Aminosäurestoffwechsel I. Grundlagen und Ammoniak-Stoffwechsel COO- +H 3 C R. Johannes Schmidt; Matthias Schnepper

Transkript

1 Aminosäurestoffwechsel I Grundlagen und Ammoniak-Stoffwechsel OO- 3 N R Johannes Schmidt; Matthias Schnepper

2 Einführung Gliederung: Struktur und Einteilung der Aminosäuren Grundzüge des Aminosäurestoffwechsels Ammoniakstoffwechsel Stoffwechsel der Aminogruppen der Aminosäuren

3 Einführung: Die Aminosäuren besitzen 4 Funktionen im Stoffwechsel der Zellen: 1. als Bausteine für die Biosynthese der Proteine 2. als Aminogruppen- bzw. Stickstoffdonatoren bei der Biosynthese von stickstoffhaltigen Verbindungen 3. als Substrat für die Gluconeogenese ( Glucosehomöostase ) 4. als exzitatorische (anregende) und inhibitorische Neurotransmitter

4 Struktur der Aminosäuren: Aminosäuren mit apolaren Seitenketten: N 3 Glycin Gly; G 3 N 3 Alanin Ala; A Valin Val; V Leucin Leu; L OO- 3 N 3 3 OO- OO- OO- 3 N 3 3 OO- 3 3 N 3 Isoleucin Ile; I OO- OO- S 3 N 3 Methionin Met; M OO- N 3 Phenylalanin Phe; F N Prolin Pro; P OO- N 3 Tryptophan Trp; W N

5 Struktur der Aminosäuren: Aminosäuren mit ungeladenen polaren Seitenketten: O N 3 Serin Ser; S 3 N 3 O Threonin Thr; T N 3 Asparagin Asn; N O N 2 N 3 Glutamin Gln; Q O N 2 S N 3 ystein ys; Se N 3 Selenocystein Sec OO- OO- OO- OO- OO- OO- OO- O N 3 Tyrosin Tyr; Y

6 Struktur der Aminosäuren: Aminosäuren mit geladenen polaren Seitenketten: O O OO- OO- OO- N N N 3 Aspartat Asp; D O N 3 Glutamat Glu; E O N 3 istidin is; N 3 N 3 Lysin Lys; K OO- OO- N N 3 Arginin Arg; R N 2 N 2

7 Einteilung der Aminosäuren: nach Struktur und funktionellen Gruppen in proteinogene und nichtproteinogene Aminosäuren: nicht proteinogen sind z. B. Ornithin (arnstoffzyklus) itrullin (arnstoffzyklus) 5-ydroxytryptophan (Vorstufe von Serotonin) ß-Alanin (Teil von oenzym A) insgesamt sind 21 Aminosäuren proteinogen, mehr als 100 sind nicht proteinogen

8 Einteilung der Aminosäuren: in essentielle und nichtessentielle Aminosäuren: essentiell sind istidin; Isoleucin; Leucin; Lysin; Methionin; Phenylalanin; Threonin; Tryptophan; Valin nichtessentiell sind Alanin; Arginin; Asparagin; Tyrosin; Glutamat; Glutamin; Glycin; Prolin bedingt essentiell sind Serin; ystein nach Biosyntheseweg

9 Grundzüge des Aminosäurestoffwechsels:

10 Tagesumsatz der Aminosäuren: Werte für eine 70 kg schwere Person Stickstoffgleichgewicht bei täglicher Zufuhr von 32 g hochwertigem Protein

11 Zentrale Stellung der Leber: Aufnahme der über die Nahrung resorbierten Aminosäuren Biosynthese von Proteinen Umwandlung von Aminosäuren durch Abspaltung von Ammoniak Bildung von Ketocarbonsäuren Umwandlung von Ammoniak in arnstoff Kontinuierliche Abgabe von Aminosäuren an das Blut (Pufferfunktion)

12 Zentrale Stellung der Leber:

13 Intrazellulärer Aminosäurestoffwechsel: Es bestehen enge Verknüpfungen zwischen Aminosäure-, Fett- und Kohlenhydratstoffwechsel. Durch verschiedene Reaktionen können Aminosäuren z.b. in α- Ketocarbonsäuren wie Pyruvat oder Oxalacetat umgewandelt werden, die dann weiter verstoffwechselt werden können. Besondere Bedeutung für den Aminosäurestoffwechsel hat das Pyridoxalphosphat (PALP). O O O P O 2 N O O 3

14 1. Transaminierung:

15 Austritt eines Protons, das sich an die Schiff sche Base anlagert Stabilisierung der Schiff schen Base durch eine kationische Gruppe des aktiven Zentrums des Enzyms E Bildung einer Schiff schen Base zwischen PALP und der Aminogruppe der Aminosäure PALP (Pyridoxalphosphat)

16 Anlagerung des Protons führt zum Umklappen der Doppelbindung

17 ydrolyse der Schiff schen Base, Freisetzung einer a- Ketosäure PAMP (Pyridoxaminphosphat) Die Aminogruppe der ehem. Aminosäure bleibt kovalent gebunden.

18 PAMP (Pyridoxaminphosphat) Bindung einer anderen a- Ketosäure, Bildung einer Schiff schen Base Austritt eines Protons, das sich an die Schiff sche Base anlagert

19 Anlagerung des Protons führt zum Umklappen der Doppelbindung

20 ydrolyse der Schiff schen Base, Freisetzung einer Aminosäure PALP (Pyridoxalphosphat)

21 E = Aminotransferase bzw. Transaminase

22 2. a-,ß-eliminierung:

23 Bildung einer Schiff schen Base zwischen PALP und der Aminogruppe der Aminosäure (Serin: X = O; ystein: X = S) Stabilisierung der Schiff schen Base durch eine kationische Gruppe des aktiven Zentrums des Enzyms E PALP (Pyridoxalphosphat)

24 Austritt des Protons führt zum Umklappen der Doppelbindung

25 Austritt von X - (Serin: X = O; ystein: X = S)

26 PALP (Pyridoxalphosphat) ydrolyse der Schiff schen Base, Freisetzung einer Aminosäure

27 Bildung von 2 X (Serin: X = O; ystein: X = S) Abspaltung von Ammoniak; ydrolyse zur a-ketosäure

28 E = Dehydratase

29 Weitere PALP-abhängige Decarboxylierung: Reaktionen: Durch Elektronenverschiebung Labilisierung der --Bindung; Abspaltung der arboxylgruppe; ydrolyse der Schiff schen Base bewirkt Freisetzung eines Amins. E = Decarboxylase Aldolspaltung: Durch Elektronenverschiebung Labilisierung der --Bindung zwischen a- und ß--Atom; Freisetzung einer Aminosäure sowie z.b. bei Threonin von Acetaldehyd bzw. bei Serin von einer ydroxymethylgruppe. E = Aldehydlyase bzw. Aldolase

30 Der Ammoniakstoffwechsel:

31 Ammoniak: nach der Definition von Broensted: Base kann biologische Membranen gut passieren liegt bei physiologischem p-wert (7,40 im Blut; 6,0-7,1 in Körperzellen) zu etwa 99% als N 4 vor Gefahr der Alkalisierung des Blutes bei erhöhter Ammoniakkonzentration N Ausscheidung von Ammoniak: nach Umbau durch die Leber als arnstoff (90-95%) als freies Ammoniak (5-10%) mit dem Urin für fast alle Lebewesen essentiell

32 Verwendung von Ammoniak: zur Biosynthese von Aminosäuren (insbesondere Gln, Asp, Gly) Porphyrinen Purinen Pyrimidinen Kreatin (als Phosphat wichtige Energiequelle in Muskeln) Aminozuckern

33 Toxizität von Ammoniak: schwere zerebrale Schäden schon bei geringen Mengen Ammoniakvergiftung: Flattertremor der ände, verwaschene Sprache, Sehstörungen, in schweren Fällen Koma und Tod freies Ammoniak muss kovalent gebunden oder ausgeschieden werden!

34 Entgiftung von Ammoniak: z.b. durch die mitochondrialen Enzyme Glutamatdehydrogenase (GLD, v.a. in der Leber) und die Glutaminsynthetase (in allen Geweben) Reaktion der GLD ist stark durch die freie Energie begünstigt (27,2 kj/mol) keine Rückreaktion = Freisetzung von Ammoniak

35 Pathobiochemie & Therapie: Ammoniak im Pfortaderblut stammt aus dem Stoffwechsel von Mikroorganismen, die Nahrung sowie arnstoff durch das Enzym Urease in Ammoniak und O 2 spalten können. Diagnose (hier am Beispiel einer Infektion mit elicobacter pylori): mittels Atemtest Therapie: mit Lactulose (Disaccharid aus Galaktose und Fructose) Bildung von Lactat, Acetat, Formiat und O 2 Abfall des p-wertes Umwandlung von Ammoniak in Ammoniumionen Ausscheidung der Ammoniumionen mit dem Stuhl mit schwer resorbierbaren Antibiotika wie z.b. Neomycin Eindämmung der Ammoniakproduktion

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37 Aminostickstoff-Stoffwechsel Der Aminostickstoff der Aminosäuren kann durch Transaminierung in anderen Aminosäuren gesammelt werden auptsächlich in Alanin, Aspartat und Glutamat Diese wiederum stellen den Stickstoff für die Biosynthese und arnstoffbiosynthese bereit Alanin, Aspartat und Glutamat bieten sich besonders an, weil ihre α-ketosäuren ständig im Stoffwechsel produziert werden

38 Glutamat als Drehscheibe des Aminostickstoff-Stoffwechsels

39 freies Ammoniak bildet durch Fixierung an α- Ketoglutarat Glutamat Glutamat α-ketoglutarat N 3

40 Die Aminogruppe von Glutamat kann durch reversible Transaminierung auf die α-ketosäure Pyruvat unter Bildung von Alanin übertragen werden Pyruvat Alanin Glutamat α-ketoglutarat Transaminierung ist eine durch Aminotransferasen katalysierte und vollständig reversible Reaktion, bei der eine Aminogruppe von einer Aminosäure (Ketosäure) auf eine Ketosäure (Aminosäure) übertragen wird. N 3

41 Oder die Aminogruppe wird auf die α-ketosäure Oxalacetat unter Bildung der Aminosäure Aspartat übertragen, dessen Aminostickstoff für zahlreiche Biosynthesen und v.a. für die Bildung von arnstoff verwendet wird Pyruvat Alanin Oxalacetat Glutamat α-ketoglutarat Aspartat α-ketoglutarat N 3

42 Durch Fixierung von Ammoniak an Glutamat bildet sich Glutamin (wirkt ebenfalls als Aminostickstoffdonator bei Biosynthesen und beim Stickstofftransport im Blutplasma) -N 3 Glutamin N 3 Pyruvat Alanin Oxalacetat Glutamat α-ketoglutarat Aspartat α-ketoglutarat N 3

43 Aus Glutamat kann überschüssiges Ammoniak durch Desaminierung freigesetzt Pyruvat werden, welches Alanin bei der arnstoffbildung N 3 benötigt wird. Glutamin -N 3 Oxalacetat Glutamat α-ketoglutarat Aspartat α-ketoglutarat N 3 arnstoff

44 N 3 -N 3 Glutamin Pyruvat Alanin Oxalacetat Glutamat α-ketoglutarat Aspartat α-ketoglutarat N 3 Fumarat arnstoff Übertragung der Aminogruppen durch den Aspartatzyklus

45 Aspartatzyklus

46 Im Aspartatzyklus werden die Aminogruppen von der Aminosäure Aspartat unter Bildung eines zwischenzeitlichen Kondensationsproduktes auf Ketoverbindungen übertragen. Neben der aminierten Verbindung entsteht auch Fumarat, welches über Malat und Oxalacetat durch Enzymreaktionen und unter Gewinn eines Reduktionsäquivalent (NAD ) wieder zu Aspartat regeneriert werden kann.

47 Möglichkeiten der Ammoniakfreisetzung: Im Aspartatzyklus durch ydrolyse des Kondensationsproduktes Durch enzymatische Überführung der Aminosäuren (und anderen stickstoffhaltigen Verbindungen) in ein Produkt, das durch Wasser leicht angegriffen werden kann (=N Bindung) Bei den Aminosäuren Serin, Threonin, ystein, istidin und omoserin über den irreversiblen Prozess der Pyridoxalphosphatabhängigen Eliminierung (Nichtdehydrierende Desaminierung). Durch hydrolytischen Abbau der Pyrimidine und Purine Durch Aminosäureoxidasen (in Leber und Niere) werden Aminosäuren irreversibel durch Dehydrierung desaminiert.

48 Ammoniaktransport Alle Organe besitzen einen mehr oder weniger intensiven Aminosäurestoffwechsel, jedoch nur die Leber ist imstande, mit ilfe der arnstoffbildung überschüssiges Ammoniak zu entgiften. Aus diesem Grund wird Ammoniak in Form von Alanin und Glutamin im Blutplasma von den peripheren Organen zur Leber transportiert. Das zur Bildung von Alanin benötigte Pyruvat stammt aus dem Glucoseabbau (Glykolyse). In der Leber wird das Kohlenstoffskelett von Alanin zur Glucoseneubildung, der Aminostickstoff zusammen mit Bicarbonat und Energie zur arnstoffsynthese verwendet (Glucose-Alanin-Zyklus). Das Kohlenstoffgerüst des freigesetzten Glutamins hingegen stammt aus Aminosäuren, und zwar hauptsächlich aus Glutamat und Aspartat. Der Großteil des Glutamins wird nicht wie Alanin in der Leber sondern von Darm- und Nierenzellen aufgenommen.

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50 Ammoniakstoffwechsel von Leber, Gehirn und Nieren Eine zentrale Bedeutung im Stoffwechsel der Aminosäuren besitzt die Leber, da nur sie die enzymatische Ausstattung für eine vollständige Biosynthese von arnstoff aus Ammoniak und Bicarbonat besitzt. Die Synthese von arnstoff erfolgt deshalb, weil Ammoniak eine äußerst toxische Substanz darstellt. Eine 70kg schwere Normalperson bildet täglich etwa 30 g arnstoff. Somit steht die arnstoffbildung im Vergleich zur Biosynthese anderer Stoffe quantitativ an erster Stelle.

51 arnstoffsynthese (Krebs-enseleit-Zyklus): Die arnstoffsynthese läuft in einem auf zwei Zellkompartimente verteilten Zyklus ab. Die ersten beiden Schritte finden im Mitochondrium, die übrigen im ytosol ab.

52 O - N Schritt: (im Mitochondrium) 2 ATP 2 ADP P i arbamylphosphat arbamyl- phosphat- Synthetase I Durch das Enzym arbamylphosphat-synthetase I wird unter Verbrauch von zwei Molekülen ATP aus Bicarbonat und Ammoniak arbamylphosphat gebildet. Unentbehrlicher ofaktor dieser irreversiblen Reaktion ist N-Acetylglutamat, das wahrscheinlich als allosterischer Aktivator wirkt Acetylglutamat- Snthase I O N 2 P N-Acetylglutamat Glutamat Acetyl-oA Da die Mitochondrienmembran zwar für O 2, nicht jedoch für Bicarbonat (O 3- ) permeabel ist, muss O 2 zunächst durch eine arboanhydrase in Bicarbonat überführt werden. Mitochondrium ytosol

53 2 ATP 2 ADP P i Acetylglutamat- Snthase I O - N 3 4 N 2 O P N-Acetylglutamat arbamylphosphat arbamyl- phosphat- Synthetase I N 3 N 3 OO - Ornithin Ornithin- Transcarbamylase 2. Schritt: (im Mitochondrium) Der arbamylrest (N 2 -O-) wird auf ein Trägermolekül (Ornithin) übertragen. Dabei entsteht itrullin (ebenfalls eine nicht proteinogene Aminosäure) und anorganisches Phosphat. P i N 2 O Glutamat Acetyl-oA N N 3 OO - itrullin Mitochondrium ytosol

54 2 ATP 2 ADP P i Acetylglutamat- Snthase I O - N 3 4 N 2 O P arbamyl- phosphat- Synthetase I N 3 N 3 OO - Ornithin N-Acetylglutamat arbamylphosphat Ornithin- Transcarbamylase 3. Schritt: (im ytosol) In diesem Schritt soll eine weitere Aminogruppe übertragen werden; da dies nicht durch eine Transaminierung möglich ist, schließt sich die schon erwähnte Aspartatzyklus-Sequenz an. Dabei kondensiert die arbonylgruppe von itrullin mit der Aminogruppe von Aspartat (Aminogruppendonator) unter ATP Verbrauch. Es entsteht Argininosuccinat. N 2 OO - Glutamat Acetyl-oA Mitochondrium P i N N 2 O N 3 OO - itrullin N 3 Aspartat OO - Argininosuccinat Argininosuccinat- Synthetase 2 OO - ATP N N 3 OO - AMP P Pi 2 O P i P i N 2 OO - ytosol

55 O - N 3 4 N 2 N 2 2 ATP arbamyl- 2 N 4.Schritt: N-Acetylglutamat Synthetase I (im ytosol) 3 phosphat- Die -N Bindung wird reversibel gespalten und es entstehen 2 ADP die Produkte Fumarat und die proteinogene P Aminosäure i Arginin. N 3 Acetylglutamat- OO - Snthase I O Ornithin N 2 P arbamylphosphat Ornithin- Transcarbamylase N N 3 OO - Arginin Arginino- Succinatlyase N 2 OO - - OO Fumarat OO - Glutamat Acetyl-oA Mitochondrium P i N N 2 O N 3 OO - itrullin N 3 Aspartat OO - 2 OO - Argininosuccinat Argininosuccinat- Synthetase ATP N N 3 OO - AMP P Pi 2 O P i P i N 2 OO - Oxalacetat Malat ytosol

56 O - N 3 4 arnstoff O N 2 N 2 O 2 N 2 N 2 Mitochondrium N 3 OO - itrullin N 3 Aspartat OO - Arginase I 2 OO - Argininosuccinat Argininosuccinat- Synthetase ATP N N 2 N 3 OO - AMP P Pi 2 O P i N N 3 OO - Arginin Arginino- Succinatlyase P i N OO - 2 OO - 5. Schritt: 2 ATP (im ytosol) arbamyl- 2 N 3 N-Acetylglutamat der Synthetase I phosphat- Der Kreisprozess arnstoffbiosynthese 2 ADP wird durch P i die hydrolytische N 3 Abspaltung Acetylglutamat- der OO - Snthase I Guanidinogruppe von O Arginin geschlossen. Ornithin Dabei entstehen N P 2 Ornithin- arnstoff und arbamylphosphat den Ornithin. Transcarbamylase Ornithin wird durch Ornithincarrier wieder N ins Mitochondrium P 2 i zurücktransportiert und O dient dort wieder als Glutamat Trägermolekül. 2 N Acetyl-oA Oxalacetat - OO Malat Fumarat OO - ytosol

57 O - N 3 4 arnstoff O N 2 N 2 O 2 N 2 N 2 2 ATP 2 ADP P i Acetylglutamat- Snthase I N 2 O P arbamyl- phosphat- Synthetase I N 3 N 3 OO - Ornithin Ornithin- Transcarbamylase Arginase I N N 3 OO - Arginin N-Acetylglutamat arbamylphosphat Arginino- Succinatlyase N 2 OO - - OO Fumarat OO - Glutamat Acetyl-oA Mitochondrium P i N N 2 O N 3 OO - itrullin N 3 Aspartat OO - 2 OO - Argininosuccinat- Synthetase ATP N N 3 OO - AMP P Pi 2 O P i P i N 2 OO - Argininosuccinat Oxalacetat Malat ytosol

58 Der in der Leber gebildete arnstoff tritt ins Blut über und wird von den Nieren in den Urin ausgeschieden.

59 Energiebilanz des arnstoffzyklus Die Energiebilanz wird durch die Kopplung mit dem Aspartatzyklus bestimmt. Zur Berechnung ist entscheidend, ob der verwendete Stickstoff vorwiegend covalent gebunden (d.h. als Aminogruppe in Alanin, Aspartat oder Glutamat) oder in freier Form (als Ammoniak) vorliegt, da die Fixierung von Ammoniak zur Glutamat- und Aspartatbiosynthese energieabhängig ist Für die Biosynthese eines arnstoffmoleküls aus einem Molekül Ammoniak und der α-aminogruppe von Aspartat werden im arnstoffzyklus drei Moleküle ATP verbraucht, von denen zwei in ADP und Pi und eines in AMP und Pyrophosphat gespalten werden. Da eine Pyrophosphatase das entstandene Pyrophosphat weiter in 2 Pi umwandelt, werden zwar drei Moleküle ATP, jedoch vier energiereiche Bindungen (und damit 4 Mol ATP zur Regeneration) benötig. Bei der Regeneration von Aspartat aus Fumarat wird ein Reduktionäquivalent und damit drei Moleküle ATP gewonnen. In der Bilanz wird für die Biosynthese von 1 mol arnstoff aus einem Mol Ammoniak und der Aminogruppe von Aspartat 1 mol ATP verbraucht.

60 Regulation der arnstoffsynthese Die arnstoffbildung ist proportional zur Aminosäurekonzentration im Blutplasma Jedoch fällt die arnstoffbildung proportional stärker als die Aminosäurekonzentration ab Sie beträgt Null, wenn die Aminosäurekonzentration etwa 4,5 mg/100 ml beträgt (Dadurch wird eine zunehmende Verarmung des Aminosäurepools durch die arnstoffbildung vermieden) arnstoffbildung gesunder Versuchspersonen in Abhängigkeit von der Gesamt- Aminostickstoffkonzentration im Plasma

61 N- Acetylglutamat spielt eine Schlüsselrolle bei der schnell wirkenden Regulation des arnstoffzyklus N-Acetylglutamat In Abwesenheit von N-Acetylglutamat ist die arbamylphosphatsynthetase I vollständig inaktiv. Wahrscheinlich führt ein vermehrtes Aminosäurenangebot über eine rasche Steigerung des Glutamatspiegels zu einer vermehrten Bildung von Acetylglutamat, das als Signalmetabolit wirkt. Dagegen nimmt die Induktion der arnstoffzyklusenzyme bei kontinuierlich hoher Proteinzufuhr oder unter dem Einfluss von Glucocorticoiden Stunden bis Tage in Anspruch.

62 Entgiftung im Gehirn Im Gehirn wird Ammoniak durch Glutamatdehydrogenase und Glutaminsynthetase entgiftet Ammoniak, das im Gehirnstoffwechsels entsteht oder auf dem Blutweg das Gehirn erreicht, wird durch ATP-abhängige Glutaminbildung in den Astrocyten fixiert. Ammoniak ist neurotoxisch!! (Ursache unbekannt) Das zur Ammoniakentgiftung notwendige Glutamat kann nur schlecht die Blut-irnschranke permeieren und muss deshalb neben α-ketoglutarat (Vorstufe von Glutamat) intrazellulär aus anderen Stoffwechselwegen entzogen werden.