Status der LC-MS in der täglichen Praxis

Transkript

1 Status der LC-MS in der täglichen Praxis Möglichkeiten und Limitierungen bei Strukturaufklärung und Quantifizierung Michael ehme rganische Analytische Chemie Departement Chemie Universität Basel Strukturaufklärung Page 1

2 Was ist anders bei Strukturaufklärung mit LC-MS? Weiche Ionisationstechniken wie Elektrosprayionisation (ESI) oder chemische Ionisation bei Atmosphärendruck (APCI) ergeben kaum Bindungsfragmentierungen. Konsequenzen: Zusätzliche Information zur Strukturaufklärung durch MS/MS oder multiple MS (MS n ) benötigt. Bestimmung Elementarzusammensetzung durch genaue Massenbestimmung hilfreich. Strukturaufklärung Page 2

3 Der Normalfall: Zusatzinformation bei der Strukturaufklärung vorhanden wie Syntheseweg oder Metabolisierung einer bekannten Struktur. Ist eine Verifizierung, keine wirkliche Strukturaufklärung. Was aber bei folgenden Situationen? Strukturaufklärung Page 3

4 Die wirkliche Herausforderung Struktur ist unbekannt, ist aber ein Vertreter einer bekannten Substanzklasse (z.b. Naturstoffe wie Alkaloide, Mykotoxine etc.). Struktur eines kleinen Moleküls (bis ca. 500 u) ist komplett unbekannt. Strukturaufklärung Page 4

5 1. Beispiel: Identifizierung von Designerdrogen Problem: Immer neue Designerdrogen mit den unten gezeigten Grundstruktur und unterschiedlichen Wirkungen und Toxizität werden auf den Markt gebracht. Ziel: Identifizierung bekannter und neuer Wirkstoffe innert 30 min in Tabletten. R3 HN R2 R1 R1 (-NH 2 ; NH ; NHCH 2 ; ) R2 (-H, -, -CH 2 ) R3 (- ; Methylenedioxy-; - ; S ; Cl, Br, I, in various combinations) R1 = H; R2 = - : Amphetamine; R1, R2 = - : Amphetamine Strukturaufklärung Page 5

6 Vorgehen Tablette in 100 ml H 2 1 Tropfen konz. HCl auflösen, filtrieren. HPLC auf Nucleosil HD C 18 (125 mm Länge, 3 mm ID, 3 µm Partikel). Gradient: 50 mm NH 4 C (A), H (B), 0-2 min 30% B, 2-25 min 30-80% B, min 30% B, oder: Spritzenpumpe (Hauptprodukt) MS n : Mehrfache, bindungsenergie-abhängige Fragmentierung in einer Ionenfalle Strukturaufklärung Page 6

7 1. Schritt: ESI()-MS ergibt Information über Molekularmasse und Heteroatome (Isotopensignale). Br NH 2 DB Strukturaufklärung Page 7

8 2. Schritt: MDA NH 3 MS 2 ergibt Information über Substitution an Aminogruppe MDA:3,4-Methylendioxyamphetamin MDMA: N-Methyl-3,4-methylendioxy-amphetamin MDE: N-Ethyl-3,4-methylendioxy-amphetamin H 2 N MDMA H 2 N MDE Strukturaufklärung Page 8

9 3. Schritt: MS 3 ergibt Information über Substitution am C- Atom α zur Aminogruppe AEM NH 3 A A 1-Phenyl-2-aminobutane: Loss of 42 u (C 3 H 6 ) B Amphetamine: Loss of 28 u (C 2 H 4 ) C Phenethylamine: No loss of 28 u/42 u but of 15 u TMA Mescaline NH 3 NH 3 B C Strukturaufklärung Page 9

10 4. Schritt: MS 4 ergibt Information über Ring-Substitution: Massenspektren sind sehr substitution-spezifisch NH 3 Verlangt Erstellen einer Referenzspektren-Bibliothek zur Substitutionsposition 1-(2,3-Dimethoxyphenyl)- 2-aminobutan NH 3 1-(2,4-Dimethoxyphenyl)- 2-aminobutan NH 3 1-(2,5-Dimethoxyphenyl)- 2-aminobutan NH 3 1-(3,4-Dimethoxyphenyl)- 2-aminobutane Strukturaufklärung Page 10

11 Wichtig: MS 4 Spektren der Ring- Substitution sind unabhängig von Substitution in Seitenkette! NH 3 3,5-Dimethoxy- Amphetamine NH 3 1-(3,5-Dimethoxyphenyl)- 2-aminobutane Strukturaufklärung Page 11

12 Ergebnis MS 1 bis MS 4 -Spektren erlauben eine eindeutige Strukturaufklärung Zeitbedarf der Aufnahme MS n -Spektren ca. 10 min Zeitbedarf Interpretation bei guter Erfahrung ca. 10 min Strukturaufklärung Page 12

13 Ein weiteres Beispiel: Identifizierung von Trichothecenen Trichothecene sind sesquiterpenoide Mycotoxine, die von verschiedenen Fusarium-Pilzen produziert werden, die auf Getreide wachsen. Mehr als 140 Trichothecene bisher isoliert. Werden je nach Struktur in 4 Gruppen eingeteilt. Die wichtigsten sind A- und B-Trichothecene. H H R(3) H H R(3) R(8) R(7) R(15) 3 4 R(4) R(7) R(15) 3 4 R(4) Typ A Trichothecene Typ B Trichothecene Strukturaufklärung Page 13

14 Aufgabe: Identifizierung von Trichothecenen, die nicht als Referenzverbindungen erhältlich sind Bei APCI(): Verlust funktioneller Gruppen bei MS/MS (MS 2 ), Fragmentierung des Gerüstes bei MS 3. Beispiel: Deoxynivalenol Strukturaufklärung Page 14

15 H H H C 3 H H m/z 297 H H H C 3 C H 3 H 3 C H H H m/z 249 H H m/z m/z 201 H H H H H H 3 C - 18 H H - 30 m/z H H H H H C 3-18 m/z 261 m/z H H H C H H H H C H 3 H H 3 H m/z 203 Verlust funktioneller Gruppen m 18 u (H 2 aus H-Gruppen) m 28 u (C aus Epoxidring) m 30 u (CH 2 aus Epoxyring aus H Gruppe an C15 bei B- Trichothecenen) m 42 u (CH 2 C aus Acetylgruppe) m 60 u ( CH aus Acetylgruppe) m 102 u (( ) 2 CHCH 2 CH aus iso-valerylgruppe) Im Gegensatz zu A-Trichothecenen verlieren B-Trichothecene leicht C15 Seitenkette (chinoide Struktur, Umlagerung in stabilen aromatischen Alkohol). Strukturaufklärung Page 15

16 Erhaltene Informationen I: Je nach Anzahl Substituenten und Typ bleibt nach MS 2 ein Grundgerüst mit folgenden Massen übrig: A-Trichothecene: Typ Verrucarol (VL) mit Substituenten an R4 und R15, Gerüstfragment 200/202 u. Typ Diacetoxynivalenol (DAS) mit Substituenten an R3, R4 und R15, Gerüst-fragment 198/200 u. Typ Nesolaniol (NE) wie HT-2, T-2, T-2 mit Substituenten an R3, R4, R8 und R15, Gerüstfragment 196/198 u. B-Trichothecene: 3 oder 4 Substituenten, Gerüstfragment 200/202 u (z.b. DN, 3- und 15-ADN). Strukturaufklärung Page 16

17 Erhaltene Informationen II: Durch zusätzliche Kollisionsenergie wird mit MS 3 das C- Gerüstfragment in strukturspezifische Fragmente zerlegt. Gleichzeitige Verluste von m 15 u, 18 u, 28 u und 42 u typisch für die Trichothecen-Grundstruktur. Nur B-Trichothecene bilden Acetataddukte. Nur mit APCI(-) detektierbar. H H R R R R 3 Nur bei Acetyl- an C 15 wird das Ammoniumaddukt als Basision nach Zusatz von Ammoniumacetat gebildet. Strukturaufklärung Page 17

18 Was kann man mit diesen Informationen anfangen? Ist die Verbindung ein Trichothecen (MS 3 -Gerüstfragmente)? Wieviele und welche Substituenten gibt es (MS 2 - Massenverluste)? Ist es ein B-Trichothecen (Acetat-Anion-Addukt)? Ist an C 15 ein Acetylrest (Ammoniumion-Addukt)? Strukturaufklärung Page 18

19 Rel. Abundance [%] 8 Mit Fusarien infizierter Reis DAS Anwendung auf Extrakte mit unbekannten Trichothecenen t [min] Verbindung Nr. Rt a) [min] MW b) Ammonium- Addukt Identifizierte Substituenten Trichothecen- Struktur H, 1 Ac c) 15-Deacetyl NE H, 2 Ac 4,8-Diacetoxy T-2 tetraol H, 1 Ac 4-Deacetyl NE H, 2 Ac 4,8-Diacetoxy T-2 tetraol H, 2 Ac Iso NE oder 7,8- Dihydroxycalonectrin H, 2 Ac 7- bzw. 8- Hydroxycalonectrin H, 3 Ac 8-Acetyl NE H, 2 Ac, 1 H-i-Val d) 3'-Hydroxy T H, 1 i-val T-2 triol e) H, 2 Ac, 1 red. i-val T-2 mit reduziertem i-val Ac, 1 i-val Deoxy T Ac, 1 i-val Acetyl T-2 e) a) Retentionszeit, b) Molekulargewicht Strukturaufklärung Page 19

20 Aber: Was bei vollständig unbekannten Verbindungen? Folgende Informationen durch HPLC-MS erhältlich: Ionisationsverhalten mit ESI(/-), APCI(/-) Indikationen über Ionisierbarkeit von (Teil)strukturen, z.b.amine ESI(), Phenole/arom. Säuren ESI(-), APCI(-) Informationen vom Molekülion: Bildung von intensiven Ionenaddukten (Ionophore)? Mehrfach geladene Ionen? Dimere? (gute Ladungsdelokalisation) Isotopensignale von Heteroatomen? Anzahl C-Atome ( 13 C-Signal) Elementarzusammensetzung (Hochauflösung) Fragmentierungen (vorzugsweise mit MS n ) Verlust kleiner neutraler Moleküle (funktionelle Gruppen) Fragmentierungen C-Gerüst. Strukturaufklärung Page 20

21 Ein Beispiel zur Demonstration: Im Rahmen eines Wettbewerbes wurde eine unbekannte Substanz verschickt: Nicht ionisierbar mit ESI(/-): Weder basische noch saure gruppen vorhanden (-NH 2, -H). APCI(): Molekülion m/z 240, APCI(-): m/z 239? Normal 2 u Unterschied ausser bei tert. Aminen. 13 C-Signal: 10 C-Atome. Keine Heteroatome wie Cl, Br, S. Schwer fragmentierbar mit MS/MS (Ionenfalle): Aromat? Mehrfache Verluste von 30 u (N) 45 u (-N 2 H), z.b. APCI(-): m/z , m/z , m/z , typisch für N 2, mindesten 2 N 2? APCI(-): Zusätzlich Verlust von 29 u (m/z , Ethyl-), 74 u m/z ), 93 u (4647 u). Strukturaufklärung Page 21

22 Beispiel einiger Massenspektren der unbekannten Verbindung S#: RT: AV: 40 SB: NL: 7.38E5 T: - c Full m s [ ] Relative Abundance APCI(-) m/z S#: RT: AV: 15 NL: 1.62E5 T: c Full ms [ ] APCI() Rel ativ e Ab60 un da55 nce m S#: RT: AV: 19 NL: 3.17E4 T: - c Full m s [ ] Relative Abundance APCI(-): MS/MS, m/z scan Strukturaufklärung Page 22

23 Information zusammenfügen: Aromat (C 6, 72 u), 2 x N 2 (92 u), Rest 75 u (M: 239 u). M: 239 u, ungerade Anzahl N! Zwei für Nitrogruppen, 3 N? 75 u - 14 u = 61 u. Aromat, dreifach substituiert? 61 u - 3 u = 58 u Ethylgruppe vorhanden: 58 u - 29 u = 29 u, noch 2 C-Atome übrig: Zweimal Ethyl? Vermutete Struktur: Dinitro-N,N-Diethylanilin? (N 2 ) 2 N CH2 Korrekt: 2,4-Dinitro-N,N-Diethylanilin CH 2 Strukturaufklärung Page 23

24 Plausibilitätskontrolle Struktur vs. Massenspektrum: Einfach, wenn nur Abspaltungen funktioneller Gruppen vorliegen, aber dann meist nicht sehr signifikante Information. Anspruchsvoll, wenn Fragmente durch Umlagerungen, H-Verschiebungen, retro-diels-alder-fragmentierungen etc. gebildet werden. Ergeben zunächst unerklärliche Fragmente. Risiko für eine Falschaussage vorhanden. Interpretation solcher Spektren verlangt sehr gute Kenntnisse von MS-Fragmentierungen. Sind oft mit denjenigen unter EI-Bedingungen identisch. Gute Neuigkeit: Fragmente, die durch komplizierte Prozesse gebildet werden, meist sehr signifikant für Teilstrukturen! Strukturaufklärung Page 24

25 Ein Beispiel: Wie wird m/z 121 durch MS/MS gebildet? H MS H MS/MS H H H CH 2 m/z 121 Strukturaufklärung Page 25

26 Metabolit zeigt ebenfalls m/z 121 bei MS/MS: Gleiche Teilstruktur vorhanden! Strukturaufklärung Page 26

27 MS Sogar: Vorhandensein von m/z 121 bei ähnlichen Substanzklassen guter Indikator für gleiche Teilstruktur Beispiel: Betamethason MS/MS Strukturaufklärung Page 27

28 Ein weiteres Beispiel: Identifizierung von Isoflavone in Pflanzenextrakten Anforderungen: Isoflavone (I) sind seltener als die strukturisomeren Flavone (II): Eindeutige Unterscheidung notwendig. Pflanzenextrakte sind komplex: Eindeutige Erkennung von Isoflavonen durch on-line HPLC-MS. Strukturaufklärung bekannter bzw. neuer Strukturen ohne Isolierung aus dem Extrakt. R 3 ' R 4 ' R 7 R 7 R 3 ' R 5 R 4 ' R 5 I II Strukturaufklärung Page 28

29 1. Schritt: Gibt es charakteristische Unterschiede in den MS 2 von Flavonen/Isoflavonen Nur die MS 2 von Isoflavonen zeigen einen Verlust von 56 u: Grund? Mechanismus? Strukturaufklärung Page 29

30 2. Schritt: Identifizierung Ursprung 56 u MS n -Spektren, 13 C-Markierung an C2, genaue Massen mit Q-TF: Verlust von 2 x C aus mittlerem Ring C2 Strukturaufklärung Page 30

31 3. Schritt: Probe aufs Exempel 1. Test mit Referenzsubstanzen. 2. Scannen mit Neutralverlust 56 u lässt nur noch Isoflavone ( ) erkennen. Relative Intensität [%] Relative Intensität [%] 1 2 m/z 285 m/z 283 m/z 269 m/z 255 m/z 271 m/z 285 m/z 283 m/z 269 m/z 255 m/z 271 Strukturaufklärung Page 31

32 4. Schritt: Etablieren Vorgehen Strukturaufklärung Interpretieren von Spektren von Referenzverbindungen Analog zum früher publizierten Vorgehen für Mykotoxine, Polymere etc. Strukturaufklärung Page 32

33 Und schliesslich: Anwendung auf Extrakte Extrakt von Lupinus albus Die MS der schwarz markierten Signale enthalten einen Neutralverlust von 56 u Mit L markierte Verbindungen wurden als Isoflavone identifiziert, darunter ein bisher noch nicht in dieser Pflanze gefundenes Isoflavon (L9, 7,3 -Di-methylorobol). 20 x Strukturaufklärung Page 33

34 Schlussfolgerungen Strukturaufklärung mit LC-MS komplexer als mit GC-MS. Zusätzliche Informationen durch Anwendung verschiedener Ionisationsmethoden wichtig. Multiple MS (MS n ) absolut notwendig für komplexe Probleme. Verlangt sehr viel Erfahrung. Ist zeitaufwändig. Kann jedoch eine Antwort geben, wenn nur wenige ng oder komplexe Gemische zur Verfügung stehen. Das Hauptproblem: Mehr Forschungseinsatz nötig in Bereich Strukturaufklärung mit LC-MS. Sonst werden die Vorteile dieser Technik nie voll ausgenutzt. Strukturaufklärung Page 34