B SEROLOGIE ANTIKÖRPER UND KREUZPROBE B - 4 ANTIKÖRPER UND KREUZPROBE ILIAS DOXIADIS UND FRANS CLAAS

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1 B - 4 ILIAS DOXIADIS UND FRANS CLAAS B Einleitung Die Antikörperbildung gegen HLA- oder andere Zelloberflächen-Alloantigenen erfolgt als immunologische Antwort gegen verschiedene Stimulationen wie Schwangerschaft, Bluttransfusion und Organtransplantation. Neben diesen Alloantikörpern können Patienten, die auf eine Organtransplantation warten, auch Autoantikörper im Gefolge ihrer Primärerkrankung oder aufgrund der Behandlung gebildet haben. Im Zuge der Immunisierung kann ein Patient in der Regel Antikörper gegen folgende Antigene gebildet haben: B Anti-Klasse I: Diese Antikörper können gegen ein HLA-Antigen, z.b. HLA-A23 oder gegen ein Epitop gerichtet sein, das auf vielen Antigenen zu finden ist, z.b. HLA-Bw4, HLA-Bw6 bzw. das HLA-A2, B17 Epitop. Ebenfalls kann eine Mischung aus verschiedenen Antikörpern bei einem Patienten vorhanden sein. Eine große Anzahl an Studien hat gezeigt [1,2], daß Antikörper gegen HLA-Alloantigene klinisch relevant sind. B Anti-Klasse II: Antikörper gegen HLA-DR und/oder -DQ können den Ausgang einer Organtransplantation beeinflussen [3]. Andererseits können klinisch nicht relevante Antikörper, die gegen B-Zellen reagieren, die Antikörpersuche erschweren. Diese Antikörper sind in der Regel instabil, reagieren bei niedrigen Temperaturen und gehören üblicherweise der IgM Klasse an. Sie können durch Dithiothreitol (DTT) oder andere reduzierende Reagenzien inaktiviert werden [4]. B Anti-Monozyten: In der Regel sind Anti-Monozyten Antikörper klinisch nicht relevant. Nur solche, die neben Monozyten auch Endothel-Zellen erkennen können, haben eine klinische Relevanz [5]. In der Regel reagieren diese Antikörper nicht gegen Lymphozyten. Ihre Erkennung kann nur durch laborintensive Untersuchungen erfolgen. Dazu werden gezüchtete Endothel-Zellen oder Nabelschnur-Zellen verwendet. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

2 B Anti-Granulozyten: Granulozyten-spezifische Antikörper haben in der Regel keinen Einfluß auf die Organtransplantation. Aber sie können die laborüblichen Screening-Untersuchungen verfälschen (falsch positive Ergebnisse). B Autoantikörper: Diese Antikörper werden so genannt, weil sie mit den eigenen Zellen des Patienten in einem in vitro Test reagieren. Sie können auch eine HLA-Spezifität haben [6]. Bei der Organtransplantation haben sie üblicherweise keine klinische Relevanz, aber sie führen zu falsch positiven Ergebnissen im Screening und in den Kreuzproben [7]. Die Mehrzahl dieser Antikörper gehören der IgM Klasse an und kann durch DTT inaktiviert werden. Durch Absorption mit patienteneigenen Zellen gelingt in manchen Fällen deren Entfernung. B HLA-A,B,C Antikörperscreening Mit dem Antikörperscreening wird versucht, die Spezifität der im Patienten-Serum befindlichen HLA spezifischen Antikörper zu bestimmen. Deswegen ist es auch hilfreich, wenn die HLA-Antigene der jeweiligen Immunogene (Ehepartner, Organspender, Bluttransfusionsspender) bekannt sind. Es bieten sich viele Verfahrensweisen für ein zellgebundenes Screening. Es können Lymphozyten von Blutspendern, Organspendern, Labormitarbeitern oder allgemein von Blutproben, die für HLA Typisierungen ins Labor gebracht werden, verwendet werden. Diese Lymphozyten können frisch oder gefroren sein. Nachstehend ist eine Verfahrensweise wiedergegeben, die sich im Laufe der Zeit als sehr brauchbar erwiesen hat. Screening mit einem Panel von 20 Lymphozyten-Donoren, die die Frequenzen der HLA Klasse I Antigene (HLA-A,B,C) in der Normalbevölkerung reflektieren. Dieses Screening wird mit und ohne Dithiothreitol (DTT) durchgeführt. Die Lymphozyten werden im gefrorenen Zustand aufbewahrt (siehe Methoden, Abschnitt: Einfrieren von Lymphozyten) und bei Bedarf aufgetaut. Dadurch läßt sich sehr viel Zeit und Aufwand vermeiden. Diese Methode gibt einen Hinweis auf die Anwesenheit von Antikörpern und auf die Immunglobulin-Klasse (IgG, IgM) dieser Antikörper. Sie gibt keine verläßliche Information über die HLA Spezifität der Antikörper. Die Reaktivität des Panels (%PRA) reflektiert die Wahrscheinlichkeit auf eine positive Kreuzprobe mit beliebigen Donoren. Screening von Seren mit einem ausgesuchten Panel von 50 Lymphozyten-Donoren. In diesem Panel sind die HLA-Antigene mehrere Male in verschiedenen Kombinationen 56 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998

3 repräsentiert. Die Lymphozyten dieser Donoren sind ebenfalls vorrätig, so daß auch bei Bedarf gerichtete Screenings durchgeführt werden können. Diese Methode gibt eine verläßliche Information über die Spezifität der Antikörper im untersuchten Serum. Die Reaktivität des Serums gegen das Panel (%PRA) ist nicht informativ, weil es sich hier um ausgesuchte Lymphozyten-Donoren handelt. Nachstehend ist die Methode beschrieben, um Zellen einzufrieren und aufzutauen. B Einfrieren von Lymphozyten 1) Ampullen beschriften. 2) Die Ampullen bei Raumtemperatur senkrecht in eine Polystyrenbox stellen. 3) Zu maximal 20 x 10 6 isolierten Lymphozyten werden 0.5 ml 25 % fötales Kälber-Serum (FCS) in RPMI-1640 zugegeben und die Zellsuspension auf schmelzendes Eis gestellt. 4) Das gleiche Volumen kaltes 25% FCS und 20% DMSO in RPMI-1640 zufügen und Ampullen füllen. 5) Die Box mit den Ampullen sofort für 24 Std. bei - 70 C stellen. Anschließend in flüssigem Stickstoff aufbewahren. Die Ampullen können ebenso in einer kontrollierten Weise maschinell eingefroren werden. Die Einfrierrate sollte im Bereich von 1 bis 1,5 C / Min. bis - 30 C sein bei einer vorsichtigen Kompensation am kritischen Kristallisationspunkt (bei rund -18 C) und danach weiterfrieren mit einer Geschwindigkeit von 7 C / Min., bis die Temperatur des flüssigen Stickstoffs erreicht ist. NB DMSO zum spätmöglichsten Zeitpunkt zum RPMI + 25% FCS zufügen und danach das Röhrchen sofort in Eis stellen B Auftauen von Lymphozyten 1) Fötales Kälberserum (FCS) auftauen. 2) Die Ampullen mit Lymphozyten in flüssigem Stickstoff ins Labor bringen. 3) Die Ampullen in ein 37 C Wasserbad stellen und schnell auftauen lassen. 4) Die Zellsuspension in ein Plastik- bzw. silikonisiertes Glasröhrchen übertragen. 5) Das gleiche Volumen an FCS tropfenweise zum Röhrchen zugeben und zwischendurch gut mischen. Etwas DNAse (einige Kristalle) zugeben. 6) Röhrchen bei 1700 rpm (400 x g) zentrifugieren und das Pellet in RPMI % FCS resuspendieren. Die Suspension für 30 Min. bei 37 C stehen lassen. Auf diese Weise erholen sich die Zellen am besten vom Auftauen. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

4 7) Anschließend für 5 Min. bei 1700 rpm zentrifugieren. Einmal mit RPMI % FCS waschen. NB: Frische wie gefrorene Lymphozyten werden im Standard NIH getestet. Die Methode ist im Abschnitt (GME, SW) beschrieben. B DTT-Modifikation B Prinzip Dithiothreitol ist ein Reagenz, daß die Fähigkeit hat, IgM Antikörper zu reduzieren ohne entsprechende IgG Antikörper zu schädigen. Dadurch läßt sich relativ einfach eine Unterscheidung der Antikörper Klasse erreichen. NB. Dithiothreitol inaktiviert (reduziert) in der Regel Antikörper der Klasse IgM. Hierbei werden sowohl Autoantikörper wie HLA spezifische Antikörper betroffen, letztere lassen sich in einem Screening erkennen. B Methodik Zwei Methoden haben sich für die Verwendung von DTT etabliert. B Inkubation von DTT mit Lymphozyten Reagenzien: 0.01 M DTT Lösung in einem Glasröhrchen 1.54 mg D,L Dithiothreitol / ml PBS ph 7,4 D,L Dithiothreitol Sigma no. D-0632, MW 154,2 Gesättigte Cystin Lösung Minimum 4,8 mg L-cystine / ml PBS ph 7,4, abzentrifugieren und Pellet vor dem Einfrieren entfernen. L-cystine Sigma no. C-8755, MW 240,3 NB Die Lösungen können für 14 bis 21 Tage bei 4 o C oder für 6 Monate bei - 20 o C aufbewahrt werden. Durchführung: 1) Mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut wie üblich isolieren. 2) Unter Öl wird in eine Terasaki-Platte 1 µl der zu testenden Seren gegeben. Es werden zwei Platten vorbereitet (eine mit und eine ohne DTT = Kontrolle). 3) Zwei Röhrchen beschriften und die gewonnenen Zellen verteilen. 4) Abzentrifugieren und die Zellen entweder in der DTT Lösung oder in Medium aufnehmen 5) Je 1 µl der Zellsuspensionen in die jeweiligen Platten zugeben und für 30 Min. bei 37 o C inkubieren. 58 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998

5 6) Zu der DTT-Platte 1 µl Cystin und sofort 5 µl Komplement zugeben. 7) Bei Raumtemperatur für weitere 60 Min. inkubieren. 8) Färben, fixieren und ablesen wie üblich (vgl. Abschnitt GME, SW). NB Ab dem Augenblick, in dem die Zellen mit DTT in Kontakt gekommen sind, sind die Inkubationszeiten genau einzuhalten. B Inkubation von DTT mit Serum Reagenzien: 0.05 M DTT Lösung Solution in einem Glasröhrchen 7,7 mg D,L Dithiothreitol / ml PBS ph 7,4 (D,L Dithiothreitol Sigma no. D-0632, MW 154,2) Gesättigte Cystin Lösung Minimum 4,8 mg L-Cystine / ml PBS ph 7,4, abzentrifugieren und Pellet entfernen vor dem Einfrieren. (L-Cystine Sigma no. C-8755, MW 240,3) NB Die Lösungen können für 14 bis 21 Tage bei 4 o C oder für 6 Monate bei-20 o C aufbewahrt werden. Durchführung: 1) Mononukleäre Zellen wie üblich isolieren. 2) Für jedes zu untersuchende Serum ein Röhrchen beschriften. 9 µl Serum werden mit 1 µl DTT gemischt. 3) 30 Min. bei Raumtemperatur inkubieren. 4) Terasaki-Platten mit je 1 µl DTT behandeltem oder Kontrollserum (ohne DTT) vorbereiten. 5) Pro Kavität 1 µl Zellen zugeben und 30 Min. bei Raumtemperatur inkubieren. 6) Zu den DTT behandelten Seren 1 µl Cystin und danach sofort 5 µl Komplement zugeben. 7) Bei Raumtemperatur 60 Min. weiterinkubieren. 8) Färbern, fixieren und ablesen wie üblich. B Autoantikörper und ihre Erkennung In der Regel sind Autoantikörper für die Organtransplantation irrelevant. Deswegen ist es unerläßlich zu erfahren, ob ein positives Screening-Ergebnis oder eine positive Kreuzprobe auf Allo- oder Autoantikörper zurückzuführen ist. Üblicherweise sind Autoantikörper kältereaktiv und gehören der IgM Klasse an. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

6 Patienten mit dem Verdacht auf Autoantikörper sollten grundsätzlich in einer autologen Kreuzprobe getestet werden. Folgende Kriterien können auf Autoantikörper hindeuten: Schwach positive Screeningsergebnisse ohne erkennbare Spezifität. Nachgewiesene IgM Antikörper im DTT Screening. Patientenseren mit schon nachgewiesenen Autoantikörpern. Es ist empfehlenswert, daß das Serum solcher Patienten mindestens einmal pro Jahr auf Autoantikörper getestet wird. Auto-Kreuzproben werden mit dem Standard-Mikrolymphozyto-Toxizitätstest bei 4 C, 20 C, 37 C und mit DTT durchgeführt unter Verwendung von hitzeinaktivierten aktuellen wie "historischen" Seren. Es ist empfehlenswert, Seren, die Autoantikörper enthalten, nochmals mit und ohne DTT zu screenen. NB Es ist möglich, daß Patienten HLA spezifische IgM Antikörper in ihrem Serum haben. Diese sind jedoch spezifisch, also im Screening erkennbar und sind in der autologen Kreuzprobe negativ. B Akzeptable Inkompatibilitäten (acceptable mismatches; AM) Die Methode ist für Patienten mit mehr als 80% Allo-Reaktivität gegen das übliche Lymphozyten-Screeningspanel zu verwenden. Mit Hilfe eines speziellen Computer- Programms erfolgt die Selektion von Lymphozyten-Donoren, die sich nur in einem HLA-A oder -B Antigen vom Patienten unterscheiden. Es ist empfehlenswert, gefrorene Lymphozyten vieler Donoren (auch HLA-homozygoter Donoren) zu verwenden, um für die Patienten AM zu bestimmen. B Bestimmung akzeptaler Inkompatibilitäten B Durchführung: 1) Durchführung einer autologen Kreuzprobe mit unseparierten Lymphozyten, um zwischen Allo- und Autoantikörpern zu unterscheiden. 2) Die Screeningsergebnisse werden auf die Anwesenheit von HLA-spezifischen Antikörpern und die HLA-Merkmale der Lymphozyten-Donoren mit negativen Reaktionen herausgeschrieben. 3) Falls die Familientypisierung des Patienten bekannt ist, können die nicht vererbten maternalen HLA-Antigene einen Hinweis geben über eventuelle AM. 60 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998

7 4) Soweit wie möglich werden Lymphozyten-Donoren mit einer HLA-A,B Inkompatibilität herausgesucht. 5) Durchführung der Kreuzprobe mit aktuellen und historischen Seren. Interpretation der Kreuzproben: Kreuzprobe negativ mit allen verwendeten Seren: Das Antigen ist akzeptabel. Kreuzprobe positiv mit einem oder allen Seren: Folgende Möglichkeiten nachprüfen: a. Autoantikörper: Wiederholung der Auto-Kreuzprobe DTT-Kreuzprobe (IgG vs. IgM) Mikroabsorption b. Klasse I spezifische Antikörper: Mikroabsorption c. Klasse II spezifische Antikörper: Mikroabsorption Kreuzprobe mit HLA-DR identischem oder kompatiblen Donor(en) Hinweis: Nach jeder Immunisierung, wie Bluttransfusion, Transplantation müssen die AM neu geprüft werden. B Durchflußzytometrische Kreuzprobe (Flow-XM) B Lymphozyten-Flow-XM B Reagenzien Konjugat: Dako F(ab)2 rabbit anti human IgG gamma Ketten FITC gelöst 1:10 in PBS (PBL) oder 1:20 in PBS (Milzzellen) BDT Zellen CD3 PE Cat No :16 in PBS B Zellen CD20 PE Cat No :16 in PBS Leucogate Cat No :32 in PBS Hinweis: Falls Doppelfluoreszenz benötigt wird, sollte das Konjugat gleichzeitig zugegeben werden. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

8 Kontrollen: 1. Zellen + Leucogate 2. Unmarkierte Zellen 3. Negative Kontrolle (AB Serum) 4. Positive Kontrolle (Bw4 or Bw6 oder Pool Bw4 + Bw6)) Hinweis: Die Verdünnungen sollten mit jedem neuen Konjugat überprüft werden. B Durchführung 1) Zellen wie üblich isolieren 2) In 2 ml RPMI % FCS + DNase aufnehmen und für 30 Min. bei 37 C inkubieren. Für 5 Min. bei UPM zentrifugieren. 3) Einmal mit PBS waschen. 4) Zellen mit 1 ml 1% Paraformaldehyd für 5 Min. bei 4 C fixieren. 5) 50 µl Serum per 1 x 10 6 Zellen in 50 µl PBS zugeben und für 30 Min. bei 20 C inkubieren. 6) Dreimal mit PBS waschen, für 5 Min. bei UPM zentrifugieren. 7) 25 µl Konjugat zufügen und für 30 Min. bei 4 C im Dunkeln inkubieren. 8) Dreimal waschen mit PBS und anschließend die Zellen in 0.3 ml 1% Paraformaldehyd resuspendieren. 9) Die Zellen können bis zu 72 Stunden nach Fixierung gebraucht werden. Hinweis: Für eine durchflußzytometrische Kreuzprobe können sowohl gefrorene als auch frische Zellen verwendet werden. B Agglutinationstest Dieser Test wird verwendet, um Antikörper, die das übliche Screening durch ihre Anwesenheit erschweren können, aufzuspüren: Granulocyten-spezifische Antikörper "non HLA" spezifische Antikörper gegen die Antigene 5A/5B und zusätzlich HLA spezifische Antikörper, die kein Komplement binden Test in Reagenzgläsern = Makroagglutination Test in Terasaki-Platten = Mikroagglutination. 62 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998

9 Es werden 10 ml EDTA-, Citrat- oder definibriertes Blut benötigt. Die Thrombozyten und das Plasma werden durch Abzentrifugieren der Röhrchen bei 1000 Upm entfernt. Die Thrombozyten werden danach aus dem Plasma mit 2500 Upm abzentrifugiert und das thrombozytenfreie-plasma wird dann zu den Leukozyten gegeben. 2 ml 52% Dextran wird den Leukozyten zugefügt und das Röhrchen bei 37 C für 20 Min. schräg ins Wasserbad gestellt. Die Oberschicht, die Lymphozyten, Granulozyten, Monozyten und einige Erythrozyten enthält, wird für den Test verwendet. B Makroaggutination 1) Das zu testende Serum hitzeinaktivieren 2) Serum 1:1 bis 1:64 titrieren und je 1 Tropfen der Verdünnung in ein Glasröhrchen geben 3) Ein Tropfen der Zellsuspension zugeben und die Suspension für 105 Min. bei 37 C inkubieren 4) Flüssigkeit über dem Zellpellet entfernen und einen Tropfen Essigsäure (6%) ohne Mischen zugeben 5) Zellsuspension vorsichtig auf einen Objektträger geben und lichtmikroskopisch auswerten B Mikroagglutination 1) Oberschicht des sedimentierten Blutes (siehe oben) oder isolierte reine Granulozyten verwenden. 2) 2 µl des Serums unter Öl in eine Terasaki-Platte geben. Falls notwendig, Verdünnungen des Serums verwenden. 3) 2 µl der Zellsuspension zugeben und für 105 Min. bei 37 C inkubieren. 4) Lichtmikroskopisch ablesen. B Nicht-Komplement-fixierende Antikörper B Antiglobulin-Mikrozytotoxizitätstest B Prinzip Im Serum vorhandene Antikörper binden an Zelloberflächen- Antigene. Wenn genug Antikörper gebunden sind und die Antikörper der richtigen Immunglobulinklasse angehören (IgM, IgG1, IgG3), kann Komplement aktiviert und die Zellmembran zerstört werden. Um die Sensibilität des Tests zu erhöhen oder um Antikörper zu entdecken, die kein Komplement binden, kann der Antiglobulintest gebraucht werden. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

10 Hinweis: Die Inkubationszeiten sind sehr wichtig! Wenn die Inkubation zu lange ist, kann sich der gebundene Komplex wieder von der Zellmembran lösen oder in die Zelle internalisiert werden. Dadurch können Ergebnisse verfälscht werden. B Durchführung Der Test kann bei T- und B-Zellen angewendet werden. Es werden jeweils zwei Platten vorbereitet: eine für den Antiglobulintest und die zweite als Kontrolle, also ohne Anti- Globulin. 1) Zellen dem Serum zufügen. 2) Platten abzentrifugieren. 3) 30 Min. bei Raumtemperatur inkubieren. 4) Komplement der Kontrollplatte zufügen. 5) Die Zellen in der Anti-Globulin Platte werden 3 mal mit Hank's-Lösung oder RPMI-1640 gewaschen, um nicht gebundene Antikörper zu entfernen. 6) Die Platten werden zwischen den Waschschritten zentrifugiert. 7) 1 µl Antiglobulin hinzufügen, 2 Min. inkubieren und anschließend Komplement zugeben. 8) Färbung und Fixierung wird wie beim üblichen Test durchgeführt. Hinweis: Das Antiglobulin wird bei -70 C aufbewahrt. B Indirekte Immunfluoreszenz bei Lymphozyten B Reagenzien Fluoreszenzmarkierung: SR/GaHu/IgG9Fc)FITC, Nordic Paraformaldehyd 1% in 0,9% gepuffertes NaCl, ph 7,4 B Durchführung 1) Zellen wie oben beschrieben isolieren. 2) Zellen mit Paraformaldehyd bei 4 C fixieren. 3) Nach einmaligem Waschen mit PBS/BSA 1% das Zellpellet in der Waschflüssigkeit resuspendieren. Nur so viele Tropfen wie nötig für das Experiment zugegeben. 4) 2 Tropfen des zu testenden Serum mit 2 Tropfen Zellsuspension für 60 Min. bei Raumtemperatur inkubieren. 5) 3 mal mit PBS/BSA 1% waschen. 6) 1 Tropfen FITC markiertes, antihumanes IgG zufügen und für 30 Min. bei Raumtemperatur inkubieren. 7) 2 mal mit PBS/BSA 1% waschen und die Zellen in Glycerin-PBS resuspendieren. 64 DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998

11 8) Die Präparation wird im Immunfluoreszenz-Mikroskop untersucht und die beobachtete Membranfluoreszenz in Prozenten angegeben. B Monozyten-Mikrolymphozytotoxizitätstest B Reagenzien Lidocain, konzentrierte Lsg. 2 g Lidocain ad 50 ml Aqua dest. Lidocain, Gebrauchslsg. 8 ml konz. Lsg. 41 ml RPMI-1640 ph mit 7,5% NaHCO3 auf 7,2-7,3 einstellen. Carboxyfluoreszein-Diacetat (CFDA), konz. Lsg. 1 ml Azeton p.a. 10 mg CFDA Gebrauchslsg.: 10 ml PBS + 50 µl CFDA konz. Lsg. PI / Tinte-Lsg. 10 g BSA (Fraktion 5) gelöst in 100 ml EDTA Lsg ( 4,9% Na-EDTA x 2 H 2 O, ph 7,0) 2 ml Propidiumiodine konz. Lsg. 1 ml Tinte (Leitz, verdünnt 1:3) bei -20 C aufbewahren. Propidiumiodid konz. Lsg. 1 mg/ml Propidiumiodine (Sigma), gelöst in 5% EDTA bei 4 C aufbewahren. B Durchführung 1) 10 ml heparinisiertes, EDTA- oder Citrat-Blut verwenden. 2 ml 5% Dextran zufügen und das Gemisch für 20 Min. sedimentieren lassen. Den Überstand über 3 ml Ficoll schichten und für 15 Min. bei 2500 rpm (1000 g) zentrifugieren. 2) Die Interphase entnehmen und zweimal mit kaltem PBS-BSA 1% waschen. Jeweils bei 1500 rpm für 5 Min. zentrifugieren. 3) Das Zellpellet in 5 ml RPMI-1640 aufnehmen, das 20 % fötales Kälberserum oder autologes Serum enthält. In einer 60 mm adhärenten Kulturflasche aus Plastik für Min. bei 37 C in einem feuchten (5% CO2)Inkubator inkubieren. 4) Überstand (nicht-adhärente Lymphozytenpopupation) entfernen und die Flasche sorgfältig 4-5 mal mit kalter Hank's-Lösung oder RPMI-1640 waschen. 5) 20 ml Lidocain-Lösung + 20 % Serum in die Kulturflasche zugeben und bei Raumtemperatur für 15 Min. inkubieren 6) Die anhaftenden Zellen entfernen, indem der Boden der Kulturflasche mit einem Gummi Spatel abgekratzt wird. 7) Beide Zellsuspensionen mit kaltem PBS-BSA 1% waschen. Jeweils bei 1500 rpm für 5 Min. zentrifugieren. DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik

12 8) Das Zellpellet im Dunklen mit 2 ml PBS-BSA 1% + 10 µl CFDA Gebrauchslösung inkubieren. 9) Die Zellen zweimal mit kaltem PBS-BSA waschen und die Suspension mit Hank's- Lösung oder RPMI-1640 auf 4 x 10 6 Zellen/ml einstellen. 10) 1 µl Zellsuspension und 1 µl Serum mischen und für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunklen inkubieren. 11) 5 µl Kaninchen Komplement zugeben und nochmanls für 2 Stunden im Dunklen inkubieren. 12) 5 µl Propidiumiodin-Lösung (PI/Ink) zugeben und ablesen B HLA-DR, DQ Screening Die klinische Relevanz von HLA-DR, DQ oder DP Antikörper ist noch nicht eindeutig bewiesen. Es scheint sich jedoch die Tendenz zu etablieren, daß hochtitrige Antikörper gegen diese Determinanten einen negativen Effekt auf die Transplantation haben. Deswegen ist es ratsam bei Retransplantations-Patienten ein Klasse II Screening durchzuführen. Die Ergebnisse müssen dann bei einem Organangebot berücksichtigt werden. B Literatur 1. Patel R. and Terasaki P.I.: N Engl J Med 280:735; Williams et al. N Engl J Med 279:611; Ayoub et al. Transplantation 29:227: Okuno T. and Kondelis N. J. Clin. Pathol. 31:1152; Cerilli et al. Human Immunol 7:45; Hernadi et al. In: Visuals of the clinical histocompatibility workshop P.I. Terasaki ed. 1988, pp Ting A. Transpl Internat 2:2; Weiterführende Literatur: 1. ASHI Laboratory Manual 2nd Edition, Rinehart, J.J. et al.: A new method for isolation of human monocytes. J.Immunol.Methods 23: , Cross D.E. et al.: Importance of the autocontrol crossmatch in human renal transplantation. Transplantation 21: , Claas F.H.J. et al.: A special strategy to increase the chance of finding crossmatch negative kidneys for highly sensitized patients. Transplant. Proc. XX no , Nelken D. et al.: A method to increase the sensitivity of the lympocyte microcytotoxicity test. Transplantation 10: 346, Chapman J.R. et al.: Analysis of flow cytometry crossmatches in renal transplantation. Transpl. Proc. 17: , Amos D.B. and Peacocke N.: Leukoagglutination technique, Histocompatibility Testing 1965, National Academy of Sciences National Research Council, pp , DGI Technisches Handbuch Histokompatibilität & Immungenetik 1998