ADVIA120 Zellzähler und durchflusszytometrisch der Anteil der CD45+, CD14+, Annexin V+ und 7-AAD+ Events.