Die Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteine von Marchantia polymorpha L. (Brunnenlebermoos):

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1 Die Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteine von Marchantia polymorpha L. (Brunnenlebermoos): Identifizierung und Charakterisierung der sie codierenden Genfamilie Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades - Dr. rer. nat. - dem Fachbereich Biologie/Chemie der Universität Bremen vorgelegt von Dipl.-Biol. Ina Groke aus Ahlden (Aller) Bremen Januar 2002

2 Die Arbeiten wurden in der Zeit von September 1998 bis Januar 2002 in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. F. Koe nig an der Universität Bremen und in der Arbeitsgruppe von Dr. S. Jansson an der Universität Umeå (Schweden) durchgeführt. Erster Gutachter: Zweiter Gutachter: Prof. Dr. F. Koenig (Universität Bremen) Prof. Dr. H. Grimme (Universität Bremen) Tag des öffentlichen Kolloqiums:

3 für Lena

4 4 INHALT 1 EINLEITUNG Oxygene Photosynthese Antennenkomplexe oxygener photosynthetischer Organismen Struktur und Funktion Antennensystemtypen und ihre Verbreitung Membranintrinsische Lichtsammelkomplexe (LHCs) der Pflanzen Chlorophyll a/b bindende Proteine Struktur Ausgewählte Eigenschaften Genfamilie der CAB-Proteine Fragestellung und Zielsetzung 25 2 MATERIAL UND METHODEN Pflanzenmaterial und Pflanzenanzucht Thalluskulturen von M. polymorpha Kulturbedingungen Anlage von Sterilkulturen Starklichtexposition Pigmentanalytik Chlorophyllbestimmung Molekularbiologische Methoden Bakterienstämme und Vektoren Anzucht der Bakterien Dauerkulturen von Bakterien Isolierung von Nukleinsäuren RNA Plasmid -DNA Präparation von Plasmiden mit geringerem Reinheitsgrad (Boiling-Methode) Präparation von Plasmiden mit hohem Reinheitsgrad 33

5 Inhaltsverzeichnis Quantifizierung von Nukleinsäuren Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen Agarosegelelektrophorese Auftrennung von DNA Auftrennung von RNA Gelelektrophorese von mit Glyoxal denaturierter RNA Gelelektrophorese von mit Formaldehyd denaturierter RNA Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Oligonukleotidprimer RT-PCR Reverse Transkription (RT) Standardbedingungen für die PCR PCR für die Amplifikation von DNA-Sonden Klonierung von DNA-Fragmenten Isolierung der Insert-DNA Vorbereitung des Vektors Ligation Herstellung kompetenter Zellen Transformation von E. coli Blau-weiß Selektion DNA-Sequenzierung Northernblot-Analyse Transfer von RNA auf Nylonmembranen Herstellung radioaktiv markierter DNA-Sonden Hybridisierung Detektion von Hybridisierungen mittels Autoradiographie Entfernen radioaktiver Signale vor einer erneuten Hybridisierung Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels ESTs cdna Bibliotheken Herstellung Titerbestimmung In vivo-excision von ptriplex2 aus λtriplex Anzucht der EST-Klone Sequenzierung aus EST-Klonen isolierter Plasmid -DNA Verarbeitung von Sequenzdaten: Bioinformatik 52

6 Inhaltsverzeichnis 6 ERGEBNISSE Strategien zur Identifizierung einzelner Mitglieder der cab-genfamilie RT-PCR Partielle Analyse des nukleären Genoms mittels expressed sequence tags Bioinformatische Analyse der EST-Sequenzen ESTs mit Ähnlichkeit zu CAB-Proteinen Zusammensetzung der cab-genfamilie von M. polymorpha Proteine des LHCI Proteine des LHCII Lhcb Lhcb4-Lhcb Verwandte der cab-genfamilie PsbS Sep1 ähnliches Protein Analyse der Expression einzelner cab-gene diurnale Expression einzelner cab-gene Auswirkung von Lichtstress auf die Genexpression des Sep1-ähnlichen Gens 86 4 DISKUSSION Zusammensetzung der cab-genfamilie des Bryophyten M. polymorpha Analyse der CAB-Proteinsequenzen Lhca LHCII , Lhcb2, Lhcb Lhcb Verwandte der cab-genfamilie Expression einzelner Lhc-Gene von M. polymorpha Diurnale Expression Veränderte Expression des Sep1-ähnlichen Gens bei Lichtstress Ausblick ZUSAMMENFASSUNG 103

7 Inhaltsverzeichnis 7 6 LITERATURVERZEICHNIS ANHANG 119 DANKSAGUNG 127

8 8 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen A. bidest - deionisiertes, dann 2x destilliertes Wasser Amp, Amp r - Ampicillin, ampicillinresistent A. thaliana - Arabidopsis thaliana ATP - Adenosintriphosphat BNN132 - Bakterienstamm (E. coli) bp - Basenpaare CAB - Chlorophyll a/b bindendes Protein cdna - complementary DNA - komplementäre DNA Chl - Chlorophyll CP - Chlorophyll-bindendes Protein Cyt b6/f - Cytochrom b6/f-komplex DEPC - Diethylpyrocarbonat DMSO - Dimethylsulfoxid DMF - N,N -Dimethylformamid DNA - Desoxyribonucleicacid Desoxyribonukleinsäure E. coli - Escherichia coli EDTA - Ethylentetraamineessigsäure ELIP - early light inducible protein - frühes lichtinduziertes Protein EST - expressed sequence tags exprimierte Sequenzbereiche HLIP - high light inducible protein - Starklicht induziertes Protein IPTG - Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid K - Kelvin Kan, Kan r - Kanamycin, kanamycinresistent kda - Kilodalton LB - Luria-Bertani (Medium für Bakterien) Lil - light harvesting like LHC-Protein - light harvesting complex Lichtsammelkomplex M. polymorpha - Marchantia polymorpha mrna - messenger RNA - Boten-RNA MCS - multiple cloning site - Polylinker MOPS - Morpholinopropansulfonsäure MSK2 - Nährmedium zur Kultur von Pflanzen NPQ - nicht photochemisches Quenching

9 9 OD PCR pfu PSI PSII RNA rpm RT SDS SMART SSC TAE Tet, Tet r U UV X-GAL XL1-Blue XL1-Blue MRF V - optische Dichte - polymerase chain reaction - Polymerasekettenreaktion - plaque forming unit - Plaque-bildende Einheit - Photosystem I - Photosystem II - ribonucleiacid - Ribonukleinsäure - rotations per minute - Umdrehungen pro Minute - Reverse Transkription - sodium dodecyl sulfate - Natriumdodecylsulfat - switch mechanism at the 5 end of RNA transcripts - standard saline-citrate - Tris-Acetat-EDTA-Puffer - Tetracyklin, tetracyklinresistent - unit - Einheit der Enzymaktivität - Ultraviolett - 5-Bromo-4-chloro-3- indoyl-β-d-galctopyranosid - Bakterienstamm (E. coli) - Bakterienstamm (E. coli) - Volt

10 10 1 Einleitung 1.1 Oxygene Photosynthese Photoautotrophe Organismen vermögen die Lichtenergie der Sonne in chemisch gebundene Energie umzuwandeln. Bei diesem als Photosynthese bezeichneten Prozeß werden aus einfachen anorganischen Substanzen mit Hilfe der Energie absorbierter Strahlung energetisch höherwertige organische Moleküle synthetisiert. Bei der cyanobakteriellen und pflanzlichen Photosynthese ist die Reduktion von Kohlendioxid zu Kohlehydraten mit der photoinduzierten Oxidation von Wasser unter Freisetzung von molekularem Sauerstoff gekoppelt. Für den Gesamtvorgang ergibt sich die folgende Gleichung (Formel 1): 6 CO H 2 O C 6 H 12 O H 2 O + 6 O 2 ÄG = 2868 kj Formel 1 Grundvoraussetzung für die Fähigkeit zur photoinduzierten Oxidation von Wasser ist die Erzeugung eines genügend hohen Redoxpotentials. Dies ist bei Cyanobakterien und Pflanzen durch das Hintereinanderschalten von zwei in Serie arbeitenden Photosystemen verwirklicht. Photosysteme sind membrangebundene Multiproteinkomplexe, die sich aus einem Kernkomplex mit integralem Reaktionszentrum und einem Lichtsammlerkomplex zusammensetzen. Gemeinsam mit zwei weiteren membrangebundenen Multiproteinkomplexen dem Cytochrom b 6 /f-komplex (Cyt b 6 /f) und der ATP-Synthase vermitteln die Photosysteme I (PSI) und II (PSII) unter Einbezug von beweglichen Elektronenüberträgern (Plastochinon, Plastocyanin, Ferredoxin), die einzelnen Reaktionsschritte des photochemischen Teilprozesses der oxgenen Photosynthese (Abb. 1). Pigmente der Lichtsammlersysteme (Antennen) absorbieren Lichtquanten des sichtbaren Bereichs des Lichtspektrums und leiten deren Energie schnell und effizient in Form von Excitonen an die photochemischen Reaktionszentren weiter. An speziellen Chlorophyllen in den Reaktionszentren (special pair) findet die primäre Ladungstrennung statt, und freigesetzte Elektronen werden über eine Reihe verschie dener Elektronenakzeptoren bzw. Elektronendonatoren weitergeleitet und schließlich in Form von Reduktionsäquivalenten festgelegt. Das während des lichtgetriebenen Elektronenflusses durch den Protonentransport und den sich dadurch aufbauenden Protonengradie nten gebildete elektrochemische Potential über der Membran wird für die Synthese von Energieäquivalenten in Form von Adenosintriphosphat (ATP) genutzt.

11 Einleitung 11 Bei Pflanzen sind die Multiproteinkomplexe des Photosyntheseapparates in das Thylakoidsystem der Chloroplasten eingebettet und auf unterschiedliche Bereiche dieses Membransystems verteilt (ANDERSON & ANDERSON, 1988). Während sich das PSII vor allem in den dicht gestapelten Granathylakoiden befindet, sind das PSI und die ATP-Synthase bevorzugt in den Stromathylakoiden lokalisiert. Der Cyt b 6 /f-komplex ist auf die beiden Membrandomänen relativ gleich verteilt. Abb. 1: Vereinfachte Darstellung des photosynthetischen Elektronentransportes bei Pflanzen. Grau: plastidenkodierte Proteine, weiß: kernkodierte Proteine. Die einzelnen Komponenten der Multiproteinkomplexe tragen die Bezeichnung des für sie kodierenden Gens, einige auch die des Proteins (Schema vereinfacht nach HERRMANN 1996). 1.2 Antennenkomplexe oxygener photosynthetischer Organismen Der überwiegende Teil der an der Photosynthese beteiligten Chromophore ist in den Antennen organisiert. Dadurch erhöhen Antennen den Absorptionsquerschnitt der Reaktionszentren um ein Vielfaches. Drei Klassen von Chromophoren sind für die Absorption von Lichtquanten und die Weiterleitung der Energie in Antennen oxygener photosynthetischer Organismen von Bedeutung: die Chlorophylle, die Phycobiline und die Carotinoide. Alle diese Chromophore sind in Form wohl definierter Chromophor -Protein-Komplexe organisiert 1. Durch die Zahl und die spektralen Eigenschaften der enthaltenen Chromophore erlauben Antennen eine flexible Anpassung des Photosyntheseapparates an unterschiedliche 1) Für die freien Substanzen wird im folgenden die Bezeichnung Chromophor verwendet, für die Chromophor- Protein-Komplexe der Begriff Pigment.

12 Einleitung 12 Lichtbedingungen. Somit stellen sie das wesentliche adaptive Element dar, das dem Photosyntheseapparat ermöglicht, möglichst effizient zu arbeiten. In Anbetracht der Bedeutung der Photosynthese für die heutige Vielfalt an Lebensformen auf der Erde ist es wichtig, ein möglichst umfassendes Verständnis zur Funktionsweise photosynthetischer Antennensysteme zu entwickeln Struktur und Funktion Ein Vergleich der heute bekannten photosynthetischen Systeme zeigt, daß die Evolution mehrere verschiedene Lichtsammlersysteme hervorgebracht hat. Die funktionellen Anforderungen an die verschiedenen Antennen sind jedoch gleich. Jede photosynthetische Antenne muß: (i) (ii) (iii) Lichtenergie effizient absorbieren, die Anregungsenergie schnell und möglichst verlustfrei an die photochemischen Reaktionszentren weiterleiten bzw. auf diese verteilen, überschüssige Lichtenergie zum Schutz vor photooxidativen Schäden ableiten. Vielfalt herrscht vor allem bei den äußeren Antennensystemen. Neben den mit den Kernkomplexen der Photosysteme assoziierten lichtsammelnden Komplexen (äußere Antennen), beteiligen sich auch Pigmente der Kernkomplexe selbst an der Weiterleitung von Anregungsenergie an die Reaktionszentren. Diese Lichtsammelproteine der Kernkomplexe, werden als innere Antennen bezeichnet. Bei Pflanzen bilden die eng mit dem Reaktionszentrum assoziierten Kernkomplexuntereinheiten CP43 und CP47, die innere Antenne des PSII. Sie binden neben Carotinoiden vorwiegend Chlorophyll a (Chl a). Beim PSI hingegen ist die innere Antenne integraler Bestandteil der Reaktionszentrumsuntereinheiten PsaA/B. Die Organisation der Antennenchromophore in wohl definierten Chromophor-Protein- Komplexen ist von enormer Bedeutung für ihre funktionellen Eigenschaften. Durch die Bindung an Proteine, nicht kovalent (Chlorophylle und Carotinoide) oder kovalent (Phycobiline), werden die spektralen Eigenschaften der Chromophore beeinflusst, sowie deren räumliche Anordnung festgelegt (SIMPSON & KNOETZEL, 1996). Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die wichtigsten Charakteristika der Gruppen photosynthetischer Chromophore oxygener Phototropher.

13 Einleitung 13 Tab. 1: Vorkommen und ausgewählte Charakteristika der Chromophore oxygener Phototropher. Chromophor Organismen Vorkommen (RC, Kernantennen, periphere Antennen) Chl a Chl b Chl c Chl d Cyanobakterien, Algen, Moose, Farne, Höhere Pflanzen Prochlorophyten Grünalgen Moose, Farne, Höhere Pflanzen Prochlorophyten Cryptophyten Chromophyten Prochlorophyten, Rotalgen RC, Kernantennen alle Komplexe alle Komplexe alle Komplexe alle Komplexe Funktion Lichtsammlung, Ladungstrennung in den RC Absλ max [nm] 1) Emλ max [nm] 1) ~ 440, ~ periphere Antennen Lichtsammlung ~ 460, ~650 ~ 660 periphere Antennen Lichtsammlung ~ 400, ( ) periphere (?) Antennen ~ 620 Lichtsammlung ~ 440, ~ 690 ~ 700 β-carotin Xanthophylle 1 ) in vivo Algen, Moose, Farne, Höhere Pflanzen Pflanzen alle Komplexe periphere Antenne Lichtsammlung Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie Lichtsammlung Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie ~ Die präzise Abstimmung der Abstände und Orientierungen der Antennenchromophore zueinander ist insbesonders für den strahlungslosen Energietransfer an die Reaktionszentren entscheidend. Anregungsenergie muß in den Antennen über Distanzen von mehreren 100 Å transferriert werden. Grundsätzlich kann die Weiterleitung von Excitonen in photosynthetischen Antennen über zwei Mechanismen erfolgen, über den Förster- oder den Dexter-Mechanismus. Während der Förster-Mechanismus einen Energietransfer über Entfernungen von bis zu 100 Å erlaubt, ist über den Dexter-Mechanismus nur ein Transfer über kürzere Entfernungen von bis zu 20 Å möglich (SAUER 1986, VAN GRONDELLE et al. 1994). Dem Förster-Mechanismus liegt eine Resonanzinduktion von Dipolen ohne die wirkliche Verschiebung von Elektronen zugrunde, der Mechanismus des Dexter-Transfers hingegen ist ein vollständig anderer (Abb. 2). Hier werden Elektronen zwischen einem Donor-Chromophor und einem Akzeptor-Chromophor getauscht ( Austauschmechanismus ). Aus dem angeregten Zustand des Donors wechselt ein Elektron zum angeregten Zustand des Akzeptors, während ein Elektron aus dem Grundzustand des Akzeptors zum Grundzustand des Donors wechselt (HOLZWARTH 1999). Antennen müssen nicht nur in der Lage sein, Lichtenergie effizient zu

14 Einleitung 14 absorbieren und weiterzuleiten, sondern sie müssen auch überschüssige Energie wieder abgeben können. Wird mehr Lichtenergie von den Antennen absorbiert als durch den Photosyntheseapparat genutzt werden kann, kommt es infolge eines zu hohen Reduktionsgrades der Elektronentransportkette zur Verminderung der Quantenausbeute. Die relativ lange Lebensdauer der angeregten Zustände in den Chromophoren, die ja einerseits entscheidend für die Effizienz der Lichtabsorption ist, birgt zugleich die Gefahr der Bildung von Triplettzuständen. Chlorophylle im Triplettzustand führen zur Bildung reaktiver Sauerstoffe wie Singulett-Sauerstoff, die die oxidative Zerstörung von Pigmenten und Proteinen bedingen (HOLZWARTH 1999). Abb. 2: Mechanismen des Energietransfers in photosynthetischen Antennen. a): Förster-Mechanismus. B): Dexter- Mechanismus. Die kurzen, roten Pfeile symbolisieren die Spin-Zustände der beteiligten Elektronen in den entsprechenden Molekülorbitalen bzw. Elektronenzuständen (horizontale Linien). Die roten gebogenen Pfeile geben den Übergang der entsprechenden Elektronen an, die beim Energietransfer beteiligt sind. Eine große Bedeutung bei der Dissipitation überschüssiger Energie wird den Carotinoiden zugeschrieben (SIEFERMANN-HARMS 1987, DEMMING-ADAMS 1990, YOUNG 1991, NIYOGI 1999). Carotinoide sind sowohl in photosynthetischen Antennen als auch in den Reaktionszentren vorhanden. Sie vermögen nic ht nur als Lichtsammlerpigmente zu fungieren, sondern auch mit Triplett-Chlorophyll oder Singulett-Sauerstoff zu reagieren und die übernommene Energie als Wärme abzugeben (SIEFERMANN-HARMS 1987, YAMAMOTO & BASSI 1996). Der zugrunde liegende molekulare Mechanismus, der in den Antennen das Umschalten zwischen Energietransfer und Energiedissipitaion steuert, ist aber noch nicht verstanden (HORTON, 1996). Auch durch die variable Umverteilung von Anregungsenergie zwischen den Photosystemen kann ein zu hoher Energietransfer zu den Reaktionszentren verhindert werden. Die Phosphorylierung der Trimere bildenden Lichtsammelproteine Lhcb1 und Lhcb2 im N-terminalen Bereich (BENNETT 1991, ALLEN 1992, ALLEN & NIELSON 1997) führt bei Pflanzen zur Ablösung dieser

15 Einleitung 15 Proteine von der peripheren Antenne des PSII (SCHUSTER et al. 1986). Diese Proteine migrieren dann von den Grana- in die Stromabereiche des Thylakoidsystems und lagern sich dort an das PSI an (MCCORMAC et al. 1994), wo sie wieder als Antennen fungieren. Die Veränderung der Verteilung der Trimere des Lichsammelkomplexes II (LHCII) 1) zwischen den Photosystemen wird auch als state transitions bezeichnet (ANDERSON 1986, ANDERSON & ANDERSON 1988, MELIS 1991, ALLEN 2001) Antennensystemtypen und ihre Verbreitung Äußere Antennen lassen sich generell in membranextrinsiche und membranintrinsische Antennen unterscheiden. Membranextrinsiche Phycobilinantennen finden sich in Cyanobakterien, Cryptophyceen und Rotalgen. Nur durch einen kleinen Membrananker sind diese Antennen mit den photosynthetischen Membranen verbunden. Aufgrund der spektralen Eigenschaften der gebundenen Phycobiline können membranextrinsische Antennen grünes Licht effizienter nutzen, als dies membranintrinsischen Antennen vermögen. Diese hingegen benötigen viel weniger Protein pro Chromophor als membranextrinsiche Antennen und können aufgrund ihres hohen Chromophor zu Protein-Verhältnisses mit relativ geringem Aufwand an Proteinsynthese hohe Absorptionskapazitäten erreichen. Die Chromophoren membranintrinsischer Antennen sind verschiedene Chlorophylle und Carotinoide. Membranintrinsische Chlorophyll a/b bindende Antennen sind für prokaryotische Prochlorophyten sowie für eukaryotische Chlorophyten, Moose, Farnpflanzen und Höhere Pflanzen charakteristisch. Fucoxanthin Chlorophyll a/c bindende Antennensysteme finden sich in Chromophyten. 1.3 Membranintrinsische Lichtsammelkomplexe (LHCs) der Pflanzen Lichtsammelproteine mit drei membrandurchspannenden Helices bilden die mit den Kernkomplexen der Photosysteme der Pflanzen assoziierten Lichtsammelkomplexe, die als LHCs (light harvesting complexes) bezeichnet werden. Die kerncodierten, verschiedene Chlorophylle und Carotinoide bindenden Lichtsammelproteine dieser LHC-Komplexe zeichnen sich durch einen hohen Grad an Sequenzhomologie aus. Deshalb werden sie als eine Proteinfamilie und die zugehörigen Gene als Genfamilie angesehen (GREEN et al. 1991, GREEN & DURNFORD 1996). Die Kurzbezeichnung für die Mitglieder der Proteinfamilie lautet Lhc- 1) der LHCII ist die periphere Antenne des PSII bei Pflanzen (siehe auch 1.3)

16 Einleitung 16 Proteine, abgeleitet von der englischen Bezeichnung Light harvesting chlorophyll proteins (PICHERSKY & JANSSON 1996). Zu bedenken ist, daß der Begriff Lhc-Proteine weiter gefaßt ist und ebenfalls die chloroplastencodierten Chl a bindenden Lichtsammelproteine der Kernkomplexe (innere Antennen), die einer eigenen Proteinfamilie zugehören, mit einschließt. Die strukturellen und funktionellen Gemeinsamkeiten der kerncodierten Lhc-Proteine lassen die Entwicklung aus einem gemeinsamen Vorläufer vermuten (DURNFORD et al. 1999). MULKIDJANIAN & JUNGE (1997) postulieren die Entwicklung der Reaktionszentren und membranintrinsicher Lichtsammelproteine aus einem Vorläuferprotein mit zehn membrandurchspannenden Helices, wie es noch im Reaktionszentrum der Heliobacteriaceae konserviert ist. Dieses Protein soll ursprünglich als UV-Protektor fungiert haben. Nach der Endosymbiontentheorie sind Chloroplasten aus von Eukaryoten inkorporierten Cyanobakterien hervorgegangen. Ob LHCs bzw. ihre Proteine bereits in Cyanobakterien entwickelt wurden, ist unklar. Die charakteristischen Antennen der Cyanobakterien, die Phycobilisomen, sind membranextrinsiche Antennen. Zwar wurden in Cyanobakterien erst kürzlich zusätzliche membranintrinsiche Antennen um das PSI nachgewiesen (BOEKEMA et al. 2001, BIBBY et al. 2001), bei diesen handelt es sich jedoch nicht um LHCs. Die Proteinkomponente dieser unter Eisenmangelbedingungen identifizierten intrinsischen Antenne bindet Chl a und weist starke Sequenzhomologie zur CP43 Untereinheit der Kernantenne um das PSII auf. Bei Rotalgen jedoch, die ebenfalls Phycobilisomen als äußere Antennen nutzen, konnten LHCs nachgewiesen werden (WOLFE et al. 1994, TAN et al a, TAN et al b). Diese sind spezifisch mit dem PSI assoziiert (MARQUARDT & RHIEL 1997). Die Proteine dieser LHCs lassen sich aufgrund der vorhandenen Sequenzhomologie der Proteinfamilie der kerncodierten Lhc- Proteine zuordnen. Dies läßt vermuten, daß diese Proteine vor der getrennten Entwicklung der Rot- und Grünalgen entstanden sind. Die Coexistenz von Phycobilisomen und LHCs unterstützt allerdings nachhaltig den gemeinsamen evolutionären Ursprung aller Chloroplasten (DURNFORD et al. 1999). Auch die erst vor wenigen Jahren entdeckten, zu den Cyanobakterien zählenden Prochlorophyten weisen aufgrund ihrer Chromophorzusammensetzung auf eine direkte Verwandschaft der Cyanobakterien und Chloroplasten hin. Prochlorophyten besitzen anstelle von Phycobilisomen Chlorophyll a/b bindende Antennen (PALENIK & HASELKORN 1992, MATTHIJS et al. 1994, POST & BULLERJAHN 1994). Allerdings handelt es sich nicht um LHCs. Die Chlorophyll a/b bindenden Proteine dieser Antennen weisen starke Sequenzhomologie zu den Proteinen der IsiA Gene des Cyanobakteriums Synechococcus sp. PCC7942 auf (LA ROCHE et al. 1996). Diese wiederum sind dem Chl a bindenden CP43 Protein Höherer Pflanzen verwandt.

17 Einleitung Chlorophyll a/b bindende Proteine Seit der ersten Isolierung eines Chlorophyll a/b bindenden (CAB) Proteins durch THORNBER (1975) sind zahlreiche CAB-Proteine einschließlich der sie codierenden Gene (cab-gene) beschrieben und charakterisiert worden. Zehn verschiedene Typen lassen sich unterscheiden (JANSSON et al. 1992, JANSSON 1994), wovon vier ausschließlich mit PSI und sechs in der Regel mit PSII assoziiert sind. Sie sind die Genprodukte der kerncodierten Lhc-Gene und tragen die Bezeichnung Lhca1-Lhca4 für die mit PSI bzw. Lhcb1-Lhcb6 für die mit PSII assoziierten Proteine. Zwei weitere Gensequenzen, Lhca5 und Lhca6, wurden für Arabidopsis thaliana beschriebenen und lassen die Existenz weiterer CAB-Proteine vom Lhca-Typ vermuten (JANSSON 1999). Abbildung 3 zeigt die derzeitigen Modellvorstellungen zur Organisation der verschiedenen Antennenpigmente des PSI bzw. des PSII bei Höheren Pflanzen. Zahlreiche verschiedene Nomenklaturen haben sich im Zuge der Erforschung der CAB-Proteine ergeben, die leider nur unnötig verwirren. Tabelle 2 gibt eine Übersicht über die verschiedenen Nomenklaturen. In der vorliegenden Arbeit wird in der Regel die Nomenklatur von JANSSON (1994) verwendet. Tab. 2: Nomenklaturen für die zehn verschiedenen Typen von CAB-Proteinen Gen GREEN et al THORNBER et al BASSI et al JANSSON 1994 Lhca1 Type I LHCI LHC Ib LHCI-730 Lhca1 Lhca2 Type II LHCI? LHCI-680 Lhca2 Lhca3 Type II LHCI LHC Ia LHCI-680 Lhca3 Lhca4 Type IV LHCI LHC Ib LHCI-730 Lhca4 Lhcb1 Type I LHCII LHC IIb 28 kda LHCII Lhcb1 Lhcb2 Type II LHCII LHC IIb 27 kda LHCII Lhcb2 Lhcb3 Type II LHCII LHC IIb 25 kda LHCIIa Lhcb3 Lhcb4 Type II CP29 LHC IIa CP29 Lhcb4 Lhcb5 Type I CP29 LHC IIc CP26 Lhcb5 Lhcb6 CP24 LHC IId CP24 Lhcb6

18 Einleitung 18 A B Abb. 3: Modellvorstellung zur Organisation der Antennenproteine des PSI (A) bzw. PSII (B) am Beispiel Höherer Pflanzen (A: aus SCHELLER et al. 2001; B: aus JANSSON 1994) Struktur Jedes der zehn verschiedenen CAB-Proteine besitzt vier α-helicale Domänen: drei membrandurchspannende, von denen die erste und die dritte homolog zueinander sind und eine vierte, viel kürzere und Lumen exponierte. Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung der Struktur des Lhcb1-Proteins der Erbse, dessen atomare Struktur von KÜHLBRANDT und Mitarbeitern (1994) durch Elektronenbeugung an zweidimensionalen Kristallen bestimmt wurde. Aufgrund der hohen Sequenzübereinstimmung der verschiedenen CAB-Proteine wird diese Kristallstruktur als Strukturmodell für alle CAB-Proteine herangezogen. Die erste und die dritte Helix durchspannen die Thylakoidmembran in einem Winkel von ca. 45 zueinander und werden durch Arginin -Glutamin Salzbrücken zusammengehalten. Eine Folge von 22 Aminosäuren, die auch als LHC-Motiv bezeichnet wird, ist in diesen Helices hoch konserviert. Die Konsenssussequenz für dieses Sequenzmotiv lautet: ELINGRLAMLGFGFLVPELIT. Fast sämtliche an der Chlorophyllbindung beteiligten Aminosäuren sind in dieser hydrophoben Region lokalisiert. Bei der Chlorophyllbindung selbst spielen neben Koordinationen mit den Aminosäuren Histidin, Glutamin und Asparagin auch

19 Einleitung 19 Pigment/Pigment-Wechselwirkungen eine wichtige Rolle. Eine weitere Bindungsstelle für Chlorophylle, vermutlich für Chl b ist in der vierten, Lumen exponierten Helix lokalisiert (KÜHLBRANDT et al. 1994). Zwei eng mit den Helices eins und drei assoziierte Carotinoid-Moleküle stabilisieren die Gesamtstruktur. 1) Bei diesen handelt es sich um zwei Lutein-Moleküle (BASSI et al. 1993, KÜHLBRAND et al. 1994). Abb. 4: Schematische Darstellung der Struktur des Lhb1-Moleküls nach KÜHLBRANDT und Mitarbeitern (1994). Die schraubenförmigen Bänder stellen die α-helicalen Bereiche des Proteins dar, dünne Fäden die verbindenden Loops. Der N-Terminus ist links oben und dem Stroma zugewandt, der C-Terminus links unten und dem Thylakoidlumen zugewandt. Die Zuordnung der Chlorophylle (Chl a schwarz, Chl b rot) und ihre Orientierungen sind bisher noch nicht gesichert. CAB-Proteine besitzen außer den beiden Bindungstellen in der ersten und der dritten transmembranen Helix noch weitere Carotinoid-Bindungsstellen, die zum Teil keine ausgeprägte Spezifität für ein bestimmtes Carotinoid zeigen. Neben β-carotin können sie die Xanthophylle Neoxanthin, Violaxanthin und Lutein binden (SIEFERMANN-HARMS 1985, BASSI et al. 1993, YAMAMOTO & BASSI 1996, BASSI & CAFFARRI 2000). Unterschiede zwischen verschiedenen CAB-Proteinen bestehen sowohl was die Anzahl der gebundenen Chlorophylle als auch die Art der gebundenen Carotinoide betrifft. So enthält ein Lhcb1-Molekül mindestens 12 Chlorophylle: 7 Chl a und 5 Chl b Moleküle (KÜHLBRANDT et al. 1994), während ein Lhcb4 Polypeptid nur 8 Chlorophylle bindet (6 Chl a, 2 Chl b) (SANDONA et al. 1998). 1) Die transmembrane Helix der CAB-Proteine werden vom Strukturmodell der Erbse abgeleitet und auch wie folgt bezeichnet: 1. Helix = B, 2. Helix = C, 3. Helix = A, 4. Helix = D.

20 Einleitung Ausgewählte Eigenschaften In Anbetracht der ca. 350 Millionen Jahren konservierten, sehr komplexen Organisation der Antennensysteme liegt die Vermutung nahe, daß jedem einzelnen CAB-Protein eine besondere Funktion zukommt (JANSSON 1994). Seitens der differenzierten Funktionen der einzelnen CAB- Proteine besteht jedoch noch ein enormer Aufklärungsbedarf. Es folgt eine kurze Zusammenstellung ausgewählter Eigenschaften der verschiedenen Mitglieder der CAB- Proteinfamilie. Lhca1-4 Die vier CAB-Proteine Lhca1, Lhca2, Lhca3 und Lhca4 bilden den Lichtsammelkomplex I (LHCI), die periphere Antenne des PSI von Pflanzen. Aufgrund der jeweils typischen Maxima im Fluoreszenzemissionsspektrum bei 77 K wird zwischen zwei verschiedenen Lichtsammelkomplexen unterschieden, dem LHCI-680 und dem LHCI-730. Die mit 22 kda und 21 kda zu den kleineren CAB-Proteinen zählenden Lhca1- und Lhca4-Proteine bilden zusammen den Subkomplex LHCI-730. Die Bestandteile des LHCI-680 sind die Antennenproteine Lhca2 und Lhca3 (KNOETZEL et al. 1992). Die exakte Position und die Anzahl der Dimere an Lhca Proteinen, die den LHCI bilden, konnte jedoch bislang noch nicht ermittelt werden (JANSSON 1999). Nach der derzeitigen Modellvorstellung sind sämtliche Lhca-Proteine asymmetrisch auf einer Seite des PSI-Kernkomplexes lokalisiert (siehe Abb. 3). Für die Ausbildung des Heterodimers aus Lhca1 und Lhca4 wird Chlorophyll b benötigt (SCHMID et al. 1997). BOSSMANN und Mitarbeiter (1997) zeigten, daß Lhca4 als einziges LHCI- Protein in der Chlorophyll b-freien Gerstenmutante chlorina-f2 f2 nicht stabil ist. Das Lhca 4- Protein gehört damit zusammen mit dem Lhcb1- und dem Lhcb6-Protein des PSII zu den Antennenproteinen, die Chlorophyll b für die vollständige und stabile Insertion in die Thylakoidmembran benötigen. Lhcb1-3 Der Lichtsammelkomplex II (LHCII), der mit dem Kernkomplex des PSII assoziiert ist, wird durch die Antennenproteine Lhcb1-Lhcb6 gebildet. Während Lhcb1 und Lhcb2 bzw. Lhcb1, Lhcb2 und Lhcb3 gemischte Trimere bilden und an der Peripherie der äußeren PSII-Antenne lokalisiert sind, gruppieren sich die als Monomere vorliegenden Antennenproteine Lhcb4, Lhcb5 und Lhcb6 eng um den Kernkomplex (PETER & THORNBER 1991a, BASSI et al. 1993). Trimerer LHCII kann im Rahmen von den sogenannten state transitions, über welche die Verteilung der Anregungsenergie unter den Photosystemen reguliert wird (WANG & MEYERS 1974) als Antenne

21 Einleitung 21 für beide Photosysteme fungieren. Alle rdings werden nur Homotrimere aus Lhcb1 sowie Heterotrimere aus Lhcb1 und Lhcb2 von PSII abgekoppelt. Trimere, die Lhcb3 enthalten, verbleiben an PSII (THORNBER et al. 1994, JANSSON 1999). Dies mag damit zusammenhängen, daß Lhcb3 im Gegensatz zu Lhcb1 und Lhcb2 nicht phosphorylierbar ist. Das Lhcb1-Protein ist das häufigste Protein in Thylakoidmembranen (JANSSON 1994) und bindet rund die Hälfte aller an der Photosynthese beteiligten Pigmente (KÜHLBRANDT et al. 1994). Lhcb4-6 Eng um den Kernkomplex des PSII gruppieren sich die Lichtsammelproteine Lhcb4, Lhcb5 und Lhcb6. Diese CAB-Proteine binden insgesamt weniger Chlorophyll als der trimere LHCII, dafür aber weitaus größere Mengen an Carotinoiden (Tab. 3). So werden von ihnen zb. 80 % des gesamten Violaxanthins im PSII gebunden (BASSI et al. 1993). Aufgrund der hohen Anzahl an gebundenen Carotinoiden kommt diesen CAB-Proteinen wahrscheinlich eine besondere Funktion bei der Dissipitation überschüssiger Anregungsenergie zu (BASSI et al. 1993, GILMORE 1997, NIYOGI 1999). Carotinoide vermögen sowohl Anregungsenergie auf Chlorophylle zu transferieren als auch Anregungsenergie von Chlorophyllen im Triplettzustand zu übernehmen. Letzterer Eigenschaft kommt im Zusammenhang mit dem Xanthophyllzyklus eine besondere Bedeutung zu. Beim Xanthophyllzyklus wird in einem reversiblen, über den lumenalen ph regulierten Prozess Violaxanthin über Antheraxanthin zu Zeaxanthin deepoxidiert. Der Triplettzustand des Zeaxanthins liegt unter dem des Triplett-Chlorophylls und Zeaxanthin kann daher die Anregungsenergie des Triplett-Chlorophylls übernehmen. Das Zeaxanthin, das durch die Aktivität der Violaxanthin-Deepoxidase entsteht, wird zum Teil von den CAB-Proteinen Lhcb4 und Lhcb5 gebunden (VERHOEVEN et al. 1999). Ein Großteil verble ibt jedoch frei in der Lipidphase, wo es Lipide vor der Peroxidation schützt (HAVAUX & NIYOGI 1999). Die Zunahme des Gesamtgehaltes an Xanthophyllen bei Pflanzen, die sich an Starklichtstandorte anpassen, legt eine protektive Funktion der Xanthophyllzykluspigmente nahe (THAYER & BJÖRKMANN 1990, SCHÄFER et al. 1994). BERGANTINO und Mitarbeiter (1995) zeigten an Mais, daß das Lhcb4-Protein bei Licht- und Kältestreß phosphoryliert. Da Mais-Linien mit einer geringeren Fähigkeit zur Phosphorylierung des Lhcb4 auch empfindlicher auf Licht und Kältestress reagieren (MAURO et al. 1997) wird dem Lhcb4 eine besondere Funktion bei der Anpassung an derartige Streßsituationen zu gesprochen. Über die spezifischen Funktionen des Lhcb6 ist noch wenig bekannt.

22 Einleitung 22 Tab3: Anzahl der mit verschiedenen CAB-Proteinen des PSII assoziierten Chromophore (nach YAMAMOTO & BASSI 1996). Angegeben wurde die aus experimentellen Werten errechnete Anzahl der Moleküle pro Polypeptid. Protein Chl a Chl b β-carotin Lutein Neoxanthin Violaxanthin Referenz Trimerer LHCII a,b Lhcb a,c Lhcb a,d Lhcb a,d a) BASSI et al. 1993, b) KÜHLBRANDT et al. 1994, c) DE VITRY et al. (1984), d) PETER & THORNBER (1991a) PsbS Das ebensfalls Chl a und Chl b bindende PsbS-Protein des PSII weist einige Besonderheiten auf und wird in der Regel deshalb als Verwandter der 10 CAB-Proteine bezeichnet: - So zeichnet es sich durch vier transmembrane Helices statt der sonst typischen drei aus. Drei dieser Helices weisen Homologie zu denen der CAB-Proteinen auf (GRIMM 1989). - Das PsbS bindet Chl a und b (FUNK et al a) in erheblich geringerer Menge (4-6 Chlorophylle) als andere CAB-Proteine (FUNK et al a) und ist aufgrund der geringen energetischen Kopplung der gebundenen Chlorophylle wahrscheinlich nicht an der Lichtsammlung selbst beteiligt. - Im Gegensatz zu anderen CAB-Proteinen kann das PsbS auch bei Abwesenheit von Chromophoren stabil in die Thylakoidmembran integriert werden (FUNK et al. 1995b). Dem PsbS-Protein wird eine besondere Funktion beim nicht photochemischen Quenching (NPQ) zugeschrieben. Hierunter wird weitläufig die Ableitung überschüssiger Anregungsenergie in Form von Wärme und Fluoreszenz verstanden (OSMOND 1994). LI und Mitarbeiter (2000) zeigten an einer Mutante von A. thaliana, daß die Deletion des psbs-gens zu einer deutlichen Abnahme des NPQ führt. Die Funktionsweise des PsbS-Proteins ist allerdings noch nicht verstanden. Vorstellbar ist, daß über die Ansäuerung des Thylakoidlumens eine Konformationsänderung des Proteins induziert wird. Diese Konformationsänderung bedingt, daß benachbarte PSII-Untereinheiten ebenfalls ihre Konformation ändern. Durch die Konformationsänderung verändern sic h die funktionellen Eigenschaften dieser Untereinheiten dahingehend, daß sie dann in der Lage sind, überschüssige Anregungsenergie abzuleiten. (BASSI & CAFFARI 2000).

23 Einleitung Genfamilie der CAB-Proteine Je nach Species kann die Zahl der Gene, die für ein CAB-Protein kodieren, stark variieren. Die höchste Anzahl ist für das Lhcb1-Gen mit 5-18 Genen beschrieben worden (PICHERSKY & JANSSON 1996), während für die übrigen CAB-Proteine jeweils nur ein oder wenige Gene bekannt sind. Neben den genannten 10 Typen an CAB-Proteinen umfaßt die Genfamilie der CAB-Proteine zahlreiche weitere Mitglieder (Tab. 4). Auch die Gene der sogenannten high light induced proteins (HLIPs) der prokaryotischen Cyanobakterien (DOLGANOV et al. 1995), der early light induces proteins, kurz ELIPs (ADAMSKA et al. 1992) genannt und das PsbS-Protein (KIM et al. 1992, WEDEL et al. 1992) gehören dieser Genfamilie an (GREEN & PICHERSKY 1994). Durch eine Analyse der zahlreichen für A. thaliana existierenden Sequenzen von EST-Klonen (EST = expressed sequence tags ) wurden weitere Mitglieder der Genfamilie identifiziert und diese insgesamt zur Super -Genfamilie ausgeweitet (JANSSON 1999). Neben zwei neuen Lhca-Genen, Lhca5 und Lhca6, wurden weitere Gene für Stress-induzierte Proteins (Seps) entdeckt. Aufgrund der vorhandenen Sequenzhomologien (LHC-Motiv) in einer von zwei transmembranen Helices sind die Gene dieser Proteine der Genfamilie der CAB-Proteine zuzuordnen. Auch ein als HLIP bezeichnetes Protein mit einer transmembranen Helix wurde als neues Mitglied der Lhc- Genfamilie von A. thaliana identifiziert (JANSSON 1999). Die Nomenklatur der neuen Mitglieder sorgt für Verwirrung. So existieren synonyme Bezeichnungen für die Gene der Sep-Proteine, die einerseits als Sep1-3 (ADAMSKA 2001), aber auch als Lil3-5 (JANSSON 1999) bezeichnet werden. Gleiches gilt für die Gene der ELIPs 1 und 2, die einerseits als Elip1-2 (ADAMSKA 2001) andererseits als Lil 1-2 bezeichnet werden. Es sei darauf verwiesen, daß in dieser Arbeit im folgenden die Nomenklatur von ADAMSKA (2001) verwendet wird. ADAMSKA (2001) nimmt eine Gliederung der Familie der Elip-Proteine in drei Gruppen vor: (1) Proteine mit drei transmembranen Helices: ELIPs (2) Proteine mit zwei transmembranen Helices: Seps (3) Proteine mit einer transmembranen Helix: HLIPs, Scps (small cab like proteins), Ohps (one helix proteins)

24 Einleitung 24 Tab. 4: Mitglieder der cab- Super -Genfamilie von A. thaliana (JANSSON 1999). Gen Protein Aminosäuren des Proteins mit Transitpeptid Aminosäuren des Proteins ohne Transitpeptid Lhca1 Lhca Lhca2.1 Lhca Lhca3 Lhca Lhca4 Lhca Lhca5 Lhca Lhca6 Lhca Lhcb1.1 Lhcb Lhcb1.2 Lhcb Lhcb1.3 Lhcb Lhcb1.4 Lhcb Lhcb1.5 Lhcb Lhcb2.1 Lhcb Lhcb2.2 Lhcb Lhcb2.3 Lhcb Lhcb2.4 Lhcb Lhcb3 Lhcb Lhcb4.1 Lhcb Lhcb4.2 Lhcb Lhcb4.3 Lhcb Lhcb5 Lhcb Lhcb6 Lhcb PsbS PsbS Elip1 ELIP Elip2 ELIP Hlip HLIP Sep1 Sep Sep2 Sep Sep3 Sep Evolution der cab-genfamilie Die derzeitige Vorstellung zur evolutionären Entwicklung der cab-genfamilie beruht auf der Sequenzähnlichkeit in den Helix-Bereichen zwischen den cyanobakteriellen HLIPs einerseits und den verschiedenen CAB-Proteinen andererseits (DOLGANOV et al. 1995). Ausgehend von einem HLIP ähnlichen Protein (eine transmembranen Helix) soll durch zwei interne Genduplikationen ein Protein mit vier Helices entstanden sein. Die Reduktion einer Helix im Verlauf der Evolution habe dann zu den heutigen Lhc-Proteinen mit drei transmembranen

25 Einleitung 25 Helices geführt (GREEN & PICHERSKY 1994, MONTANE & KLOPPSTECH 2000). Ein CAB-Protein mit vier transmembranen Helices ist das PsbS. Drei seiner Helices weisen Homologien zu den Helices der CAB-Proteinen mit drei transmembranen Helices auf. Durch die Identifizierung der Seps mit ihren zwei transmebranen Helices konnte inzwischen auch das letzte fehlende Glied, an dem diese Modell bisher krankte, nachgewiesen werden. 1.4 Fragestellung und Zielsetzung Untersuchungen zu Chlorophyll a/b bindenden Lichtsammelproteinen und ihrer Organisation in den Antennenkomplexen erstreckten sich bisla ng vorwiegend auf Höhere Pflanzen und einige wenige Algengruppen. Da sich in allen Höheren Pflanzen 10 verschiedene Typen an CAB- Proteinen und ihre Gene finden, muß jedem Proteintyp wohl seit mehr als 350 Millionen Jahren eine besondere Funktion innerhalb der Antennenkomplexe zukommen. Ansonsten wären im Verlauf der Evolution wohl einige der verschiedenen Lhc-Gene verloren gegangen (JANSSON 1994). Welche differenzierten Funktionen ein jedes der CAB-Proteine innerhalb der Antennenkomplexe erfüllt, ist jedoch erst ansatzweise verstanden. Zu einem besseren Verständnis kann unter anderem das Wissen von der molekularen Evolution der sie codierenden Genfamilie beitragen. Landpflanzen und Grünalgen begründen sich auf einen gemeinsamen Ursprung und bilden eine monophyletische Gruppe (CAVALIER-SMITH 1981). Während eine Fülle an Sequenzdaten für CAB-Proteine von Samenpflanzen vorliegen und auch für Grünalgen vermehrt Nukleotidsequenzen gewonnen werden (TERAMOTO et al. 2001), existieren für Bryophyten nur wenige Sequenzen. Für ein komplettes Bild zur Evolution der cab-gene bedarf es aber ebenfalls der Sequenzdaten von Bryophyten, insbesonders da sie erste Landpflanzen repräsentieren (MISCHLER 1994, KENRICK et al. 1997). Bryophyten spalteten sich in der phylogenetischen Entwicklung früh von den Farnpflanzen ab, aus denen sich die Samenpflanzen entwickelten (KRANZ et al 1995, BHATTACHARAYA & MEDLIN 1998). Interessant ist es zwischen den Eigenschaften der CAB-Proteine der Grünalgen, Bryophyten und der Samenpflanzen zu vergle ichen. Abweichende Eigenschaften könnten helfen die differenzierten Funktionen der einzelnen Typen an CAB-Proteine besser zu verstehen. Ferner ist es interessant zu wissen, wann die komplexe Organisation der Antennensysteme und die Funktionen einzelner CAB-Proteine im Verlauf der Evolution festgelegt wurden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es für das Lebermoos M. polymorpha die Zusammensetzung der Genfamilie der kerncodierten Lhc-Gene zu ermitteln. Aufbauend auf Vorarbeiten von KILIAN und Mitarbeitern (1998) die bereits mittels biochemischer Methoden wichtige Informationen zur Antennenorganisation des PSII dieses Bryophyten sammeln konnten, sollte durch die

26 Einleitung 26 Klonierung, Sequenzierung und Analyse der Genexpression der einzelnen Mitglieder dieser cab- Genfamilie zum einen das lückenhafte Wissen zur Evolution dieser Genfamilie komplementiert werden. Weiterhin sollte auf molekularer Ebene Datenmaterial gewonnen werden, das das bisher erlangte Verständnis zur Antennenorganisation dieses Bryophyten erweitert und untermauert.

27 27 2 Material und Methoden 2.1 Pflanzenmaterial und Pflanzenanzucht Thalluskulturen von M. polymorpha Alle Experimente wurden mit steril angezogenen in vitro Kulturen von M. polymorpha durchgeführt. Das Ausgangsmaterial bildeten sterile Thalluskulturen, die Prof. Becker von der Universität Saarbrücken freundlicherweise zur Verfügung gestellt hatte, bzw. eigens aus Sporen angelegte Sterilkulturen. Diese Kulturen wurden kontinuierlich in Abständen von Wochen subkultiviert Kulturbedingungen Stammkulturen von M. polymorpha wurden mixotroph angezogen, während für die Experimente ausschließlich autotroph gewachsenes Pflanzenmaterial verwendet wurde. Die Anzucht erfolgte unter den von ADAM (1992) ermittelten optimalen Wachstumsbedingungen. Als Kulturgefäße dienten für mixotrophe Kulturen 250 ml Erlenmeyerkolben, die mit Cellulosestopfen und Kappen aus Aluminiumfolie verschlossen waren. Die Kolben enthielten jeweils 70 ml mit 0.9 % (w/v) Agar Agar verfestigtes und mit 1 % (w/v) Saccharose angereichertes Nährmedium. Als Nährmedium diente ein leicht modifiziertes GAMBORG-Medium (GAMBORG et al. 1968). Die Veränderung gegenüber dem Originalmedium bestand im Austausch der Spurenelementekonzentrationen gegen die des MSK2-Mediums von KATOH und Mitarbeitern (1980). Phototrophe Thalli wurden wie bei WÖLFEL (1998) beschrieben in transparenten Plastikgefäßen (Lifeline, Osmotek, Rehovot, Israel) kultiviert, die mit transparenten Kunststoffdeckeln verschlossen und mit 400 ml Nährmedium gefüllt waren (Abb. 5). Den Gasaustausch mit der Umgebung ermöglichte eine in den Deckeln vorhandene, luftdurchlässige Membran. Zur vegetativen Vermehrung der Kulturen wurden entweder 1-2 cm 2 große Thallusstücke von einem mindestens vier Wochen alten Thallus steril entnommen und in die Erlenmeyerkolben überführt oder mehrere mit einer Pinzette vorsichtig von der Thallusoberseite entfernte Brutbecher auf das Kulturmedium übertragen. Für die Anzucht phototrophen Pflanzenmaterials wurden vier ca. 10 mm 2 große Thallusstücke randständig auf einer flüssigkeitsdurchlässigen Membran (Liferaft, Osmotek, Rehovot, Israel) plaziert, die mit Hilfe eines Schwimmkörpers (Osmotek, Rehovot, Israel) auf der Oberfläche der Nährlösung schwamm. Die Kultur erfolgte in einer Klimakammer

28 Material und Methoden 28 bei 20 C unter Langtagbedingungen (16 h Licht, 8 h dunkel) bei einer konstanten Quantenflußdichte von 30 µmol m -2 s -1. Die Lichteinstrahlung erfolgte durch Leuchtstoffröhren (L18W/20 Hellweiß Lumilux; Osram, Berlin, Deutschland) von oben. Die Lichtintensität wurde mit Hilfe eines Quantumsensors (Li-cor 189, Walz, Effeltrich, Deutschland) ermittelt. Dazu wurde der Quantumsensor in die Kulturbehälter gelegt und diese mit dem entsprechenden Deckel bzw. Stopfen verschlossen. Die für die Experimente verwendeten phototrophen Thalli waren zwischen 4 und 6 Wochen alt. Abb. 5: phototroph kultivierte M. polymorpha-thalli. Die Thalluslappen sind durch die Rhizoide an einer auf der Nährlösung schwimmenden flüssigkeitsdurchlässigen Membran verankert Anlage von Sterilkulturen Sporen im Innern einer Sporenkapsel liegen steril vor. Dies erweist sich als sehr vorteilhaft bei der Anlage neuer Sterilkulturen aus Sporen. Sporenkapseln von M. polymorpha wurden auf dem Gelä nde der Universität Bremen gesammelt und zur Oberflächensterilisierung für 10 min in 2 % (w/v) NaOCl-Lösung inkubiert. Nach mehrmaligem Spülen mit sterilem Wasser wurden die Sporenkapseln unter aseptischen Bedingungen (Heraeus Lamin Air, TL3048, Heraeus Instruments, Hanau, Deutschland) geöffnet und die Sporen auf sterilem, mit 0.9 % (w/v) Agar Agar verfestigtem Nährmedium ausgesät. Die sich aus den Sporen entwickelnden Gametophyten wurden in der zuvor beschriebenen Verfahrenweise (siehe ) vegetativ vermehrt. Die neu angelegte Sterilkultur unterschied sich weder im Habitus noch im Chlorophyll a/b Verhältnis von den schon vorhandenen Sterilkulturen und zeigte ein vergleichbares Wachstumsverhalten.

29 Material und Methoden Starklichtexposition Bei der Untersuchung von Starklichteffekten an der intakten Pflanze ist zu berücksichtigen, daß Effekte meist inhomogen auf das Gewebe verteilt sind. Mit zunehmender Tiefe im pflanzlichen Gewebe nimmt die Lichtintensität exponentiell ab. Des weiteren können sich einzelne Bereiche der Pflanze bei der Belichtung gegenseitig beschatten. Auch die Gefahr der Austrocknung bei hohen Lichtintensitäten erschwert die Untersuchung von Starklichteffekten, insbesondere wenn die zu untersuchenden Pflanzen an feuchte Standorte angewiesen sind, wie M. polymorpha. Die Wirkungen von Trocken- und Lichtstreß könnten sich überlagern und nicht unterschieden werden. Der Gefahr der Austrocknung wurde durch das gewählte Kulturverfahren (siehe ) begegnet, durch das die ausreichende Versorgung der Thalli mit Nährlösung auch während einer Starklichtexposition gewährleistet blieb. Des weiteren wurde nur Thallusmaterial, das möglichst unbeschattet war, für die Experimente verwendet. Zur Untersuchung von Starklichteffekten wurden vier Wochen alte Thalli in einer auf 20 C temperierten Klimakammer einer Quantenflußdichte von 300 µmol m -2 s -1 ausgesetzt. Die Lichtintensität war damit 10 x höher als bei der Anzucht der Thalli ( ). Als Lichtquelle dienten Halogen-Metalldampflampen vom Typ MT 400 DL IBM (Yor k International, York, USA). Parallel zu den Starklicht exponierten Thalli wurden Thalli einer Quantenflußdichte von 30 µmol m -2 s -1 in der schattierbaren Klimakammer ausgesetzt. Effekte nur aufgrund unterschiedlicher Lichtquellen (Anzucht: Leuchtstoffröhren L18W/20 Hellweiß Lumilux; Osram, Berlin, Deutschland und Starklichtexperiment: Halogen-Metalldampflampen vom Typ MT 400 DL IBM, York International, York, USA) sollten so ausgeschlossen werden. Zur gleichmäßigeren Beleuchtung wurden die Deckel der Kultur gefäße durch Deckel mit einer klaren und durch ein zentrales kleines Membranfeld luftdurchlässigen Suncap-Folie (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland) ausgetauscht. Lichtintensitäten wurden in den Kulturgefäßen, denen die Deckel aufgesetzt waren, mittels eines Quantumsensors (Li-cor 189, Walz, Effeltrich, Deutschland) bestimmt. Als Bezugsgröße diente der Chlorophyllgehalt der Thalli, der bei jeder Probennahme bestimmt wurde (2.2.1). 2.2 Pigmentanalytik Chlorophyllbestimmung Chlorophyllgehalte der Thalli wurden photometrisch anhand von Pigmentextrakten mit N,N- Dimethylformamid (DMF) bestimmt. Die Chlorophyllkonzentration wurde aus den

30 Material und Methoden 30 Absorptionen bei 646.8, und 750 nm anhand der folgenden Gleichungen berechnet (PORRA et al. 1989): Chl a = (A A 750 ) 3.11 (A A 750 ) Chl b = (A A 750 ) 4.88 (A A 750 ) Chl a+b = (A A 750 ) (A A 750 ) Aus den Thalli wurden Scheibchen mit einem Frischgewicht von mg (Ø 5-7 mm) ausgestanzt und mit 1 ml DMF versetzt. Die Extraktion der Pigmente erfolgte im Dunkeln bei 4 C über 24 h. Die Thallusstücke entfärbten sich über diesen Zeitraum vollständig. Anschließend wurden die Extrakte zentrifugiert (14000 x g, 5 min) und die Überstände für die Absorptionsmessungen verwendet. 2.3 Molekularbiologische Methoden Wenn nicht anders vermerkt, wurden Chemikalien und Feinchemikalien für die molekularbiologischen Arbeiten von den Firmen Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Deutschland), oder Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. Alle Arbeiten wurden unter sterilen Bedingungen durchgeführt Bakterienstämme und Vektoren Für die Klonierung von cdna wurden die Phagemid-Vektoren pbluescript II SK(+) und λtriplex2 verwendet. Angaben zu den wichtigsten genetischen Eigenschaften der Vektoren sowie der zur Vermehrung der Vektoren verwendeten Escherichia coli K12 Derivate finden sich in der Tabelle 5. Tab. 5: Eigenschaften der verwendeten Vektoren und Bakterienstämme. Vektor besondere Eigenschaften Referenz pbluescript II SK (+) a) λtriplex2 b) Amp r, lacz, SHORT et al. (1988) high copy number Phagemid-Vektor (2.96 kb) Genebank # X52328[SK(+)] Amp r, lacz, loxp, Clontech (Palo Alto, USA) Phagemid-Vektor (42.3 kb), einfache und effiziente cre-lox Konversion zum Plasmidvektor ptriplex2 (3.59 kb, high copy number Vektor), regulierte Expression der klonierten Insert-DNA möglich

31 Material und Methoden 31 Bakterienstamm Genotyp Referenz E.coli XL1-Blue a) reca1 enda1 gyra96 thi-1 hsdr17 supe44 BULLOCK et al. (1987) rela1 lac [F proab laci q Z M15 Tn10 (Tet r )] c E.coli XL1-Blue MRF a) (mcra)183 (mcrcb-hsdsmr-mrr)173 enda1 JERPSETH et al. (1992) supe44 thi-1 reca1 gyra96 rela1 lac[f proab laci q Z M15 Tn10 (Tet r )] c E.coli BNN132 c) enda1 gyr96 hsdr17 rela1 (lac-proab) ELLEDGE et al. (1988) (F trad36 proa+ prob+ laci q Z M15) λkc (Kan r -cre) a) Stratagene, Heidelberg, Deutschland b) Komponente des SMAR cdna Library Construction Kit, Clontech, Palo Alto, USA c) erhalten von Dr. T. Hiltonen, Universität Umeå, Schweden Anzucht der Bakterien Die verschiedenen E. coli Stämme wurden in LB-Medium (1 % (w/v) Bacto-Tryptone, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % (w/v) NaCl, ph 7.0 mit NaOH) angezogen, dem bei Bedarf nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf mindestens 50 C Antibiotika zugesetzt wurden (Tab. 6). Für die Herstellung von Platten wurde das LB-Medium mit 0.8 % (w/v) Agar Agar verfestigt. Zur Anzucht von E.coli XL1-Blue für die Transduktion von λ-phagen und die Titerbestimmung der cdna Banken enthielt das LB-Medium zusätzlich 10 mm MgSO 4 und 0.2 % (w/v) Maltose. Je nach Präparationsart wurden zur Isolierung von Plasmid-DNA 1.5 ml LB-Medium in 96 well- Kulturplatten (automatisierte Plasmidisolierung, ) oder ml LB-Medium in 13 ml Kunststoffröhrchen mit jeweils einer einzelnen Bakterienkolonie inokuliert. Platten und Flüssigkulturen mit Bakterien wurden über Nacht (12-16 h) bei 37 C inkubiert, mit Ausnahme der Kulturen von E. coli BNN132, die bei 30 C inkubiert wurden. Flüssigkulturen wurden zusätzlich bei 220 rpm geschüttelt. Tab. 6: Konzentrationen der zur Selektion eingesetzten Antibiotika. Antibiotikum Stammlösung Endkonzentration Ampicillin (Amp) 100 mg ml -1 in A. bidest., sterilfiltriert 100 µg ml -1 Tetrazyklin (Tet) 50 mg ml -1 in Ethanol 15 µg ml -1 Kanamycin (Kan) 50 mg ml -1 in A. bidest., sterilfiltriert 50 µg ml Dauerkulturen von Bakterien Zur längerfristigen Lagerung eines Bakterienstammes wurden Stammkulturen in Glycerin angelegt. Die Zellsuspension einer gut gewachsenen Übernachtkultur wurde dazu mit 15 % (v/v) Glycerin versetzt, aliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Derartige Stammkulturen wurden bei 80 C gelagert. Geringe Mengen wurden bei Bedarf entnommen und auf selektierendem Medium ausgestrichen.